2015 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
I.
INTRODUCCIÓN:
La evolución ha forjado todas las formas de vida en la tierra; la diversidad estructural y funcional que apreciamos en las células representa un conjunto de éxitos evolutivos que, a través del proceso de selección natural, confiere un valor de supervivencia (adaptabilidad) a los microorganismos de hoy. La diversidad microbiana puede ser apreciada en términos de variaciones en el tamaño celular y la morfología, estrategias metabólicas, movilidad, división celular, biología del desarrollo, adaptación a ambientes extremos y muchos otros aspectos estructurales y funciones de la célula (1). Durante las últimas décadas se ha demostrado que las comunidades microbianas pueden encontrarse en muchas condiciones adversas, como temperatura, pH y salinidad, entre otras. Los microorganismos que habitan en estos ambientes extremos son llamados extremófilos, y poseen características bioquímicas y metabólicas que les permiten vivir en hábitats poco comunes, resultando ser microorganismos muy útiles para el desarrollo de nuevos procesos biotecnológicos (2, 3). Los microorganismos halófilos, al pertenecer al grupo de microorganismos extremófilos capaces de vivir en ambientes salinos, ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnología (4) tales como en la producción de enzimas industriales, producción de colorantes y aditivos, biotecnología alimentaria y producción de alimentos fermentados, producción de antibióticos (actinomicetos halófilos), producción de biopolímeros, incluso en la biorremediación.
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
1
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
II. 2.1.
GENERALIDADES DE LOS HALÓFILOS:
MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS HALÓFILOS:
La sal es un factor inhibidor para muchos microorganismos, sin embargo existen aquellos que han logrado adaptarse a ambientes con elevadas concentraciones de sales (Na Cl). Aunque las sales se requieren para todas las formas de vida, los microorganismos pueden ser clasificados según el requerimiento a este factor: - Los organismos no halófilos que sólo pueden crecer por debajo de 0.2 M de NaCl. - Los halotolerantes son aquellos que pueden crecer en presencia y en ausencia de altas concentraciones de sal. - Los halotolerantes extremos son capaces de crecer aproximadamente al 15% (w/v) de NaCl (2,5 M). - Los HALÓFILOS se distinguen por el requerimiento de condiciones hipersalinas para su crecimiento. - Los halófilos ligeros o débiles muestran crecimiento óptimo dentro de una concentración de NaCl que oscila oscil a entre 0.2 y 0.85 M (2-5%). Aquí están incluidos la mayoría de organismos marinos, considerando que el agua de mar contiene cerca del 3% (w/v) de NaCl. - Los halófilos moderados, crecen entre 0.85 y 3.4 M (5-20 %) de NaCl. Son filogenéticamente diversos incluyendo algunos metagénicos y gran número de bacterias gram positivas y negativas. - Los halófilos extremos, que crecen de 3.4 a 5.1 M (20-30%) de NaCl .Se encuentran principalmente los de la familia Halobacteriaceae (5,6).
CUADRO 1. Clasificación de microorganismos halófilos de acuerdo a sus necesidades de NaCl. HAL HAL FILOS FILOS CONCEN CONCENTRA TRACIO CIONES NES DE NaCl NaCl Halófilos extremos Halófilos moderados Halófilos débiles Halotolerantes Halotolerant es
De 3.4 a 5.1 M (20-30%) a más. Entre 0.85 y 3.4 M (5-20 %). Entre 0.2 y 0.85 M (2-5%). Toleran salinidad.
2.2. DOMINIOS DE MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS HALÓFILOS: Arqueas:
Muchas archeas evolucionaron bajo condiciones que imperaban en la tierra primitiva, condiciones extremas; alta temperatura (ebullición), radiaciones letales, salinidad, desecación y atmósfera anaerobia. A diferencia de los extremófilos adaptados a una sola condición extrema las Haloarcheas Haloarcheas disfrutan de un metabolismo versátil. Crecen en aerobiosis, anaerobiosis o como fotótrofos (mediante energía luminosa) se adaptan a fluctuaciones de temperatura, pH y concentraciones de iones metálicos. Se las encuentran en marismas anaeróbicas, fuentes hidrotermales, permafrost antárticos, salmueras subterráneas, subsuelos marinos entre otros ambientes hipersalinos. Son capaces de Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
2
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
reproducirse y realizar sus funciones metabólicas de una manera más eficaz en presencia de altas concentraciones de sales, tienen la capacidad de balancear su presión osmótica en relación con el medio y resistir los efectos nocivos de la sal (6,7). La principal dificultad técnica que entraña el estudio de la mayoría de especies de archeas estriba en la recreación, en el laboratorio, de las condiciones extremas que requieren. Las archeas halófilas, en cambio, son fáciles de cultivar; los microbiólogos las has utilizado en experimentos de genética, fisiología y biología molecular (7,8). Las arqueas halófilas se distribuyen en seis géneros principales, de los cuales cuatro incluyen miembros que crecen a pH neutro: Halobacterium, Haloferax, Haloarcula y Halococcus. Halococcus . Los miembros pertenecientes a los géneros Natronobacterium y Natronococcus requieren Natronococcus requieren condiciones alcalinas para su crecimiento (9). Dentro de las especies más estudiadas, se puede mencionar a Halobacterium halobium, halobium , principal habitante del Gran Lago Salado de Utah en Estados Estados Unidos, se adapta a la alta concentración de sal y escasez de oxígeno, desarollando una proteína en la membrana llamada bacteriorodopsina; esta proteína contiene pigmentos que dan un color púrpura a la membrana y su capacidad de reaccionar ante la luz crea un gradiente protónico en la membrana, permite perm ite la síntesis del ATP, importar importa r iones de potasio o exportar los del sodio; Halobacterium salinarum, salinarum , concentra cloruro de potasio en su interior para evitar la deshidratación. deshidratació n. Su crecimiento óptimo se da a 50°C, 50°C, un pH 7.2 y concentraciones de NaCl de 3.5 a 4.3 M. también utiliza la bacteriorodopsina (10).
Bacterias:
La mayoría de las bacterias halófilas, Gram positivas y Gram negativas; aerobias o anaerobias facultativas son consideradas como miembros de los géneros: Halomonas, Delega, Volcaniella, Flavobacterium, Paracoccus, Pseudomonas, Halovibrio y Chromobacterium (11).
Eucariotas:
Hay un amplio rango de grupos taxonómicos eucariotas, aunque muy pocos han sido estudiados en cultivos. Dunaliella salina, salina, vive en lagos salados en los que muchas veces es la única alga presente. Sintetiza altas concentraciones del glicerol intracelular 7 M (56%) como soluto compatible para mantener el balance osmótico.
CUADRO 2. Principales géneros de especies de microorganismos halófilos. DOMINIO ARCHAEA
BACTERIA Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
GÉNERO Halobacterium Halobacterium sp Haloferax sp Haloarcula sp Halococcus sp Methanohalobium sp Methanohalophilus sp Halomonas sp Halomonas sp 3
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
EUCARIA
2.3.
