Odată cu creşterea numărului de enzime descoperite şi studiate sub aspectele structurii lor chimice şi mecanismului reacţiei catalizate, a apărut necesitatea unei clasificări ştiinţifice a acestora. Astăzi este valabilă clasificarea propusă în 1964 de către Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie care are la bază tipul şi mecanismul reacţiei catalizate (fig. 2). Conform acestui criteriu, enzimele cunoscute până în prezent se clasifică în şase clase principale, enzimele cuprinse într-o clasă catalizând acelaşi tip de reacţie: 1) oxidoreductazele - enzime ce catalizează reacţiile de oxidoreducere ce au loc în organismele vii; 2) transferazele - enzime ce catalizează reacţii de transfer ale unor grupe de atomi ce pot fi şi grupe funcţionale de la un substrat la altul, fără ca aceste grupări să existe libere în timpul procesului; 3) hidrolazele - enzime ce catalizează scindarea diferitelor legături covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă; 4) liazele - enzime ce catalizează reacţii de adiţie a unor grupe de atomi la molecula substratului sau clivarea acestor grupări cu rearanjarea ulterioară a valenţelor; 5) izomerazele - enzime care catalizează diferite reacţii de izomerizare a substratelor; 6) ligazele sau sintetazele - enzime ce catalizează formarea unor noi legături chimice carbon – carbon sau carbon – heteroatom, în majoritatea cazurilor utilizându-se energia stocată în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP. La rândul lor enzimele din fiecare clasă se împart în subclase şi subsubclase, în funcţie de mecanismul de reacţie, natura cofactorului, tipul de legătură chimică din substrat asupra căreia acţionează etc. În cadrul fiecărei subsubclase, enzimele sunt aranjate într-o anumită ordine, în special cronologică (cartea cu nomenclatura enzimelor). Conform acestei clasificări, fiecare enzimă este caracterizată nu numai de o denumire ci şi de un cod specific format din patru cifre: prima cifră reprezintă clasa, a doua subclasa, a treia cifră arată subsubclasa, iar ultima cifră a codului indică numărul de ordine din subsubclasa respectivă. Acest cod este precedat de prescurtarea E.C. (Enzyme Commission). De exemplu, denumirea corectă şi completă a catalazei este H2O2: H2O2-oxidoreductaza (EC 1.11.1.6), iar cea a enzimei cu denumirea trivială dihidroorotaza este L-5,6-dihidroorotat-amidohidrolaza (EC 3.5.2.3). II.2.3.1 Caracterizarea clasei oxidoreductazelor
Din numărul total de enzime cunoscute până în prezent, aproximativ 25 % sunt enzime ce catalizează diferite reacţii de oxidare şi reducere biologică, aparţinând clasei oxidoreductazelor. Acestea sunt implicate, în principal, în procesele de oxidare biologică şi catalizează reacţii bimoleculare:
Aox + Bred
Ared + Box
Denumirea sistemică a oxidoreductazelor se alcătuieşte prin includerea denumirii donorului şi acceptorului de hidrogen urmate de termenul oxidoreductaza (donor:acceptoroxidoreductaza). Atunci când acceptorul de hidrogen este oxigenul, se foloseşte termenul de oxidază. De exemplu, denumirea sistemică a alcooldehidrogenazei este alcool:NAD+ oxidoreductaza (EC 1.1.1.1), catalaza are denumirea sistemică H2O2:H2O2-oxidoreduc-taza (EC 1.11.1.6). În acelaşi timp, Uniunea Internaţională de Biochimie permite şi utilizarea aşanumitelor denumiri de lucru prescurtate: alcooldehidrogenaza, malat - dehidrogenaza etc. O enzimă importantă din această clasă este lactat - dehidrogenaza (L-lactat:NAD+oxidoreductaza EC 1.1.1.27) ce catalizează reacţia de conversie a acidului lactic în acid piruvic: +
