Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas La histología estudia histología estudia la estructura microscópica de tejidos, células, órganos y sistemas. El cuerpo está compuesto de células, matriz intercelular y líquido extracelular (líquido tisular). El líquido extracelular, derivado del plasma, transporta nutrientes, oxígeno y moléculas de señalamiento hacia las células, u desde elles transporta productos de desecho y el dióxido de carbono hacia la sangre y los vasos linfáticos.
Microscopía de luz Preparación de los tejidos Las diversas técnicas histológicas pretenden conservar lo más posible el estado natural en vivo de los fijación, deshidratación y aclaramiento , inclusión en un medio estable, tejidos. Las etapas incluidas son fijación, sección en cortes delgados, montaje y tinción. Fijación La fijación con sustancias químicas retarda las alteraciones tisulares subsecuentes a la muerte y conserva formalina amortiguada. Estas sustancias la configuración normal de los tejidos. El fijador más común es la formalina permiten el entrecruzamiento de las proteínas y, por tanto, conservan una imagen del tejido similar al vivo. Deshidratación Deshidratació n y aclaramiento Por su alto contenido de agua, el tejido debe ser deshidratado deshidratado con una serie gradual de baños de alcohol, comenzando con alcohol al 50% hasta alcanzar el alcohol al 100%. Posteriormente, el tejido se aclara con xileno, una sustancia miscible en parafina que lo torna transparente. Inclusión incluirse en un medio apropiado. Para la Para poder distinguir entre sí las células, el tejido debe incluirse microscopía de luz, el medio habitual de inclusión es la parafina. El tejido se coloca en un recipiente con parafina fundida hasta que se infiltra por completo. Posteriormente, se forma un bloque de parafina que incluya al tejido. Sección El bloque de tejido se secciona con secciona con un micrótomo. Para la microscopía de luz, el grosor de cada corte fluctúa entre 5 y 10 μm. Las muestras congeladas en nitrógeno o congeladas rápidamente en un criostato se seccionan a temperaturas bajo cero con una hoja de acero enfriada.
Montaje y tinción Los cortes se montan en portaobjetos de vidrio recubiertos con algún adhesivo. Para poder distinguir sus distintos componentes, el tejido debe teñirse. La tinción para microscopía de luz emplea principalmente colorantes hidrosolubles, por lo que primero debe eliminarse la parafina del corte y rehidratarse el tejido para poder teñirlo. Ya teñido, el corte vuelve a deshidratarse para poder montarlo definitivamente en un cu breobjetos. Los colorantes histológicos se agrupan en tres clases: Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales en ellos Los colorantes más comunes son hematoxilina y eosina (H y E). La hematoxilina es una base que tiñe de azul los componentes ácidos de la célula (el núcleo, rico en ADN y ARN, y las regiones con abundantes ribosomas son elementos basófilos que se tiñen de azul oscuro). La eosina es un ácido que tiñe de rosa los componentes básicos de la célula ( estos componentes acidófilos abundan en el citoplasma, que se t iñe de rosa).
Algunos colorantes, como el azul de toluidina, se polimerizan cuando se exponen a concentraciones altas de polianiones en el tejido. Estos agregados tienen un color diferente al de sus monómeros. El azul de toluidina, por ejemplo, tiñe de azul los tejidos, excepto los que son ricos en polianiones (como la matriz cartilaginosa y los gránulos de las células cebadas), que se tiñen de púrpura. Un tejido o componente que muestra metacromasia se denomina metacromático .
Microscopía de luz El microscopio de luz emplea una serie de lentes que amplifican las imágenes. La luz, proveniente de una bombilla eléctrica, se concentra en un haz enfocado por la lente condensadora. El haz de luz atraviesa desde abajo el tejido y penetra en una de las lentes del objetivo; estas lentes están asentadas en una torreta movible localizada arriba del espécimen. Generalmente se cuenta con cuatro lentes objetivos, que proporcionan amplificaciones baja (4x), media (10x), alta (40x) y con aceite (100x). La imagen de las lentes del objetivo se amplifica adicionalmente en un factor de 10 por las lentes del ocular, consiguiendo aumentos totales de 40, 100, 400 y 1,000. Las lentes del ocular enfocan la imagen resultante en la retina del ojo. La imagen proyectada en la retina está invertida de derecha a izquierda y al revés. La calidad de una imagen también depende de la resolución de las lentes, su capacidad para mostrar la separación de dos objetos. La calidad de una lente depende de la proximidad de su resolución al límite teórico de 0.25 μm, determinado por la longitud de onda de la luz posible.
Interpretación de cortes microscópicos Los cortes histológicos, bidimensionales, deben interpretarse como cortes tridimensionales.
Procedimientos avanzados de observación Histoquímica Los métodos histoquímicos y citoquímicos permiten localizar constituyentes químicos específicos de tejidos y células. Estos métodos aprovechan la actividad enzimática, reactividad química y otros fenómenos fisicoquímicos del elemento en cuestión. Las reacciones de interés se evidencian por la formación de precipitados coloreados insolubles. Una reacción histoquímica emplea el ácido peryódico de Schiff (PAS) , que forma un precipitado magenta con moléculas ricas en glucógeno y carbohidratos. La histoquímica permite localizar enzimas mostrando el producto de la reacción enzimática y no la enzima misma. El reactivo promueve que el producto se precipite en el sitio de reacción y se reconozca como un depósito metálico o de color.