Delega sp Volcaniella sp Flavobacterium sp Paracoccus sp Pseudomonas sp Halovibrio sp Chromobacterium sp Salinibacter sp Tetragenococcus sp Marinococcus sp Acetohalobium sp Salibacillus sp Halobacillus sp Debaryomyces hansenii Dunaliella sp Hortaea werneckii Wallemia ichthyophaga
ECOLOGÍA:
Los ambientes hipersalinos están bastante extendidos por todo el mundo, sin embargo, los ambientes extremadamente salinos son raros. La mayoría de éstos se encuentran en zonas calientes y secas. La composición iónica de los lagos salinos varía considerablemente. El predominio de unos u otros iones depende de la topografía, geología y condiciones climáticas generales que rodean el lago. El Gran Lago Salado, en el Estado de Utah, EE.UU., por ejemplo: este lago está fundamentalmente constituido por agua de mar concentrada, debido a que la proporción relativa de cada ión es la del agua de mar, sólo que mucho más alta. El catión principal es el sodio, mientras que el anión primario es el cloro; existen cantidades significantes de sulfato y un ligero pH alcalino. Por el contrario, en el Mar Muerto, en Israel, es relativamente baja la concentración del catión sodio, pero alta la del magnesio. La química del agua de los lagos carbonatados se asemeja a la del Gran Lago Salado pero, debido a los carbonatos que se incorporan al agua de las rocas circundantes, el pH es bastante más alcalino, presentando valores de entre 10 y 12; además, el magnesio y el calcio están prácticamente ausentes, debido a que los mismos precipitan a altos valores de pH. A pesar de que parece que son ecosistemas duros para la vida, los lagos salados representan ecosistemas muy bioproductivos. Las salinas marinas son también buenos hábitats para los procariotas, halófilos extremos. Como se sabe, las salinas son aguas de mar estancadas, que se evaporan lentamente por la acción del sol. A medida que la salina se aproxima a la concentración de sales que permitan el crecimiento de los halófilos extremos, las aguas se vuelven de color rojizo, debido al aparecimiento masivo de arqueas halófilas que crecen en este hábitat (la coloración rojiza proviene de los carotenoides y otros pigmentos). También suelen encontrarse en las salinas Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
4
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS procariotas poco comunes, como las bacterias cuadradas. También se han aislado halófilos extremos en alimentos con alta concentración de sal, como salmueras, salsa de soya y pescado. La ecología y diversidad de los microorganismos halófilos es muy variada; muchos de estos microorganismos han sido aislados de hábitats que presentan alta salinidad, ubicados en diferentes puntos geográficos del planeta. En la TABLA 1 se mencionan algunos de los puntos geográficos característicos de los diferentes ambientes salinos, el rango de salinidad que presentan así como el pH característico en cada caso.
TABLA 1. Ecología de los microorganismos halófilos, diferentes hábitats salinos. Lagos salinos
Suelos salados
Salinas de Mar Rojo España y (25 a 30%) Salar de Atacama, Alicante, Chile España (15 - 30%) (2,4 - 12,7%) Lago Assal, en Djibouti, Somalia (27,7%) Lago salado de UTA, EE.UU (22%)
Hábitats salinos y fríos
Hábitats salinos y alcalinos
Alimentos salados
Antártica, 300 lagos hipersalinos (28%)
Lago Megadi, Kenia y Lago Wadi Natrum, Egipto (pH=9) (10%)
Pescado seco Plantas del y salsa de desierto: soya (6,5 a Atriplex 10%) halinus,
Vestfold Hills, lago salino frío (0 - 5 ºC) (0,5 - 20%) Valles Dry, suelo salino (12% a -40 ºC)
Lago Venere, Isla Pantelleria, Italia (pH=9,7) (9 - 17%)
Bacalao (19%)
Hábitats poco comunes
Desierto del Neguev, Israel (0,5 - 20%) Animales del desierto: fosas nasales de iguanas (12 a 45 ºC)
Mar Muerto, Israel (28%)
III.
ASPECTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS HALÓFILOS: La fuente primaria de energía para la expulsión del Na+ y acumulación de K+ por la mayoría de los microorganismos es el gradiente electroquímico de protones (∆µH+) a través de la membrana citoplasmática. Este gradiente electroquímico de protones deriva de la cadena transportadora de electrones (en Halobacteriales durante el crecimiento aeróbico) o del ATP formado durante la fosforilación por la actividad de la ATPasa (H+-ATPasa tipo F en bacterias+ ATPasa tipo A en organismo halófilos del phylum Archae). Existe un caso excepcional de la generación directa de una fuerza protón motriz generada por la luz, mediada por la bacteriorrodopsina en Halobacterium salinarum y algunos miembros de Halobacteriaceae, ésta parece ser una
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
5
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS excepción, más que la regla en los halófilos del dominio Archaea.Se puede también establecer un gradiente de Na+ (∆µNa+) a expensas del gradiente de protones, vía los antiportadores Na+/H+; tal actividad ha sido demostrada en las halófilas del phylum Archaea, bacterias halófilas y eucariontes. El bombeo de protones en los microorganismos que acumulan solutos orgánicos también requiere energía para el bombeo de iones, para mantener su concentración iónica intracelular baja y contender con la difusión de sales inorgánicas a través de sus membranas. Los antiportadores Na+/H+ se han caracterizado en las bacterias halófilas moderadas que sintetizan solutos orgánicos, tales como Salinivibrio costicola. Estos antiportadores juegan un papel importante para mantener bajas las concentraciones de Na+. La actividad del antiportador Na+/H+ de la membrana citoplasmática de Dunaliella aumenta cuando las células crecen en altas concentraciones de NaCl. La captación o expulsión de iones de las células jueg a un papel importante en la osmoadaptación de ciertos organismos. E. coli, por ejemplo, activa un sistema de captación de iones K+ en condiciones de alta osmolaridad; esto lo realiza con el fin de acumular el ion K+ así como otros osmolitos (5).
FIGURA 1. Modelo de h aloarcheae. La bacteriorrodopsina, con su coloración púrpura, utiliza la energía lumínica para la obtención de combustible celular. Los fotones de luz producen cambios en la forma de esa proteína mediante el bombeo de protones (iones de hidrógeno) hacia fuera de la célula. Otra proteína, la ATP sintetasa, aprovecha el flujo de protones que tiende a volver al interior para convertir el difosfato de adenosina (ADP) en trifosfato de adenosina (ATP). A su vez, el ATP aporta la energía para que otras máquinas moleculares realicen un trabajo útil (7).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
6
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 2. Adaptación a las altas concentraciones de sal en hongos halotolerantes / halófilas: una perspectiva molecular (12).
IV.