NAD COOH H C OH CH3
+
NADH+H
COOH C O L.D.H
D(+)lactat
CH3 piruvat
Această reacţie este implicată în fermentaţiile lactice precum şi în procesul anaerob de degradare a glucidelor prin glicoliză. Determinarea activităţii acestei enzime în sânge este utilizată în practica medicală pentru diagnosticul infarctului de miocard, a hepatitei virale, a anemiei pernicioase etc. Reacţiile enzimatice catalizate de oxidoreductaze care posedă în calitate de coenzimă NAD+ sau NADP+ sunt de obicei reacţii reversibile şi sunt cuplate cu alte reacţii de regenerare a coenzimei. În prima reacţie coenzima, care are şi rol de cosubstrat, se reduce, iar în reacţia cuplată (conjugată) se regenerează forma oxidată a coenzimei: NAD
Gliceraldehid-3-fosfat
+
Acetaldehidã
Alcool-dehidrogenaza
Gliceraldehidfosfatdehidrogenaza
Acid 1-3-difosfogliceric
NADH+H
+
Etanol
Aceste reacţii conjugate prezintă o deosebită importanţă pentru procesele redox ce au loc în celulele vii deoarece permit refacerea continuă a acceptorilor de hidrogen. II.2.3.2 Caracterizarea clasei transferazelor În transformările biochimice catalizate de enzimele aparţinând acestei clase, are loc clivarea unei grupe de atomi R (ce poate fi şi grupare funcţională) din structura substratului A-R şi fixarea acesteia pe cel de-al doilea substrat:
A R + B
transferazã
A +
B R
Reacţiile catalizate de transferaze sunt prin urmare reacţii bimoleculare, în care un substrat joacă rol de donor, iar celălalt rol de acceptor al grupării transferate. Din această cauză, denumirea sistemică a acestor enzime este de tipul donor:acceptor-transferaza. Dintre enzimele cunoscute până în prezent, aproximativ 30% sunt transferaze. Din această clasă de enzime fac parte, de exemplu aminotransferazele, enzime ce catalizează reacţia unui α -aminoacid cu un α -cetoacid, conducând la formarea unui nou aminoacid şi a unui nou cetoacid. Din punctul de vedere al mecanismului de reacţie, această transformare poate fi considerată ca fiind o dezaminare oxidativă a donorului (aminoacidul) cuplată cu aminarea reductivă a acceptorului (cetoacidul) iar aminotransferazele ar putea fi considerate şi ca COOH oxidoreductaze:
COOH
COOH
H – C – NH 2
+
R1
C=O
H – C – NH 2
+
C=O
Aminotransferazã R2
α-Aminoacid I
COOH
R2
α-Cetoacid I
α-Aminoacid II
R1
α-Cetoacid II
II.2.3.3 Caracterizarea clasei hidrolazelor Această clasă conţine aproximativ 24 % din enzimele cunoscute până în prezent, enzime ce catalizează reacţia de scindare a substratului cu participarea apei: S R + H2O
S OH + R H
Deşi reacţiile sunt reversibile, in vivo echilibrele sunt deplasate în sensul hidrolizei, în timp ce procesele inverse au loc, de regulă, pe alte căi metabolice. Reacţii hidrolitice se întâlnesc în aproape toate căile metabolice, hidrolazele participând atât la metabolismul glucidelor, lipidelor şi proteinelor, cât şi în metabolismul produşilor secundari.
