Microbiologie 2
Chapitre 2 : La bactérie. I. Composition chimique. 1. L’organisme. Escherichia coli : On récupère une quantité de bactéries de l’ordre de 100 mg (par filtration ou par centrifugation). Les 100 mg forment une masse compacte, une pâte. On dessèche cette pâte et on découvre qu’il y avait 70% d’eau. Maintenant que l’on connaît la masse sèche, on peut peser les différents éléments. Carbone Oxygène Azote Hydrogène Phosphore Potassium Soufre Calcium Magnésium Chlore Fer Autres
% poids sec 50 20 14 8 3 2 1 0.5 0.5 0.5 0.2 0.3
Cumul 50 70 84 92 95 97 98 98.5 99 99.5 99.7 100
L’analyse organique d’une espèce bactérienne… Dépend de conditions de croissance et de l’état de croissance. Page 8 poly. Toutes les bactéries on en commun un plan d’organisation cellulaire qui leur est particulier = procaryote. Les procaryotes n’ont pas e noyau différencié (= pas de membrane nucléaire). Les bactéries étaient analysées sur le plan biochimique, absence ou présence de x. Le problème des procaryotes est qu’il n’y a pas de reproduction sexuée. La notion est donc beaucoup plus difficile à mettre en place. On arrive tout de même à mettre en place des espèces. Espèces = grand nombre d’isolats naturels qui vont présenter des caractéristiques ou caractères identiques. Isolats = souches. Un très grand nombre d’isolats = espèce. L’espèce est : - une donnée artificielle crée par l’Homme vrai et faux. - donnée très judicieuse et valide qui a une réelle signification physiologique et naturelle. Des virus vont venir attaquer les bactéries = bactériophages.
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Microbiologie 2 La majorité des mêmes isolats auront les mêmes types de phage. Malgré le continuum évolutif, la notion d’espèce est tout de même valable chez les bactéries. La notion de souche pose problème. Souche = toues les bactéries d’une même espèce qui possèdent quelques différences. Mais les mutants créer en génétique sont aussi appelés mutants. Il existe donc 2 définitions différentes : - isolats naturels d’une même espèce avec quelques différences. - résultat du travail des chercheurs qui ont créé des mutants. En général, on donne des numéros de souches lorsque ce sont des mutants. L’évolution est continue. Les cultures prolongées provoquent des mutations que l’on ne souhaitait pas. Prolongé = changer de milieu tous les 15j par exemple. Il faut trouver un mode de conservation des bactéries qui limite la croissance de bactéries pour limiter les mutations. 2 méthodes utilisées : - lyophilisation des souches. - placer les souches à basse température (-80°C) avec un cryoprotecteur. 2. Le milieu. Les bactéries sont unicellulaires et bien trop petites pour contrôler le milieu extérieur. Tout un ensemble de mécanismes vont leur permettre d’ajuster leurs constituants cellulaires en fonction du milieu extérieur (pH, osmolarité…). Ces mécanismes vont leur permettre de percevoir le milieu extérieur et sont indispensables à la vie. Pour une même bactérie, dans 2 milieux différents, il y aura des protéines différentes synthétisées. 3. L’état de croissance. Si on place les bactéries dans un nouveau milieu, il va falloir un certains temps pour que toutes les bactéries soient dans le même état. Toutes les bactéries vont devoir faire un ajustement de leurs constituants cellulaires. La durée va être variable car : - dépend de la différence des 2 milieux (d’où la bactérie vient et ou elle est installée) - dépend de l’état individuel de la bactérie (une bactérie peut s’adapter + vite qu’une autre). Après cet ajustement, on entre en phase exponentielle. Une fois dans ces conditions, les bactéries vont toutes rester dans le même état pendant un certains temps, et cet état va rester tant que le milieu n’est pas modifier par la croissance = tant que les nutriments seront en quantités saturantes. On dit, dans ce cas, que la croissance est balancée car on peut être assuré pendant ce temps là que tous les composants de chaque cellule augmentent par même unité de temps. C’est la situation idéale pour étudier les bactéries. 4. La dynamique. 96% des cellules sont composées de macromolécules. La bactérie n’est pas très différente d’une cellule eucaryote à part 2 constituants : la mureine et les lipopolysaccharides. On ajoute au milieu du glucose radioactif marqué uniformément au carbone 14. Ensuite, on prélève et on fait une analyse des différents constituants et ça donne : 2
Microbiologie 2 Voir schéma 7 Le flux de glucose à l’intérieur de la cellule est très rapide et la transformation en petites molécules est très rapide aussi. Par contre, le flux est beaucoup + lent pour les macromolécules. Dans ce cas, au bout d’un doublement, on n’a que la moitié. Les ARNm démarrent + lentement que les petites molécules mais bien que ce soit des macromolécules, le temps est + rapide tout de même. La rapidité des ARNm est particulièrement cruciale chez les bactéries. II. Taille et composition d’une cellule moyenne. 1. Isolement et dénombrement des bactéries. On va vouloir séparer les bactéries les unes des autres et on va les compter. Pour cela, on va avoir plusieurs méthodes. Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients. • Le dénombrement des B par étalement. Cette méthode est utilisée pour isoler une souche. Schéma 8. Si l’on ne connait pas bien la bactérie, on étale toutes les solutions de 10-1 à 10-7. Au départ, il y a sur la boite un tapis bactérien. Puis petit à petit, au fur et à mesure des dilutions, on voit apparaitre des colonies. Au départ, on des colonies qui se touchent mais elles sont toujours incomptables. Puis, on obtient des colonies isolées avec de l’espace entre elles et dans ce cas, on peut facilement compter le nombre de colonies. Il faut au moins avoir 100 colonies par boite car lorsque l’on va prélever le milieu, on n’est pas dans une solution mais dans uns suspension càd que même si l’on ne les voit pas, il y a des bactéries. Donc, quand on prend du milieu avec la pipette, on va prendre des bactéries avec. A la fin, il y a donc une déviation standard. Ex : on compte 100 colonies 100 + ou – 10 (10%) (Racine carré) 625 + ou – 25 (4%) Il va falloir faire un compromis entre une déviation standard et l’erreur de comptage de colonies. On peut également compter la boite de dilution au dessus et celle en dessous pour vérifier si le travail a bien été fait. • Dénombrement total. Schéma 9 On rempli le quadrillage avec les bactéries : 10-5 µL. Au microscope, on va pouvoir dénombrer le nombre de bactéries. Ici, on compte toutes les bactéries mortes ou vivantes. Et on ramène systématiquement en nombre de bactéries / ml de culture de départ.
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Microbiologie 2 • Turbidimétrie. On visualise l’augmentation du trouble de la suspension bactérienne. L’appareil utilisé est le spectrophotomètre ou le néphélomètre. Dans le cas du spectrophotomètre, on a : Le récepteur mesure la lumière reçue. Dans ce cas la loi de Beer Lambert ne s’applique qu’aux solutions et ici on a une suspension. Donc on ne mesure pas une absorbance ici. On mesure une quantité de lumière qui va être, pendant un tps, proportionnelle au nombre de bactéries. Plus la concentration de bactérie est élevée, plus la lumière difractée est importante. C’est valable jusqu’une certaine valeur, à partir d’une densité de bactéries trop importante ce n’est plu proportionnel. Donc dans les cas qui ns intéresse, on a une linéarité entre une DO de 0,1 et 0,5. Schéma 11 A partir du moment où on est à DO = 0,5, il faudrait diluer les cultures pour toujours se trouver dans une bonne DO pour que la courbe soit toujours linéaire. La DO ici ne nous a pas donné un nombre de bactérie. Le nombre de bactérie peut être déterminé de 2 manières : - relation entre DO et poids sec des bactéries - dénombrement : à une DO particulière on prélève un échantillon, on dilue et on étale sur boite et après on compte. Il faut absolument faire une courbe d’étalonnage dès qu’on change de spectrophotomètre. Puisqu’on mesure l’augmentation d’un trouble, ce n’est pas universel pour toutes les bactéries. Si on a une bactérie plus grosse, il n’y aura pas le même nombre de bactérie pour une même DO. 2. Taille. Schéma 12. Pour E. coli : Dans 100mg, on a 1011 bactéries. Masse d’une cellule ici = 9,5.10-13 g. Lorsqu’on sèche cette bactérie, masse = 2,8.10-13g Taille extrêmement faible. Toute petite cellule. Cette taille est très importante par rapport à la manière de vivre. Grâce à cette petite taille, le rapport surface volume est important. Plus il y a possibilité d’échange rapide avec le milieu extérieur. Entrée très rapide de nutriment et sortie très rapide des déchets. Permet taux métabolique très élevé participe à la croissance rapide de la majorité des bactéries. Le taux métabolique d’une bactérie est de 10 à 100 fois supérieur que celui d’une cellule eucaryote. 3. Variétés et nombre des molécules. 4. Les protéines. On peut faire une électrophorèse en 2 dimensions. 4
Microbiologie 2 Après analyse, on peut montrer qu’on va avoir à peu près dans une bactérie donnée : 1 800 protéines. Le poids moyen d’une protéine est de 40 000. Autrement dit : il y a environ 2,4 millions de bactéries en tout dans la cellule bactérienne. La nature des 1 800 protéines dépend très étroitement du milieu de culture. 5. Les ARN. Il y a 20% d’ARN dont 81% d’ARNribosomique On peut dénombrer 18 700 copies de chacune des sortes d’ARNr (23S, 16S, 5S) 18 700 ribosomes. 15% d’ARNt pour E. coli il y en a 200 000 copies. Chacun des ARNt n’est pas en nombre identique, il y a environ 60 ARNt différents. Il reste donc 4% d’ARNm, ils st très instables, la durée moyenne de demi vie d’un ARNm est de l’ordre d’1 min. Instabilité car va de 0,5 min à 10min. On peut considérer, qu’à un moment donné, on a 600 à 900 différentes espèces d’ARNm. On a 1 800 protéines cela signifie qu’une partie des ARNm est organisée en opérons. Opéron = normalement un ARNm code une protéine. Dans le cas d’un opéron, il y a plusieurs protéines codées par le mm ARNm càd qu’il y a un même promoteur pour une 2 ou 3 protéine. Schéma 3. Les 3 gènes ABC vont être transcrits par le même promoteur et donnés 3 protéines différentes qui vont être traduites indépendamment. Le renouvellement (= turn over) est très important. Leur instabilité participe à une croissance rapide et à une adaptation rapide du milieu. 6. L’ADN : chromosome et plasmides. L’ADN procaryote n’a pas vraiment la même structure qu’un chromosome. Cette seule structure circulaire s’appelle le génome. Structure accessoire = plasmide = partie variable accessoire du génome. Seule la molécule circulaire va être indispensable à la vie. On a une molécule circulaire double brin dont la longueur chez E. coli = 4 640 000 pb. (Pas énorme). Si on prend cette molécule et qu’on l’étire, elle fait 1 mm de long. La molécule d’ADN est donc fortement compactée grâce à des protéines (qui ne sont pas des histones). Potentiellement, la protéine moyenne = 40 000. Chez E. coli, la capacité maximale de codage est de 4 300 gènes donc = environ 4 300 protéines. Mais, il y a une centaine de gènes. Et il y a des parties non codantes entre les gènes. On dit donc que chez E. coli, il y a environ 4 200 protéines. Dans une condition donnée, on a 40% à 50% du génome qui est en activité. 7. Les lipides. Les lipides représentent 9%. Tous les lipides sont membranaires. Pas de réserve en lipide (seul réserve = glycogène). Tous les lipides sont des phospholipides (sauf le LA de la Gram-). Schéma 14 5
Microbiologie 2 X est la partie hydrophile qui peut être variable selon le milieu et selon les bactéries. 8. Les lipopolysaccharides. Lipopolysaccharide : 3,5 % N’est présent que chez Gram-. Elle est variable selon les espèces voir selon les souches. C’est une structure hautement antigénique. Rôle de protéger la bactérie. 9. La muréine. Muréine : 2,5 % de la masse sèche. Elle se trouve dans le peptidoglycane. Absent dans une toute petite quantité de bactéries. Mais dans la grande majorité, il y a de la muréine. La muréine va former une coque rigide tout autour de la bactérie qui permet de se protéger de la pression osmotique et donne la forme à la bactérie. 10. Les molécules organiques. Voir poly page 10 table 2 Il y a des acides aminés, Nucléotides et des sucres et leurs précurseurs. 11. Les ions organiques. Voir poly page 10 table 3 Il y a des ions. Le sodium n’est pas indispensable. Il est indispensable seulement pour quelques bactéries (marines ou photosynthétiques). Ceci nous donne une idée de la complexité de la cellule bactérienne. La cellule bactérienne est complexe, sa composition va être réglée de manière très stricte mais a une adaptation très rapide. Mais finalement la cellule bactérienne n’est pas fondamentalement différente des autres cellules. III.Organisation de la cellule procaryote. C’est dans les années 50 que l’on a vu pour la 1ère fois cette structure grâce à l’amélioration du microscope. Permet de voir l’ultra structure des bactéries. L’organisation globale de la cellule est très différente de celle que l’on observe chez les eucaryotes. Point commun : ces cellules sont entourées d’une membrane. Il n’y a pas de réseaux membranaires à l’intérieur de la bactérie. Une seule structure membranaire. Pas d’organites à l’intérieur des bactéries (pas de chloroplastes..). On voit un cytoplasme granuleux et qui traduit l’extrême richesse en ribosomes. On voit une masse = ADN qui est dans le cytoplasme. Pas de membrane nucléaire donc pas de noyau. On a, à la place, un nucléoïde. L’absence de membrane nucléaire fait que le chromosome baignant dans le cytoplasme, l’ARNm va être en contact avec les ribosomes et donc transcription et traduction se font en même temps. Permet une rapidité d’adaptation supérieure, permet de gagner du temps pour la
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Microbiologie 2 croissance balancée. Mais une grande partie des avancées observées chez les eucaroytes ne sont pas observables chez les bactéries. Dans certains cas, il y a des structures annexes : - les fibrilles (pili) : pour adhérer en générale - les flagelles : pour se déplacer Voir poly page 11 et 12. Elle est petite. Non compartimentée par des membranes entre ADN et machinerie. Pas d’organites complexes. Le transport des e- a lieu à la surface des membranes cellulaires. On a des mécanismes de transports très développés qui vont permettre… Le matériel génétique, division cellulaire et… sont de complexité minimale par rapport aux cellules eucaryotes. Le flagelle est de constituions beaucoup + simple que chez les bactéries. 1. Variétés dans la structure de l’enveloppe. Cette variété a été mise en évidence pour la 1ère fois par le test de Gram. Gram = microbiologiste danois en 1884. Ce test permet de distinguer les bactéries gram - et Gram+. Il faut étaler les bactéries sur une lame, fixer ces bactéries par la chaleur. Colorer au violet de gentiane. On applique une solution d’iode qui va former un complexe avec le violet de gentiane. On voit que le complexe peut ressortir de certaines bactéries. Si le complexe ressort de certaines bactéries : elles sont appelées Gram-. Si le solvant polaire ne peut pas ressortir de la bactérie : elles sont appelées Gram+. Permet de montrer les différences dans la composition de l’enveloppe qui ont été compris que 80 ans + tard. Cette coloration Gram dépend des conditions physiologiques. Dans certaines conditions, des Gram+ ne sont pas colorées. Certaines bactéries échappent à cette coloration car elles ne possèdent pas de paroi et donc pas muréine. 2. Archées. Un grand groupe de procaryote : les archées = 2ème grand groupe (après les bactéries) de procaryote qui eux n’ont pas de muréine et ne sont donc pas sensibles à la coloration. Ces archées sont des procaryotes également. La structure des lipides est très différente. Ils ont des caractéristiques communes avec les bactéries et les eucaryotes. Au début, on pensait que c’était des bactéries spéciales qui vivaient dans des milieux extrêmes. 3. Les 3 domaines : Archea, Bacteria, Eucarya. Voir poly page 13.
