Biljke iz staklenke – kultura biljnih tkiva i stanica “in vitro”
Kultura biljnih tkiva i stanica “in vitro” (kultura u staklu) vrlo je zanimljiva metoda vegetativnog razmnožavanja bilja, pri kojoj se iz sitnih djelova tkiva ili stanica mogu uzgojiti minijaturni izdanci ili biljčice. Ova metoda zasigurno će oduševiti svakoga tko se bavi razmnožavanjem bilja, bilo profesionalno ili iz hobija, a ima mnoge prednosti u odnosu na proizvodnju presadnica u plasteniku. Na vrlo malom prostoru moguće je proizvesti veliki broj sadnica, a od samo jedne majčinske biljke moguće je proizvesti i do 20 milijuna sadnica. Ušteda energije u odnosu na grijani plastenik je velika, jer se sadnice slažu na police te je klimatizirani prostor maksimalno iskorišten. Metodom razmnožavanja biljaka, koje su dobivene izoliranjem meristemskog tkiva iz vršnih pupova, moguća je proizvodnja sadnog materijala oslobođenog patogenih
klica, posebice virusa koji su danas vrlo veliki problem u npr. voćarstvu ili vrtlarstvu. Posebno je zanimljivo što se na ovaj način mogu uzgojiti mnoge biljne vrste kojima u prirodi prijeti izumiranje, čime bi se moglo pridonijeti očuvanju biološke raznolikosti ukoliko bi to dozvolile i potaknule nadležne institucije. Metoda kulture tkiva i biljnih stanica “in vitro”, koristi se za vegetativno razmnožavanje brojnih biljnih vrsta, posebno onih koje stvaraju malu količinu sjemena, čije sjeme ima slabu klijavost ili onih koje se teško razmnožavaju vegetativnim putem. Primjerice, orhideje je umjetno moguće razmnožiti jedino na ovaj način (iz sjemena). One stvaraju velike količine sjemena ali u prirodi njihovo sjeme može klijati samo u simbiozi s gljivama. Simbioza im je potrebna zbog toga, što sjeme orhideja nema ili ima vrlo mali endosperm te pomoću gljiva dobivaju hranjiva potrebna za klijanje. In vitro metodom im hranjiva podloga može nadoknaditi potebne hranjive tvari.
Ovom tehnologijom razmnožavanju se razne ukrasne biljke poput gerbera, ruža, ukrasnog drveća i grmlja, sobnog i akvarijskog bilja i voćaka, a može služiti i za dobivanje nekih kompleksnih spojeva, koje je teško i skupo dobiti kemijskim putem. Zainteresirani za ovu vrstu uzgoja, posjetili smo laboratorij za in vitro uzgoj bilja, mladog direktora tvrtke Hortilab d.o.o. Vilima Eleza. Vlastitim trudom, sa puno volje i znanja, u podrumu obiteljske kuće uredio je prekrasan mali laboratorij za razmnožavanje bilja „in vitro“ tehnologijom. Laboratorij je osmišljen vrlo jednostavno, praktično i funkcionalno. U svom laboratoriju trenutno proizvodi 15 biljnih vrsta, sa preko 40 raznih sorti. U uzgoju ima 6 vrsta ukrasnih, sobnih biljaka i egzota kao što su muholovke, orhideje, tilandsije i akvarijsko bilje, 7 vrsta vrtnih ukrasnih biljaka, npr. mini ruža, gerbera i više od 12 sorti krizantema. U uzgoj uvodi stalno nove biljne vrste te mnogo ulaže u razvoj i eksperimentalnu proizvodnju s ciljem stručnog usavršavanja. Posebno su nam se svidjele minijaturne muholovke i orhideje te mini ružice i dipladenije. Ljubazni domaćin potrudio se objasniti nam i
pokazati tehnologiju “in vitro” proizvodnje, a imali smo i priliku prisustvovati proizvodnom procesu. Proces proizvodnje izgleda ovako: Biljke se pripremaju za uvođenje u “in vitro” kulturu. Iz sitnih dijelova biljaka (eksplantata) u kontroliranim uvjetima, uzgajaju se male presadnice na hranjivoj podlozi koja omogućuje njihov normalan rast i razvoj. Ovaj postupak se naziva mikrorazmnožavanje. Prvo slijedi faza umnožavanja, zatim ukorjenjivanja. Presadnice se može proizvesti iz pojedinačnih stanica (nastaje kalusno tkivo, kojem pomoću biljnih hormona potičemo rast), iz adventivnih izdanaka, iz meristemskog tkiva vršnih pupova ili stolona. Kako je podloga povoljna za razvoj velikog broja patogena, treba paziti da pri rukovanju sa sadnim materijalom uvijek vladaju potpuno sterilni uvjeti. Postupak: Prvo pripremamo hranjivu podlogu za razmnožavanje budućih presadnica. Kemijski sastav podloge se razlikuje ovisno o biljnoj vrsti. Hranjiva podloga sadrži u pravilu: makro i mikroelemente, organske tvari (npr.saharozu), vitamine, biljne hormone i agar. Omjer biljnih hormona bitan je, jer utječe na formiranje i razvoj stanica izdanka, korijena ili kalusnog tkiva. Hranjiva podloga za razmnožavanje sadrži fitohormon citokinin koji pospješuje stvaranje postranih pupova. Sastojke miješamo prema određenoj recepturi te ih zagrijavamo do temperature 95-98 º C. Mjerimo pH vrijednost otopine koja za većinu vrsta treba iznositi oko pH 5-6 te vršimo korekcija pH dodavanjem kiseline ili lužine prema potrebi.