Clasificarea hidrolazelor în subclase şi subsubclase se face în funcţie de natura legăturii chimice ce urmează a fi scindată. Pentru hidrolazele implicate în scindarea hidrolitică a diferitelor tipuri de esteri este intrată în uz denumirea generică de esteraze. O esterază foarte cunoscută este lipaza a cărei denumire sistemică este triacilglicerol-acil-hidrolaza (EC 3.1.1.3) şi care este implicată în scindarea hidrolitică a triacilglicerolilor:
CH 2 O CO R1 lipaza CH O CO R2 + 3 H 2O CH 2 O CO R3 triacilglicerol
CH 2 OH CH OH CH 2 OH
R1 – COOH R2 – COOH R3 – COOH
+
acizi grasi ,
glicerol
Spre deosebire de celelalte enzime, lipaza prezintă o particularitate legată de natura substratului asupra căruia acţionează, mai exact a lipidelor care sunt insolubile în apă. In vivo are loc mai întâi o emulsionare a grăsimilor (care în cazul animalelor se realizează cu ajutorul bilei secretată de ficat) şi în felul acesta creşte suprafaţa de contact dintre faza liposolubilă a substratului şi cea hidrosolubilă a enzimei. Din această cauză, viteza iniţială de reacţie este dependentă de numărul de molecule enzimatice adsorbite la interfază, fiind, în general, mică. Ulterior, după formarea primelor molecule de acizi graşi, viteza de reacţie creşte datorită emulsionării mai rapide a substratului, moleculele de acizi graşi având zone cu proprietăţi hidrofobe şi hidrofile (R-COO–). Din aceeaşi clasă fac parte cele două fosfomonoesteraze (fosfataze), alcalină şi acidă cu denumirile sistemice ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim alcalin) (EC 3.1.3.1) şi respectiv ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim acid) (EC 3.1.3.2). Fosfataza alcalină catalizează scindarea hidrolitică a esterilor acidului ortofosforic ai alcoolilor primari, secundari şi ciclici, fenolilor etc., dar nu şi fosfodiesterii. Fosfataza acidă hidrolizează un mare număr de fosfomonoesteri, fosfoproteine şi altele:
CH 2 – OH CH – O – PO 3H2
H2O
CH 2 – OH CH – OH
fosfatazã
CH 2 – OH β - Glicerofosfat
+
H3PO4
CH 2 – OH Glicerol
Aceste două enzime prezintă o importanţă deosebită şi din punct de vedere medical, activitatea lor fiind determinată în sânge în scopul diagnosticării litiazelor biliare şi a diferitelor afecţiuni hepatice, respectiv a unor boli ale prostatei.
Un rol extrem de important în procesul complex de reînnoire a proteinelor structurale îl joacă o serie de proteinaze tisulare reunite sub numele de catepsine. În prezent se cunosc mai multe catepsine notate cu majuscule ale alfabetului latin (A, B, C, D, E etc.) ce se deosebesc între ele după specificitatea de substrat, pH-ul optim de acţiune şi alte criterii. O grupă de enzime proteolitice extrem de intens studiată în ultima vreme o reprezintă caspazele (cysteinil – aspartate – cleaving proteases), cistein-proteinase responsabile de distrugerea progresivă a celulei prin apoptoză. Moartea celulară programată este parte integrată a fiziologiei normale a unui organism. Astfel, în cursul numeroaselor mitoze şi diferenţieri celulare care permit crearea unui organism pornind de la stadiul de ou, este necesară eliminarea celulelor inutile sau potenţial periculoase. Acest fenomen de eliminare selectivă a celulelor este mediat printr-un proces denumit apoptoză (termenul provine de la grecescul α π ο π τ ο σ ι σ
, ce înseamnă „căderea frunzelor”).
Noţiunea de apoptoză a fost introdusă în 1972 de către Kerr şi et al.. pentru a indica o formă de moarte celulară total diferită de necroză atât din punct de vedere morfologic cât şi biochimic. Apoptoza se întâlneşte la toate tipurile de celule vegetale sau animale, uni- sau pluricelulare, până la nivelul mamiferelor superioare. O dereglare de la moartea celulară programată poate sta la originea numeroaselor stări patologice; unele sunt legate de o inhibiţie a apoptozei (cancer, sindrom limfoproliferativ etc), în timp ce altele sunt asociate cu o stimulare a acestui fenomen (SIDA, maladiile neurodegenerative, maladiile auto-imune etc.). În cursul apoptozei, celulele pun în evidenţă un ”mecanism