OSMOADAPTACIÓN BACTERIANA
Los seres vivos están permanentemente expuestos a determinados factores biológicos, físicos o químicos existentes en el medio ambiente. Dichos factores se encuentran sujetos a variaciones que pueden amenazar la supervivencia de los organismos, lo que hace necesario desarrollar estrategias de adaptación a estas variables. Uno de estos parámetros es la concentración de solutos, no sólo importante en ambientes hipersalinos, sino en cualquier ambiente natural en los que la desecación o la lluvia puedan provo car importantes variaciones en la osmolaridad. La osmolaridad es la presión osmótica de una solución, expresada en moles de soluto por litros de solución. Un aumento en la presión osmótica del medio conlleva a una baja actividad de agua, lo que provoca una deshidratación por parte de la célula, que puede significar su muerte. En procariotas, la osmoadaptación comprende un complejo sistema de mecanismos fisiológicos y genéticos de adaptación al estrés osmótico. Así los microorganismos halotolerantes y halófilos han desarrollado una serie de mecanismos específicos de adaptación a elevadas concentraciones salinas, que posiblemente se encuentren conectados entre sí formando un complejo circuito que se encuentra osmorregulado. Las dos primeras respuestas específicas de la célula frente a un aumento de la presión osmótica externa son la adaptación de la composición lipídica de las membranas y la acumulación citoplasmática de compuestos osmoprotectores para compensar el estrés osmótico (1) . Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
7
2015 4.1.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
RESPUESTA ESPECÍFICA AL ESTRÉS OSMÓTICO: 4.1.1. Adaptación de la composición lipídica de las membranas. La membrana citoplasmática constituye una barrera que separa el citoplasma del medio externo, en el que pueden producirse cambios en la concentración de sales, por lo que debe jugar un papel importante en la respuesta de la célula a dichos cambios. Se ha demostrado que la adaptación de la composición lipídica de las membranas celulares frente a una nueva situación de estrés osmótico incluye modificaciones en el tipo de fosfolípidos existentes en las membranas y en el tipo de ácidos grasos que forman parte de los lípidos. Con respecto a los fosfolípidos, a medida que aumenta la salinidad, la membrana se enriquece en fosfatidilglicerol y/o en di-fosfatidilglicerol (cardiolipina), fosfolípidos cargados negativamente, a costa de una disminución en la fosfatidiletanolamina (PE), un fosfolípido neutro. Estas modificaciones en la composición de lípidos polares aportan consistencia a la membrana, a la vez que son necesarios para mantener la estructura en doble capa lipídica, ya que la PE, en respuesta a la salinidad, tiende a formar fases en una única capa. La composición en ácidos grasos de los fosfolípidos de membrana también experimenta modificaciones con respecto a la temperatura y la salinidad, siendo estos diferentes en bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Así, en bacterias halófilas moderadas Gram-negativas, el cambio más destacable es un aumento de los ácidos grasos ciclopropánicos, a costa de los insaturados, de los cuales derivan. Este efecto se ha descrito en Pseudomonas halosaccarolytica, H. halmophila, H. canadiensis, H. salina y Chromohalobacter salexigens. La transformación de ácidos grasos insaturados en ciclopropánicos proporcionaría a la célula una disminución en la fluidez de la membrana, contribuyendo así a mantener la integridad de la misma (1).
4.1.2. Mecanismos de resistencia al estrés osmótico: Existen dos diferentes estrategias que permite a ciertos microorganismos sobrellevar un estrés osmótico debido a la presencia de una alta concentración de sal; i) Las células mantienen altas concentraciones intracelulares de sal, osmóticamente o al menos equivalente a la concentración externa de sal (“salt -in” strategy); algunos sistemas intracelulares deben adaptarse a la presencia de altas concentraciones de sal. ii) Las células mantienen bajas concentraciones de sales en su citoplasma (“compatible-solute” strategy). La presión osmótica del medio es balanceada por solutos compatibles, y no se requiere de una adaptación especial de los sistemas intracelulares.
A. Mecanismo Salt-in: Este mecanismo es es utilizada por dos grupos filogenéticamente no relacionados: Los aeróbicos extremadamente Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
8
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS halófilos del phylum Archaea, del orden de los Halobacteriales, y las bacterias anaeróbicas halófilas del orden de los Haloanaerobiales. Estos microorganismos acumulan en su citoplasma iones inorgánicos, principalmente K+ y Cl-. El aumento en la concentración de KCl en el citoplasma conlleva a una adaptación a las altas concentraciones salinas de todas las proteínas y otros componentes celulares como los ribosomas. En las células que usan la estrategia salt-in para la adaptación osmótica, las enzimas y componentes estructurales de las células se han adaptado a la presencia de altas concentraciones de sal para asegurarse del propio funcionamiento de la maquinaria enzimática intracelular. Se ha observado que los organismos halófilos muestran adaptaciones moleculares, dentro de las cuales existe un exceso de aminoácidos con carácter ácido y pocos aminoácidos hidrofóbicos en sus proteínas. Esto determina que los organismos que utilizan este mecanismo tengan una limitada capacidad para adaptarse a los cambios en la osmolaridad del medio, por lo que su crecimiento se restringe a ambientes con concentraciones salinas muy elevadas. Es interesante que no se ha identificado ningún soluto orgánico osmoprotector en los organismos representativos de estos grupos, y en la mayoría de los estudios reportados, las concentraciones intracelulares de iones son similares a la que se encuentran en el medio donde habitan estos organismos (1,5).
B. Mecanismo
Salt-out: En
otros microorganismos halófilos y halotolerantes, el balance osmótico se establece mediante pequeñas moléculas que son sintetizadas por las células o tomadas del medio donde se encuentran disponibles. Este es el llamado mecanismo “compatible solute” o “solutos compatibles”. Los solutos compatibles se definen como solutos que a altas concentraciones permit en a las enzimas funcionar eficientemente Este mecanismo es el que utilizan las bacterias, tanto halófilas como halotolerantes, además de las arqueas metanógenas halófilas moderadas. Así, estos microorganismos, en respuesta al estrés osmótico, acumulan en su citoplasma compuestos orgánicos de bajo peso molecular, que mantienen el equilibrio osmótico sin interferir con el metabolismo celular, por lo que se denominan solutos compatibles. Se trata de un sistema mucho más flexible, ya que permite la adaptación a las fluctuaciones en la presión osmótica del medio. Los solutos compatibles pueden acumularse tras su transporte al interior celular desde el medio externo, o bien mediante síntesis, como sucede por ejemplo cuando las bacterias se cultivan en un medio mínimo. Dado el ahorro de energía que supone para la célula, el transporte es preferido a la síntesis “de novo”. Los osmoprotectores incorporados desde el medio externo son acumulados junto con los producidos por la célula, o bien
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
9
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS pueden reemplazarlos totalmente. A su vez, existen canales proteicos que responden frente a un choque hipoosmótico, diferentes a los sistemas de transporte, que funcionan como válvulas de seguridad, permitiendo la expulsión de los solutos compatibles acumulados. La mayor flexibilidad y versatilidad de este mecanismo explica el hecho de que se encuentre mucho más extendido en la naturaleza, habiéndose observado también en hongos, plantas y animales, incluso en células humanas (1,5).