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Chapitre 3 : L’enveloppe Bactérienne. Les propriétés structurales et fonctionnelles de l’enveloppe vont avoir des différences dans leur capacité adaptative. Les différents constituants de l’enveloppe bactérienne vont être adaptés en 1 er lieu à la … de nutriments. L’entrée des nutriments ne doit pas se faire au détriment de la bactérie, il faut que les produits nocifs restent à l’extérieur. Enveloppe : propriété d’adhérence et adaptée au transfert génétique. Dans le génome bactérien ¼ des gènes sont impliqués dans la synthèse, la régulation et la maintenance des constituants de l’enveloppe. Parmi les constituants de l’enveloppe, on trouve des caractéristiques biochimiques très spécifiques qui permettent de classer les bactéries d’un point de vu taxonomique. La constitution de l’enveloppe des bactéries est spécifique d’une espèce voir d’une souche. Le peptidoglycane est collé à la membrane externe chez les bactéries Gram - grâce à une lipoprotéine. Il y a une + grosse couche à l’extérieur chez les Gram+ que chez les Gram-. Schéma 1 LPS participe à la protection des bactéries Gram- face au milieu extérieur. I. La membrane cellulaire. 1. Les lipides. Dans cette membrane cellulaire, on trouve des lipides et des protéines. Bicouche lipidique. Chez la quasi totalité des bactéries, la bicouche n’est formée que de phospholipides (pas de glycérol). 2 espèces sont majoritaires : - les phosphatidyl glycérol (20%) - les phosphatidyl éthanolamine (75%) - cardiolipide (5% minoritaire) Poly page 10 fig 5 Les 2 phosphatidyl représentent la tête polaire. La nature de l’acide gras détermine la + ou – grande fluidité de la membrane. La membrane doit être suffisamment fluide pour que tous les constituants puissent bouger à l’intérieur. Schéma 2 Ex : Pourcentage d’acide gras qu’il y a dans les phospholipides : à 37% E. coli 43% acide palmitique C16 : 0 (=Saturé) 33% acide palmitoléique C16 : 1 (= insaturé 1 fois) 23% acide cis- vaccénique C18 : 1 (= insaturé 1 fois)
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Microbiologie 2 1% de traces On observe au maximum 1 insaturation. 2. Les protéines. Chez E. coli, 70% de la masse de la membrane représente des protéines. C’est beaucoup + que dans la majorité des cellules eucaryotes. Beaucoup + car dans la membrane cellulaire des bactéries, il y a un nombre de fonctions beaucoup + élevé que dans celle des eucaryotes. Fonctions : - barrière osmotique - transport spécifique de solutés (nutriments et ions) - toutes les protéines nécessaires à la synthèse des lipides - en grande partie les protéines nécessaires à la biosynthèse du peptidoglycane - tous les systèmes de sécrétion qui vont permettre de traverser la membrane cellulaire et également de traverser la membrane externe (Gram-) pour exporter des protéines dans le milieu extérieur. - chaine respiratoire - ségrégation des chromosomes - Chimiotactisme = toutes les protéines qui permettent à la bactérie de percevoir des variations et les transmettre au flagelle - protéines qui sont des capteurs et qui perçoivent tout type de variation et qui vont transmettre à l’intérieur de la cellule à des intégrateurs. II. Les couches externes de l’enveloppe. 1. La paroi des bactéries à Gram positif. La régulation de la quantité des protéines dans l’enveloppe est très stricte et très précise. Donc un grand nombre de gène est impliqué dans la régulation de ce nombre de protéines. Les bactéries vivent souvent dans un milieu hypotonique dont : Une membrane cellulaire seule ne permet pas de résister à la pression c’est pourquoi, on trouve au dessus des couches externes qui permettent à la bactérie de résister à des variations de pression très importantes. Peptidoglycane : Même les bactéries à Gram- (qui ont une petite couche de peptidoglycane) sont capables de résister à une pression de 100 atm. Gram+ : épaisse couche de peptidoglycane permet de donner sa forme à la bactérie. Les 2 acides sont liés au peptidoglycane ce qui permet de rester attacher à la cellule. La structure du peptidoglycane est globalement la même pour les Gram+ et les Gram-. Le PG (= peptidoglycane) est constitué de : - acide N_acétyl_muramique (NAM) - N_acétylglucosamine. (NAG) Ces 2 là répétés n fois. Ce n’est pas une glycoprotéine, c’est un tetrapeptide (muramique). 2
Microbiologie 2 Page 17 a Un pontage permet d’associer entre elles les différentes chaines. Page 17 b Les 4 AA liés à la NAM sont des AA particuliers. La liaison entre les 2 chaines se fait entre D alanine et la mesodiaminopimelate Page 18 a Contrairement à avant, les 2 chaine peptidiques ne sont pas reliées directement mais reliées par des glycines. Mais l’effet est le même. Seule chose invariable = enchainement des sucres Choses variables = AA + type de pontage Mais la structure globale va être a peu près la même. Page 18b A. Les pontages sont extrêmement importants. B. Il y a un pontage de temps en temps. Seul 25 % des tétrapeptides sont impliqués dans les pontages. Différence entre ces bactéries au niveau osmotique. Bactérie Gram- : Autre structure enchâssée dans PG : acide téichoïque et … important pour l’attachement à la cellule. Ce sont des déterminants antigéniques reconnus par l’hôte quand la bactérie passe dans un eucaryote. 2 grandes catégories d’acides téichoïques : - fabriqué par un enchainement de ribitol - fabriqué par un enchainement de molécules de glycérol Dans ces enchainements, il y a aussi des substitutions par des AA. Peptidoglycane + acide téchoïque donnent une structure extrêmement hydrophile obstacle pour les molécules hydrophobes càd que leur accession à la membrane cellulaire va être beaucoup + lente. Protection contre explosion de la cellule et protection contre les molécules toxiques et hydrophobes. Le peptidoglycane n’est pas un obstacle pour l’ADN, ni pour les… Placée dans un milieu hypotonique, une bactérie forme un lysozyme détruit et dégrade le peptidoglycane. Lorsque le peptidoglycane est dégradé à condition d’être dans milieu hypotonique on observe immédiatement la lyse de toutes les cellules. Même expérience dans milieu légèrement hypertonique pas de lyse mais les cellules sont déformées, on observe des protoplastes. Puis, si on remet dans milieu normal, la bactérie redevient normale. 2. La muréine.
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Microbiologie 2 3. La paroi et la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Pour les Gram- : On a un peptidoglycane + membrane externe. La membrane externe remplace la grosse couche de peptidoglycane de la Gram+. La membrane externe a une structure en bicouche lipidique qui est complètement asymétrique (contrairement à la membrane cellulaire), la face interne de cette membrane est majoritairement constituée de phospholipides, et sur la face externe on a que la partie lipidique du lipopolysaccharide. Permet de résister à des nombreux composés toxiques. 4. Le lipopolysaccharide. Le lipopolysaccharide est composé 3 parties : - Lipide A : constitué comme un lipide : - partie hydrophile = 2 molécules de glucosamine reliées à 4-6 acide gras (acide gras de C12 à C16 dans la majorité des cas saturés + rigide). Les glucosamines sont en générale phosphorylés donc chargés. Du coup, pour que les molécules du LPS interagissent ensemble pour former une barrière, il faut neutraliser ces charges avec des molécules de Ca 2+ ou Mg2+. Si la charge n’est pas neutralisée peut avoir des perturbations dans la structure de la membrane. - partie hydrophobe Page 19 KDO, heptose : sucres particuliers qui constituent la 1ère partie de la partie polysaccharidique. Le KDO = acide céto desoxyoctanoïque (pas à savoir ce que veut dire KDO). KDO et hexose sont relativement bien conservés chez toutes les espèces. Au dessus du noyau est greffé l’antigène O indispensable pour la virulence des bactéries. Parmi les (4 sucres)n, il peut y avoir beaucoup d’enchainements (45). Page 20 Il y a des protéines donc chargés structure hydrophile. Page 21b Structure que certains pensent du LPS. Certains pensent que si la partie polysacharidique est recourbée meilleure protection. La membrane externe + LPS : protection contre les molécules hydrophiles et les molécules hydrophobes. Cette structure est plus efficace pour empêcher les molécules de rentrer que la protection des Gram+. Chez Gram-, seul le … assure la fonction de barrière. EDTA : tous les ions bivalents sont… Désolidarise les molécules de LPS : crée des trous temporaires dans le LPS permet au lysozyme de rentrer et donc de détruire le peptidoglycane et donc la lyse de la bactérie dans le milieu hypotonique. On obtient des sphéroplastes (pas protoplaste car 2 membranes). Des résidus de membrane externe restent attachés à la membrane interne.
