LAS POBLACIONES 1. El crecimiento microbiano se refiere al crecimiento de una poblacion - un aumento en el número de células, no un aumento en el tamaño de una célula individual.
Figura 8.11 Filtración. Tabla 8.7. Métodos de determinación del número de microorganismos. Microorganismos Tipo de Método para los que se Usos / Limitaciones recuento utiliza Indirecto Turbidez
Peso se seco Actividad metabólica Directo Recuento microscópico
Recuento electrónico Recuento en placa
La mayoría de las bacterias y levaduras
Total
Cualquier Tot ota al microorganismo Cualquier Viab Vi able les s microorganismo viable
Cualquier microorganismo unicelular
Total
Cualquier microorganismo unicelular Cualquier microorganismo unicelular viable
Tot ota al
Viab Vi able les s
Numero más probable
Cualquier Viab Vi able les s microorganismo viable
Filtración
Cualquier Viab Vi able les s microorganismo viable
Determina la tu turbidez co con un un espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se requiere una curva patron Ted ediioso y req equ uier ere e un ci cie erto ti tie empo, per pero o preciso y reproducible Requ Re quie iere re un ci cier erto to ti tiem empo po y pue puede de se ser r impreciso; puede utilizarse con materiales complejos Muy út útil pa para el re recuento de un titipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Muy úti till par ara a el recuen ento to de cé célu lula las s de un cultivo axénico; rápido y preciso; no debe estar presente material extraño Muy Mu y sen sensi sibl ble e - pu pued ede e det detec ecta tarr inc inclu luso so un una a célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de colonias Util Ut iliz izad ado o par para a mic micro roor orga gani nism smos os qu que e son son difíciles de cultivar en medio sólido y para determinar contaminación por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo Se co conc ncen entr tra a una una mu mues estr tra, a, de ma mane nera ra qu que e se puede recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de un líquido o de un gas
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CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS 1. El tiempo de duplicación es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente. 2. La tasa de crecimiento se mide normalmente como el tiempo de duplicación por hora. 3. El crecimiento exponencial significa que durante cada tiempo de duplicación, el número de células de la población se incrementa por un factor de dos. La fórmula es N = 2n, donde N es el número de células en el cultivo después de que han pasado n tiempos de duplicación. 4. El crecimiento microbiano se representa gráficamente en una escala logarítmica. 5. Un cultivo microbiano pasa típicamente por cuatro fases distintas de crecimiento: la fase lag, la fase log, la fase estacionaria y la fase de muerte. Las fases lag y de muerte no se producen a veces en un cultivo determinado. 6. Generalmente, la fase lag se produce cuando las células en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Es un período de no crecimiento, pero existe una actividad metabólica considerable, ya que las células se preparan para crecer. 7. La fase log no continúa indefinidamente debido a factores como la reducción de nutrientes o a la acumulación de productos tóxicos. 8. Durante la fase estacionaria no se produce un incremento neto de la masa, pero las células se hacen más pequeñas y sintetizan componentes que les ayudan a sobrevivir durante los períodos de no crecimiento. 9. Durante la fase de muerte, las células mueren exponencialmente, pero a una tasa más baja de la que crecen en la fase log. Generalmente la muerte se produce porque las células agotan sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los componentes celulares. 10. En condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua en el ambiente de una célula a bajas concentraciones, de manera que la tasa de crecimiento es fijada por la concentración del nutriente más escaso, o nutriente limitante. 11. En el laboratorio, se consigue un cultivo continuo con un quimiostato. La concentración del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo. 12. Las células de una colonia están en fases diferentes de crecimiento dependiendo de su localización. Las células que crecen en la superficie de una colonia son aeróbicas y las que están en el centro son anaeróbicas.
¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER? 1. Los nutrientes son compuestos químicos procedentes del medio ambiente que son utilizados por una célula para sintetizar las moléculas necesarias para fabricar nuevas células. 2. Todos los microorganismos requieren una fuente de carbono para crecer, porque el carbono es la base estructural de los compuestos bioquímicos. 3. El oxígeno desempeña un papel complejo en el metabolismo microbiano - como nutriente, como aceptor de electrones y como generador de productos tóxicos, Los microorganismos que son capaces de una respiración aeróbica utilizan el oxígeno gaseoso para generar energía. 4. Los compuestos tóxicos que contienen oxígeno son productos del metabolismo aeróbico. Entre ellos se encuentran el peróxido de hidrógeno y los radicales libres superóxido y el radical hidroxilo. 5. Los aerobios estrictos pueden crecer tan sólo en presencia de oxígeno. Los microaerófilos toleran menos oxígeno. Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. Los anaerobios aerotolerantes no requieren oxígeno pero no mueren al ser expuestos a él. Los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxígeno. 6. Todos los seres vivos requieren alguna forma de nitrógeno (un constituyente de las proteínas y de los ácidos nucleicos, así como de determinados metabolitos esenciales), de fósforo (un constituyente de los ácidos nucleicos, de los fosfolípidos y de ciertos metabolitos esenciales) y de azufre (un componente de dos aminoácidos, de algunos tipos de tRNA, y de determinados metabolitos esenciales). 7. Los elementos traza son compuestos químicos inorgánicos, que se requieren en cantidades pequeñas, aunque son esenciales, tales como el potasio, el hierro y el zinc, que los microorganismos necesitan para crecer. Algunos elementos traza son cofactores. 8. Los factores de crecimiento orgánicos son bloques básicos esenciales. Si un microorganismo no puede sintetizar un determinado bloque básico en particular, debe ser suministrado a partir del ambiente. Los factores de crecimiento orgánicos pueden ser aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos o vitaminas.
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9. La diversidad nutricional se refiere a los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgánicos de los microorganismos. 10 Los microorganismos crecen en un ambiente rico, utilizando los bloques básicos preformados, incluso aunque sean capaces de fabricarlos.
El ambiente no nutritivo 1. Cada especie microbiana crece en un intervalo de temperatura, desde la temperatura mínima de crecimiento a una temperatura máxima de crecimiento. La temperatura óptima de una especie es aquella a la cual crece más rápidamente. 2. Los termófilos crecen mejor a temperaturas superiores a los 50 0C. Los mesófilos crecen mejor a temperaturas cercanas a los 37 0C, la temperatura del cuerpo humano. Los psicrófilos crecen a 5 0C o por debajo de ésta temperatura, la temperatura de un frigorífico. 3. La estabilidad al calor de las proteínas de los microorganismos determina la temperatura máxima a la cual puede crecer. La temperatura mínima está determinada por el debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas de las proteínas. 4. La presión hidrostática es la presión que se aplica a un líquido. La mayoría de los microorganismos toleran altas presiones hidrostáticas. Los barófilos crecen mejor (facultativos) o solamente (estrictos) a presiones superiores a 1 atmósfera. 5. En general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino, y los hongos crecen mejor a un pH ligeramente ácido. Los acidófilos viven en un ambiente con un pH extremadamente bajo, mientras que los alcalófilos viven en ambientes con un pH elevado. 6. Las bacterias mantienen una presión de turgencia positiva. la presión osmótica del interior de la célula es mayor que la presión osmótica de su ambiente externo. Determinadas especies bacterianas, las halófilas, requieren elevadas presiones osmóticas externas. 7. La plasmolisis se produce cuando un incremento en la presión osmótica externa hace que salga agua de la célula, encogiéndose el citoplasma.
MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS 1. Algunos métodos de medida son indirectos, y miden una propiedad la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otros métodos son directos, contando las células individuales. 2. El recuento al microscopio o el recuento electrónico dan un recuento total - un recuento de todas las células, vivas y muertas. Un recuento de viables es un recuento de tan sólo las células vivas, es decir, aquellas que son capaces de reproducirse. El recuento en placa y el NMP son recuentos de viables. 3. La turbidez se mide con un espectrofotómetro. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite un cultivo líquido de células microbianas. Se utiliza una curva patrón para relacionar las medidas en el espectrofotómetro con la masa celular o con el número de células de un cultivo particular. 4. Para la determinación del peso seco se separan las células del medio, se desecan y se pesan. 5. Hay varios procedimientos por los que se puede usar la actividad metabólica para medir el número de células: la tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o ácidos, que produce un cultivo; la tasa de utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa; la tasa de reducción de determinados colorantes. 6.El recuento microscópico se hace con un porta especial determinado cámara de recuento, como la cámara de petroff-hauser. A partir de la profundidad del pocillo y de la rejilla, se puede determinar el número de células de un volumen determinado de muestra. 7.El recuento electrónico se hace con un contador Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como su medio. 8. En el recuento en placa, se diluye varias veces al décimo o al centésimo una muestra del cultivo, y posteriormente, se inocula o se mezcla en una placa y se incuba. Se seleccionan las placas que tienen entre 30 y 300 colonias y se recuentan. 9. El número más probable se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. Después de varias diluciones seriadas al décimo, se incuban los tubos problema. Los tubos que se ponen turbios recibieron una o más células. Determinando la dilución media a la que los tubos no reciben células, se puede calcular,
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utilizando una tabla del NMP, el número de microorganismos que estaban presentes de manera más probable en la muestra original. 10. La filtración se hace antes de medir un número pequeño de microorganismos en grandes volúmenes de líquido o gas.
MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS La medida del crecimiento y muerte de los microorganismos en el laboratorio requiere técnicas especiales. Algunas técnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otras técnicas son directas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa, o el cálculo del número más probable (NMP). (A veces la filtración es una etapa preliminar en las medidas directas.) El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse ( viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtración, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas técnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes.
Turbidez Debido a que todas las células de un cultivo axénico son aproximadamente del mismo tamaño, su numero es proporcional a su peso. En otras palabras, dos células pesan el doble que una célula, cuatro células pesan el doble que dos, y así sucesivamente. De esta manera, podemos estimar el tamaño de una población microbiana a partir de su peso total. Generalmente, los microbiólogos no recogen de manera laboriosa las células y las pesan. En su lugar, utilizan un instrumento óptico denominado espectrofotómetro (Figura 8.7). Un espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo líquido de células microbianas. Cuanto mayor masa de células tenga un cultivo, mayor será su turbidez, se transmitirá menos luz y la lectura en el espectrofotómetro será mayor. Puesto que un espectrofotómetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente un cultivo liquido, no es muy sensible con respecto al número de células bacterianas. Para que el líquido se vea turbio, el cultivo liquido debe contener alrededor de 10 millones de células bacterianas de un tamaño intermedio por mililitro y, por lo tanto, un espectrofotómetro no es útil para detectar una pequeña contaminación, es decir, la presencia de un pequeño número de células microbianas no deseadas. Al igual que para la mayoría de los cultivos bacterianos, el espectrofotómetro también puede emplearse para cultivos de levaduras.
Figura 8.6 La plasmólisis de una célula bacteriana separa la membrana plasmática de la pared celular, excepto en las uniones Bayer, lugares en los que la membrana plasmática se une a la membrana externa mediante la pared celular (Capítulo 4). Esta micrografía electrónica de transmisión muestra la plasmolisis de Escherichia coli. Generalmente, el espectrofotómetro se utiliza para estimar masa de un cultivo relativamente denso, y poder así registrar crecimiento de una población microbiana (Figura 8.7). Para medir la masa o el número de células con un espectrofotómetro, necesitamos, en primer lugar, preparar una curva patrón, o gráfica en la que se relacionan las medidas del espectrofotómetro con la masa celular de un determinado cultivo. Generalmente los distintos
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tipos de bacterias producen una turbidez diferente Posteriormente, se puede determinar a partir de la gráfica la masa celular que se corresponde con cualquier lectura en el espectrofotómetro. Las curvas patrón también pueden obtenerse para relacionar las lecturas en el espectrofotómetro con el número células de un cultivo. Como cualquier otro instrumento, el espectrofotómetro tiene ventajas y desventajas. Sus medidas son rápidas y reproducibles. Sin embargo, sólo puede utilizarse para cultivos relativamente densos, y no puede distinguir entre células muertas y vivas. Tampoco puede utilizarse con células que tiendan a formar agregados, porque dejan de suspenderse rápidamente y desaparece la turbidez.
Figura 8.7 El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La célula bacteriana dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene células bacterianas y está transparente. El de la derecha contiene alrededor de mil millones (10 9) de células por mililitro y, por lo tanto, está turbio. (c) La curva patrón relaciona la absorbancia con el número de células bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de absorbancia en número de células. Por ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100 millones (10 8) de células por mililitro.
Peso seco El número de células de un cultivo se puede medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una célula individual. El peso seco de las células de un cultivo se determina separándolas del medio, desecándolas y pesándolas. Para obtener una medida precisa, se requieren alrededor de 25 ml de un cultivo relativamente denso. Las células se separan mediante filtración (Capítulo 3) o mediante centrifugación. Una centrífuga es un instrumento que hace girar unos recipientes denominados tubos de centrífuga a una velocidad elevada, generando una fuerza centrífuga que hace que las partículas pequeñas, incluidas las células microbianas, se lavan al fondo del tubo. Luego, se lavan las células, se resuspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo. Después del segundo lavado, las células se desecan en un horno a 1050C durante unas 24 horas y luego se enfrían en un desecador, para evitar que capten la humedad del aire. Un desecador es una cámara que se mantiene con una humedad muy baja, bien químicamente o mecánicamente, y que se utiliza para desecar los materiales o para mantenerlos desecados. Finalmente, se pesan las células.