Los solutos compatibles son moléculas polares sencillas, altamente solubles y sin carga, o bien con carga neta neutra a pH fisiológico, con capacidad estabilizadora de proteínas frente al calor, la desecación o la congelación. Estos efectos beneficiosos se basan en el modelo de “exclusión preferencial”. Según dicho modelo, los solutos compatibles quedarían excluidos de la primera capa de hidratación de las proteínas, lo que daría lugar a una hidratación preferencial de la superficie de las mismas, disminuyendo así el volumen que ocupan y estabilizando su estructura. Los solutos compatibles que acumulan las bacterias halófilas moderadas se han identificado recient emente mediante técnicas de RMN y HPLC. Dichas técnicas han permitido, entre otros avances, identificar las tetrahidropirimidinas (ectoína e hidroxiectoína), y elucidar las rutas biosintéticas de varios solutos compatibles. A continuación se describen los principales solutos compatibles.
a) Aminoácidos: Aunque este tipo de compuestos fueron los primeros solutos compatibles que se identificaron, no parecen tener una gran importancia en bacterias halófilas moderadas. La excepción la constituye la prolina, que es acumulada por algunas especies Gram-positivas, como Salinococcus roseus y S. hispanicus. Sin embargo, en bacterias no halófilas, los aminoácidos parecen poseer una mayor importancia. Así, la prolina es un importante osmoprotector en Bacillus subtilis, cuya ruta biosintética recientemente se ha elucidado, Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium. El glutamato es el anión regulado osmóticamente más abundante en enterobacterias. Asimismo, éstas también acumulan alanina y glutamina, aunque a niveles muy inferiores. b) Azúcares: En muchos microorganismos, incluyendo algunas bacterias halófilas moderadas, es frecuente la acumulación de sacarosa y trehalosa, como respuesta a un choque hiperosmótico, aunque estos compuestos alcanzan concentraciones intracelulares poco elevadas, inferiores a 500 mM, y sólo pueden reemplazar parcialmente a los solutos compatibles nitrogenados. En E. coli , sin embargo, la trehalosa es el principal osmoprotector que se acumula cuando se cultiva en medio mínimo, teniendo lugar su síntesis a partir de la glucosa-6-fosfato en respuesta a un choque hiperosmótico. Los genes responsables de la síntesis (otsAB) están regulados por la osmolaridad del medio y la fase estacionaria de crecimiento del cultivo. La trehalosa también interviene en la protección de la célula frente a otros tipos de estrés, como el calor, la desecación, o la congelación. Sin embargo, la trehalosa no funciona como agente osmoprotector si se suministra externamente. Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
10
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
c) Glicina betaína (Betaína): La mayoría de las bacterias, incluyendo las bacterias halófilas moderadas, acumulan betaína como principal soluto compatible, cuando se cultivan en medio complejo con elevadas concentraciones salinas. La betaína se acumula tras su transporte desde el medio externo, o bien por oxidación de su precursor, la colina. También existen bacterias capaces de sintetizar betaína “de novo”. Esta síntesis, muy común en bacterias fotótrofas, no se observa en quimioheterótrofas, a excepción de las halófilas extremas Actinopolyspora halophila y Halothiorhodospira halochloris. Esta ruta de síntesis, que se inicia a partir del aminoácido glicina, comprende tres reacciones de metilación, con sarcosina y dimetilglicina como intermediarios, y la S-adenosil metionina como donador de grupos metilos. Los mecanismos de transporte y de síntesis de betaína por oxidación de colina han sido estudiados en profundidad en bacterias no halófilas, como B. subtilis, E. coli, S. typhimurium y Sinorhizobium meliloti . En bacterias halófilas moderadas, estos estudios son más recientes, destacando la caracterización bioquímica del sistema de transporte de alta afinidad por betaína, y la clonación de los genes de síntesis de betaína a partir de colina en C. salexigens. La ectoína (2-metil-4-carboxi-3,4,5,6d) Ectoína e hidroxiectoína: tetrahidropirimidina) se describió por primera vez en la bacteria purpúrea fotosintética Halorhodospira halochloris (anteriormente Ectothiorhodospira halochloris, de donde proviene el nombre de ectoína), aunque se encuentra ampliamente distribuida en bacterias, así como su derivado hidroxilado, la hidroxiectoína (2-metil-4-carboxi-5-hidroxi-3,4,5,5-tetrahidropirimidina). La ruta biosintética de la ectoína fue elucidada en H. halochloris y H. elongata por Peters y col. Esta ruta comienza con la transformación del aspartato semialdehido en ácido diaminobutírico (DA), que a su vez es transformado en ácido N-acetildiaminobutírico (NADA), que es convertido finalmente en ectoína. Se han aislado y caracterizado parcialmente las enzimas implicadas en dicha ruta en H. elongata (53); la DA transaminasa, la DA acetil transferasa y la NADA deshidratasa, más conocida como ectoína sintasa. Hasta el momento se han caracterizado los genes de síntesis de ectoína de Marinococcus halophilus, H. elongata y Sporosarcina pasteurii . En H. elongata existen evidencias de que la hidroxiectoína se forma a partir de la ectoína por hidroxilación directa. En las especies del género Halomonas y en C. salexigens, la ectoína y la hidroxiectoína son los solutos predominantes cuando las células se cultivan en un medio sin betaína o colina, alcanzando concentraciones considerablemente elevadas, que son suficientes para conseguir, junto con los iones intracelulares, un equilibrio osmótico con el medio. e) Otros solutos compatibles de origen bacteriano: Existe una amplia gama de compuestos solutos compatibles, cuya composición química varía, dependiendo de la especie bacteriana que los sintetiza. Además de los descritos anteriormente, destaca especialmente el glucosilglicerol, que es acumulado por un gran número de cianobacterias halófilas moderadas. También se ha destacado en Rhodobacter sulfidophilus, Pseudomonas mendocina, P. alkaligenes y C. salexigens. Por otro lado, en algunas bacterias Gram-positivas, como Halobacillus halophilus, Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
11
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
Planococcus sp. y Sporosarcina halophila, mediante 13C-RMN se han podido detectar diaminoácidos N-acetilados, como la Nε-acetilisina y la Nδ-acetilornitina. En la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus, se ha detectado la acumulación de manosilglicerato y di-mio-inositolfosfato, en respuesta a aumentos de temperatura o salinidad. El manosilglicerato se acumula preferentemente al aumentar la salinidad, mientras que el di-mio-inositolfosfato se acumula a temperaturas superiores a la temperatura óptima de crecimiento. Por otro lado, en varias especies del género Thermococcus se ha identificado un nuevo soluto compatible, la β -galactopiranosil5-hidroxilisina, que probablemente se sintetiza a partir de la peptona presente en el medio de cultivo.
FIGURA 3. Solutos compatibles orgánicos encontrados en microorganismos halófilos y halotolerantes (5).
V.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS:
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
12
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
5.1.