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Microbiologie 2 LPS a un rôle important dans la pathogénèse. Lipide A = partie la + réactive du LPS. Si trop de lipide A peut provoquer la mort. Aucune molécule n’est donc sensée rentrer par cette membrane externe. Ce sont des protéines qui permettent le passage de nutriments. Les protéines effectuent le même travail que les protéines de transport de la membrane cellulaire. On va avoir 2 catégories de protéines qui permettent le transport de molécules hydrophiles : - porines : chez E. coli il y en a 2 : OmpC et OmpF, ce sont des trimères. Chaque monomère possède son canal de diffusion. Transport non spécifique. Permet de transporter des molécules hydrophiles de masse moléculaire inférieure à 700Da = majorité des nutriments. Ces 2 protéines (Omp..) font parties des protéines majeures de la membrane externe chez E. coli. - transporteurs spécifiques : permet de faire entrer des vitamines (vit B12), les phérichromes (ortho) (FhuA), des oligosaccharides (de 7-10 sucres) = petit produit de dégradation de l’amidon. - Protéines de structure : - OmpA : protéine transmembranaire complètement dévolu à la structuration de l’enveloppe. - lipoprotéine de Braun : permet de retenir le peptidoglycane contre la membrane externe. Possède 3 acides gras. Si absente, la bactérie ne survie pas. Donc indispensable. - Des protéines impliquées dans la perception du milieu extérieur. Pour expliquer les liaisons : On peut imaginer des connexions entre membrane cellulaire et membrane externe. On aurait des zones de Bayer. Schéma 3. On ne connait pas trop la nature des jonctions entre membrane cellulaire et membrane externe. III.Le périplasme. Le périplasme forme un gel dans lequel on retrouve : - le peptidoglycane - différentes protéines : 2 grdes catégories - protéines qui facilitent la nutrition : 2 catégories : - protéines qui aident au transport des nutriments. Protéines hydrophiles qui capturent les nutriments quand ils entrent dans le périplasme et les amènent… (transport : AA, sucre, vitamines) - enzyme de dégradation comme phosphatase, protéase permet le recyclage des protéines en fin de vie. Endonucléases : découpe les acides nucléique, traverse la membrane cellulaire et est utilisé comme substrat. - protéines qui inactivent les procédés toxiques On trouve des oligosaccharides particuliers : des glycanes périplasmiques OPG déterminant de la virulence des bactéries à Gram - et sont des molécules signales qui permettent de percevoir les variations de l’environnement.
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Microbiologie 2 IV. Les structures facultatives. Les structures facultatives sont + ou – impliquées dans la pathogénèse. 1. Les couches de surface cristallines. = couche S Elle est formée d’une seule sorte de protéine et est polymérisée à l’extérieur de la bactérie. Parfois des glycanes y sont attachés. Cette couche S est nécessaire pour la virulence. 2. La capsule. Elle est, dans la majorité des cas, un polysaccharide + ou – complexe. Dans quelques rares cas, enchainement d’AA. En générale, la synthèse de la capsule est conditionnelle = synthétisée dans certaines conditions environnementales. Fonction : lutte contre la dessiccation (hausse de l’osmolarité). Pour les pathogènes, elle sert à lutter contre les défenses de l’hôte notamment contre la phagocytose. 3. Les flagelles. Permet de se déplacer. Facteur de virulence important. La majorité des bactéries pathogènes ont des flagelles. Si on leur retire ce flagelle, elles sont beaucoup moins virulentes. Structure complexe : - Gram- : - 2 disques permettent de traverser la membrane cellulaire - 2 disques permettent de traverser la membrane externe - crochet qui courbe fortement le flagelle : très important pour le fonctionnement du flagelle procaryote - moteur alimenté par le gradient électrochimique de protons (1 000 protons / tour) - 1 filament (polymérisation d’une seule protéine) - Gram+ : même chose sauf qu’il n’y a pas de membrane externe donc 2 disque en moins. La flagelline (protéine majeure du filament) est hautement antigénique et permet à la bactérie de se faire repérer par son hôte lorsqu’elle est pathogène. 4. Les pilis. Ce sont des appendices dépassant à l’extérieur de la cellule. Les pilis sont des structures protéiques beaucoup + petites en taille que le flagelle. Les pilis de type 1 et de type 4 sont des organites d’attachement en surface et vont être, en générale, relativement spécifiques. Pour E. coli, 200 à 300 pilis. Les pilis peuvent prendre naissance soit dans la membrane cellulaire soit dans la membrane externe. 6
Microbiologie 2 Les pilines… Certains pilis possèdent une protéine polymérisée, d’autres plusieurs protéines. Souvent à l’extrémité de ces pilis, il y a une protéine qui est la protéine de spécificité… Il y a un type de pili particulier = pili sexuel joue un rôle important dans la conjugaison bactérienne. Cette conjugaison est un des systèmes majeur qui permet aux bactéries de se transférer l’une l’autre de l’ADN : permet le brassage de l’information génétique. Les E. coli pathogènes (urinaire, méningite) ont besoins de piline pour s’accrocher sur une cellule de l’organe qu’elle doit infecter. Ce sont des éléments très importants pour les organismes pathogènes. V. Les récepteurs des agents délétères exogènes. 1. Les bactériophages. Ce sont les virus à bactérie. Taille = 20 à 300 nm. On ne peut pas les repérer en microscopie optique (sauf exception). Mais visible en microscopie électronique. Possède un très grand degré de symétrie. Constitution : tête dans laquelle il y a un acide nucléique. On peut avoir une seule molécule d’acide nucléique ou plusieurs. Queue (pas tjrs présente). Dans le cas du bactériophage T4 : Tête protéique renfermant l’acide nucléique (ADN double brin). La tête protéique est formée de sous unités qui s’assemblent = capsomères. Forme icosahèdrique = 20 faces et 12 sommets. Possède une queue qui facilite l’injection de l’ADN. De plus, la queue peut être contractile. La contraction de la queue permet d’injecter le matériel génétique à l’intérieur de la cellule. Il y a apparemment une jonction entre la membrane cytoplasmique et la membrane externe. (Soit rapprochement des 2 membranes, soit pont protéique on ne sait pas très bien). Quelques exemples (pour E. coli): - T1, T2, T4 : possèdent queue contractile 169 kb - φ x 174 : + petit et ne possède pas de queue. 5,4 kb - λ : possède une queue non contractile. Chaque espèce de bactérie possède sa propre collection de bactériophage. Chaque bactériophage est spécifique d’une espèce. Même certains bactériophages sont spécifiques d’une seule souche pour une espèce donnée. Mais on dit qu’un phage est spécifique d’une espèce. La spécificité des bactériophages dépend de certains constituants de l’enveloppe bactérienne. Les protéines ou lipopolysaccharides ne sont pas à la surface pour faciliter l’entrée des phages. Mais ces structures ont été détournées de leur fonction initiale pour servir de récepteur aux différents bactériophages.
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Microbiologie 2 Lorsque le récepteur du bactériophage est le lipopolysaccharide, dans ce cas, seule une partie de l’espèce sera infectée car il y a une variation du LPS. D’autres bactériophages reconnaissent d’autres protéines : - Btu B BF 23 (T4) - Fhu A T5 - Lam B λ D’autres structures reconnues par les bactériophages : - Pilis sexuels M13 - Flagelles : χ (chi) Salmonella enterica, PBS1 Bacillus subtilis. On peut considérer que toute structure en contact direct avec le milieu extérieur est probablement la cible d’un ou plusieurs bactériophages. On a 3 types de bactéries : - sensible : contaminée puis éliminée par le bactériophage - résistante : ne possède pas le récepteur du bactériophage - immune : a le récepteur mais possède au sein de son chromosome l’ADN du bactériophage et empêche l’infection. La majorité des bactériophages sont virulents (càd qu’ils reconnaissent la bactérie sensible, ils se développent et détruisent la bactérie). Bactériophages tempérés : ils sont capables de ne pas détruire systématiquement la cellule bactérienne qu’ils ont infectés. Ils ont 2 possibilités : - entrée en cycle lytique : se comporte comme un phage virulent - entrée en cycle lysogénique : va s’intégrer au génome bactérien sans causer de tord à la cellule bactérienne. Le phage va être à l’intérieur du chromosome bactérien et est invisible. Le bactériophage se comporte comme un élément quelconque du chromosome. Mais lorsque la cellule bactérienne est en survie, il peut s’exciser du chromosome bactérien et commencer un cycle lytique. Bactérie lysogène : quand le génome est intégré. Dans le cas de bactériophages virulents : On considère une suspension de bactériophage et une population de bactéries qui leurs sont associés. 100 bactériophages + 106 bactéries : la multiplicité d’infection = 10-4. On laisse ce mélange 5 ou 10 min le temps que le bactériophage trouve une bactérie à infecter. On étale ce mélange sur LB. On laisse une nuit à 37°C. On obtient un tapis bactérien. Les bactériophages se sont répendus et ont contaminés les bactéries. Toutes les bactéries proches de la bactérie initialement infectée vont lyser. Donc, on obtient des « trous » (sans bactérie) causés par la lyse des cellules bactériennes. Environ 100 trous. On peut suivre le devenir des bactériophages lors d’une infection on le fait en milieu liquide et à différents temps. Toutes les 5 min, on prélève la culture bactérienne et on regarde ce qu’il se passe.
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Microbiologie 2 106 bactériophages + 5.106 bactéries. Toutes les 5min, on prélève : On centrifuge la culture et on mesure le nombre de bactériophages présents dans le surnageant. Le surnageant, on le met en contact avec des bactéries sensibles pendant 10min. On l’étale sur boite en milieu LB, on le laisse poser une nuit. Puis on pourra compter le nombre de bactériophage, à différents temps, dans notre milieu de bactéries. Schéma 4 Phases : 1 = Phase de déclin 2 = Phase d’éclipse 3 = Phase explosive Dans ce graphique : on mesure le nombre de bactériophage présent dans le surnageant. Phase de déclin : Au bout de 5 min, il n’y a plu de bactériophage dans le surnageant. Tous les bactériophages se sont adsorbés à la surface des bactéries. Du coup, s’ils sont fixés à la bactérie, lors de la centrifugation, ils tombent avec les bactéries dans le culot. Il n’y a donc rien dans le surnageant. Phase d’éclipse : Le bactériophage a trouvé une cible. Le matériel génétique est injecté à l’intérieur de la bactérie, ce matériel génétique s’exprime en détournant toutes les fonctions de l’autre, il va répliquer son ADN, il synthétise tout le matériel nécessaire à la formation de la capside. Cette phase correspond donc à : tout le temps nécessaire au bactériophage pour se multiplier et former de nouveaux bactériophages. Puis début de libération des nouveaux bactériophages. Phase explosive : Correspond à la lyse des bactéries et donc à la libération massive des nouveaux bactériophages nouvellement formés. Chaque bactérie infectée par un seul bactériophage va libérer une centaine de bactériophages. On a donc 100 fois plus de bactériophages à la fin par rapport au début. La boite de pétri présente donc des « trous », pourquoi la lyse ne se répend pas partout. Pourquoi nous n’obtenons pas une boite sans aucune bactérie ? Les bactéries vont se développer en même temps qu’elles ont acquis le phage. La bactérie lysée libère les bactériophages autour d’elle. Les 100 bactériophages issus de cette 1 ère lyse se retrouvent à proximité de la cellule bactérienne. Mais autour, il y a également d’autres bactéries qui vont être infectées par les 100 bactériophages. Pendant ce temps, les cellules bactériennes non infectées se multiplient (x2). Donc les nouveaux bactériophages infectent les nouvelles bactéries etc… Puis les… Les bactériophages ont besoin d’énergie pour pouvoir se « reproduire ». Cette énergie n’est pas présente si la bactérie est en phase stationnaire. Donc lorsque le milieu a été consommé entièrement, les bactéries sont en phase stationnaire. L’ADN n’est pas capable de se multiplier et impossibilité de former de nouveaux bactériophages. Donc la culture n’évolue pas et il reste toujours des bactéries dans la boite. Poly page 26 et 27.
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Microbiologie 2 2. Les bactériocines. Ce sont des protéines synthétisées à partir d’un ARN messager. Ces bactériocines sont sécrétées par des bactéries pour tuer d’autres bactéries. Les bactériocines d’E. coli sont nommées : colicines. Ces colicines sont fais pour tuer d’autres E. coli. En même temps que la bactérie synthétise la colicine, elle produit une protéine d’immunité. La colicine et la protéine forment un complexe. Sécrétée dans le milieu extérieur, la colicine quitte la protéine d’immunité et va pouvoir alors aller attaquer une E. coli sensible. Action possible des colicines : Les colicines vont s’intégrer dans la membrane cellulaire, faire un trou. Tous les gradients vont être bouleversés. Provoque la mort cellulaire. La colicine entre dans le cytoplasme et agit comme une nucléase = coupe l’ADN. La colicine considérée va couper un site spécifique (ARN16S), la transcription est rendue impossible. Protéines relativement grosses : 50 à 80 KDa. Les récepteurs à la prolicine sont les mêmes que ceux reconnus par les bactériophages. Chaque structure extérieure à la bactérie sert donc de récepteur à la bactériocine. Une fois que la bactériocine arrive sur sa cible, elle est dénaturée et traverse la membrane externe sous forme dénaturée. Elle est prise en charge par un complexe transmembranaire de la bactérie elle-même. Elle va ensuite arriver à la membrane cytoplasmique ou à l’intérieur de la cellule. La bactériocine est alors renaturée à l’intérieur de la cellule et peut infecter. Paragraphe pas à retenir.
