Las técnicas de DNA recombinante comprenden una gran cantidad y variedad de desarrollos tecnológicos tecnológ icos en permanente avance durante los últimos 30 años, que han dado lugar a la biotecnología, uno de los campos más activos y de mayor crecimiento de la investigación científica de los últimos dos decenios (Pierce, 2006).Este desarrollo que permitió llegar a la tecnología del ADN recombinante se logró gracias a una serie de descubrimientos: en 1909 el físico británico Archibald Garrod es el primero en proponer la relación entre los genes y las proteínas. Propone que los genes pueden estar incluidos en la formación de las proteínas que realizan las reacciones del metabolismo; 1928 Franklin Griffith descubre que la información genética puede ser transferida de bacterias muertas a bacterias vivas por incremento de la temperatura. Este fenómeno fue denominado transformación transformaci ón (Griffith, 2002); en 1930 mediante experimentos realizados con cepas mutantes de levaduras de Neurospora, George Beadle y Edward Tatum aportan evidencias que apoyan la hipótesis de Garrod. Esta evidencia da origen a la hipótesis: “un gen, una proteína”, es decir, que cada proteína de la célula resulta de la expresión de un gen; en 1944 Oswald Avery, Maclyn McCarty y Colin MacLeod identifican al DNA como el “agente transformante” de Griffith; en 1957 durante una epidemia de disentería en Japón, un grupo de biólogos descubrieron que ciertas cepas de bacterias eran resistentes a antibióticos. Posteriormente se descubriría que esta resistencia se debía a plásmidos; en 1961 Sidney Brenner y Francis Crick proponen el código genético, estableciendo que los aminoácidos de las proteínas están codificados por grupos de tres nucleótidos o codones en el DNA; en 1966 se descifra el código genético al descubrir, mediante análisis bioquímicos el aminoácido que determina cada codón; 1970 Hamilton Smith, en la Escuela de Medicina del Johns Hopkins, aísla por vez primera una enzima de restricción;1972 Stanley Cohen y Herbert Boyer combinan sus esfuerzos para generar la tecnología del DNA recombinante, lo que da origen a la industria biotecnológica (Horton, 2008);1976 Herbert Boyer es cofundador de Genentech, la primera compañía que aplica la tecnología de DNA recombinante;1978 se sintetiza la primera proteína humana mediante tecnología de DNA recombinante, la somatostatina, que regula a las hormonas del crecimiento ( Beas, 2009) La tecnología de ADN recombinante es un conjunto de técnicas moleculares para localizar, aislar, alterar y estudiar segmentos de ADN (Mathews, 2013). El termino recombinante se utiliza porque a menudo el objetivo es combinar ADN de dos fuentes distintas. Estas moléculas son creadas en la naturaleza con más frecuencia que en el laboratorio; por ejemplo, cada vez que un bacteriófago o virus eucariótico infecta su célula huésped e integra su ADN al genoma huésped, se crea un recombinante. A veces, esos virus toman un fragmento de ADN huésped cuando se separan del genoma de su huésped; esas moléculas de ADN recombinante natural se han usado para estudiar algunos genes (Horton, 2008)
En el campo de la biología molecular, la tecnología de clonación se ha convertido en una herramienta indispensable permitiendo el análisis funcional y/o de expresión de genes; en los últimos años esta tecnología ha tenido avances considerables, al desarrollarse un nuevo sistema de clonación llamado GATEWAY® (Invitrogen), que provee una forma más fácil, rápida y eficiente para clonar genes o fragmentos fr agmentos de DNA de interés. El sistema de clonación GATEWAY® reemplaza las endonucleasas de restricción y la ligasa, por una serie de recombinaciones de sitios específicos, a través de las cuales se pueden transferir segmentos de DNA entre diferentes vectores. Este