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES Y OTRAS MOLÉCULAS DE INTERES BIOTECNOLÓGICO:
Muchos procesos industriales se desarrollan bajo condiciones extremas, lo que ofrece un campo de aplicación para las enzimas producidas por microorganismos extremófilos, capaces de actuar a valores extremos de temperatura, pH o salinidad. La mayoría de las enzimas halófilas extra e intracelulares que se han aislado y caracterizado a la fecha provienen de bacterias halófilas moderadas. Así se han descrito varias hidrolasas del tipo de las amilasas, proteasas, nucleasas y 5´- nucleotidasas así como otras moléculas que actualmente tienen importantes aplicaciones en procesos biotecnológicos producidas por halófilos (4). La base de este interés son las propiedades que presentan las proteínas halofílicas, llamadas así porque necesitan en general altas concentraciones salinas para su correcto funcionamiento. Las enzimas halofílicas necesitan normalmente una concentración 1M de Na+ o K+ para presentar actividad, y muestran su actividad máxima a una concentración de 2-4M (según especies y enzimas). A concentraciones salinas bajas estas proteínas se desnaturalizan y pierden su actividad. Se han sugerido varios modos por los que las proteínas halofílicas mantendrían su estructura y función a concentraciones salinas tan altas: en la estructura tridimensional de las proteínas aparecería un apantallamiento exterior de cargas negativas,debido al exceso de residuos ácidos (glutámico y aspártico),a las que se unirían iones positivos.Mediante estos residuos polares y los iones se crearía una capa de hidratación en la superficie de la proteína (13).
FIGURA 4. Efectos de baja y alta osmolaridad sobre la estructura y función de las enzimas halófilas. Se originan fuerzas de repulsión debido a la carga negativa neta en la superficie de la enzima lo que resulta en la desnaturalización de la estructura de la proteína nativa a baja osmolaridad. A altas concentraciones de cationes se forma un blindaje (K +) neutralizando la carga negativa, reduciendo así las fuerzas de repulsión sobre la superficie de la enzima (14).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
13
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 5. Estabilización de la estructura de enzimas en halotolerantes a elevada osmolaridad. Exclusión preferencial de solutos compatibles (círculos azules) en la superficie de la proteína ayuda a mantener la estructura de la enzima en la osmolaridad elevada, mientras que también ayuda a aumentar el volumen celular (14).
A) Enzimas industriales: Los biotecnólogos han explotado a los extremófilos como fuente de enzimas denominadas extremoenzimas, las cuales ofrecen nuevas oportunidades para biocatálisis y biotransformaciones como resultado de su extrema estabilidad. Las más usadas son las bacterias halófilas moderadas ya que crecen óptimamente en un rango de salinidad de 0.5 a 2.5 M; además producen una serie de enzimas hidrolíticas extracelulares tales como: amilasas, proteasas, lipasas, nucleasas y esterasas (15). En los últimos años, el interés por el estudio de estas enzimas se ha incrementado debido a sus propiedades catalíticas y potencial de aplicación industrial en la formulación de detergentes, elaboración de productos dietéticos, procesamiento de cuero, papel y alimentos cárnicos, así como también en biodegradación de residuos tóxicos y contaminantes industriales, entre otros (16). Aunque el potencial de las halobacterias para catalizar reacciones bajo condiciones extremas de sal es bien conocido, hasta ahora no hay muchos reportes de su aplicación en forma inmovilizada, debido a que estas células son muy frágiles y se lisan con la disminución de sal en el medio externo; sin embargo, se ha observado que la producción de α -amilasa por parte de microorganismos halófilos se ha logrado mantener durante 45 días, inmovilizando los microorganismos en perlas de alginato y películas de alcohol polivinílico. Uno de los géneros reportados como productores de mayor diversidad de enzimas extracelulares son los miembros del género Halomonas. La primera de estas enzimas extracelulares caracterizada a nivel bioquímico y molecular ha sido una alfa-amilasa producida por Halomonas meridiana. Por otra parte Sánchez-Porro y col ., 2003 llevaron a cabo un estudio de las bacterias halófilas moderadas productoras de enzimas hidrolíticas extracelulares presentes en ambientes hipersalinos. Como resultado del mismo encontraron una gran variedad de enzimas con potencial biotecnológico, incluyendo amilasas, DNAsas, lipasas, proteasas y pululanasas (17).
Las hidrolasas:
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
14
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
Las hidrolasas producidas por microorganismos halófilos han sido usadas en la industria farmacéutica para la elaboración de algunos medicamentos como antibióticos, hormonas y pesticidas, también han sido usadas para el tratamiento de superficies marinas contaminadas con petróleo. Algunas celulasas haloestables han sido aisladas de Salinovibrio sp. Por otro lado, se han caracterizado isomerasas termoestables que permiten que la manipulación del DNA sea más conveniente y eficiente; la Peptidil prolil cis-trans isomerasa (PPIasa) ha sido usada para la regeneración de proteínas desnaturalizadas, para la estabilización de proteínas, para la producción de proteínas recombinantes y para la producción de importantes sustancias inmunosupresoras y fisiológicamente activas (15 y 18)
B) Solutos compatibles: Las bacterias halófilas acumulan en su citoplasma determinados compuestos orgánicos de bajo peso molecular que no interfieren con el metabolismo celular, por lo que se denominan solutos compatibles, y que constituyen la base fundamental de la tolerancia a la sal de estos microorganismos (4). Dichos compuestos osmoprotectores han despertado un enorme interés a nivel industrial ya que poseen un alto poder estabilizador y protector de enzimas, ácidos nucleicos, membranas e incluso células enteras, contra la congelación, la desecación, la desnaturalización por calor y la alta salinidad. También se han descrito sus posibles aplicaciones en tecnología enzimática (biosensores, PCR, etc.) y en la industria farmacéutica y cosmética. Algunos solutos compatibles, como la ectoína y la hidroxiectoína han demostrado poseer un marcado efecto protector sobre las enzimas lábiles, como la lactato deshidrogenasa y la fructoquinasa. Así, en diversos estudios en los que se comparó el efecto protector de distintos solutos compatibles sobre estas enzimas (glicina betaina, trealosa, glicerol, prolina, ectoínas y azúcares), se puso de manifiesto que las ectoínas fueron los mejores agentes protectores del calor y los procesos de congelación y descongelación. (15,19 y 20) La trehalosa, un osmolito en varias bacterias halotolerantes, puede utilizarse como crioprotector para el congelamiento de biomoléculas, pero también para la conservación de los microorganismos, ya que la estructura de las membranas es preservada en presencia de este disacárido (5). Las ectoínas son comunes en eubacterias aeróbicas heterotróficas como Halomonas elongata. La ectoína posee propiedades protectoras adicionales en comparación con otros solutos compatibles, y estabiliza incluso células enteras contra tensiones tales como la radiación UV o citotoxinas. También protege contra la inflamación inducida por nanopartículas en el epitelio pulmonar, y daños en el intestino delgado de la isquemia y reperfusión. Sus propiedades protectoras hacen de la ectoína un compuesto valioso, que se comercializa en productos de cuidado de la salud y cuidado de la piel. Por lo tanto, se produce anualmente en una escala de toneladas por la industria en un proceso biotecnológico utilizado como cepa productora a H. elongata γ-proteobacteria (21). Una de las aplicaciones más prometedoras es el uso de la ectoína como estabilizador de la reacción en cadena de la polimerasa-PCR (5).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
15
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
Los aminoácidos activos son ampliamente usados como intermediarios en la semisíntesis de antibióticos, hormonas peptídicas y pesticidas. Una ruta quimioenzimática para la síntesis de D-aminoácidos involucra la conversión de DL5-hidantoínas. Estas son asimétricamente hidrolizadas a N-carbamoil D-aminoácido por una hidantoinasa específica (dihidro-pirimidasa). El producto es convertido químicamente a los correspondientes D-aminoácidos bajo condiciones ácidas (5).