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Chapitre 4 : Biogénèse de l’enveloppe bactérienne. I. Régulation de la composition de l’enveloppe. Toutes les membranes sont des surfaces fermées qui doivent être physiquement continues pour permettre le maintient de la cellule et sa continuité. Mais doit pouvoir grandir sans perdre sa continuité par addition de matière lipidique. Tous les constituants de l’enveloppe doivent croitre de manière coordonnée et au bon endroit. Chacun des éléments doit être dirigé vers la bonne localisation. Chaque protéine est différente et on doit systématiquement les envoyer à la bonne localisation. Au cours du cycle cellulaire, on a la division cellulaire et donc il faut à nouveau séparer les 2 cellules filles sans rompre la continuité de l’enveloppe bactérienne. Il faut permettre accroissement du peptidoglycane sans rompre la continuité du peptidoglycane. De plus, au niveau des enveloppes, les variations du milieu extérieur sont perçues. Il peut donc avoir des changements importants sur la membrane en fonction des variations du milieu extérieur. Ex : Variation brutale du milieu extérieur = changement de source de carbone. 1. L’exemple de l’utilisation du maltose par Escherichia coli. Schéma 1 Lorsque du Glc est présent dans un milieu de culture. Une série de régulateur empêche l’utilisation des autres sources de carbone. Donc les protéines nécessaires à l’utilisation du maltose ne sont présentes. Ce phénomène s’appelle la diauxie. La 1ère croissance est due à l’utilisation exclusive du glucose. Phase 2 : phase stationnaire car plu de Glc, qq minutes suffisent pour reprendre ensuite la croissance. La bactérie s’adapte donc très rapidement. En qq minutes, on passe de 0% de protéines maltose à 7%. La bactérie est capable de passer en quelques minutes d’une alimentation Glc à une alimentation maltose. II. Assemblage des protéines. 1. Protéines membranaires et protéines sécrétées. Dans l’enveloppe, on a des protéines solubles (hydrophiles) et des protéines hydrophobes. Il faut séparer les protéines qui doivent s’intégrer dans une membrane des cellules qui doivent rester dans le cytoplasme. 1
Microbiologie 2 On a 2 catégories de protéines : - possèdent un peptide signal = partie qui indique à la cellule si la protéine doit être dans la membrane ou sécrétée. Sécréter une protéine = La protéine passe sous forme linéaire dans la membrane mise en conformation lente de la protéine car mise en conformation impossible dans le cytoplasme. - ne possède pas de peptide signal et possède une mise en conformation rapide. Correspond aux protéines qui restent dans le cytoplasme. Le peptide signal est différent pour chaque protéine, par contre il possède des caractéristiques communes à tous les peptides signal. Il fait de 20 à 40 AA en position N-term de la protéine. On peut systématiquement visualiser plusieurs parties. Au tout début, on a une charge positive. Ensuite 16 AA hydrophobes. Souvent au début de la protéine mature, on a des AA neutres ou chargés négativement. La partie d’AA hydrophobes s’insère dans la membrane ce qui permet de transloquer toute la protéine. Schéma 2. … Système SEC : a besoin du passage de plusieurs protéines dans membrane ou cytoplasme. Schéma 3. Leader peptidase : protéase spécifique qui va cliver spécifiquement la protéine entre la fin du peptide signal et le début de la protéine. Libération du peptide signal qui va être dégradé. Ce clivage se fait que quand la protéine est bien ancrée dans la membrane. Ce schéma marche que pour 2 types de cellules. Il reste à voir la solution pour les protéines de la membrane externe et les protéines sécrétées. Page 46 fig 5 Les protéines de la membrane externe. Schéma 4 Commence pareil que schéma 3. Une structure l’empêche de s’intégrer dans la bicouche lipidique (membrane cellulaire). Dès que la protéine sort dans le périplasme, elle est prise en charge par des protéines de type chaperons qui vont la protéger de l’agrégation, des protéases. Ces protéines chaperons vont conduire cette protéine dénaturée jusqu'à son lieu de résidence définitive : la membrane externe. A son arrivée, elle se met en conformation dans la membrane externe. Ce schéma ne fonctionne pas pour les lipoprotéines. Lipoprotéine de Braun : Poly page 53 fig 16. Une cystéine en N-term où se lie les 3 acide gras. On a notre lipoprotéine complètement constituée, mais celle-ci est ancrée dans la membrane cellulaire. Mais normalement elle doit se retrouver dans la membrane externe. Il va donc falloir transloquer la lipoprotéine jusqu'à la membrane externe implique de sortir les acides gras de la membrane cellulaire. Schéma 5 2
Microbiologie 2 On a 3 étapes : - La 1ère protéine extrais les lipides de la membrane cellulaire. Les lipides vont être masqués par cette protéine. - Transfert de la lipoprotéine vers une 2 ème protéine qui va acheminer la lipoprotéine vers la membrane externe. - Arrivée à la membrane externe, une 3 ème protéine accepte la lipoprotéine et l’insère à l’intérieur de la membrane externe. Le système sec est suffisant pour les bactéries à Gram+ car il n’y a qu’une membrane. Gram- : Cas + difficile à résoudre. Il y a des systèmes de sécrétion spécifiques pour elles. Il y a 6 systèmes différents qu’on peut regrouper en 2 grandes catégories : * systèmes Sec-dépendants : * systèmes Sec-indépendants : permet le passage de la protéine en une seule étape du cytoplasme vers le milieu extérieur. Les + sophistiquées contiennent 15 protéines. Ex : Système Sec - indépendant. 3 protéines impliquées. Schéma 6. a L’ensemble forme un cylindre à travers lequel va pouvoir passer des protéines. Une fois la protéine passée, cet assemblage va pouvoir se défaire. La protéine passe dans le cylindre en forme dénaturée, puis se met en conformation dans le milieu extérieur. Ex : Système Sec – dépendant. Schéma 6 b. La protéine est prise en charge seulement dans le périplasme pour être emmenée vers l’extérieur. La protéine est sécrétée dans le périplasme où elle adopte sa mise en conformation définitive. Le système de sécrétion doit reconnaitre la protéine qui doit être sécrétée des protéines qui doivent rester dans le cytoplasme. Une protéine unique dans la membrane externe qui doit se mettre en multimère (Douzaine de monomères) qui permet d’accommoder un pore relativement gros pour laisser passer la protéine déjà en conformation (n’est plu linéaire). Dans la membrane cellulaire, tout un ensemble de protéines différentes. Puis plusieurs protéines de liaisons qui permettent de reconnaitre la protéine à sécréter, l’amener au pore formé par les protéines de la membrane externe pour l’emmener vers l’extérieur. III.Assemblage des phospholipides. Toute la synthèse des phospholipides a lieu sur la face interne de la membrane cellulaire. On forme des micelles (molécules amphiphiles). C’est ce que l’on obtient lorsque l’on met des phospholipides dans de l’eau. Il faut des conditions très particulières pour obtenir une conformation en bicouches phospholipidiques.
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Microbiologie 2 On a une composition en phospholipides identiques pour la couche ext et int dans les conditions in vitro. Les nouveau phospholipides se mettent sur la face interne mais comment passent-t-ils sur la face externe ? Ils se retournent et passe de l’autre coté = hypothèse simple. Mais cela serait très couteux en énergie. On fait traverser à la tête polaire une bicouche lipidique. Hypothèse actuelle : il y aurait des protéines particulières qui font traverser la tête polaire sans avoir de contact entre partir polaire / lipidique. Schéma 7. Les phospholipides néo synthétisés coulisseraient le long de la protéine empêchant les tètes polaires d’être en contact avec la partie hydrophobe des acides gras. On imagine un autoassemblage. Equilibre de la quantité de phospholipides entre face ext/int. Composition en phospholipides différente selon les endroits. Donc régulation très fine dans la composition en phospholipides et dans l’organisation des phospholipides dans la structure membranaire. Mais on ne sait pas ce qui permet d’avoir des phospholipides différents entre face interne et face externe. IV. Synthèse de la muréine. C’est une molécule qui est la cible d’antibiotiques extrêmement efficaces. La biosynthèse de la muréine est à peu près identique pour Gram – et Gram+. Les différences sont principalement dues aux peptides qui relisent les chaines de glycane. Page 51. Fig 10 : Synthèse de suffisamment de muréine pour permettre l’accroissement de la cellule et permettre sa futur division. Ce qui nécessite de l’énergie se fait du coté cytoplasmique. Page 52 fig 11. Chez E. coli : Il y a 8 étapes qui permettent à parvenir à la synthèse d’UDP. Le 5ème peptide est utilisé ultérieurement dans l’assemblage sera passé dans le périplasme. L’énergie formée par la coupure du 5ème AA va permettre la transpepdidation ( ?). Une molécule en C55 sur lequel sont accrochés les précurseurs du peptidoglycane. Sur C55 on greffe NAG. On obtient le module de base *. On se retrouve sur la face externe de la membrane cellulaire. L’élément qui vient d’être transloqué va a donné a.
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Microbiologie 2 Schéma 8. L’élément rose est ensuite libéré lorsque n+1 est suffisant. On obtient les petites briques. On va pouvoir faire s’interconnecter la chaine avec le peptidoglycane. Page 51 fig 9 mal représenté. Les nouveaux éléments synthétisés vont devoir traverser le peptidoglycane sans le rompre ! Il faut donc des protéines = PBP (Penicillin Binding Protein). Les 1ères PBP sont en violet. Pour insérer la partie rose dans le peptidoglycane 2 et 4 (bleu). PbP 2 et PBP 4 ont 2 activités : - transglycosylation -transpeptidation Ces 2 activités permettent la création d’un réseau = peptidoglycane (PG). Il va quand même y avoir des coupures transitoires du peptidoglycane pour insérer les nouvelles. Le peptidoglycane = 1 molécule. En gardant cette molécule unique, on garde les propriétés du peptidoglycane. Organisation du peptidoglycane en spirale autour de la membrane cellulaire. Schéma 9 Gris peptidoglycane déjà présent. Bleu : Nouvelle unité de base à insérer. PBP : coupe en rose. Permet d’intégrer la nouvelle unité. Accroissement de la taille du peptidoglycane. Lorsque l’on intègre cette unité, il y a à la fois transglycosylation et transpeptidation PBP 3 : Permet d’effectuer une division cellulaire correcte entre les 2 cellules filles du peptidoglycane Septation. Intérêt des antibiotiques : - on s’attaque à une structure vitale de la bactérie (peptidoglycane). - s’attaque à une structure exclusivement bactérienne pas de risque d’avoir de problème dans les systèmes de biosynthèses des eucaryotes. Ex d’antibiotiques page 52 : α : fosfomycine, D-cycloserine β : vancomycine γ : bacitracine, colicine M Δ : pénicillines, … Toutes les étapes de biosynthèse du peptidoglycane vont être attaquées par un inhibiteur = antibiotique. Β-Lactamases détruisent le cycle β-lactame et inactivent l’antibiotique. Ils sont localisés dans le périplasme pour les bactéries à Gram- là où agissent les pénicilline.
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Microbiologie 2 V. Synthèse du lipopolysaccharide. Le LPS est composé de 3 parties : - lipide A synthétisé au sein (face interne) de la membrane cellulaire. Puis, on allonge dessus la partie polysaccharidique du noyau (toujours face cytoplasmique). Une fois que l’antigène O est activé, on le transloque (grâce au cycle undecaprenyl…) sur face externe de la membrane cellulaire, c’est à ce moment qu’il est accroché à l’extrémité des sucres. Une protéine permet le retournement de l’Ag A face externe de la membrane cellulaire essentiel pour la biosynthèse du LPS.
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Chapitre 5 : La recherche de nourriture. I. Introduction. Dans la majorité des cas, les bactéries se trouvent dans des conditions de carence nutritionnelle. Il leur faut trouver rapidement la nourriture nécessaire à leur survie. Elles doivent faire ça rapidement car : - nourriture limitante - bactéries vivent en communauté. Dans les milieux de laboratoire et lorsque les bactéries pathogènes se trouvent dans l’hôte nourriture abondante. Comment la bactérie est capable de transporter des éléments nutritifs et comment est elle capable de l’accumuler dans son cytoplasme ? Ex : E. Coli On trouve 100 systèmes de transports différents. Selon le système de transport, il y a 1 à 5 protéines impliquées. Et il y a une soixantaine de gènes impliqués dans la motilité. On arrive à environ 10% du génome qui est dévolu au transport et au tactisme (= motilité). Schéma 1 1ère partie = toutes les enzymes ont une quantité de substrat supérieur à ce dont elles ont besoin jusqu’au point rose. On a un arrêt brutal en qq minutes arrivée en phase stationnaire. Arrivé ici, si on dose le Glc résiduel < 1µM. Tandis qu’au départ (avant ajout de bactéries), on est à 11mM. Donc tout le Glc a été consommé. Comment les bactéries peuvent-elles assurer une croissance à la même vitesse du début à la fin ? Partie a : concentration de Glc en excès donc tout fonctionne bien Partie b : concentration de Glc inférieure aux quantités normalement nécessaires pour que cela fonctionne à plein régime. On s’attendrait donc à la courbe bleue. La concentration d’un milieu intérieur est différente de la concentration d’un milieu extérieur. Les systèmes de transport sont capables de concentrer les nutriments à l’intérieur de la cellule afin de toujours maintenir une quantité de nutriment maximale même en faible quantité de substrat. Arrêt brutal car à concentration basse le système de transport ne fonctionne plu. La quasi-totalité des éléments nutritifs sont absorbés par des systèmes qui permettent de concentré les nutriments on va contre le gradient de concentration on utilise donc de l’énergie. II. Le transport. 3 grandes fonctions du transport : * Régulation du volume cellulaire. Implique maintien du pH, molarité établissement et maintien de la condition ionique.