sistema se basa en las reacciones de r ecombinación que el bacteriófago λ lleva a cabo en la bacteria E. coli, llamado attP(proveniente del fago) y attB(proveniente de la bacteria). Cada uno de estos sitios está compuesto de una secuencia de nucleótidos de 7 pares de bases referida como secuencia núcleo(O) y por dos brazos flanqueados llamados P y P´ y B y B´. El proceso de recombinación comienza cuando varias moléculas de la integrasa codificadas por el fago y el factor del huésped de integración bacteriana (IHF) se unen fuertemente al par de b ases de 232 de attP. Este complejo es apareado entonces con la secuencia de 21pb de attB en el cromosoma bacteriano. Mellas de DNA escalonada se producen en los extremos de la secuencia central de ambas secuencias attP y attB seguido por un intercambio de cadenas entre ellas. Debido que existen las regiones cortas de 7 pares de bases de secuencias homologas, una unión pequeña heteroduplex es formada. Una vez formada esta unión la secuencia de DNA del fago está flanqueada por dos sitios híbridos att llamados attL y attR(izquierdo y derecho respectivamente). Entonces los sitios de recombinación son llamados attP, attB, attR y attL, dichos sitios solo se pueden recombinar en una forma específica: los sitios attB se recombinan con los sitios attP, y los sitios attL se recombinan con los sitios attR; por lo que las reacciones de recombinación se conocen como: reacción BP y reacción LR respectivamente. La reacción LR es la recombinación entre un vector DE ENTRADA y un vector DESTINO, realizada por una mezcla de enzimas llamadas CLONASA LR, esta reacción transfiere fragmentos de DNA del vector DE ENTRADA al vector DESTINO para crear un vector DE EXPRESIÓN (Figura 4). El vector DESTINO además del gen de resistencia a algún antibiótico, contiene un gen letal para E.coli denominado ccdB, la proteína codificada por éste gen interfiere con el reconocimiento de la DNA girasa, causando que el cromosoma se corte en pedazos por lo que, al no ser llevada a cabo de manera correcta la recombinación, las bacterias transformadas morirán, garantizando una eficiencia de hasta el 99%. La reacción BP es lo inverso a la reacción LR, transfiriendo fragmentos de DNA de un vector DE EXPRESIÓN a un vector DONADOR, para producir nuevamente un vector DE ENTRADA, creando de esta manera un ciclo . Esta reacción es catalizada por una mezcla de enzimas llamada CLONASA BP. Para lograr la clonación mediante este sistema, lo que se hace es flanquear una secuencia de DNA con estas secuencias hibridas en los extremos 5´ y 3´ utilizando cebadores específicos para amplificar por PCR. Este producto de PCR flanqueado se mezcla con plásmidos especiales llamados vectores donantes de Gateway y un mix de enzimas llamado BP clonasa. Este mix de enzimas cataliza la recombinación del inserto con la secuencia de attB del inserto con la attP del vector. http://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/22399/ROSAS%20RODRIGUEZ%2C%20B.%20E.. pdf?sequence=1&isAllowed=y Este sistema de clonación cuenta con ventajas interesantes como: transferir uno o más fragmentos de DNA dentro de diferentes tipos de vectores de manera paralela, mantiene el marco de lectura y la orientación del segmento de DNA transferido, debido a su alta eficiencia minimiza la necesidad de chequeo de colonias transformadas; prácticamente cualquier vector se puede convertir en un vector compatible con este sistema creando un vector DESTINO; el proceso de clonación es más fácil y rápido. Todas estas características hacen del sistema GATEWAY® una
herramienta útil en el proceso de clonación, por lo que actualmente, es empleado ampliamente en la biología molecular. http://www.ira.cinvestav.mx:86/tesis/zuniga_2009.pdf
Metodología.
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/34691/Documento_completo__.pdf?sequence =1 bien para metodología del proecto de ruby
Aspergillus flavus
A.fumigatus A.niger A.ochraceus A.versicolor P.viridicatum
Esterigmatocistina Aflatoxina Acido aspergilico Acido cójico Aspetoxina Gliotoxina cido oxálico Ocratoxina Ácido penicílico Esterigmatosistina Ocratóxina Citrina
Carcinogénica Hepatotóxica Mutagénica Teratogénica Neurotóxica Hepatotóxico mutagénico Carcinogénica Neurotóxica Carcinogénica Carcinogénica
(Belen, 2015) (Zúñiga, 2009) (Maroniche, 2011) (Grossniklaus, 2003) (Salcedo, 2012) (Ortiz, 2015) (GIBCOBRL) (Invitrogen) (biosoft, 2016) (Soriano, 2017)
