Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores. Zaragoza. AUTOR: Bautista Delgado Elan
TITULO: Cromatografía. Extracción y separación de pigmentos vegetales.
ASESOR: Cecilia Sugina Matsubara Oda.
Laboratorio de Ciencia Básica III
GRUPO: 3314
FECHA: 20 de noviembre de 2012
RESUMEN: El desarrollo experimental que se llevo a cabo fue la cromatografía. Los tipos de cromatografía llevados a cabo fueron la cromatografía en columna y la cromatografía en capa fina. Mediante esta técnica se pretendió separar los diferentes pigmentos contenidos en la espinaca (Clorofilas, carotenos, etc.), interesándonos especialmente por el β-caroteno. El pigmento a separar fue previamente extraído de la espinaca con cloruro de metileno, a través de una extracción sólido-líquido, con la espinaca previamente seca, para después llevar a cabo una cromatografía en capa fina con los diferentes disolventes con que contamos para elegir el o los adecuados para utilizar en la cromatografía en columna. Al terminar la separación en cromatografía en columna, se llevo a cabo otra cromatografía en capa fina para así poder realizar el cálculo de Rf y/o Rx, según sea el caso, para comprobar la pureza del pigmento separado de la espinaca. INTRODUCCIÓN: La cromatografía es un método que permite separar los componentes de una mezcla de compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es móvil y la otra estacionaria. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido, este último debe estar inmóvil sobre un soporte inerte. La fase móvil puede ser un líquido o un gas. Dependiendo de la naturaleza de las fases usadas, la cromatografía puede clasificarse en varios tipos: sólido-líquido, líquido-líquido, sólido-gas y líquido-gas; por esta diversidad la cromatografía en los últimos años ha adquirido un gran valor, ya que su empleo ha contribuido no sólo a la identificación sino también al aislamiento de compuestos que son de origen biológico; aún en cantidades muy pequeñas, dichos compuestos generalmente poseen propiedades físicas y químicas muy semejantes, siendo muy difícil por medio de otras técnicas conseguir tales resultados. Por los que, al presentarse con el problema de separar una mezcla completamente desconocida lo mejor es emplear un ensayo cromatográfico por medio de la cromatografía en capa fina, la cual dará detalles acerca de la complejidad de la muestra a separar. La cromatografía en capa fina es uno de los métodos analíticos más sencillos ya que se utiliza poca cantidad de muestra, pues es sensible en alto grado y requiere de poco tiempo para separar compuestos estructuralmente muy parecidos. Los resultados de la cromatografía en capa fina son muy valiosos pues ayudan a seleccionar el adsorbente y eluyentes adecuados que puedan ser empleados para una separación de cromatografía en columna. Para obtener buenos resultados de
la cromatografía en columna se deben seleccionar perfectamente las variables de las cuales depende la separación en bandas de los compuestos de la mezcla. Comentarios breves sobre el tema: Fundamento teórico: La cromatografía es una método de análisis químico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Este método depende del principio de adsorción selectiva. La cromatografía es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. La elección de un método cromatográfico dependerá de la naturaleza, cantidad de la muestra y de las limitaciones del tiempo. Todos los Métodos cromatográficos tienen en común el uso de una fase móvil y una fase estacionaria. Las técnicas cromatográficas, según el dispositivo utilizado para conseguir la separación entre la fase móvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.
Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a través de ella se hace pasar la fase móvil.
Cromatografía plana: La fase estacionaria está colocada en una superficie plana.
Se divide en dos tipos generales: 1. Cromatografía en papel: en la que el papel absorbente actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición). Una muestra líquida fluye por una tira vertical de papel absorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares específicos. 2. Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria, se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva. La cromatografía en capa fina es muy simple, barata, sensible y eficiente. Es especialmente útil cuando se quiere determinar el número de componentes de una mezcla o identificar los compuestos existentes en una mezcla.