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Microbiologie 2 * Extraire et concentrer les nutriments. (= les molécules nécessaires à la formation d’énergie et à …) * Maintien des gradients ioniques de part et d’autre de la membrane (Na+, K+, Ca2+…) 1. Les différents types de transport. On va principalement parler de la concentration des nutriments. On se place chez les bactéries à Gram-. Les nutriments doivent traverser la membrane ext, traverser le périplasme et donc le PG (ne pose pas bcp de problèmes aux molécules hydrophiles). Puis traversé de la membrane cellulaire (principale obstacle de molécules hydrophiles). Dans la membrane cellulaire : On retrouve tous les systèmes de transport qui doivent permettre l’entrée des molécules nécessaires à la croissance et laisser à l’extérieur toutes les molécules délétères. Tous les systèmes de transport seront spécifiques d’une molécule ou d’une famille de molécules. Les bactérier ont 5 types de transports différents : - La diffusion simple 1. - La diffusion facilitée 2 - Le transport actif primaire 3 - Le transport actif secondaire 4 - La translocation de groupe. 5 2. La simple diffusion. Elle se fait sans intervention d’aucune protéine. Les gaz peuvent traverser librement les membranes = diffusion simple. 3. La diffusion facilitée. On parle à ce moment là de transport. Une protéine joue le rôle de transporteur. En général, on a même un transporteur stéréospécifique. Sans le transporteur, la molécule ne peut pas traverser la membrane toute seule. Le transporteur ne peut pas transporter de molécules autres que celle pour laquelle il a été synthétisé. Le substrat est transporté selon le gradient de concentration. On peut assimiler ce transporteur à une enzyme. Spécificité de substrat + vitesse de transport dépend de la différence de concentration du substrat de part et d’autre de la membrane jusqu'à une vitesse limite qui correspond à la saturation du transporteur. Seul le glycérol est capable d’entrer par diffusion facilitée. Avec ces 2 systèmes (simple et facilitée), on ne peut pas concentrer le substrat à l’intérieur de la bactérie car selon gradient. 4. Le transport actif. Le transport actif primaire, secondaire et la translocation de groupe nécessitent la présence d’énergie car ce sont des transports actifs. On établit un gradient de concentration au lieu de l’exploiter. Avantage même à basse concentration de substrat on continue d’accumuler dans la cellule. 2
Microbiologie 2 Transporteur particuliers = perméases. 5. Le transport actif secondaire. L’énergie = les différents gradients ioniques établis de part et d’autre de la membrane cellulaire. Schéma 2. 2 gradients : - H+ - Na+ Selon les nutriments et le transporteur, on utilisera ou le gradient de protons ou le gradient sodique. Une protéine transmembranaire (souvent dimère) va pouvoir faire entrer ou du H + ou du Na+ avec le substrat. On dissipe un gradient qui est préétabli. Au moment du transport, on n’utilise pas d’énergie. Par contre il va falloir recréer le gradient c’est ce qui consomme de l’énergie. C’est pourquoi on l’appelle transport actif secondaire. L’utilisation de l’énergie et le transport sont 2 étapes bien différentes. Le gradient de H+ est reformé : - en aérobiose par respiration - en anaérobiose par … (fermentation ?) Il existe 3 types de transport actif secondaires. Page 43 fig 1 - symport : entrée dans le même sens le substrat et ions. Entrée d’un anion ou molécule neutre. - antiport : la molécule H+ ou Na+ entre tandis qu’on expulse un ion de charge différente - uniport : la charge conditionne le sens de transport. Cations entrent et anions sortent. Spécificité : chaque transporteur transporte une ou une famille de molécules. Symport : le port ne veut pas dire pore !!!! Les transporteurs sont des protéines qui peuvent avoir au moins 2 états : - fermé : pour empêcher l’entrée de molécules autres - ouvert : permet le passage, lorsque c’est nécessaire, du substrat considéré. Le sens du transport est déterminé par le gradient et pas par la molécule de transport. Si on pouvait inverser le gradient, les molécules passeraient dans l’autre sens. On peut transporter différents types de molécules : - AA : Gly ou Phe, Pro par symport à sodium - sucre : lactose = symport H+ - ions : antiport Na+/H+ ou antiport Na+/K+ ( ce paragraphe est inutile)
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Microbiologie 2 Comment montrer le transport et l’accumulation d’une molécule dans une cellule ? Ajout de lactose radioactif prélèvement de suspension bactérienne, filtrer, rincer par lactose non radioactif. On compte la radioactivité du filtre. Si lactose est transporté augmentation de la radioactivité en fonction du temps. Comment savoir par quel moyen est transporté le lactose ? On utilise des découplants. On introduit de petites molécules qui vont formés des pores transmembranaires qui sont suffisamment grands pour laisser passer les ions mais trop petits pour laisser passer le lactose. Donc on se retrouve avec une concentration H+ et Na+ égale de chaque coté de la membrane. On fait la même expérience de transport. On pourra conclure de l’expérience que le substrat est transporté par une anion. 6. Le système de transport sensible aux chocs osmotiques. Transport actif primaire. Sensible aux chocs osmotiques. N’existe que chez les Gram- ou gram + ? On centrifuge les bactéries en phase exponentielle. On reprend les bactéries dans une solution contenant : - saccharose 20% (hypertonique). - EDTA 5mM (chélateur d’ions bivalents, Mg2+, Ca2+). On recentrifuge les bactéries et on resuspend le culot bactérien dans une solution de MgCl 2 0,5mM à 0°C. On mesure alors l’activité de transport des différents nutriments. On introduit un substrat radioactif au milieu. On observe alors que si on ajoute du lactose radioactif, il y a transport du lactose. Alors que si on essaye de transporter du maltose ou de l’histidine pas de transport. Ici, on n’a donc pas de transport actif secondaire. L’ajout d’EDTA fait que l’on piège tous les ions bivalents, donc les LPS ne sont plus bien attachés. Création de trous temporaires dans la membrane perte de la totalité du contenu plasmique (protéines, ions…) qui est répendu dans le milieu extérieur. Toutes les prootéines solubles sortent dans le milieu extérieur. Dans le système de transport, on a surement une protéine soluble impliquée dans le transport et c’est pour cela que maltose ou histidine ne sont pas transportés. Cette protéine est appelée : protéine affine périplasmique. Dans ce transport, besoin de 4 protéines : - protéine affine périplasmique (fixe le substrat) - 2 protéines membranaires (impliqué dans le transport proprement dit) - 1 protéine cytoplasmique (lié à la membrane, elle fournit l’énergie nécessaire au transport du substrat)
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Microbiologie 2 Le transport du maltose chez E. coli : (Système transposable pour d’autres substrats). Le substrat traverse la membrane ext, une fois atteint le périplasme, le maltose se fixe à la protéine affine périplasmique = protéine Mal E. Celle-ci permet de concentrer le substrat d’un facteur 5 000 par la fixation du substrat sur la protéine. Mal E est donc en très grande quantité. Cette protéine conduit le substrat jusqu’aux transporteurs : Mal F et Mal G (qui sont présentes en – grande quantité). Puis, il y a la protéine Mal K qui est en relation étroite avec Mal F et Mal G. Mal K est toujours lié à la membrane à Mal F et Mal G. Est-ce que la protéine affine périplasmique accélère le transport ? Si mutant sans Mal E Il n’y a plu aucun transport de maltose. Donc la protéine Mal E est indispensable. Et on peut en conclure que le maltose n’est pas reconnu par Mal F et Mal G. C’est le complexe Mal E-ligand qui est reconnu par Mal F et Mal G. Le ligand tout seul ne se lie pas aux transporteurs (pareil pour le maltose). Il y a donc au moins 2 conformations pour Mal E : - libre - lié au ligand. Mal F et Mal G = transporteurs actifs, ils concentrent le substrat. Ex : le maltose peut être concentré 100 000 fois. Comment et quand est utilisée l’énergie ? Un chercheur a trouvé. Il y aurait plusieurs conformations pour Mal F et Mal G qui permettent l’entrée de maltose. Schéma 3 Changement de conformation de Mal E qui peut alors fixer le ligand (maltose). Dans cette configuration (complexe ligand Mal E), Mal E est alors capable d’interagir avec le complexe MalF/ MalG. Le transport nécessite alors un changement de conformation de Mal F et Mal G. Le ligand se fixe que Mal F et MalG et se détache de Mal E qui reprend sa conformation initiale. On n’a pas un port qui se crée, on a l’entrée du substrat mais il n’y a jamais une ouverture totale entre intérieur et extérieur. Mal K hydrolyse une molécule d’ATP et cette énergie va permettre à Mal F et Mal G de retrouver la conformation initiale qui les rend a nouveau compétant pour accepter le transport d’une nouvelle molécule de maltose par l’intermédiaire de Mal E. L’énergie dépensée à ce moment là est stockée sous forme conformationnelle dans les transports Mal F et Mal G. (si pas compris cette phrase pas grave). L’énergie est donc utilisée durant le transport donc transport actif primaire. Dans ce cas de transport, on peut transporter n’importe quel type de molécule (sucres, vitamines…). 7. La translocation de groupe (PTS). Fonctionne pour Gram+ et Gram-.
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Microbiologie 2 Il ne peut transporter que des sucres. Le substrat est modifié de telle sorte qu’il sera directement utilisable pour sa dégradation. Source d’énergie = PEP (phosphoénolpyruvate) est utilisé pour transporter différents substrat. Poly page 43 fig 3. 2 enzymes indispensables : Enzyme 1 et protéine HPr PEP donne son phosphate (P) donc donne du pyruvate. Le phosphate est transporté de l’enzyme 1 jusque l’enzyme HPr. Une fois que l’enzyme 2 a fixé la protéine, le manitol est phosphorylé en Manitol 1 P. Cas du glucose : Le phosphate est transporté jusque P III qui transfert son phosphate sur le Glc. Il y a phosphorylation du Glc en Glc 6 P. Ensuite le Glc 6 P, peut entrer directement dans la glycolyse. La 1ère étape est donc l’activation en sucre phosphorylé… ? Ce système de transport permet de gagner une molécule énergétique. Pourquoi le Glc a besoin d’une protéine en + ? La protiéne III est utilisée pour le transport du Glc mais est aussi utilisé pour empêcher les autres transports (interagit par ex avec complexe Mal G et Malf). 8. L’adsorption de substrats de masse importante. On prend l’exemple de Btu B. Dans la membrane externe, on trouve la protéine Btu B. Schéma 4. La fixation de la vitamine B12 sur la protéine Btu B ne nécessite pas d’énergie. Problème : il faut de l’énergie pour transloquer la vitamine sur la face interne. Il va falloir transporter l’énergie jusque de la membrane cellulaire. La protéine Ton B. La protéine interagit avec la Btu B et va changer de conformation. Cette conformation énergétique va être transférée à la protéine Btu B. Ce qui permet la translocation de la vitamine B12. 2 systèmes permettent de transporter les grosses molécules : - ce système - Porines spécifiques III.Motilité et tactismes. 1. Trouver l’habitat approprié. Les bactéries arrivent dans leur habitat par hasard car elles sont dépendantes de leur environnement. Par ex : elles sont transportées par l’eau… Donc les bactéries vont pouvoir se déplacer involontairement. On parle ici d’un autre déplacement plus limité : qq centimètres. 6
Microbiologie 2 Il faudra percevoir les variations du milieu extérieur. Toutes les bactéries ne sont pas capables de se déplacer volontairement (toutes ne possèdent pas de flagelle). Pour celles possédant des flagelles, on parle de tactisme. Tactisme car quand il y a présence de flagelle, les bactéries possèdent aussi tout un système de perception qui permet d’aller dans le bon sens etc… Des bactéries sont capables de se déplacer : - grâce au flagelle - sans flagelle en glissant sur le substrat - bactéries péritriches Tous ces modes de déplacement sont associés à un type de tactisme. Il existe 4 types de tactisme différents : - chimiotactisme = tactisme qui réagit à des [ ] de produits chimiques - Aérotactisme = réagit aux variations de [ ] de l’oxygène. - Phototactisme = permet aux bactéries de se déplacer vers la lumière. Certaines bactéries sont même capables de distinguer certaines longueurs d’ondes particulières. - Magnétotactisme = permet aux cellules de se déplacer le long des lignes de force du champ magnétique terrestre. Ex : E. coli : pH optimum ext = 7,2 Son tactisme c’est s’éloigner de pH troc acide ou basique. Recherche zones tempérées et évite les lumières bleues intenses. Elle est capable de se rapprocher de zones où il y a des [ ] de nourriture + élevées. On observe qu’il y a bcp de mutants. Page 47 Il y a 3 groupes de mutants au tactisme : - 1er type de mutation = mutation dans des gènes qui codent les protéines qui donnent le flagelle (partie bleu et verte) - 2ème Rouge - 3ème : gène qui codent des protéines et qui permettent la perception des variations du milieu extérieur transmis au moteur qui dit au flagelle de tourner dans un sens ou dans l’autre. 2. Mécanisme de la mobilité liée au flagelle. Comment les bactéries sont capables d’aller dans un sens particulier ? Dû en partie à la présence de la forme crochet du flagelle. Lorsque les flagelles tournent dans le sens des aiguilles d’une montre, on observe une structure ébouriffée qui permet aux bactéries de tourner sur elles-mêmes. Schéma 5a Lorsque les flagelles tournent dans le sens inverse des aiguilles d’une montre tous les flagelles se mettent dans le même sens pour former une sorte d’hélice composite. Permet à la bactérie d’avancer dans une direction. Schéma 5b
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Microbiologie 2 Permet aux bactéries d’aller + vite = 10 à 20µm/s. (revient à 60km/h pour un humain). Les bactéries avancent, s’arrêtent, tournent sur elles-mêmes, puis repartent dans une autre direction se produit régulièrement. L’hélice ne permet pas de tourner, juste aller tout droit. Test de nage : Se fait dans 3 ou 4g / L d’agar. Dans la boite, on dépose à un endroit particulier les bactéries (105). On attend qq heures. On commence avec un diamètre d’1mm environ. On va voir les bactéries qui vont se déplacer. On passe de 1mm à qq cm. On voit des cercles concentriques. Il n’y a pas de gradient dan ce milieu, donc pourquoi se déplace-t-elle ? Les bactéries elles-mêmes créés le gradient. En effet, elle consomme la nourriture la où elles sont, ensuite, il n’y en a plu donc elles se déplacent etc… Le gradient est donc automatiquement crée par les bactéries qui consomment les nutriments et qui se multiplient. Schéma 6 Résume poly page 44. On met les bactéries dans un milieu homogène. On observe au microscope : Schéma 7 = Mouvement d’une bactérie unie. Les ronds = bactéries qui culbutent dure un dixième de seconde. Le trait = bactérie qui nage dure 1 seconde (dans un milieu homogène et donc sans gradient). Milieu avec sérine : Création d’un gradient. On observe un changement de comportement des bactéries. Schéma 8 Toujours culbute de un dixième de sec. Mais allongement du temps de nage quand on est dans le bon sens. Par contre, lorsque que l’on ne nage pas dans le bon sens (pas vers nutriments), le temps de nage se raccourci. La bactérie se dirige dans une direction complètement aléatoire : - si bonne direction : allonge temps de nage - si mauvaise direction : raccourci temps de nage La bactérie analyse très souvent son environnement. 3. Le chimiotactisme : résultat d’une marche aléatoire biaisée. Comment les bactéries peuvent-t-elles percevoir les variations de concentrations du milieu extérieur ? 2 possibilités : - La bactérie a des capteurs de part et d’autre de son corps et elle compare entre 2 zones de son corps. Mais on peut penser que la distance entre l’avant et l’arrière de la bactérie est trop petit pour sentir des variations. Pas possible. - la bactérie peut mesurer à tout moment la concentration du substrat extérieure et la comparer avec la mesure précédente de concentration de substrat Bonne possibilité.