C) El Q fotoproducto de bacteriorodopsina: Debido a sus propiedades fotocrómicas, se perfila como un pigmento con gran futuro en aplicaciones muy diversas como material para elaboración de memorias ópticas, almacenamiento y procesado de información, holografía, moduladores espaciales de luz, etc (22). Se ha determinado que Haloarcula marismortui es la archea de mayor producción de la Q bacteriorrodopsina. Sin embargo durante el proceso de expresión de la proteína, el problema de la agregación de proteínas se presenta a menudo en forma de cuerpos de inclusión, por lo que no todo el producto sale de la célula. Feng et al, 2013, purificó el gen BRS que codifica la bacteriorodopsina y lo inserto en el genoma de E. coli pET21b, los resultados de sobreexpresión del producto fueron favorables (23).
FIGURA 6. Esquema del procedimiento para lograr la sobreexpresión del gen BR mutado en E. coli (23).
En el CUADRO 3 se ejemplifican las enzimas y otras moléculas de interés biotecnológico producidas por estos microorganismos.
CUADRO 3. El presente cuadro se ejemplifica algunas aplicaciones biotecnológicas de las enzimas y otras moléculas halofilicas.
ENZIMAS/OTROS Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
APLICACIÓN 16
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS Bacteriorodopsina
Proteasas Deshidrogenasas
MICROORGANISMOS HALOFILOS
Nucleasas, amilasas Solutos compatibles
b-galactosidasa,aamilasas,serina proteasas,etc. Isomerasas
Interruptores ópticos y generadores fotónicos de corriente en dispositivos bioelectrónicos. Síntesis peptídica Biocatálisis en medio orgánico Agentes saborizantes Protectores de proteínas y células en una variedad de aplicaciones industriales como congelación y calentamiento. Obtención de productos en la industrias farmacéutica y química. Modelamiento, estabilización. Desnaturalización y renaturalización de proteínas.
5.2. BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA: A) Acidos grasos poliinsaturados de cadenas larga (PUFA): Los microorganismos halófilos han sido usados para la producción de suplementos alimenticios; como por ejemplo los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA), usados como complementos en dietas para contrarrestar deficiencias en acidos grasos esenciales. Una alternativa promisoria para la producción de estos ácidos grasos, son las bacterias marinas, las cuales permiten procesos de purificación convencionales, rápidos rangos de producción y buena consistencia del producto y rendimiento (15 y 22).
B) Pigmentos carotenoides: En el caso de los colorantes, los β -carotenos son usados en la industria de alimentos como colorantes naturales, y al ser precursores de la vitamina A, son usados como complementos alimentarios (preparaciones multivitamínicas) y productos saludables. También como aditivos en cosméticos y como componentes de fármacos. Se ha reportado que las bacterias halófilas extremas tienen un óptimo crecimiento y un buen rendimiento en la producción de carotenoides en presencia de 25% de NaCl (15). Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
17
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
C) Agentes saborizantes: Las nucleasas y amilasas producidas por bacterias halófilas son usadas como agentes saborizantes en la industria alimentaria.
5.2.1. PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS FERMENTADOS: Los microorganismos halófilos juegan un importante papel en los procesos de fermentación que ocurren en presencia de sal; estos microorganismos catalizan la fermentación y generan los compuestos encargados de dar características de sabor, consistencia y aroma a los productos resultantes, adicionalmente los microorganismos halófilos producen compuestos que pueden servir como control de microorganismos no deseados (15). Así en la elaboración de la salsa de soya intervienen determinadas especies del género Tetragenococcus. Los granos de trigo y soya se resuspenden en agua con NaCl al 19% y se deja durante 9 meses en oscuridad. T. halophila se emplea como indicador de la fermentación pudiendo alcanzar una densidad de 10 8UFC/mL en la salsa de soya, que contiene una concentración aproximadamente 3 M de NaCl (24).
CUADRO 4. En el presente cuadro se ejemplifica algunas aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos halófilos en la producción de alimentos.
MICROORGANISMOS HALOFILOS
5.3.
FUENTE
APLICACIÓN
PUFA
Alimentos naturales, complementos alimenticios humanos y para ganado. Salsas fermentadas y modificadores de sabor y textura en alimentos Transformación y degradación de desechos
Microorganismos
PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS:
La aparición de resistencia a los antibióticos es un proceso evolucionista que se basa en la selección para los organismos que tienen mayor capacidad para sobrevivir dosis de antibióticos letales. Diferentes antibióticos como la penicilina, eritromicina y gentamicina que solían ser una de los curas importantes ahora son menos eficaces porque las bacterias tienden a ser más resistentes. La ventaja de que se mantenga la estabilidad estructural de la proteína de un halófilo en ambientes de alta concentración de sal se ha atribuido al bajo Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
18
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS contenido de residuos hidrofóbicos y en consecuencia débiles interacciones hidrófobas dentro de las moléculas de la proteína. Esta ventaja de los halófilos ha mostrado muchas aplicaciones médicas (25).
5.3.1. HALOCINAS PRODUCIDAS POR ARCHEAS HALÓFILAS: Las bacteriocinas denominadas BLIS (Bacteriocin like inhibitory substance) son aquellas subtancias que cumplen al menos dos requisitos esenciales: -
Son proteínas o péptidos sintetizados ribosómicamente y liberados al exterior celular. Su modo de acción sea bactericida.
En cuanto al significado biológico de ser de las bacteriocinas resulta muy tentador asignarles un papel importante en la regulación de la dinámica de poblaciones en ecosistemas microbianos. Todo parece apuntar a que la producción de estas sustancias es un mecanismo de competencia territorial. Otros autores opinan que en realidad las bacteriocinas tal vez intervengan en algún proceso vital para las células que lo producen, es decir, que tiene una función primaria distinta a la actividad antibiótica que manifiestan sobre otros microorganismos. Las halocinas son sustancias BLIS, producidas por casi todas archeas halófilas que se han estudiado, a excepción del género Halococcus ya que hasta la fecha no se ha descrito ninguna halocina producida por este género. En contraste con el gran número de halocinas estudiadas que se han detectado, el número de ellas que han sido estudiadas en profundidad es muy reducido. Como puede apreciarse en la TABLA 2, la mayoría de halocinas que se han caracterizado hasta el momento, excepto la H4 y la H1, son péptidos de bajo peso molecular, más comparables con microcinas bacterianas. Por ello resulta más adecuado referirnos a ellas con el término de microhalocinas.
