UNIVERSIDAD NACIONAL “HERMILIO VALDIZÁN” ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL CURSO: ANALISIS POR INSTRUMENTACIÓN Ayala Torres Jerry; Espinoza Coz Sol; Julca Retis Lizbeth; Satalaya Onofre Mónica PRÁCTICA 05: CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES, MEDIANTE EL MÉTODO FOLIN CIOCALTEU I. INTRODUCCIÓN
Los compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios de los vegetales, donde desempeñan diversas funciones fisiológicas. Se trata de compuestos que intervienen en el crecimiento y reproducción de las plantas, así como en procesos defensivos contra agentes patógenos, depredadores o radiación ultravioleta. Tradicionalmente se han considerado como sustancias antinutritivas debido al efecto adverso de uno de sus componentes principales, los taninos, en la digestibilidad de proteínas. Sin embargo, actualmente existe gran interés en estos compuestos debido a la gran variedad de actividades biológicas que presentan, considerándose uno de los compuestos fitoquímicos alimentarios más importantes por su contribución al mantenimiento de la salud humana. La actividad biológica de los polifenoles está relacionada con su carácter antioxidante, el cual es debido a su habilidad para quedar metales, inhibir la actividad de la enzima lipooxigenasa y actuar como atrapadores de radicales libres.La cantidad de compuestos polifenólicos y tipos presentes en un alimento varía en función de la especie vegetal, variedad y parte del vegetal considerada (fruto, semillas, brotes, hojas), horas de exposición solar, grado de madurez, condiciones de cultivo, procesado, condiciones de almacenamiento, almacenamiento, etc. (Kaur, C. y Kapoor, Kapoor, H. C.; 2001). Se lleva a cabo una evaluación de polifenoles de la hoja de coca, por medio de la reacción FolinCiocalteau, mediante la cual se fermentó la muestra de 2.0 g en 250 ml de agua hervida por 4 minutos con una posterior decantación y centrifugación. Luego de agregarle el reactivo de Folin - Ciocalteau y carbonato de sodio, las muestras fueron incubadas a 20°C por 2 horas con agitación. Los fenoles totales fueron calculados mediante una lectura de absorbancia a 750 nm, como equivalentes al ácido gálico (GAE). Se utilizó un composito de todas las muestras a modo de muestra de control de calidad. Se encontró cantidades significativas de polifenoles: 3.8 g/100 g basados en peso seco y 66 mg por ración de infusión Resulta difícil interpretar la información sobre los polifenoles, ya que no todos los tipos de fenoles tienen el mismo efecto sobre la absorción del hierro. (Brune M, Rossander L, Hallberg L.; 1989) Decimos que el análisis análisis de fenoles totales se realiza por espectrofotometría, espectrofotometría, basándose basándose en una reacción colorimétrica de óxido –reducción. –reducción. A 50 μL de extracto se le agregaron 2 mL de agua destilada, 250 μL de reactivo Folin-Ciocalteu. Como resultado la gran mayoría de estas plantas, hojas, frutos contienen una gran cantidad de polifenoles. Sobre todo cuando se le saca directo de la siembra misma. Se obtuvo: (Curifuta et al. 2012) Contenido de fenólicos y extractos
compuestos flavonoides naturales
en
II.
absorbancia en espectrofotómetro a 700 nm.