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Microbiologie 2 Expérience : On se met dans 3 conditions différentes. Schéma 9 * Sérine = 0mM. Les bactéries se déplacent, nagent, culbutent. Etat équilibré donc nage = 1 sec et culbute = 1 dixième de sec. * Sérine = 0,75mM (répartie de manière homogénéisée). La bactérie se rend compte qu’elle passe de 0 à 0,75 mM de sérine donc qu’elle doit allonger son temps de nage. On observe un allongement de tps de nage. La bactérie mémorise bien la concentration précédente. *Sérine = 0,24 mM (tjr jhomogène). Les bactéries culbutent + souvent et le temps de nage dure moins d’une seconde. La bactérie s’imagine qu’elle est tout le temps dans le mauvais sens donc elle réduit son temps de nage. Au bout d’un moment, dans les conditions 2 et 3, elles retourneront à 1sec / 1 dixième de seconde. 4. Nature et fonction des capteurs et de la transmission du signal. Poly page 48 Tsr, Tar et Trg = Capteurs qui perçoivent les variations de concentration des molécules attractives. Tsr reconnait sérine. Tar reconnait asp, et le maltone fixé à protéine affine … Ces 3 protéines sont capables de mesurer la concentration. Elles sont appelées des MCP = methyl Chemoreceptor Protein. Ce sont des protéine qui peuvent être méthylées. Schéma 10 Une fois que le ligand est fixé transmission d’info via d’autres protéines : - w = protéine de connexion qui relie le récepteur à une protéine essentielle = A - protéine A s’auto-phosphoryle et va pouvoir phosphoryler une protéine différente : Y Elle est capable de s’auto-phosphoryler (grâce à l’hydrolyse de l’ATP) puis de transférer son P sur Y. - Y : état phosphorylé ou non. Y phosphorylé va pouvoir interagir avec le flagelle on active la culbute. Si Y est non phosphorylé nage. La nage et la culbute dépendent donc de la phosphorylation de Y et donc de celle de A. A ne peut pas déphosphoryler. - Z déphosphoryle Y. Z a une activité constante. L’état de phosphorylation de A dépend de son interaction avec w et T.
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Microbiologie 2 Milieu homogène : On observe que T est dans un état particulier qui induit le changement de conformation de w qui permet à A d’être phosphorylé qui permet de phosphoryler Y un équilibre se créé entre phosphorylation et déphosphorylation 1sec / 1dixième de sec pour un milieu homogène. Milieu à haute concentration de ligand : Diminution de l’autophosphorylation de A et donc diminution de la phosphorylation de Y et comme Z a une activité constante, on augmente donc le taux de Y non phosphorylé et donc on augmente la nage. + il y a de Y phosphorylé + il y a de culbute + il y a de N non phosphorylé + il y a de nage Milieu à très haute concentration de ligand : Le phénomène s’accentue encore. On continue à inhiber la culbute et à nager + longtemps. Mais la bactérie ne va pas toujours dans le même sens car culbute aléatoire. Bactérie dans le bon sens : le ligand augmente. La bactérie se réoriente dans le mauvais sens. La bactérie se rend compte que la concentration de ligand à diminuer et reculbute tout de suite. Comment on arrive à mémoriser la concentration ? 2 protéines sont impliquées : - R : activité constante. Elle rajoute des méthyl (Me) sur différents sites du récepteur. Le degré de méthylation de la protéine donne de la mémoire au système. - B : existe sous de formes = phosphorylé ou non phosphorylé. Elle enlève les méthyles du récepteur. C’est A qui phosphoryle B. L’affinité avec le ligand dépend du taux de la méthylation du récepteur. Lorsque la concentration en ligand augmente cela conduit à augmenter le degré de méthylation du récepteur. Donc le récepteur T va avoir une affinité différente pour son ligand. Comme on augmente la quantité de Me, le récepteur devient réfractaire au ligand car le récepteur est sur-méthylé. S’il y a une concentration supérieure de ligand il est encore + méthylé. Il devient alors réfractaire à la concentration inférieure. S’il y a une concentration inférieure de ligand car mauvais sens favorise la culbute et donc B fonctionne et le récepteur devient à nouveau apte à percevoir la concentration inférieure car le récepteur est moins méthylé. Plus il y a de méthyles, + il faut une concentration élevée pour que le récepteur reconnaisse le ligand.
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Chapitre 6 : Communication bactérienne. I. Les capteurs de quorum. Ce sont des systèmes qui se déclenchent quand la quantité de bactérie est importante. 1. Mise en évidence. A été mis en évidence il y a un peu + de 30 ans. Mise en évidence pour la 1 ère fois par des chercheurs qui travaillaient sur la production de lumière du calamar. La fluorescence des ces animaux est due à la présence de bactéries dans certains endroits de leur corps. Les bactéries présentes chez des invertébrés ou des poissons = Vibrio fisheri. Réaction qu’ils font : FMNH2 + RCHO + O2 FMN + R-COOH + hυ (494nm) Enzyme = luciférase. 2. Communication intraspécifique. Les bactéries remplissent des cavités spécialisées. Dans l’eau de mer, il y a une concentration de Vibrio très faible. Lorsque le calamar nait les cavités sont vides. Il va faire rentrer dans ces cavités quelques bactéries de l’espèce Vibrio fisheri mais pas bcp car concentration faible. Une fois que les bactéries sont entrées dans cet organe, le calamar leur donne des conditions de vie qui va leur permettre de se développer de manière très importante. La bactérie possède 2 flagelles à l’état libre. Lorsqu’elle rentre dans l’organe de Vibrio, elle perd ses flagelles, change un peu de métabolisme. Le Vibrio va pouvoir se multiplier de manière considérable grâce aux conditions du milieu de l’organe. Arrivée à une certaine concentration, Vibrio active la luciférase et effectue la réaction le calamar devient fluorescent. Le calamar peut contrôler la quantité de bactérie qu’il possède. Il peut contracter cet organe pour expulser les bactéries s’il y en a trop. Il y a même présence de macrophage pour que le calamar ne soit pas envahit par les bactéries. La fluorescence lui sert à se camoufler. La journée, il vit enfouit. La nuit, il monte en surface. Si c’est une nuit avec beaucoup d’étoiles, en remontant à la surface, il va représenter une tache noire proche de la surface et être repéré. S’il est fluorescent il se confond avec la lumière. S’il n’y a pas bcp de lumière expulse les bactéries la concentration de bactérie diminue La réaction ne se produit plus plu de fluorescence. La production de lumière est conditionnée par la quantité de bactéries. 3. Les bactéries à Gram négatif. Pour les capteurs de quorum, on à un couple de protéines :
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Microbiologie 2 LuxI / LuxR 2 protéines indispensables pour activer la luciférase. Schéma 1. 2 milieux différents. Dans les 2 cas, on a apparition de lumière à la même concentration de bactérie. Donc le système n’est pas dépendant du temps de génération mais est dépendant principalement de la concentration des bactéries dans le milieu. Pourquoi à une concentration donnée, toutes les bactéries sont fluorescentes en même tps ? Il doit y avoir une molécule dans le milieu qui permet ce phénomène. Idée : les bactéries réagissent à une molécule sécrétée dans le milieu extérieur. Expérience : Milieu conditionné = milieu dans lequel on fait pousser les bactéries, on récupère notre culture (en phase de fluorescence), on centrifuge et récupère le surnageant. Pour être sûr qu’il n’y a pas de bactérie on filtre. On obtient un milieu stérile dépourvu de toute trace de bactérie. A ce milieu, on ajoute des éléments nutritifs. Dans ce milieu, on ajoute à nouveau des bactéries de type Vibrio à une concentration faible. Dans ces conditions, les bactéries sont fluorescentes dès le début. Montre que dans le milieu, il y a une molécule qui permet aux bactéries de fluorescer. Ce n’est pas la quantité de bactérie qui déclenche la fluorescence mais + probablement la concentration de la molécule du milieu qui permet de déclencher la fluorescence. Hypothèse : Les bactéries synthétisent constamment cette molécule, donc + on avance dans le temps, + la concentration de la molécule augmente. Donc la quantité de molécule sécrétée est proportionnelle à la quantité de bactérie. Arrivé à une certaine concentration permet de déclencher une cascade de réaction. Cette molécule sécrétée est un auto-inducteur (car sécrété par la bactérie elle-même). Chaque espèce de bactérie possède sa propre : Acyl Homosérine Lactone (AHSL). Molécule sécrétée = auto-inducteur. C’est un système qui permet la reconnaissance des bactérie de la même espèce. Schéma 2 Basse concentration : A faible concentration, LuxI synthétise l’auto-inducteur en permanence. Cet auto-inducteur, de part sa composition, peut diffuser à travers les membrane. Donc équilibre de [AHSL] de part et d’autre de la membrane. Mais LuxR n’est pas capable d’activer les gènes. Forte concentration : A partir d’une certaine concentration, Lux R est capable de fixer AHSL et donc d’activer les gènes. Ces gènes vont produire des luciférases qui vont permettre de réaliser la réaction et donc fluorescence.