Pripremljenu otopinu razlijemo u dno staklenki, koje nakon toga složimo u uređaj za sterilizaciju (autoklav).
Nakon provedene sterilizacije pripremamo majčinske biljke za uvođenje u kulturu “in vitro”. Odabiremo sortno čiste i zdrave biljke te pripremamo početni material za razmnožavanje (eksplantat).
Ako želimo proizvesti presadnice iz meristemskog tkiva vegetacijskog vrha prvo, odabrane dijelove biljke podvrgavamo površinskoj sterilizaciji. Nakon toga se vrši izolacija meristemskog tkiva vegetacionog vrha u laminaru, koji osigurava sterilne uvjete. Izdvojen eksplantat brzo se prebacuje na pripremljenu hranjivu podlogu, kako bi se izbjeglo isušivanje tkiva. Staklenke se slažu u klima komoru u kontrolirane uvjete (temperature, vlage i svjetlosti) te u njoj započinje proces razmnožavanja.
Nakon određenog vremena biljke se vade iz staklenih posuda, čiste od medija i dijele, kako bi se mogle staviti na ukorjenjivanje. Priprema se nova hranjiva podloga, za ukorjenjivanje, koja sadrži hormon auksin. Auksin zaustavlja postrani rast i razmnožavanje biljke, a potiče stvaranje korijena. Hranjiva otopina se ulijeva u nove staklenke te se u svaku presađuje po nekoliko biljaka. Staklenke se zatvaraju i ponovo vraćaju u klima komoru. Aklimatizacija: Kada biljčice narastu, moraju se pripremiti za uzgoj u vanjskim uvjetima (in vivo). Biljke se čiste od hranjive podloge, prenose u plastenik te se presađuju u kontejnere u dezinficirani supstrat, uz zaštitu od širenja vektora zaraza. Unose se u male plastične tunele zaštićene od svjetlosti u kojima vladaju uvjeti visoke relativne vlage zraka, oko 95 %, koju postižemo uređajem za fino orošavanje i temperature od oko 25°C. Presadnice se postepeno privikavaju na smanjenje relativne vlažnosti. Prvi dan se izlažu svjetlosti samo sat vremena, a svaki sljedeći dan se biljke izlažu nešto dužem periodu osvijetljenosti kako bi se privikle na prirodno osvjetljenje. Relativna vlaga se prati uz pomoć higrometara i postupno se smanjuje tijekom desetak dana. Aklimatizacija traje 6 – 12 tjedana, a nakon toga su biljke spremne za život u “in vivo” uvjetima. Oslobađanje od virusa: Biljke je moguće od virusa osloboditi kombinacijom termoterapije i mikrorazmnožavanja, no termoterapija nije uvijek potrebna. Tehnologija oslobađanja sadnog materijala od virusa zasniva se na činjenici, da se virusi ne nalaze u svim dijelovima biljke. Vršni pup (meristem) gotovo nikada nije zaražen. Meristemsko tkivo vršnog pupa se izdvaja te se iz njega, na hranjivoj podlozi može uzgojiti mlada biljka.
S obzirom da su virusi termolabilni i da se najvećim dijelom uništavaju na temperaturama od 37- 38º C, biljke je potrebno oko 21 dan izložiti navedenoj temperaturi uz regulaciju relativne vlage zraka (tzv. termoterapija). Nakon što smo se upoznali sa procesima proizvodnje kulture biljnih tkiva i stanica “in vitro”, zahvaljujemo direktoru tvrtke Hortilab d.o.o. Vilimu Elezu što je odvojio vremena za nas i pokazao nam, kako se iz jednog običnog podruma, može uz puno volje, rada i kreativnosti napraviti fantastičan laboratorij. S obzirom da se uz vođenje laboratorija, bavi i prodajom i montažom opreme za navodnjavanje, sustavima za kontrolu prihrane u hidroponskim i kontroliranim uvjetima, uvozom i prodajom raznih vrsta mineralnih gnojiva, kemikalija za poljoprivredu, biljnih hormona, zaštitnih sredstava i ostale opreme za poljoprivredu, sigurna sam da ćemo o njemu još puno čuti i pisati.
