Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Superiores Zaragoza
Laboratorio de Ciencia Básica III “Extracción y se paración del pigmento vegetal del chile chile guajillo ”
Alumno: Zamora Cisneros Omar Arturo Grupo: 3303 Profesora: Ma. Estela Jiménez Jiménez Encarnación
Resumen.
Se realizó la extracción del pigmento del chile guajillo con cloruro de metileno para, posteriormente, separarlo mediante una cromatografía en capa fina probando distintos disolventes orgánicos. Se escogió el eluyente adecuado y se llevó a cabo la separación de cromatografía en columna.
I ntroducción.
La cromatografía es un método fisicoquímico que permite separar los componentes de una mezcla de solutos por distribución en dos fases, una de las cuales es móvil y la otra estacionaria. Pudiendo servir como fase estacionaria un sólido o líquido, este último debe estar inmóvil sobre un soportador inerte. La fase móvil puede ser un líquido o un gas. Dependiendo de la naturaleza de las fases usadas, la cromatografía puede clasificarse en varios tipos: solido-liquido, liquido-liquido, gas-sólido y gas-liquido, por esta gran diversidad, la cromatografía en las últimas décadas ha adquirido un gran valor, ya que su empleo ha contribuido no solo a la identificación sino que tambien al aislamiento de compuestos químicos o de origen biológico, aun en cantidades muy pequeñas, dichos compuestos generalmente poseen propiedades físicas y químicas muy semejantes, siendo muy difícil por otras técnicas conseguir tales resultados. Por lo que al enfrentarse con el problema de separar una mezcla completamente desconocida lo mejor es emplear un ensayo cromatográfico por medio de la cromatografía en capa fina la cual dará detalles acerca de la complejidad de la mezcla a separar. La cromatografía en capa fina es uno de los métodos analíticos más sencillos ya que se utiliza poca cantidad de muestra pues es sensible en alto frado y requiere de poco tiempo para separar compuestos estructuralmente muy parecidos. Los resultados de la cromatografía en capa fina son muy valiosos, pues ayudan a seleccionar el adsorbente y eluyente adecuados que puedan ser empleados para una separación de cromatografía en columna. Para obtener buenos resultados en la cromatografía en columna se debe seleccionar perfectamente las variables de las cuales depende la separación en bandas de los compuestos de una mezcla. Debido a la gran sensibilidad de estas técnicas son de gran importancia en ciencias químicas, biológicas y médicas, además de utilizarse mucho en la industria. La extracción se basa en la distribución de una sustancia entre dos fases inmiscibles. La constante del equilibrio se define por la ecuación: =
[ ] [ ]
Donde [ ] es la concentración en el equilibrio de la sustancia en la fase A, y [ ] es la concentración en el equilibrio en la fase B. En los procesos de extracción empleados normalmente en química orgánica, una fase es agua y la otra un disolvente orgánico adecuado. Un cambio en el disolvente cambiará la solubilidad en esta fase y en consecuencia alterará el coeficiente de reparto. En general la regla de “lo semejante disuelve a lo semejante” es
una guía adecuada cuando se escoge el disolvente apropiado. La solubilidad de un producto en una fase puede incrementase con la adición de un reactivo que sea capaz de formar un complejo estable y soluble en esta fase. Por el contrario, la solubilidad puede disminuir, en especial fases acuosas, por la adición de sales neutras. Objetivos.- Extraer un pigmento de algún producto natural.
Separar por medio de las técnicas de cromatografía en capa fina y en vegetales.
columna
los pigmentos
Hipótesis.- Se extrae un pigmento vegetal, se aplica el método cromatografía en capa fina y se selecciona el
adsorbente y eluyente correctos, entonces en la cromatografía en columna el extracto se separará. Materiales y reactivos.
Frasco de café pequeño Frasco ámbar Embudo de filtración de tallo corto Anillo metálico Soporte universal Frascos Gerber de boca ancha Tubos de ensayo Tubos capilares Portaobjetos Balanza analítica Pipeta graduada de 1 ml Pipeta graduada de 5 ml Probeta 100 ml Papel aluminio Algodón Pinzas de doble presión Bureta de 50 ml Gradilla Papel filtro Vaso de precipitado de 150 ml Encendedor Jeringa con manguera o propipeta Estufa Matraz bola de 100 ml
Acetato de etilo Acetona Cloroformo Cloruro de metileno Etanol Éter de petróleo Hexano Metanol Silica gel p/capa fina Silica gel p/columna Chile guajillo Sal de mesa
Procedimiento.