Inmunocitoquímica La inmunocitoquímica permite ubicar con más exactitud diferentes enzimas y macromoléculas. Para esto debe desarrollarse un anticuerpo contra la molécula a localizar y éste debe marcarse con un colorante fluorescente (fluorosceína o rodamina). Existen dos métodos de marcado con anticuerpo: directo e indirecto. En el método directo se marca el anticuerpo contra la molécula con un colorante fluorescente. Luego, se hace reaccionar el anticuerpo con la macromolécula y se observa el complejo resultante con un microscopio de fluorescencia. En el método indirecto, más sensible que el directo, se prepara un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el anticuerpo primario para la molécula de interés. Una vez que el anticuerpo primario reacciona con el antígeno, la preparación se lava para eliminar el anticuerpo no unido; posteriormente se añade el anticuerpo marcado para que reaccione con el complejo antígeno-a nticuerpo. Esto forma un complejo secundario visible con microscopía de fluorescencia. La inmunocitoquímica puede emplearse en la microscopía electrónica si se marca el anticuerpo con ferritina, una molécula electrodensa, en lugar de un colorante fluorescente.
Autorradiografía La autorradiografía (radioautografía) permite localizar e investigar una secuencia temporal de fenómenos. El método requiere la incorporación de un isótopo radioactivo, generalmente tritio ( 3H), en el compuesto estudiado. Después de inyectar el compuesto radiomarcado en un animal se obtienen especímenes de tejido a intervalos de tiempo determinados. El tejido es procesado en la forma usual y se coloca en un portaobjetos que, en lugar de sellarse con un cubreobjetos, se recubre con una delgada capa de emulsión fotográfica. El tejido se coloca en una caja oscura durante algún tiempo para que las partículas emitidas del isótopo radioactivo expongan la emulsión sobre los sitios en los que se localiza el isótopo. La emulsión se revela como una fotografía y se dejan gránulos de plata sobre sus porciones expuestas. Posteriormente, el espécimen se sella con un cubreobjetos y se observa con un microscopio de luz. Los gránulos de plata aparecen sobre las regiones que incorporaron el compuesto radiactivo.
Microscopía electrónica En los microscopios de luz, las lentes enfocan luz visible (un haz de fotones). En los microscopios electrónicos, los electromagnetos enfocan un rayo de electrones. La longitud de onda de un haz de electrones es mucho más corta que la de la luz visible, por lo que, en teoría, los microscopios electrónicos deberían tener un poder de resolución de 0.005 nm. En la práctica, la resolución del microscopio electrónico de transmisión (MET) es de ~0.2 nm, y la del microscopio electrónico de barrido (MEB) se aproxima a 10 nm. Los microscopios electrónicos modernos pueden amplificar hasta 150,000 veces un objeto.
Microscopía electrónica de transmisión Los cortes para microscopía electrónica de transmisión se preparan siguiendo las etapas de la técnica histológica para microscopía de luz. No obstante, el poder de resolución mayor del ME requiere entrecruzamientos proteicos más finos y específicos, por lo que deben usarse fijadores especiales, como las disoluciones amortiguadas de glutaraldehído, paraformaldehído, tetróxido de osmio y permanganato de potasio. Estos fijadores, además de preservar finos detalles, actúan como colorantes electrodensos. La inclusión se realiza en medios como la resina epóxica, que permiten obtener cortes ultradelgados, de 25 a 100 nm, que no absorben el haz de electrones. Los haces de electrones salen del cátodo, un filamento de tungsteno, hacia el ánodo, una placa metálica con un agujero central. Una carga diferencial de unos 60,000 voltios colocada entre el cátodo y el ánodo proporciona a los electrones que atraviesan el agujero del ánodo una elevada energía cinética.
El haz de electrones se enfoca en el espécimen mediante electromagnetos, análogos a las lentes condensadoras. Los metales pesados que tiñen los tejidos y se precipitan preferencialmente en membranas lipídicas reducen la energía cinética de los electrones que interactúan con el tejido. Cuanto más pesado sea el metal que encuentra un electrón, menos energía será retenida. Los electrones que atraviesan el espécimen se someten a los campos electromagnéticos de varios electromagnetos adicionales, que enfocan el haz en una placa fluorescente. Conforme los electrones chocan con la placa, su energía cinética se convierte en puntos de luz, cuya densidad es directamente proporcional a la energía cinética del electrón. La placa fluorescente te puede sustituirse con una película sensible a electrones, que produce un negativo a partir del cual pueden imprimirse fotomicrografías en blanco y negro.
Microscopía electrónica de barrido El MEB, empleado para observar la superficie de un espécimen sólido, muestra una imagen tridimensional del objeto. El espécimen se prepara de una forma especial que permite depositar en su superficie una capa delgada de un metal pesado, como oro o paladio. Conforme el haz de electrones explora la superficie de la muestra, algunos se reflejan (electrones retrodispersos) y otros se expulsan (electrones secundarios) desde la capa de metal pesado. Los electrones retrodispersos y secundarios son capturados por detectores de electrones y se interpretan y muestran en un monitor como una imagen tridimensional que puede fotografiarse o digitalizarse.
Técnica de fractura por congelación (criofractura) Las estructuras lipídicas se revelan mediante fractura por congelación (criofractura) . Los especímenes congelados son tratados con criopreservadores que evitan el daño mecánico. Conforme la hoja de corte fría choca con el espécimen congelado, se producen fracturas a lo largo de planos de segmentación, regiones de menor unión molecular. La fractura suele ocurrir entre las hojas interna y externa de la membrana. La cara de la fractura se recubre en un ángulo con platino y carbón evaporados: esto forma acumulaciones de platino sólo en un lado de la proyección, generando una réplica de la superficie. Posteriormente, el tejido es digerido y la réplica se examina con el MET. Este método permite observar proteínas transmembranales.