TABLA 2. Halocinas estudiadas hasta la actualidad con sus respectivas referencias.
HALOCINA
Microorganismos productor
Peso molecular
Precursor
1° Referencia
H4
Haloferax mediterraneí R4 (ATCC 33500) Halobacterium spp GN 101
34,9 kD
No
Meseguer & Rodríguez-Valera 1985
2,5 kD
Si
Rdest & Sturn, 1987
Halobacterium spp Tu A4
6,2kD
No hay datos
Rdest & Sturn, 1987
Hal R1 Hal R2
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
19
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
H6
Haloferax gibbonsii (ATCC 33959)
2,7kD
Probablemente
Torreblanta et al., 1989
H1
Haloferax mediterranei M2a
31kD
No
Platas et al., 1996
S8
Cepa S8a
3,58kD
Si
Price & Shand, 2000
C8
Halobacterium spp AS7092
6,3kD
Si
Li et al., 2003
Los genes que codifican halocinas, estudiados hasta el momento, se han localizado en plásmidos. Esta también es una característica muy típica de las bacteriocinas bacterianas. A continuación, se describen la halocinas H4 y H6, por ser las más estudiadas con relación al mecanismo de acción:
Halocina H4: La halocina H4, la primera que se descubrió. Esta se obtiene a partir del sobrenadante de cultivos de Haloferax mediterranei . La máxima actividad se alcanza justo después de la fase estacionaria. Se trata de una proteína de 34.9 kD en forma madura. Es una proteína sal – dependiente y posee una región hidrofóbica de 32 residuos de aminoácidos. Posee un amplio espectro de acción. En contacto con la células sensible esta se absorbe y produce la muerte por inhibición tanto del transporte de aminoácidos como del retorno pasivo de protones al medio intracelular por lo que las células se hinchan y se deforman antes de la muerte por lisis. Tales efectos sugieren que el objetivo primario de esta halocina se encuentra localizado en la membrana citoplasmáticas y concuerdan con la presencia de la mencionada región hidrofóbica de la molécula. La H4 se uniría a la membrana alterando su permeabilidad y equilibrio iónico, produciendo finalmente la muerte celular.
Halocina H6: La halocina H6 es sin duda, la de mayor interés desde el punto de vista biotecnológico. Fue la segunda halocina estudiada. Esta halocina se obtiene a partir de cultivos de Haloferax gibbonsii al final de la fase exponencial de crecimiento mediante procesos de ultrafiltración. La halocina H6 es un inhibidor específico del intercambiador Na /H o NHE, (Sodium Proton exchanger). Las haloarcheas viven en un ambiente donde la concentración de Na alcanza valores de saturación (3-4 molar).Sin embargo la concentración de Na en el medio intracelular, oscila entre valores de 0,5 a 3 dependiendo de las especies y, por encima de estos valores,comienza a ser perjudicial para la actividad celula r. Para contrarrestar la entrada de Na, estos microorganismos disponen de un NHE unidireccional activado por la fuerza protón motriz, que se encarga de eztraer este catión del citoplasma en contra de su gradient e. Si el NHE
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
20
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS deja de funcionar, la concentración de Na intracelular aumenta rápidamente, provovando un desajuste osmótico.El agua comienza a entrar, las células se hinchan progresivamente y finalmente se lisan. El espectro de acción de la halocina H6 frente a otras halo arqueas, no es muy amplio, pero en contraste, su actividad no se restringe a las arqueas halófilas sino que sorprendentemente es capaz de inhibir el NHE de células eucariotas. Este es el primer caso en que una bacteriocina o BLIS ejerce su efecto sobre organismos tan distantes filogenéticamente del productor. El NHE es un mecanismo presente en todas las células conocidas, tanto procariotas como eucariotas. En todas ellas es bidireccional (excepto en las arqueas halófilas) y tiene funciones importantes como la regulación del pH y volumen intra celular. De hecho, en mamíferos algunos estados patológicos provocan la hiperact ividad del NHE que causa daños irreversibles en las células que la conducen a la muerte. Tales estados patológicos son, por ejemplo, situaciones de isquemia como las que se producen en el infarto de miocardio o el cerebral. Si en esos procesos patológicos se pudiera administrar un inhibidor del NHE, muchas células podrían sobrevivir. Y eso es realmente lo que ocurre En sayos realizados en animales de experimentación han puesto de manifiesto un gran efecto protector del miocardio al suministras halocina H6 intravenosa a los animales durante el infarto. A si mismo se ha demostrado in vitro que la H6 es activa sobre el NHE de células humanas en cultivo. Durante el procedimiento del curtido de pieles se utiliza la sal como conservante. Sin embargo, algunos microorganismos halófilos extremos presente en dicha sal, pueden crecer sobre la piel y deteriorarlo. Estudios recientes realizados por Todkar S. et al. (26) en el 2012, demuestran la actividad antibacteriana de halófilos marinos que inhibe el crecimiento de bacterias gram negativos como Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y hongos como el Aspergillus niger , Penicillium sp. Candida albicans, mostrando actividad significativa de la inhibición contra ellos. La TABLA 3 muestra la actividad antibacteriana de los halófilos (proteína extracto crudo) en contra de los organismos de prueba. La inhibición se encontró que era máxima contra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis seguidos por Klebsiella pneumonía.
TABLA 3. Muestra la actividad antibacterial in vitro de los extractos puros de proteínas (halocina) de halófilos marinos.
Organismos Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
Zone of Inhibition in (mm) Isolate 1 21
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
E s crherichia coli Pseudomonas aeroginosas B acillus s ubtilis K lebs iella pneumonia
8,4 5,4 5,2 4,2
La TABLA 4 muestra la actividad antifúngica de los halófilos (proteína crudo extrac to) contra los hongos de ensayo y la inhibición se encontró que era máxima contra Candida Albicans seguido por Aspergillus niger, Penicillium spp.
TABLA 4. Muestran la actividad antifúngica in vitro de los extractos puros de proteínas (halocina) de halófilos marinos.
Organisms C andida albicans A s perg illus nig er Penic illium s p
5.4.
Zone of Inhibition in (mm) Isolate 1 8,4 6,2 6,4
PRODUCCIÓN DE BIOPOLÍMEROS:
Los microorganismos halófilos tienen la capacidad de producir biopolímeros de diferentes clases entre los cuales encontramos: exopolisacáridos, biosurfactantes, liposomas, lectinas y bioplásticos.