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Microbiologie 2 Chez Pseudomonas aeruginosa : Nombre important de gènes virulents qui ne doivent pas être exprimer tous au même moment cascade de régulation minutieuse de l’expression de gène qui mène à la virulence. Pseudo a trouvé un système, elle à 2 capteurs de quorum différents : - LasI / LasR - RhlI / RhlR Les 2 systèmes sont des homologues de LuxI/LuxR RhlI va produire une AHSL qui sera reconnue par RhlR (mais pas par LasR). Il n’y a pas de réaction croisée entre les 2. Comment peut-on avoir une cascade de régulation ? On a plusieurs gènes de régulation. On dit qu’on a 2 catégories de gènes régulés qui doivent être exprimés à des moments différents. Ceux régulée par Las doivent être régulés + tôt que ceux régulés par Rhl. Vir I = gène exprimé précocement (Régulateur = LasR) VirII = gène exprimé + tardivement (régulateur = RhlR) Schéma 3. Basse concentration : Las I synthétise ASHL (carré sur schéma) en même temps RhlI synthétise son AHSL (triangle). Les 2 molécules d’AHSL sont synthétisées au même moment. Dans les gènes régulés par LasR, on a avant rhlR. De +, on a le régulateur LasR déjà présent dans la cellule. LasR n’est pas capable d’activer rhlR et vir I. Forte concentration : Las R est alors capable de reconnaitre l’AHSL correspondante qui est en concentration suffisante. On peut alors activer tous les gènes répondants à LasR. Il y a transcription des gènes de 1ère catégorie des gènes de virulence. Et début de transcription des gènes d’RhlR. Donc expression différentiel des gènes grâce à l’expression différentielle des régulateurs. Au bout d’un certains temps, RhlR est synthétisé et est en quantité suffisante pour activer les gènes de virulence de 2ème catégorie. Schéma 4 La partie qui varie = bleu. 4. Bactéries à Gram positif. Peptide synthétisé dans les bactéries et sécrété dans le milieu extérieur et s’accumule. A une concentration suffisante de peptide déclenche l’expression. Mais le peptide est incapable de traverser la membrane tout seul. Besoin d’une machinerie pour sécréter le peptide dans le milieu extérieur. Une fois dans le milieu extérieur, le peptide ne rentre plu dans la bactérie il faut détecter la concentration dans le milieu extérieur et
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Microbiologie 2 transmettre l’information que les peptides sont en quantité suffisantes et permettre l’expression des gènes cibles. schéma 5 Le peptide est fait à partir d’un petit ARNm. Cet ARNm code un petit peptide d’environ 40 AA. Ce peptide va être clivé et seul la partie rouge va être sécrétée dans le milieu extérieur, les autres parties vont disparaitre. On se retrouve avec un peptide de 8/10 AA transport spécifique de transport de ce peptide. Le peptide se retrouve à l’extérieur. Le système est globalement le même que pour Gram-. Le peptide s’accumule au fur et à mesure que la concentration cellulaire augmente. Une protéine régulatrice doit aller activer les gènes. Dans cet état, la protéine régulatrice ne fonctionne pas. Une protéine transmembranaire est un capteur. Ce capteur va percevoir la concentration des polypeptides à partir du moment où elle est suffisante. A partir de cela un mécanisme se met en place : - autophosphorylation du capteur - le capteur peut alors transmettre le P au régulateur devient actif. - Le régulateur va alors activer l’expression des gènes cibles. Les bactéries qui utilisent ce système : - streptococcus - bacillus subtilis 5. Communication interspécifique. On a vu les auto-inducteurs de type I. On a trouvé récemment des auto-inducteurs de type II. Structure totalement différente. Ces systèmes peuvent être reconnus par des bactéries Gram+ et Gram-. On a montré que certaines plantes (en particulier le Varech) qui sont contaminées par une bactérie particulière (Serratia Gram+). Elle digère les feuilles de Varech. On s’est aperçu que le Varech est devenu résistant à Serratia. Le varech sécrète une molécule qui est de type AHSL reconnue par Serratia. Lorsque Serratia arrive pour coloniser, elle reconnait l’AHSL, va alors exprimer des gènes de virulence au mauvais moment et ne pas réussir à infecter le Varech élimination de Serratia.
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Chapitre 7 : Pathogénie et symbiose. I. Introduction. On se place du côté des bactéries. Comment sont-elles capables de réaliser une infection ? II. Les étapes de l’infection. • Maintenir un réservoir. La bactérie doit se trouver à un endroit pour vivre ou pour survivre entre 2 infections. Cela signifie sa capacité de nuire à un hôte et déterminer sa capacité à vivre sans son hôte. • • • • • •
Transport vers l’hôte. Adhérer et coloniser l’hôte. Multiplication dans l’hôte. Echapper aux défenses de l’hôte. Capacité à nuire son hôte. Quitter son hôte et retourner à l’étape 1.
Ces étapes sont pour les pathogènes. Pour un symbionte, on remplace « capacité à nuire son hôte » par « capacité à apporter qqch à son hôte ». • Maintenir un réservoir. Le réservoir peut être le milieu environnant : eau… Le réservoir peut également être un hôte intermédiaire comme un animal ou une plante, cet hôte n’est pas infecté. • Transport sur l’hôte. Transport via l’air, l’eau… Transfert direct entre porteur sain et hôte définitif. • Adhérer et coloniser l’hôte. Etape très importante. Lorsque la bactérie entre dans l’hôte en quantité très limitée. Donc elle peut être éliminée très vite. En entrant dans l’hôte, la bactérie essaie de ne pas se faire repérer et commence à se multiplier. Elle a donc besoin de nutriment. Les adhésines permettent de se fixer aux tissus de l’hôte infecté. La bactérie doit s’adapter à un nouveau milieu = l’hôte. • Multiplication dans l’hôte. A partir de ce moment, la bactérie déclenche la synthèse de facteurs de virulence. Elle doit se déplacer et sécrète des produits qui permettent de détruire les jonctions entre les ccellules voir même de lyser les cellules. La bactérie se multiplie et se développe. Puis la bactérie quitte son hôte.
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Microbiologie 2 III.Les facteurs généraux de virulence. Ces facteurs sont nombreux et assez complexes à mettre en évidence. Ils sont nécessaires pour la vie à l’extérieur et à l’intérieur de l’hôte. Facteur de virulence = molécule bactérienne nécessaire au bon développement de la bactérie. On repère ces facteurs : Lorsque l’on inactive un gène et qu’on met ce mutant dans l’hôte. On regarde les facteurs de virulence dans l’hôte. Un gène muté conduit à l’absence de facteurs de virulence. La bactérie doit reconnaitre qu’elle est entrée dans l’hôte, facteurs de régulation : - température + élevée - osmolarité + élevée - abondance de nutriments - carence en fer - détection de substances spécifiques de l’hôte Tous ces facteurs sont perçus par la bactérie. La bactérie produit alors des facteurs de virulence. La production des facteurs de virulence est séquentielle. Il existe de nombreux régulateurs. Chaque régulateur va réguler plusieurs facteurs de virulence différents. Chaque facteur de virulence va, en générale, être régulé par plusieurs facteurs de régulation (régulateurs). IV. Les mécanismes de résistance aux défenses de l’hôte. Toutes les conditions environnementales doivent être réunies pour pouvoir déclencher correctement la virulence. Facteurs de virulence : - Adhésines - Expression et synthèse de toxines. - Synthèse d’éléments permettant de se défendre contre les défenses de l’hôte. - Capsule : permet de se défendre contre la phagocytose. - Molécule sécrétée Position des gènes de virulence : - les gènes sont présents autour… - les gènes sont présents sur un bactériophage tempéré - les bactéries possèdent un plasmide qui porte les gènes de virulence Si le plasmide est perdu, la bactérie peut vivre à l’extérieur de l’hôte mais n’est plus virulente. - tous les gènes sont regroupés au même endroit à l’intérieur du chromosome. Toute une zone du chromosome regroupe la totalité des gènes de virulence = Ilot de pathogénicité. Ces ilots contiennent beaucoup de bases G et C. Ilots transférables entre bactéries manière pour créer de nouvelles espèces pathogènes V. Pathogènes et symbiotes des plantes. Bactérie spectre d’hôte large : ne peut pas infecter une plante saine. Il faut que la plante est une blessure pour permettre à la bactérie d’entrer. 2
Microbiologie 2 Par contre, les b° spécifiques d’un hôte sont capables d’entrer par elles-mêmes dans la plante. 1. Agrobacterium tumefaciens : la gale du collet. Agrobacterium tumefaciens est une bactérie à large spectre d’hôte qui attaque les plantes légumineuses. Maladie provoquée = la gale du collet. En général, la maladie n’est pas fatale à la plante. Ex : vigne, plants de tomate, carottes… A l’état naturel, Agt est une bactérie de la rhizosphère (proche des racines). La bactérie n’est pas gênante pour la plante. Elle se multiplie et consomme des substances rejetés par la plante. Elle fait partie des α-protéobactérie et plus particulièrement de la famille des Rhizobiacées. Elle présente un plasmide appelé Ti qui porte tous les gènes de virulence. Tant que la plante est saine, elle ne peut pas être infectée par Agt même si présente en grande quantité. Si la plante a une blessure, il peut y avoir colonisation de la plante par les bactéries. Il faut que les bactéries détectent la blessure de la plante. Les Agt ont un flagelle et font du chimiotactisme. Une partie du chimiotactisme est dédiée à la détection de la sécrétion de substances spécifiques de la plante lorsqu’elle est blessée. Environ 10% des bactéries sont capables de se déplacer + efficacement vers une blessure. Seul 10% de la population totale d’Agt possède le plasmide de virulence. Toutes les bactéries vont se diriger vers la blessure mais seul les 10% possédant le plasmide perçoivent les substances spécifiques sécrétées par la plante quand blessure. Reconnait des concentrations de 10-7 Molaire. Composés spécifiques reconnus : Ex : acétosyringone joue un rôle attractant pour les bactéries possédant un plasmide (et jouera un autre rôle + tard). Un certains nombre de perméases vont être synthétisées et inclues dans les membranes d’Agt va permettre de faire entrer des molécules spécifiques uniquement utilisable par Agt. Acétosyringone permet la synthèse d’une perméase spécifique d’Agt. Il va y avoir hétéroconjugaison entre la bactérie et une cellule végétale. Schéma 1. Uniquement l’ADNt est transféré dans la plante. Il se retrouve dans le noyau et ce fragment s’insère au hasard dans l’un des chromosomes de la plante. Tous les gènes portés dans l’ADNt vont ensuite s’exprimer dans l’ADN de la plante. Ce transfert dépend d’un système de capteurs de quorum. 1. Synthèse d’hormones végétales qui permettent le développement des cellules végétales qui vont conduire au développement de la gale collet. On amplifie les cellules végétales portant l’ADNt dans le but de permettre à la cellule végétale de produire des métabolites qui vont être ensuite consommés par la bactérie. Ces métabolites sont : - agrocinopine - opines Ces molécules vont êtres libérées dans le milieu extérieur. Seul les Agt possèdent les systèmes de transport pour dégrader ces molécules et les utiliser.
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Microbiologie 2 Schéma 2 Schéma 3 Agrobacterium radiobacter : Elle possède un plasmide particulier = pAgK84. Elle est capable de consommer les éléments agrocinopine et opine mais est incapable de les faire sécréter par la plante. Elle fait entrer de l’agrocine dans le cytoplasme puis synthétise un analogue toxique de l’adénine. Ceci est toxique pour Agt et le détruit. Permet à Agr de prendre toute la place et de consommer les nutriments. 2. Sinorhizobium meliloti : la fixation de l’azote. Elle est une α-protéobactérie. Elle interagit avec une plante hôte et établit une symbiose. Elle sécrète de l’azote (N2). Elle n’a pas de large spectre d’hôte. Elle interagit avec une seule espèce de plante. N2 2 NH3 16 ATP Comment reconnait-elle la plante hôte ? Il faut des molécules spécifiques de la plante et de la bactérie. La plante produit tout le temps des molécules particulières même sans être blessée. Chaque plante produit ses propres molécules sécrétées. Elle produit des molécules phénoliques. Les bactéries vont percevoir ces dérivés phénoliques. Et si, aux alentours de la plante, il y a la bonne bactérie les molécules de la plante vont être reconnues par les bactéries. Au moment où la bactérie perçoit les molécules phénoliques sécrétées par la bonne plante, elle commence alors à sécréter des facteurs de nodulation. Ces facteurs sont des molécules particulières = un sucre lié à un acide gras. Chaque espèce de bactérie synthétisera son propre facteur de nodulation. La plante reconnait le facteur de nodulation Reconnaissance réciproque Cela augmente la spécificité du système. La plante autorise alors la fixation des bactéries sur les … (radicelle ?) de la plante. Des rhicadésines spécifiques vont être reconnues par des lysines spécifiques à la surface de la plante. Chaque espèce bactérienne a ses rhicadésines spécifiques. Le poil racinaire va alors se courber et les rhicadésines entrent dans les racines. Les bactéries entrent à l’intérieur des cellules de la plante. Schéma 4. Les bactéries vont alors se multiplier de manière importante et remplir les cellules végétales. Les bactéries vont grossir de 7 fois et être transformées en bactéroïdes. Ces bactéroïdes ne pourront plus jamais retourner à l’état de bactérie. Les bactéries vont être nourries par les substances nutritives fournies par la plante. En échange, la bactérie synthétise la nitrogénase pour permettre la réaction N2 2 NH3.