de sinucidere” care se traduce prin numeroase schimbări morfologice: membranele plasmatice se dezorganizează şi exprimă semnale pro-fagocitare alcătuind corpii apoptotici, cromatina se condensează înainte de a fi degradată într-un profil caracteristic numit “treptele scării”. Corpii apoptotici formaţi sunt apoi rapid eliminaţi de către celulele adiacente. Această eliminare este primordială deoarece ea nu permite lăsarea nici unei urme în ţesutul unde survine apoptoza, în particular, previnenind toate necrozele secundare care vor avea drept consecinţă eliberarea aleatorie a conţinutului celular şi va permite astfel limitarea stabilirii unei reacţii inflamatorii. Necroza şi apoptoza. Necroza este considerată ca o moarte celulară dezordonată. În fapt în cursul necrozei celulele acumulează apă astfel încât antrenează liza membranei plasmatice. Această veritabilă explozie celulară conduce la redetaşarea în mediul înconjurător a conţinutului citoplasmatic. Organitele vor avea, de asemenea, tendinţa de a se gonfla, iar ADN-ul nuclear va fi degradat în manieră „aleatorie” de endoglucanaze activate (mai ales serin-proteinaze). În opoziţie cu necroza, apoptoza este considerată ca o moarte celulară „ordonată”, acţionând în
diferite faze. Mai întâi celulele în apoptoză vor fi izolate de alte celule (dispare contactul între celule). Unul din punctele morfologice caracteristice al apoptozei este importanţa condensării simultane a nucleului şi a citoplasmei ce induce o diminuare semnificativă a volumului celular. Mitocondriile celulelor apoptotice vor suferi mai multe modificări majore, dintre acestea amintim detaşarea citocromului c în citoplasmă, diminuarea potenţialului membranar şi modificarea permeabilităţii mitocondriale care permite deschiderea porilor specializaţi. Nucleul se condensează, apoi cromatina este clivată în fragmente regulate de aproximativ 180 pb. Membrana plasmatică va înmuguri şi va conduce la formarea corpilor apoptotici reînchizând o parte din citoplasmă în celulă. În scopul de a facilita recunoaşterea corpilor apoptotici prin fagocitoză, celulele vor semnala starea lor apoptotică graţie schimbărilor de localizare a moleculelor de fosfatidilserină care trec de la o orientare citoplasmatică la una extracelulară. Moartea celulară programată este un proces rapid – câteva ore. Unul din punctele majore ale apoptozei este integritatea membranei plasmatice care nu este niciodată alterată în cursul procesului, ceea ce permite evitarea deversării conţinutului celular şi astfel, prevenirea tuturor deteriorărilor ţesuturilor din jur. Totuşi, inflamarea nu este total absentă în timpul apoptozei (având în vedere externalizarea IL-1 şi IL -18 în mediul înconjurător) însă este vorba de o inflamare regulată. II.2.3.4 Caracterizarea clasei liazelor Din această clasă fac parte enzimele ce catalizează reacţii de rupere a unor legături carbon-carbon sau carbon-heteroatom din molecula substratului, fără participarea apei, cu rearanjarea ulterioară a valenţelor. Pentru majoritatea enzimelor din această clasă, denumirea sistemică se face prin adăugarea termenului liaza la numele substratului asupra căruia acţionează enzima respectivă. Atunci când reacţia inversă este mai importantă din punct de vedere metabolic, sau atunci când s-a demonstrat doar existenţa acesteia, se poate utiliza şi denumirea de sintază (dar nu sintetază). Pentru liazele ce catalizează unele reacţii particulare, sunt utilizate denumirile triviale: decarboxilază, aldolază, dehidratază etc. Dintre enzimele cunoscute până în prezent, liazele reprezintă aproximativ 13 %. Împărţirea liazelor în subclase se face în funcţie de natura legăturii chimice pe care acestea o scindează. Astfel, subclasa 4.1. cuprinde enzimele ce catalizează ruperea legăturilor carboncarbon: decarboxilazele (4.1.1), aldehid-liazele (4.1.2), hidroxiacid-liazele (4.1.3) etc. În mod similar, subclasa 4.2. conţine carbon-oxigen-liazele, subclasa 4.3. - carbon-azot-liazele ş.a.m.d. O categorie importantă de enzime din această clasă o reprezintă aldolazele, enzime ce catalizează diferite reacţii de condensare aldolică. Astfel, fructozo-difosfat-aldolaza, a cărei