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La medida del peso seco es tediosa y requiere un cierto tiempo; además, la muestra debe contener más de unos 10 millones de células, No obstante, tiene ciertas aplicaciones. Por ejemplo, debe utilizarse para construir la curva patrón que relaciona las medidas en el espectrofotómetro con las de la masa celular.
Actividad metabólica
La actividad metabólica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir indirectamente la cantidad de células microbianas. La tasa de formación de productos metabólicos, tales como gases o ácidos, que produce un cultivo, refleja la masa de células presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilización de un substrato, como el oxígeno o la glucosa, refleja la masa celular. Finalmente, la tasa de reducción de determinados colorantes, es otra forma de estimar la masa microbiana. Por ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es reducido por los componentes de la cadena de transporte de electrones de los microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxígeno, que oxida el azul de metileno, la tasa de decoloración de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa de reducción del colorante es una medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la técnica puede utilizarse con materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.
Recuento directo Un recuento directo es un recuento de las células individuales de una población microbiana. El recuento directo puede hacerse visualmente, utilizando un microscopio y un porta especial denominado cámara de recuento. Existen muchos tipos de cámaras de recuento, pero la cámara de Petroff-Hauser, llamada así en honor de los que la desarrollaron, tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología (Figura 8.8). Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones también conocidas. De esta manera, cada cuadrado que observamos al microscopio representa un volumen determinado de líquido; por ejemplo, un microlitro (0,001 µl). Se puede calcular cuántas células están presentes en 1 ml o en cualquier otro volumen del cultivo, contando las células de varios cuadrados y haciendo la media. Puesto que las células vivas y las muertas tienen un aspecto parecido observadas al microscopio, el recuento directo es un recuento total de células. El recuento directo también puede hacerse electrónicamente, con un instrumento denominado contador Coulter. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como el medio en el que están suspendidas. Se coloca en una cámara del contador un volumen determinado del cultivo y se hace pasar a través de un pequeño poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra cámara, mediante una bomba de vacío. El poro forma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada vez que pasa una célula a través del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada electrónicamente en el contador. Los dos métodos principales de recuento directo - microscópico y recuento electrónico - dan resultados semejantes, pero se usan en situaciones muy diferentes. El recuento microscópico no requiere de un equipo caro, tan sólo se necesita una cámara de recuento, no muy cara, además del microscopio óptico que existe en cualquier laboratorio de microbiología. Pero es un proceso tedioso y lento. Por el contrario, el recuento electrónico requiere un equipo caro, pero es muy rápido y preciso, si las células son las únicas partículas presentes (el recuento electrónico también se usa en los laboratorios clínicos para contar las células sanguíneas). El recuento microscópico es necesario si la muestra contiene partículas extrañas, como células sanguíneas o fragmentos de suelo. Una persona que realiza un recuento microscópico puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas, pero si tienen aproximadamente el mismo tamaño, el contador electrónico las contará como células.
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Figura 8.8 Recuento microscópico directo. La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un microscopio, para realizar un recuento directo de células. Consta de un porta que tiene unos pocillos superficiales (de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. De esta manera, el volumen total de la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.
8.4.5 Recuento en placa Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa, empleados para cultivar los microorganismos, que se describieron en el Capítulo 3. La técnica consiste en diluir de manera seriada, generalmente diez veces por cada dilución, una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. A continuación, la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado colonias visibles, generalmente después de un día, se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas están bien separadas. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. El número de colonias de una placa, junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella, nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra original (Figura 8.9). El recuento en placa es un recuento de viables, Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa de agar. La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Además, el recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo.
Figura 8.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10 -5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de
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agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias. Dicho error es la imprecisión que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se hagan las disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la población total en conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrán más células que otras, pero en el 95 por ciento de los casos, el número real de células viables no difiere del número determinado en más del doble de la raíz cuadrada del número de colonias recontadas.
Figura 8.10 El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el número más probable de células estadísticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.
8.4.6 Número más probable El método del número más probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realización una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede determinar el numero más probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadística. La Tabla 8.6 muestra una tabla del NMP. La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilución se considera como una relación apropiada entre la precisión y la economía. El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean
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Escherichia coli provenientes
de aguas residuales contaminadas, y la presencia de agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.