En la cromatografía de capa fina, un adsorbente está depositado formando una delgada capa sobre una placa de vidrio por la que ascienden, arrastradas por un disolvente, una o más sustancias que se pretenden separar o identificar. Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequeña cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del extremo inferior de la placa. Una vez depositada la muestra, se introduce la placa en una cubeta de cromatografía, que contiene en el interior el disolvente con el que va a desarrollarse el cromatograma. La altura del disolvente en dicho frasco o cubeta debe ser tal, que éste no toque la zona donde se encuentra la pequeña mancha de producto depositado. La placa se coloca en posición vertical, ligeramente inclinada. El disolvente asciende entonces por capilaridad a lo largo de la placa, arrastrando a los compuestos a diferentes velocidades, según el grado de adsorción de éstos produciéndose así su separación. Transcurridos unos minutos, cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo de la placa, se saca ésta de la cubeta, se deja secar y se examina. Los diversos compuestos se localizan directamente si son coloreados, o con la ayuda de un indicador o luz ultravioleta, si son incoloros. Los compuestos que avanzan a lo largo de la placa se ven atraídos por fuerzas electrostáticas sobre la superficie del adsorbente, interaccionando el disolvente con ambos. Esta interacción competitiva establece las velocidades relativas con que ascienden por la capa de adsorbente, el frente de disolvente y un determinado compuesto. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos, más intensamente se ven éstos atraídos por el adsorbente. La actividad del adsorbente también influye en el grado de emigración del soluto, de manera análoga a la ya considerada anteriormente. Los adsorbentes más utilizados en cromatografía en capa fina, son la gel de sílice y la alúmina activada dependiendo su grado de adsorción del contenido en agua. La polaridad del disolvente influye asimismo en la velocidad de ascensión del soluto a lo largo de la capa de adsorbente. A mayor polaridad del disolvente, mayor grado de ascensión del soluto por la placa. Bajo unas determinadas condiciones experimentales, un compuesto dado puede recorrer una cierta distancia a lo largo de la placa. Se denomina Rf a la relación existente entre la distancia recorrida por el compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo, es decir:
Naturalmente, los valores de Rf para un determinado compuesto varían ampliamente con los cambios de disolvente. El valor de Rf para un compuesto dado depende de su estructura y es una constante física de éste. Objetivo:
Extraer el pigmento de un producto natural asignado por el profesor haciendo uso de la técnica más adecuada. Elegir mediante cromatografía en capa fina el eluyente o mezcla de eluyentes ideales para separar los diferentes pigmentos de un producto natural por cromatografía en columna. Separar por medio de cromatografía en columna los pigmentos vegetales. Verificar por cromatografía en capa fina que se logró la separación de los pigmentos por cromatografía en columna. Utilizar reveladores químicos y físicos.
Hipótesis: Se elegirá el disolvente y/o par de disolventes ideales por medio de una cromatografía en capa fina para intentar separar los pigmentos de la espinaca y la zanahoria (clorofilas, carotenos, etc.) por medio de una cromatografía en columna, comprobando su pureza, luego de la separación, con otra cromatografía en capa fina. También se intentará obtener experimentalmente el Rf y Rx del pigmento (βcaroteno). PARTE EXPERIMENTAL: Lista de material: Cantidad 20 10 10 11 10 1 1 1 1 1 Lista de reactivos:
Material Tubos capilares Portaobjetos Frascos Papel filtro Tubos de ensayo Pipeta graduada Embudo de separación Soporte universal Pinzas de tres dedos con nuez Balanza granataria Bureta graduada
Capacidad
Aprox. 50 mL
5 mL 250 mL
50 mL
Cantidad 15 20 40 5 5 5 5 5 5 5
Unidades g mL mL g mL mL mL mL mL mL mL
Descripción Gel de sílice Acetato de etilo Cloruro de metileno Espinaca y Zanahoria Metanol Etanol Acetona Cloroformo Benceno Hexano Heptano
Procedimiento:
Extracción de pigmentos de espinaca y zanahoria: Espinaca: 1. Se remoja la espinaca en un tubo de ensayo con cloruro de metileno para extraer el pigmento, decantando el pigmento en un frasco. 2. Agregamos la solución a un embudo de separación y agregamos salmuera y hexano para eliminar impurezas. 3. Separamos el pigmento y conservamos en frasco gerber tapado con aluminio. Zanahoria: 1. Remojamos en cloruro de metileno la zanahoria previamente seca. Comprimimos para extraer mejor y almacenamos como la espinaca.