Extracción del pigmento
1. Se desvenó y se cortó en pedazos el chile guajillo, luego se pesó 20 g en la balanza analítica. 2. Se colocó el chile guajillo cortado en un frasco ámbar de 250 ml y se vertió 100 ml de acetato de etilo. Se dejó reposar durante 1 día. 3. Se filtró la solución con chile guajillo con la ayuda del soporte universal, anillo metálico, embudo de filtración de tallo corto y el algodón. Los pedazos cortados se desecharon y la solución filtrada se guardó en otro frasco ámbar, cambiando la tapa por un trozo de papel aluminio. Cromatografía en capa fina
1. En el frasco de café, previamente lavado y secado, se preparó la papilla de Silica gel p/capa fina con acetato de etilo al tanteo hasta que se logró una mezcla ligeramente espesa. a. Primero se debe añadir el gel sílice al frasco y al final el acetato de etilo. 2. En el frasco Gerber se agregó 5 ml de uno de los 8 disolventes con ayuda de una pipeta graduada y la jeringa con manguera. 3. Se repitió el paso anterior con los 7 disolventes restantes. 4. El papel filtro se cortó en pedazos y colocó de forma que no llegaran al cuello del frasco y tuviera una ventana para visualizar el interior de la cámara. 5. Se prepararon las placas de capa fina sumergiendo los 8 portaobjetos en la papilla. a. Se sumergen 2 portaobjetos a la vez. b. La capa formada debe tener una forma semitransparente y no debe presentar alguna deformación o imperfección. c. El portaobjetos no debe estar completamente cubierta. Debe tener 3 cm para poder agarrarla. 6. Las 8 placas se colocaron en un papel aluminio y se llevaron a la estufa a una temperatura de 110ºC durante 30 minutos para que se activaran las placas.
7. Se partieron a la mitad los 4 capilares con la ayuda de un encendedor y las puntas se recortaron. 8. Se punteó en una placa 2 veces el extracto, la placa se colocó en una de las cámaras de elución. a. El punto debe tener una distancia de 1 cm alrededor de este. 9. Se repitió el paso anterior con las 7 placas restantes. 10. Se retiró la placa de la cámara antes de que el disolvente llegará al límite de la capa fina. 11. Las placas se ubicaron en una hoja de papel para comparar la eficacia de cada disolvente. 12. Con los resultados del paso anterior, se preparó una mezcla de 100 ml con los disolventes éter de petróleo y hexano (50 ml de cada uno), se guardó el eluyente en un frasco. Cromatografía en columna
1. Se montó el equipo de cromatografía en columna (soporte universal, pinzas doble presión y bureta). 2. El pedazo de algodón fue colocado al fondo de la bureta, antes de la llave de paso de la bureta; se vertió un pequeño volumen de Hexano y se eliminó la burbuja de aire. 3. En un matraz bola de 100 ml se colocó 6 g de Silica gel para columna y se disolvió con Hexano, calculando que rebasara el soluto 1 cm arriba. 4. La mezcla fue vertida en la bureta, con ayuda de un embudo, al mismo tiempo que era agitada para que no se solidificara. Se abrió la llave de paso para dejar pasar el disolvente y reutilizarlo para disolver los restos del soluto dentro del matraz bola. 5. Se repitió el paso 4 hasta que la Silica gel para columna llene ¾ de la bureta. 6. En la bureta, se colocó 1 cm de sal de mesa, con ayuda de la graduación de la bureta y se aplanó con un agitador de vidrio. 7. Con ayuda de una pipeta graduada, se tomó 1 ml de extracto para colocarlo encima de la sal de mesa, luego se llenó la bureta con el eluyente. 8. Se esperó a que el extracto bajara por la bureta, hasta el punto de tocar el algodón; se abrió la llave para dejar caer la muestra (eluato) en un tubo de ensayo, se recolectó 1 ml por muestra. a. Se obtuvieron 20 muestras. 9. Cada muestra se punteo en las cromatoplacas con extracto original de un lado y del otro lado el eluato y se observó si hubo un arrastre individual de cada muestra comparada con la original. Las cámaras de elución tenían el eluyente escogido.
Resultados.
Ilustración 1. Cromatografía en capa fina.
Ilustración 2. Muestras recolectadas de la columna.
Análisis de resultados.
Los resultados obtenidos en la capa fina se obtuvieron sin ningún problema, el error que se tuvo fue el de elegir los disolventes incorrectos para usar como eluyente, debido a que se confundió la información acerca de la polaridad de los disolventes. Al momento de realizar la cromatografía en columna, se observó que el extracto bajaba por el adsorbente pero solo el color amarillo, mientras que el color rojo seguía inmóvil; esto es debido a la mala elección del eluyente y que el extracto haya sido guardado por bastantes días provocando que se echara a perder. Los primeros eluatos o muestras obtenidos tenían una fuerte coloración amarillenta pero mientras más recolectábamos, más incolora se tornaban los eluatos, forzándonos a aumentar el volumen de las muestras de 1 ml a 3 ml. Al momento de colocar las placas en las cámaras, se tuvo que puntear cada placa 15 veces, debido a que al sacar las placas de las cámaras no se apreciaba arrastre alguno. Conclusiones.