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Microbiologie 2 Problème, cette nitrogénase ne supporte pas l’oxygène. La plante développe un réseau xylème/phloème pour transporter les nutriments. La chaine respiratoire des bactéries fonctionne problème présence d’O2. La plante synthétise de la leghémoglobuline qui entoure complètement les bactéries. La leghémoglobine : une partie synthétisée par la bactérie et une autre synthétisée par la plante. Le plasmide Sym contient tous les éléments indispensables à la symbiose. 10% seulement possèdent ce plasmide. On place le plasmide d’Agrobacterium dans rhizobium : Le rhizobium devient pathogène. Le plasmide Ti possède donc tous les facteurs de virulence. On place le plasmide Sym dans Agrobactérium. Agt devient une bactérie symbiotique. Elle va fabriquer des nodules mais elle sera en aucun cas capable de produire de l’azote car le gène de la nitrogénase est sur le chromosome et non sur le plasmide. Conclusion : La totalité des gènes de virulence ou de symbiose sont bien tous situés sur le plasmide. 3. Pseudomonas syringae : La réponse hypersensible. Il y a 2 groupes de gènes chez les bactéries : - gène de virulence - gène d’avirulence Des gènes peuvent être à la fois de virulence et d’avirulence. Des gènes de résistance vont se déclencher selon si l’on est dans l’hôte ou non. Dans la plante hôte, les gènes de virulence sont déclenchés. Dans la plante non hôte, les gènes d’avirulence sont déclenchés et empêchent la bactérie de se propager dans la plante. Réponse hypersensible. On dépose des bactéries à la surface de la plante non hôte. La plante reconnaît une agression. Les cellules disposées autour du dépôt bactérien vont modifier leur métabolisme. Entrée de H + et Ca2+ et sortie de K+ forte hausse du pH extracellulaire. Les bactéries n’aiment pas ce pH et commencent à êtres détruites. Mais les cellules végétales commencent également à être détruites. 1. Augmentation du pH. Destruction progressive des bactéries et des cellules végétales autour du dépôt. 2. Les cellules végétales sécrètent des substances en mécanismes de défense. 3. Les cellules végétales dans un périmètre un peu plus éloigné sécrètent des radicaux oxygénés ROS. Mais ces ROS détruisent également les cellules qui les produisent. Mais détruit également un peu les bactéries.
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Microbiologie 2 4. Etablissement d’un cordon sanitaire pour empêcher la prolifération des bactéries. Dans la zone sanitaire toutes les cellules végétales meurent. Et toutes les bactéries meurent par apoptose. En parallèle, on induit une réponse systémique (qui se propage à toute la plante), des substances vont permettre à cette zone de mieux résister s’il y a une autre infection. Pseudomonas syringae est une bactérie spécifique de l’haricot. Elle créé des trous dans les feuilles. VI. Pathogènes des animaux. 1. Yersinia pestis : la peste. Mort 7 jours après avoir été infecté. 3 pandémies : 2 en Europe et 1 dans le monde entier. 3ème pandémie : Hong Kong 1894. Il y a encore des morts aujourd’hui environ 2000 /an. Epidémie = atteinte simultanée d’un grand nombre d’individus d’un pays ou d’une région par une maladie contagieuse. (Grippe, collera…) Pandémie = une épidémie qui atteint les populations d’une zone géographique très étendue càd 1 ou plusieurs continents (peste, sida…) Endémie = maladie particulière à une région donnée qui existe de façon quasi permanente. (Collera, paludisme…) L’épidémie est accidentelle tandis que l’endémie est chronique et permanente. Yersinia pestis : Entérobactérie. Elle possède un plasmide de virulence. Bactérie très jeune car apparue il y a environ 20 000 ans. Elle est issue d’une autre bactérie = Yersinia pseudotuberculosis. Yersinia pseudotuberculosis est une proche voisine de yersinia enterocolitica. En passant de Yersinia pseudotuberculosis à Yersinia pestis. Yersinia pestis a perdu des gènes par rapport à Yersinia pseudotuberculosis. Cette perte de gène conduirait à une régulation différente de gène, notamment de gènes de virulence. Ce qui la rend + agressive, + pathogène. Virulence extrême mais perd sa capacité à survivre dans des milieux dénaturés (sur une table…). Alexandre Yersin a mis en évidence le bacille de la peste. L’hôte principal de Yersinia pestis n’est pas l’Homme mais le rat et la souris. L’Homme est un hôte intermédiaire. Les vecteurs et les hôtes intermédiaires obligatoires = les puces. Les puces présentes sur les rats sautent sur l’Homme et transmettent la maladie. Il existe 2 manières de transmettre la peste : • Transmission par les rats / souris.
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Microbiologie 2 Seule une trentaine d’espèces de puce qui peut transmettre la peste. Lorsqu’une puce normale arrive sur un hôte, elle le pique et se gorge de sang. Si cette puce saine pique un individu malade, elle ingurgite des bacilles de la peste. Ces bacilles vont se développer dans le tube digestif de la peste, dans l’œsophage. Elle va complètement bloquer ce tube digestif en formant un biofilm. La puce va piquer l’hôte et essayer d’absorber du sang mais elle ne va pas y arriver. Donc elle va piquer continuellement pour essayer de manger. Elle régurgite le sang aspiré et donc délivre des bactéries dans l’hôte. La puce finit par mourir et l’hôte est infecté à son tour. Il suffit de 80 bactéries pour provoquer la maladie. Cette peste s’appelle la peste bubonique ou peste noire. Les bactéries se dirigent ensuite vers les ganglions lymphatiques où elles se multiplient. Ces ganglions gonflent ce qui donne des bubons. Une fois que le ganglion est plein de bactérie, les bactéries vont se déverser dans le sang septicémie qui entraine la mort de l’individu en 2 jours. • La peste pulmonaire. Mort en 24 à 48h. Elle se transmet d’Homme à Homme. Les bactéries se disséminent dans l’air par éternuement, toux… L’individu sein inhale les bactéries et se retrouvent dans les poumons. Les bactéries se retrouvent directement dans le sang et il y a septicémie presque immédiatement. Mort très rapide. Septicémie = Infection généralisée très grave due à la prolifération dans le sang de bactéries pathogènes. Les hôtes intermédiaires sont des rongeurs qui ne sont pas des rats ou des souris. La bactérie est capable de se maintenir pendants des années en dormance. Elle se redéclenche en présence de l’Homme, du rat ou de la souris. Ces rongeurs sont insensibles à la bactérie mais peuvent la maintenir en vie = réservoir de la bactérie. 2. Shigella flexneri : la shigellose. Il en existe 3 espèces mêmes symptômes. Elle infecte le système intestinal et provoque la diarrhée. Entérobactérie. Elle possède un plasmide de virulence de 220kb. Les 3 espèces : - Shigella flexneri - Shigella sonnei - Shigella dysen Elles se développent exactement de la même manière et provoquent les mêmes symptômes. Leurs génomes sont un peu différents et se trouvent dans des régions différentes. Même si elle n’est pas systématiquement mortelle, c’est une vraie pathogène. Lorsque l’on est infecté, on est forcément malade. 100 bactéries suffisent pour être malade. On pense même que 10 bactéries suffisent.
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Microbiologie 2 Puisque c’est une bactérie très efficace, elle ne reste pas en vie très longtemps dans un milieu non naturel. Elle doit donc se multiplier en grande quantité pour avoir une chance d’infecter. On la retrouve dans les eaux contaminées. Le seul endroit où elles sont capables de se maintenir en vie à part leur hôte naturel est dans les produits laitiers. Ce sont des parasites intracellulaires. Elle traverse l’œsophage et arrive dans l’estomac où elle doit résister à l’acidité. Elle se dirige dans l’intestin grêle où elle commence à effectuer son cycle de virulence. Son but est de pénétrer à l’intérieur des cellules intestinales = cellules de la bordure en brosse. Problème : elle est incapable de pénétrer dans ces cellules par le côté bordure en brosse. Il va falloir trouver une méthode alternative pour pouvoir entrer dans ces cellules. Elle entre par les cellules M de la plaque de Mayer qui ne possèdent pas de bordure en brosse. Elle entre dans les cellules à bordure en brosse par les faces latérales ou par en dessous. Les cellules M ne sont pas des macrophages et ne pratiquent pas la phagocytose. Shigelle a besoin de se faire phagocyter par la cellule réceptrice. Shigelle, elle-même, développe un système pour obliger les cellules à la phagocyter. Shigelle injecte sa seringue dans la cellule M. Des cellules de la bactérie entrent dans la cellule M et vont recruter l’actine. Une vésicule d’endocytose entre dans la cellule M grâce à la polymérisation de l’actine et Shigelle peut entrer. Il y a dépolymérisation de l’actine. Elle se multiplie alors dans la cellule M. Shigelle ressort de l’autre côté de la cellule (coté opposé à la lumière intestinale). Elle va se faire phagocyter par les macrophages. Une fois entrée dans le macrophage, elle va induire l’apoptose des macrophages. L’entrée dans les macrophages provoque une haute réponse inflammatoire qui a pour conséquence que de nombreux nouveaux macrophages arrivent sur le lieu de l’infection ce qui augmente l’inflammation fragilise la membrane des cellules à bordure en brosse. Les cellules à bordure en brosse ne sont plus jointives car il y a le passage de cellules immunitaires. Ceci permet l’entrée de Shigella dans les cellules à bordure en brosse. Shigella se multiplie alors dans le cytoplasme des cellules à bordure en brosse. Elle est capable d’éliminer les bordures en brosse des cellules. Poly page 58 Shigella passe ensuite directement d’une cellule à bordure en brosse à une autre. Elle recrute à nouveau l’actine et synthétise des polymères permettant de fixer l’actine. Ceci lui permet de se déplacer + facilement. Diarrhée. 3. Bacillus anthracis : le charbon. = l’anthrax (nom américain). 2 formes : - spore ne se multiplie pas mais est très résistante. - bactérie germée = bactérie végétative La forme végétative a une durée de vie hors de son hôte de quelques minutes à quelques heures. Cette forme végétative n’a aucun pouvoir pathogène.
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Microbiologie 2 La forme virulente est la spore. La maladie ne peut être déclenchée qu’à partir de la spore. La spore est inhalée. Elle germe, se multiplie et sort de l’hôte pour sporuler à nouveau. Il y a 3 formes différentes de la maladie : - forme cutanée : par piqure ou blessure contamination. La plus répandue. Facile à diagnostiquer et à soigner. - forme intestinale : - forme pulmonaire : Pour les 2 dernières se développe sans signe extérieur au départ. Quand les 1 ers signes de la maladie apparaissent, il est trop tard car la septicémie a déjà commencée mort par septicémie. C’est un pathogène extracellulaire. Transitoirement, la bactérie doit passer par le macrophage. La bactérie est phagocytée à son entrée. Fusion avec le lysosome phagolysosome. La spore devrait disparaître car signe de germination de la spore. Elle ne germe qu’en milieu acide (lysosome : milieu acide). Elle se multiplie dans le phagolysosome… Les cellules végétatives se multiplient et continuent à synthétiser des toxines de 2 types : - létales : tue les cellules de l’hôte - facteur d’œdèmes Elle se multiplie dans le sang septicémie, l’individu meurt. Les bactéries végétatives vont se retrouver à l’extérieur de l’hôte. Une fois hors de l’hôte, la sporulation des bactéries végétatives se produit. L’oxygène est le signal qui indique à la bactérie de sporuler. La pression partielle en oxygène est beaucoup + basse à l’intérieur de l’hôte qu’à l’air libre. Mécanisme de défense de cette bactérie : - Une capsule l’empêche d’être à nouveau phagocytée par les macrophages. Polymère d’acide D-glutamique. Elle n’est pas antigénique. - Couche S qui participe à la pleine virulence de cet organisme. Il y a 2 toxines : - facteur létal : LF - facteur d’œdèmes : EF Ils sont inefficaces à eux seul, besoin d’une 3ème substance : antigène protecteur (= PA). Ces 2 toxines doivent être associées à PA pour fonctionner. LF + PA EF + PA Ces 2 facteurs doivent entrer à l’intérieur de la cellule. Cette entrée est permise par PA. Une protéine de la membrane est reconnue par PA donc il y a fixation à la membrane. Une protéase de la cellule eucaryote va cliver en 2 parties inégales PA permet à la partie la + grande de s’insérer à l’intérieur de la membrane de la cellule eucaryote = forme un pore. Les facteurs EF et LF peuvent alors traverser la membrane et entrer dans la cellule. Bacillus anthracis possède 2 gros plasmides :
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Microbiologie 2 - pOX1 : porte les gènes de toxine, les gènes de la germination et quelques gènes du métabolisme général (143 gènes) - pOX2 : porte les gènes de la capsule (85 gènes) peut être éliminé. Le plasmide pOX1 est donc ici indispensable et non accessoire comme un plasmide devrait l’être.
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