Cromatografía en capa fina: 1. En un frasco pequeño preparamos el gel sílice con un poco de acetato de etilo y agitamos a modo de obtener una mezcla uniforme. 2. Preparación de placas: una vez mezclado el gel sílice tomamos dos portaobjetos sobrepuestos uno con el otro y los sumergimos en el gel sílice de modo que se obtenga una película de gel sobre nuestros portaobjetos el cual será nuestro adsorbente o fase estacionaria, procurando eliminar todos los excesos sobrantes de las orillas y posteriormente dejando secar las placas. 3. Pigmentos: una vez activadas las placas, con ayuda de dos tubos capilares previamente preparados (Los cuales ocuparemos como micropipetas)
agregamos unas pequeñas gotas de pigmento sobre las placas de modo que el pigmento quede a un centímetro de elevación. 4. Cámaras de elusión: una vez preparadas las placas tomamos un frasco de tamaño considerable para preparar la cámara de elusión y hacer la cromatografía en el mismo. Al frasco le añadimos una cortina de papel filtro para que este adsorba un poco del disolvente a utilizar y llene de vapores la cámara en la cual, con ayuda de una pipeta graduada, añadimos cerca de 5 mL del solvente empleado. Ahora marcamos la cámara con el respectivo solvente que contendrá. Una vez que este hecho, dejamos reposar un breve periodo de tiempo nuestra placa dentro de la cámara para que se lleve a cabo el cromatograma sobre nuestro adsorbente. 5. Una vez fuera de la cámara, tomamos la placa y verificamos qué tanto avanza el solvente o fase móvil y qué tanto subió el pigmento de nuestra cromatografía. 6. Calcular Rf y Rx. Comparar resultados.
Cromatografía en columna: 1. Columna: con ayuda de un soporte universal y unas pinzas de tres dedos con nuez, sujetamos nuestra columna (bureta graduada de 50 mL) y colocamos una pequeña capa de algodón y arena en la boquilla. 2. Gel sílice y llenado de columna: pesamos 10 g de gel sílice en vidrio de reloj y lo mezclamos con 15 mL de acetato de etilo en un matraz erlenmeyer y agitamos hasta obtener una mezcla uniforme. Una vez hecho esto vaciamos dentro de la columna evitando derrames. 3. Añadimos nuestro pigmento de zanahoria o espinaca según sea el caso y esperamos a que con ayuda de nuestro eluyente o solvente a utilizar, lo pigmentos se separen y corran hacia abajo. 4. Una vez separado, conservamos el pigmento en tubos de ensayo marcando la muestra y posteriormente realizando una CCF para determinar Rf y Rx, así como la pureza.
Diagrama de flujo: Cromatografía en capa fina: Preparar el gel sílice con acetato de etilo.
Preparar placas.
Agregar pigmento sobre placas preparadas.
Preparar cámara de elusión y llevar a cabo la cromatografía.
Calcular Rf y Rx
Verificar el avance del solvente.
Cromatografía en columna: Preparar columna de reparto.
Preparar gel de sílice y vaciar en la columna.
Añadir pigmento y esperar separación.
Conservar pigmento separado y realizar CCF.
Determinar Rf y Rx.
Esquema del aparato: Cromatografía en capa fina.
Cromatografía en columna.