La hipótesis no se logró debido a la inexperiencia acerca de la polaridad de los disolventes. Se logró aprender los métodos de extracción y los métodos cromatográficos en capa fina y en columna.
Bibliografía. Brewester, R.Q., et at; “Curso Práctico de Química Orgánica Experimental”. Keese R.; “Métodos de Laboratorio para Química Orgánica”.
Pavía, D.L., et al; “Introduction to Organic Laboratory Technique, A Contemporary Approach”. Pickering, W.F., “Química analítica cuantitativa”. Pasto, D.J., “Determinación de estructuras orgánicas”
Cuestionario.
1.- A que grupos de compuestos pertenece(n) el(los) pigmento(s) R: Carotenoides y xantofilas 2.- ¿A qué se debe que estos compuestos sean coloridos? R: Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados y rojos presentes en los alimentos vegetales. Entre mayor sea la intensidad del color, mayor será el contenido de carotenoides. Xantofilas: son compuestos químicos pertenecientes al grupo de los carotenoides que poseen uno o más átomos de oxígeno en su estructura. Se encuentran de forma natural en muchas plantas. Estos pigmentos, más resistentes a la oxidación que las clorofilas, proporcionan sus tonos amarillentos y parduzcos a las hojas secas. 3.- Explicar la diferencia entre cromatografía de adsorción y de partición. R: La cromatografía de adsorción depende de los equilibrios de adsorción-desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria (solida) y la fase móvil (liquida o gaseosa). Es una técnica adecuada para la separación de compuestos de polaridad baja y media. La cromatografía de partición está basada en la separación de una mezcla de sustancias mediante el reparto existente entre la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria (liquido soportada sobre un sólido adecuado). Esta técnica es utilizable para la separación de mezclas de compuestos de polaridad media y alta. 4.- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en comparación con la cromatografía en columna?
R: Cromatografía en columna: Las separaciones en la cromatografía en columna pueden realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. El estado físico del adsorbente ha de ser de tal manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de disolvente a través de ella. Se debe seleccionar perfectamente las variables de las cuales depende la separación en bandas de los compuestos de una mezcla. Tiene fines cuantitativos. Cromatografía en capa fina: En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el soporte o bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. Se utiliza poca cantidad de muestra y requiere poco para separar compuestos estructuralmente muy parecidos. Tiene fines cualitativos (pureza y velocidad de reacción). 5.- ¿Explicar la diferencia(s) que existe(n) entre el adsorbente utilizado en cromatografía en capa fina y en columna. Hacer una lista de ellos en orden creciente de actividad.
R: En columna puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la celulosa, gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para separaciones por adsorción y de intercambio iónico). o o o o o o o o o
Azúcar, almidón Inulina Talco Carbonato sódico Carbonato potásico Carbonato cálcica Magnesia Gel de Sílice activada Alúmina activada
6.- Hacer una lista de los eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna y cromatografía en capa fina en orden creciente de polaridad.
Hexano Éter de petróleo Benceno Tolueno Éter etílico Cloroformo Acetato de etilo Cloruro de metilo Dicloroetano Acetona Etanol Metanol
7.- Hacer una lista de capacidad de adsorción de los grupos funcionales de los compuestos orgánicos. R: 8.- ¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca? R: Se aplica calor, por ejemplo una flama, a la mitad de un capilar y se estira de los lados para separarlo. Se rompe un pedazo de la punta para que tenga un pequeño orificio y poder agarrar la muestra y puntear. 9.- ¿Por qué es necesario que la cámara de elución esté saturada de los vapores del eluyente? R: Para facilitar el arrastre de los pigmentos sobre la cromatoplaca. 10.- Explicar cada uno de los siguientes términos: Eluyente: Solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un compuesto que se quiere separar de
otra fase. Elución: se produce por el flujo de una fase móvil a través de la fase estacionaria.
Elución fraccionada: Se utilizan sucesivamente distintos disolventes, cada uno de los cuales es un eluyente más
enérgico que el anterior. Este procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbid as. Adsorción: Retención de una sustancia por otra cuando están en contacto. Adsorbente: Es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en
corrientes líquidas o gaseosas. Se caracteriza por una alta superficie específica y por su inercia química frente al medio en el que se va a utilizar. Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la concentración de la sustancia en la
solución, la temperatura y la polaridad de la sustancia. Actividad por el adsorbente: Es que la sustancia ceda a la capacidad de capilaridad del adsorbente y eluya a través
de él. 11. ¿Cómo se clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria? Naturaleza de fase estacionaria
Líquido Naturaleza de fase móvil
Clasificación
Líquido-líquido: partición Líquido-sólido: adsorción, cambio iónico, exclusión, afinidad.