Tabla 8.6. Tablas del número más probable Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres NMP diluciones sucesivas 0 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4
1 0 1 0 0 1 2 0 0 1 2 0 0 1 1 2 2 3
0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0
0,18 0,20 0,40 0,45 0,68 0,68 0,93 0,78 1,1 1,1 1,4 1,3 1,7 1,7 2,1 2,2 2,6 2,7
E. coli en
Número de tubos con turbidez inoculados a partir de tres diluciones sucesivas 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 5
0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4
el
NMP 2,3 3,1 3,3 4,6 4,9 7,0 9,5 7,9 11,0 14,0 13,0 17,0 22,0 28,0 24,0 35,0 54,0 92,0 160,0
Filtración Los métodos que dependen de la formación de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez (número más probable) pueden detectar una única célula microbiana viable, pero debido a razones prácticas, sólo se utiliza alrededor de un mililitro de la muestra corno inóculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro. Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe concentrarse antes de proceder al recuento. La concentración de los microorganismos de las muestras se hace, generalmente, mediante filtración siguiendo el mismo método descrito en el Capitulo 3. Para ello, se hace pasar un volumen conocido de líquido o de aire a través de un filtro de membrana, haciendo vacío. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeños como para que no puedan pasar las células microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio sólido adecuado y se incuba. El número de colonias que se desarrollan es el número de células microbianas viables en el volumen de fluido que se filtró. Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 8.11). Los diversos métodos de determinación del número de microorganismos se resumen en las
PREGUNTAS DE REVISIÓN LAS POBLACIONES 1. ¿A qué se refiere el término
crecimiento microbiano?
CÓMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS 1. ¿Qué es el tiempo de duplicación? ¿Por qué se usa frecuentemente la tasa de crecimiento, en lugar del tiempo de duplicación? 2. Explique esta frase: los microorganismos crecen exponencialmente. 3. Nombre, secuencialmente, las fases de crecimiento de un cultivo. Explique cada una de ellas. 4. ¿Cómo se mantiene un cultivo continuo en el laboratorio? 5. En condiciones naturales, ¿qué fija normalmente la tasa de crecimiento? 6. Defina el término colonia. ¿Cómo afecta la localización en una colonia a la fase de crecimiento de una célula? ¿Cómo afecta la localización al acceso del oxígeno?
¿QUÉ NECESITAN LOS MICROORGANIMOS PARA CRECER? 9
1. ¿Qué son los nutrientes? Explique la función de cada uno de estos nutrientes: carbono, oxígeno, azufre, elementos traza, factores orgánicos de crecimiento. 2. Explique esta frase: el oxígeno juega un papel complejo en el metabolismo microbiano. Utilice el término radical libre en su explicación. 3. Explique las distintas relaciones que tienen con el oxígeno los siguientes tipos de microorganismos: aerobios obligados, microaerófilos, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes y anaerobios obligados. 4. ¿A qué se refiere la diversidad nutricional? 5. ¿Qué es un ambiente de crecimiento rico? ¿Cómo explotan los microorganismos un ambiente de crecimiento rico? 6. Nombre los factores físicos significativos para un microorganismo en un ambiente no nutritivo. Nombre los factores químicos más significativos. 7. Explique cómo crecen las distintas especies en un intervalo de temperaturas. Utilice estos términos en su comentario: temperatura mínima de crecimiento, temperatura máxima de crecimiento, temperatura óptima. Explique qué determina la temperatura máxima y mínima. 8. Defina los siguientes términos: termófilos, mesófilos, psicrólilos. 9. ¿Qué es la presión hidrostática? ¿Por qué los microorganismos pueden soportar elevadas presiones hidrostáticas? ¿Hasta qué punto es perjudicial la presión hidrostática para los microorganismos? 10. ¿Qué valores de pH prefieren las bacterias? ¿Y los hongos? ¿Qué son los acidófilos y los alcalófilos? Si las funciones metabólicas requieren un intervalo de pH relativamente estrecho, ¿cómo pueden las bacterias existir en ambientes con un amplio intervalo de valores de pH? 11. ¿Un qué se diferencian las halófilas de otras bacterias? ¿Cómo mantienen las bacterias la presión de turgencia? ¿Qué es la plasmolisis?
MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS 1. ¿Un qué se diferencian los métodos directos e indirectos de medida de las poblaciones de los microorganismos? ¿Cuál es la diferencia entre un recuento total y un recuento de viables? 2. Indique si cada uno de los siguientes métodos de medida es directo o indirecto y si de un recuento total o de viables; describa el procedimiento y explique las ventajas y desventajas.
a. turbidez b. peso seco c. actividad metabólica d. microscopia directa e. recuento electrónico directo f. recuento en placa g. número más probable (NMP) h. filtración
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