RESULTADOS:
Metanol
Etanol
Acetona
Acetato de etilo
Cloroformo
No hubo separación Benceno
Hexano
Cloruro de metileno
Heptano
Luego de realizar la CCF con los diferentes solventes con los que contábamos procedimos a realizar la CC con el disolvente adecuado para separar los componentes del pigmento de la espinaca. Al realizar la CC se lograron separar 40 diferentes fases, de la cual sólo nos interesó el β-caroteno, el cual, al terminar la CC, se procedió a realizar una CCF para comprobar la pureza:
Placa con resultado en pruebas de pureza por CCF, luego de la separación del pigmento por CC, de la decima separación (βcaroteno)
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS: La elección del disolvente por cromatografía en capa fina fue positiva, ya que, después de hacer las pruebas con los diferentes disolventes con que contamos, algunos de estos solventes no dieron como resultado una separación, mientras
que otros daban una separación mínima, ya que no lograron formar una mancha adecuada en la capa fina. Los disolventes que mejor se adaptaban a nuestra separación fueron el hexano y el heptano En el caso del hexano ocurrió una separación débil, ya que la distancia entre la mancha amarilla y el resto de componentes es pequeña, pudiendo ocasionar mayor dificultad al usarlo en la columna, pues posiblemente las fracciones saldrían muy juntas entre sí con el riesgo de que se encuentren confinadas y por tanto, el nivel de pureza sea reducido. El disolvente que mostro una separación más adecuada fue el heptano, dando manchas amarillas muy bien definidas y que comparando la de la espinaca con la de la zanahoria se encuentran a la misma distancia de avance indicando que la mancha proveniente de la espinaca es correspondiente al β-caroteno, concluyendo esto debido al patrón primario que fue la zanahoria la cual es uno de los vegetales que contienen en mayor abundancia este pigmento natural, hecho que se deja ver desde simple vista en el color de este vegetal, cabe mencionar que los carotenos son los pigmentos responsables de las coloraciones de amarillas hasta rojas. Adicionalmente, se utilizó una mezcla de disolventes para aumentar el rendimiento de la separación. Las mezclas utilizadas fueron: HeptanoAcetato de etilo 80-20, Heptano-Acetato de etilo 60-40 y Heptano-Acetato de etilo 50-50. Los resultados obtenidos en el experimento fueron satisfactorios, ya que, al realizar la cromatografía en columna se lograron extraer los diferentes pigmentos de la espinaca. Se obtuvieron 40 diferentes fases de esta separación. Al realizar la cromatografía en capa fina de estas fases, se tuvo como resultado que la decima fase era la del β-caroteno, ya que utilizamos como patrón esta misma sustancia pura, obteniendo un Rx de 1, comprobando así que tanto la sustancia separada de la espinaca como la sustancia de la zanahoria, además del patrón utilizado eran la misma sustancia. No se calculó Rf porque no aplica para estos casos. CONCLUSIONES: La cromatografía es un método de separación de sustancias actualmente muy utilizado tanto para separaciones, como para pruebas de pureza y caracterización de sustancias. En el experimento realizado en laboratorio se logró llegar a los objetivos planteados, logrando extraer los diferentes pigmentos de la espinaca, además de que se eligió correctamente el disolvente a utilizar, así como la mezcla de disolventes (Heptano-acetato de etilo) para realizar nuestra cromatografía en columna. Se logró identificar la fase móvil y la fase estacionaria en las distintas cromatografías que realizamos, llegando a la conclusión de que los vegetales contienen diferentes tipos de pigmentos, como son los carotenos y las clorofilas que se encuentran en diversas proporciones dando así los colores característicos de las plantas.
BIBLIOGRAFÍA: Ault, Addison, Techniques and experiments for organic chemistry, 3ª edición, Editorial Fontané J.C., USA, 1979. Abbot, D; Introducción a la cromatografía, Ed. Alhambra S.A., Madrid, España Brewster, R.Q., Curso práctico de química orgánica experimental, Editorial Alhambra, S.A., Madrid, España, 1978.. Domínguez, X.; Experimentos de química orgánica, Reverté S.A., Barcelona, España, 1967. Keese, R., Métodos de laboratorio para química orgánica, Editorial Limusa, 1990. Pavia, D.L., Introduction to organic laboratory techniques, 3 ª edición, Saunders Collage Publishing, USA, 1995. Villegas Casares, W.A.; Análisis ultravioleta-visible; Universidad Autónoma de Yucatán, México, 2006. The Merck Index Version 13.4 CD-ROM (Academic)