denumire sistemică este D-fructozo – 1 , 6 – difosfat – D – gliceraldehid – 3 – fosfat - liaza (EC 4.1.2.13) catalizează o reacţie importantă a căii glicolitice şi a fotosintezei:
P
O CH2 O
CH2 O
P
CH2 O
P
C O
H C O H C OH
+
CH2 OH D-frutozo1,6-difosfat
CH2 O
dihidroxiacetonfosfat
P
D-gliceraldehidfosfat
II.2.3.5 Caracterizarea clasei izomerazelor Această clasă reuneşte aproximativ 3% din enzimele cunoscute până în prezent, enzime ce catalizează diferite reacţii de izomerizare. Procesul catalitic propriu-zis constă în inducerea unor rearanjări interne ale atomilor din molecula substratului în urma cărora au loc modificări geometrice sau structurale. În funcţie de tipul reacţiei de izomerizare catalizată, izomerazele pot fi împărţite în racemaze, epimeraze, cis-trans-izomeraze, tautomeraze etc. Este cunoscut faptul că marea majoritate a organismelor vii conţin monozaharidele aparţinând seriei D, respectiv L-aminoacizii. Deoarece unele microorganisme conţin şi antipozii optici ai acestor compuşi, pentru acestea racemazele joacă un rol deosebit. Astfel, au fost descoperite şi studiate alanin-racemaza (EC 5.1.1.1), metionin-racemaza (EC 5.1.1.2), glutamat-racemaza (EC 5.1.1.3) etc. Două izomeraze extrem de importante pentru participarea vitaminei A în procesul vederii sunt retinal-izomeraza cu denumirea sistemică all-trans-retinal-11-cis-trans-izomeraza (EC 5.2.1.3) şi respectiv retinol-izomeraza, sau all-trans-retinol-11-cis-trans-izomeraza (EC 5.2.1.7) ce catalizează conversia formei trans a retinalului în izomerul 11-cis şi respectiv izomerul trans al retinolului în forma 11-cis. O etapă importantă a secvenţei metabolice Embden-Meyerhof-Parnas o constituie izomerizarea reversibilă a celor două trioze fosforilate rezultate prin scindarea fructozo-1,6difosfatului sub acţiunea aldolazei. Sub acţiunea triozo-fosfat-izomerazei are loc conversia permanentă a dihidroxiaceton-fosfatului în aldehida 3-fosfoglicerică. Denumirea sistemică a enzimei este D-gliceraldehid-3-fosfat-cetol-izomeraza (EC 5.3.1.1).
CH2 O
P
C O CH2 OH dihidroxiacetonfosfat
H
C O
H
C OH CH2 O
P
D-gliceraldehidfosfat
II.2.3.6 Caracterizarea clasei ligazelor (sintetazelor) Această clasă cuprinde aproximativ 5% din enzimele cunoscute până în prezent, liazele catalizând reacţii de formare a unor noi legături carbon-carbon sau carbon-heteroatom. De regulă, aceste reacţii au loc cu consum de energie, ele fiind cuplate cu reacţii de hidroliză ale ATP-ului sau ale altor nucleozidtrifosfaţi. Denumirea sistemică se face prin adăugarea termenului ligaza la numele substratului, sau a termenului sintetaza la numele produsului de reacţie. O grupă importantă de enzime ce fac parte din această clasă o constituie aminoacilARNt-sintetazele, enzime ce catalizează reacţiile de activare ale aminoacizilor din procesul de biosinteză a proteinelor. Aceste enzime prezintă o înaltă specificitate de substrat, existând câte o sintetază pentru fiecare aminoacid proteinogen: tirozil-ARNt-sintetaza sau L-tirozin-ARNttyrligaza (EC 6.1.11), triptofan-ARNt-sintetaza cu denumirea sistemică L-triptofanil-ARNttrpligaza (EC 6.1.1.2), treonin-ARNt-sintetaza sau L-treonil-ARNtthr- ligaza (EC 6.1.1.3) ş.a.m.d. Formarea complexului aminoacil-ARNt este un proces complex ce se realizează în două etape catalizate de aceeaşi enzimă. Procesul debutează prin activarea aminoacidului cu ajutorul energiei din ATP:
PPi
ATP
H2N–CH–COOH
O E – [H2N–CH–C ~ O–AMP]
aminoacil-ARNt -sintetaza
R
R
aminoacid
aminoacil-AMP (complex ES)
Se formează deci complexul hiperreactiv dintre enzimă şi două din cele trei substraturi, adică aminoacidul ce urmează a se activa şi molecula de ATP. Acest complex interacţionează în etapa următoare cu cel de-al treilea substrat care este ARNt – ul specific aminoacidului activat:
O
ARN t
Enzimã
E – [H2N–CH–C ~ O–AMP] R aminoacil-AMP (complex ES)
O
AMP
H2N–CH–C ~ ARN t aminoacil-ARNt -sintetaza
R aminoacil-ARN t
