1.1.8 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ thực vật: Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính chống oxi hóa so với khả năng chống oxi hóa của Trolox. Phương pháp DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH. Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khả năng chống oxi hóa bằng cách bẫy các gốc tự do. Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): lực chống oxi hóa bằng phương pháp khử sắt. Phương pháp reducing power: lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử Fe Phương pháp FTC: (ferric thiocyanat ): Phương pháp Conjugated Diene: khảo sát nối đôi liên hợp.
Phương pháp TEAC: Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối.
Phương pháp DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), có màu vàng. Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa.
Hình 7: Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxi hóa
Hoạt tính sàng lọc gốc tự do được tính theo phương trình sau: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH(%) = Asample ( 30 phút ) − Ablank ( 30 phút ) Asample ( 30 phút ) − Ablank ( 30 phút ) Acontrol ( 0 phút ) − x100 ≈ 1 − x100 Acontrol (30 phút ) Acontrol (30 phút ) Acontrol(0 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng ngay sau khi pha chế. Acontrol(30 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng sau 30 phút ủ. Asample(30 phút) = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ. Ablank(30 phút) = độ hấp thu của mẫu trắng sau 30 phút ủ. Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với một nửa lượng DPPH (hay độ hấp thu 50%) được gọi là lượng tương đối Trolox phản ứng. Khi đó, hoạt tính chống oxi hóa của mẫu có thể diễn tả bằng thuật ngữ là số micromole bằng Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g. (TE: trolox equivalent) hay IC50.
Phương pháp ORAC: Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxi hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxi hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxi hóa vào. Khi có mặt chất chống oxi hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu. Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxi hóa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxi hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.
Hình 8 : Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian
Phương pháp TRAP:
Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxi hóa. Quá trình oxi hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxi tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxi hóa trong môi trường plasma, quá trình oxi hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.
Phương pháp (FRAP): Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức Fe 3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene). Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxi hóa, các chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe 2+-TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/ g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxi hóa có thể khử nhiều phức Fe 3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.
Lipid assay: Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxi hóa acid linoleic bởi gốc ABAP trong mối quan hệ với chất chuẩn là tocopherol. Trước và trong suốt quá trình xảy ra phản ứng, nhiệt độ của hỗn hợp{[70 µL of linoleic acid (2,3 mmol/L)]; 100 mL đệm phosphate 0,05M (Natri phosphate hòa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4)} được điều chỉnh và duy trì ở 40oC. Lấy 2µl của dung dịch này cho vào 0,01 ml ABAP(0,04M). Sau 2-5 phút phản ứng, lấy 0,02 ml dịch trích ly cho vào hỗn hợp này. Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở 236nm. Xây dựng đường chuẩn là tocopherol.
Phương pháp FTC: Mục ðích của phýng php ny l khảo st khả nng lm giảm sự peroxide hĩa lipid của chất khng oxy hĩa. Thơng thýờng, cc gốc oxi tự do sẽ peroxide hĩa lipid, tạo thnh peroxide. Peroxide sẽ oxi hĩa Fe2+ thnh Fe3+, phức của Fe3+ với SCN- cĩ gi trị hấp thu tối ða tại 500nm. Gi trị hấp thu cao ðồng nghĩa với sự peroxide hĩa lipid cao trong suốt qu trình ủ dung dịch. Mẫu dung dịch cĩ chứa chất khng oxy hĩa sẽ cho gi trị ðộ hấp thu thấp hn mẫu trắng khơng cĩ chất khng oxy hĩa.
Reducing power: Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] (xanh Pruss). Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ
lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch acid ascorbic. Conjugated Diene: Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hóa lipid của chất kháng oxy hóa. Bảng 2: tóm tắt các đặc điểm các phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa STT
Phương pháp Đặc diểm phương pháp
Trang thiết bị
Tính khả thi trong các hệ thống sinh học
1
ORAC
++
+
+++
2
TRAP
---
--
+++
3
FRAP
+++
+++
-
4
TEAC
+
+
-
5
DPPH
+
+
-
6
FTC
+++
+++
-
7
Reducing power
+++
+++
+, + +, + + + mức độ đơn giản tăng dần -, - -, - - -
mức độ phức tạp tăng dần
+