Gas
Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS)
12.- ¿Cuál es la función de la fase móvil y como se lleva a cabo la separación?
R= Su función es eluir los componentes de la mezcla a separar a través de la fase estacionaria. La cromatografía de adsorción se lleva a cabo mediante el uso de una fase estacionaria donde se observará la elución de los componentes de la mezcla, los cuales serán eluidos por el disolvente, que es la fase móvil. 13.- ¿Cómo se prepara la papilla para la c.c.f.?
R= Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta hacer polvo la Silica, luego se añade el disolvente. También se puede hacer en un vaso de precipitados y con una varilla de vidrio, agitando constantemente hasta formar la papilla. 14.- ¿Cuándo es conveniente activar una placa y cómo se activa?
R= Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor depende del tipo de separación que se requiere para compuestos hidrófilos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente suficiente; para los compuestos hidrofóbicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso. Las placas de óxido de aluminio y de gel de sílice con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Y después ser activadas en un horno a 100°C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa deberán secarse al aire libre durante 30 min. y activarse al horno durante 10 min. a 105°C. 15.- ¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.F.?
R= No debe ser espesa ni muy aguada, debe deslizarse solo por la placa al momento de prepararla. 16.- Al comparar los R F de dos componentes se encontró que eran iguales, ¿podría pensarse que se trata del mismo compuesto? Explíquese.
R= Si, esto se concluye debido a que si ambos componentes eluyen de la misma manera, significa que tienen una polaridad muy semejante, por lo tanto, podría inferirse que se trata del mismo componente. 17.- Existirá una relación entre la cantidad de adsorbente y las dimensiones de la columna? Explíquese.
R= Entre más grande sea una columna, más adsorbente se necesitará, esto para observar mejor la separación de los componentes; además de necesitar más disolvente para continuar la elución y evitar la sequedad del sistema. 18.- ¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna?
R= La polaridad del eluyente debe ser mayor 19.- ¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografía en columna?
R= En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A. Hexano
Éter de petróleo
Acetato de etilo
Cloruro de metileno
Benceno
Tolueno
Dicloroetano
Acetona
Éter etílico
Cloroformo
Etanol
Metanol
20.- ¿A qué se le llama frente del eluyente?
R= Es la línea donde acaba la elusión, si se rebasa dicha línea se corre el riesgo de que los componentes separados se esparzan a lo largo de la parte posterior de la placa. 21.- ¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en columna?
R= Se controla con la llave de la bureta y que el tiempo entre gota y gota sea más de 6 segundos, se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensayo, a los que se les denominará eluatos. 22.- ¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatografía? En caso de que se fracture ¿qué se recomienda hacer?
R= Porque de no ser así la fase estacionaria se contraería y agrietaría. Se debe rehidratar con más eluyente si esto ocurre. 23.- ¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía vayan lo más secas posible (libres de agua)?
R= Para que no interfiera el agua con la elución, por medio del disolvente, de los componentes de la muestra. 24.- Al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la mínima cantidad de disolvente ¿por qué?
R= Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es de 3 a 4mL/min. en una columna de 40 cm de altura aprox. 25.- ¿Qué pH presenta la alúmina? Mencione los tres casos.
R= Presenta tres pH: alúmina ácida pH de 4.5, alúmina básica pH de 10.0 y alúmina neutra pH de 8.0. 26.- ¿Por qué cuando se usa alúmina como adsorbente no se recomienda usar acetona como eluyente?
R= Porque se desnaturaliza y queda pegada en las paredes de la columna. 27.- ¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de una placa preparativa?
R= Las separaciones en capa fina características se realizan en placas de vidrio o plástico que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente divididas, esta capa constituye Ia fase estacionaria. Las partículas son semejantes a Ias de Ia cromatografía en columna. Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas simplemente. 28.- ¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en placa preparativa?
R= La elección de un eluyente ideal para cromatografía en columna. 29.- ¿Qué diferencia existe entre C.C.F. y cromatografía en placa preparativa?
R= La preparativa se emplea generalmente para elegir un eluyente o mezcla de eluyentes ideal para cromatografía en columna. La analítica ya cuenta con un eluyente ideal y registra R x, es decir, se analiza la elusión de los componentes para arrojar un valor numérico final. 30.- En forma general ¿Cómo se clasifican los reveladores en forma general?
R= Químicos y físicos. 31.- ¿Cuando una sustancia orgánica no se revela con I 2 o luz UV, ¿qué otros reveladores pueden usarse para observar la sustancia?
R= Con reveladores químicos específicos para los componentes separados.