MATERIALES Y MÉTODOS Equipos e instrumentos: Espectrofotómetro Uv – Vis, balanza analítica, agitador magnético, vasos de precipitación, fiolas, micropipetas, tips (1000 y 200 µL), embudos, papel filtro, tubos de ensayo, gradilla, cubetas de poliestireno para espectrofotómetro (1 mL). Reactivos: Ácido Gálico (PM: 170,1) Solución Fenol de Ciocalteau (FOLIN) Carbonato de Sodio (NaCO3) a. Preparación de los extractos acuosos. Pesar 1 g de muestra y colocar en 100 mL de H2O destilada caliente a temperatura de ebullición, agitar durante 5 minutos, filtrar y almacenar en refrigeración. b. Curva de calibración 1. Preparar las siguientes soluciones stocks: Solución de Carbonato de Sodio (NaCO3) al 20% con agua desionizada. Solución de (+) – Catequin 1 mM o solución de ácido Gálico 12 mM. 2. Agregar a cada tubo 1.58 mL de agua destilada desionizada (H2O dd) y 20 µL de muestra, control (H2O dd) o estándares. Mezclar ligeramente. 3. Luego agregar 100 µL de solución de Fenol de Folin – Ciocalteau. Mezclar nuevamente. 4. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente. 5. Para neutralizar la reacción agregar 300 µL de NaCO3 al 20%. 6. Incubar por 1 hora a temperatura ambiente, tiempo en el que hay una completa reacción. 7. Para determinar la cantidad de compuestos fenólicos producidos durante la reacción, agregar 1 mL de muestra, control o estándar en una cubeta de poliestireno (1 cm x 1 cm x 4,5 cm) y leer la
III.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Concentración (ug/mL) blanco 50 100 200 400 600 800 1.2001000 1.000 A I0.800 C N A B 0.600 R O S B 0.400 A
el
R1
R2
0.074 0.152 0.173 0.272 0.476 0.668 0.895 1.136
0.143 0.169 0.272 0.474 0.655 0.890 1.152
R3
Abs. Diferencia (700nm) 0.074 0.146 0.168 0.268 0.475 0.664 0.888 1.146
0.143 0.163 0.261 0.474 0.668 0.879 1.149
0.072 0.094 0.194 0.401 0.590 0.814 1.072
3.1. RESULTADOS: TABLA 1
Tabla de concentración y absorbancia de las y = la 0.001x diluciones para obtener curva. R² = 0.9962 0.200 0.000
0
500
1000
1500
CONCENTRACION
Figura 1: Absorbancia y concentración de las
diluciones TABLA 2
Tabla de concentración de polifenoles y factor de dilución.
Desviación estándar = 17.56 diferencia
Conc. polifenoles (ug/mL)
FD (5)
0.074 0.494 0.490
0.42 0.416
420 416
2100 2080
0.497
0.423
423
2115
Formula del factor de dilución:
Muestra
Abs (700nm)
1ml de muestra (infusión de coca) + 4ml de agua
control R1 R2 R3
. =
.
4+1 =
1
=5
3.2. DISCUSIONES: Según el autor Brune M, Rossander L, Hallberg L. la hoja de coca tiene una cantidad significativa de polifenoles. Como resultado nos dice que obtuvieron 3,8 g/100 g, a comparación de nuestra práctica realizada obtuvimos un promedio de 419,6 µg/mL de polifenoles, la diferencia entre la alta concentración del autor y la baja concentración de polifenoles que obtuvimos varió porque tal vez no utilizamos la suficiente cantidad de hoja de coca, no fue sacada al instante de la misma plantación, o la reacción no fue la adecuada. Según Curifuta et al. la mayor cantidad de polifenoles se concentra en los extractos de éstos, y a diferencia que en la práctica realizada se obtuvo baja concentración de polifenoles, esto mismo se debe a que la hoja de coca estuvo seca o teníamos en poca cantidad. Podemos decir que es mejor evaluar los polifenoles cuando la planta esté poco tiempo extraída del campo.
2098.3
VI.
REFERENCIA Kaur, C. y Kapoor, H. C. (2001).
“Antioxidants in fruits and vegetables-The millennium's health”.
IV.
CONCLUSIONES Concluimos que al hacer la dilución de la muestra (zumo de la hoja de coca) de 1/1 nos dimos cuenta que el resultado no era optimo y no se encontraba en el rango adecuado, por ende tuvimos que realizar 3 dilución de 1/5 y 1/10 y como resultado tuvimos que la dilución de 1/5 es óptima y se encuentra en el rango permitido para obtener mejores resultados, donde el factor de dilución es de 2098.3. En este objeto de aprendizaje se ha descrito el fundamento y el procedimiento experimental del análisis de compuestos polifenólicos empleando el método espectrofotométrico de Folin-Ciucalteu. Con ayuda de un ejemplo se ha determinado la concentración de estos compuestos.
V.
RECOMENDACIONES
Leer la guía de práctica antes de realizar la práctica. Antes de hacer las diluciones conocer que es lo que se adicionara primero. Manejar bien los reactivos y los materiales para tener una buena práctica.
International Journal of Food Science and Technology, vol. 36, nº. 7, pp. 703 – 725, Brune M, Rossander L, Hallberg L. Iron absorption and phenolic compounds: Importance of different phenolic structures. Eur J Clin Nutr 1989; 43: 547-57. CURIFUTA, M.; VIDAL, J.; SÁNCHEZ-VENEGAS, J.; CONTRERAS, A.; SALAZAR, L.; ALVEAR, M. 2012. The in vitro antifungal evaluation of a commercial extract of Chilean propolis against six fungi of agricultural importance. Cien. Inv. Agr. 39(2), 347 – 359.