5.4.1. Producción de exopolisacáridos: Algunas especies del género Halomonas producen exopolisacáridos (EPSs) de interés biotecnológico. Los EPS son polímeros constituidos por carbohidratos que se depositan por fuera de la pared celular o se excretan al medio. Su composición química y estructura puede ser muy variada por lo que son moléculas versátiles con aplicaciones muy diversas en distintos campos biotecnológicos debido a sus propiedades viscosizantes, estabilizantes, emulsificantes, formadoras de geles y a su contenido en sulfatos. Nuestro grupo de investigación, durante las últimas dos décadas, ha caracterizado una decena de estos polímeros. Entre ellos destaca el EPS de Halomonas eurihalina por su capacidad de formar geles; el de Halomonas maura por sus propiedades viscosizantes y emulgentes; y el de Halomonas stenophila por sus propiedades antitumorales debido al alto contenido en grupos sulfato presente en el exopolisacárido (17). Estos son poco frecuentes entre los exopolisacáridos de origen microbiano. Una de las ventajas de estos exopolisacáridos es que tienen actividad moduladora de la Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
22
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS proliferación de distintos tipos celulares, entre ellos células tumorales y bloquea la entrada de células virales en células hospederas, además, los exopolisacáridos le dan la capacidad a las células bacterianas de formar biofilms permitiéndoles la adhesión a diferentes superficies Adicionalmente algunos exopolisacáridos pueden ser fuentes de oligosacáridos ricos en fucosa, presentando potenciales aplicaciones en cosmética y medicina. El exopolímero poli (γ-D-ácido glutámico) (PGA) puede ser usado como un espesante, humectante, material de liberación sostenida, o portador de medicamentos biodegradable en la industria farmacéutica o alimentaria (18). Se ha aplicado la gelificación de exopolisacáridos bajo condiciones alcalinas para remover colorantes de efluentes textiles (15).
FIGURA 7. Fotografía de una placa con colonias mucosas posibles productoras de EPS de Halomonas sp (17).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
23
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 8. Micrografía electrónica mostrando la acumulación de EPS alrededor de Halomonas almeriensis M8T durante la fase de crecimiento exponencial (A) y estacionaria (B). Las flechas indican el EPS producidos por la cepa (27).
FIGURA 9. Tabla 3 del estudio realizado por Llamas et al. 2012 , donde se muestran las características de los exopolisacáridos producidos por bacterias halófilas (27).
5.4.2. Producción de biosurfactantes: Los biosurfactantes mejoran la remediación de suelo y agua contaminados con aceite, disminuyen la tensión superficial, incrementan la solubilidad y movilidad de hidrocarburos hidrofóbicos, promoviendo la degradación (Figura 11). Los microorganismos halófilos o halotolerantes productores de biosurfactantes podrían jugar un papel importante en la acelerada remediación de medios ambientes salinos contaminados con aceite (15).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
24
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS FIGURA 10. Producción de emulsificantes del petróleo por bacterias halófilas.
5.4.3. Produccion de liposomas Los liposomas son usados en medicamentos y cosméticos para el transporte de los compuestos hacia sitios específicos en el cuerpo. Los lípidos unidos a éteres de halófilos del phylum Archae tienen una alta estabilidad química y resistencia contra las esterasas y de esta manera tienen una alta tasa de sobrevivencia comparada con los liposomas que están basadas en derivados de ácidos grasos (15 y 18).
5.4.4. Producción de lectinas Las lectinas son proteínas selectivas unidas a azúcar, son herramientas útiles para la investigación de la superficie celular y marcadores celular. Son usadas como marcadores de las modificaciones de la superficie celular para la detección de células malignas (15 y 18).
5.4.5. Producción de bioplásticos: Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres sintetizados por algunos microorganismos. Tienen numerosas aplicaciones industriales como la producción de plásticos biodegradables utilizados en la elaboración de papel de embalaje o en la fabricación de materiales utilizados en medicina. Este polímero es acumulado intracelularmente por muchas de las especies de este género Halomonas (15 y 17).
5.4.6. Aplicación en procesos de extracción del crudo en la industria petrolera. Los polímeros bacterianos tienen gran importancia en la industria petrolera. Gracias a sus propiedades surfactantes y emulsionantes pueden aumentar la eficacia de los procesos de extracción de crudo del subsuelo incrementando la viscosidad del agua que se inyecta alrededor de las bolsas, disminuyendo así su tensión superficial. Las bolsas de petróleo suelen presentar una elevada salinidad, lo que hace especialmente interesante la utilización directa de bacterias halófilas moderadas productoras de biopolímeros (28).
CUADRO 5. En el presente cuadro se ejemplifica algunas aplicaciones biotecnológicas de los biopolímeros producidos por bacterias y archeas halófilas.
BIOPOLIMEROS Polihidroxialcanoatos Polímeros reológicos
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
APLICACIÓN Plásticos de medicina Recuperación petróleo
uso
en de
25
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
BACTERIAS Y ARCHEAS HALÓFILAS
Lípidos
Membranas Glicerol
5.5.
Liposomas para liberación de fármacos y cosméticos Surfactantes para productos farmacéuticos Productos farmacéuticos
PRODUCCIÓN DE TRANGÉNICOS:
La salinidad del suelo y la sequía son algunos de los más graves problemas agrícolas y ambientales de hoy. Por lo tanto, las investigaciones de resistencia de las plantas al estrés abiótico han recibido mucha atención en los últimos años. Reda E.A. Moghaieb et al ,2011 (29) evaluaron la tolerancia a sales de plantas de tomate (Lycopersicum sculentum variedad "Momotaro") transgénicos que contenían los genes L-2,4-ácido diaminobutírico aminotransferasa (gen: ect B), ácido acetil L-2,4-diaminobutírico transferasa (gen: ect A) y sintasa L-ectoína (gen: ectC) ,dichos genes son necesarios para la síntesis de ectoína que es un soluto compatible común en bacterias halófilas que se origina a partir de Laspartato β-semialdehído. La expresión de los genes biosintéticos de la ectoína se detectó en las plantas transgénicas mediante northern blot. La concentración de ectoína aumento con el aumento de la salinidad. Los resultados sugieren que bajo condiciones salinas la síntesis de ectoína se promueve en las raíces de las plantas transgénicas, lo que conduce a una aceleración la actividad fotosintética en las raíces. Posteriormente, la función de raíz tales como la absorción de agua se mejora, en comparación con plantas de tipo salvaje. De esta manera, la tasa fotosintética se incrementa mediante la mejora de la estabilidad de la membrana celular en condiciones oxidantes bajo estrés salino. Por otro lado Gasparic M. et al , 2013 (30) identificaron la secuencia codificante completa de una proteína 3'-fosfoadenosina-5'-fosfatasa, gen ApHal2, a partir de la levadura halotolerante Aureobasidium pullulans. Este gen junto al motivo MET se insertó en Arabidopsis thaliana haciendo que esta sobreexprese un gen modificado denomidado SAL1 (mSAL1),la planta mostró una mejor halotolerancia y tolerancia a la sequía. Por lo tanto, la presencia de esta secuencia motivo META fúngica es beneficioso en condiciones de aumento de la salinidad y la sequía moderada, y no muestra inconvenientes para supervivencia de las plantas en condiciones de sequía severa. Esto demuestra que las adaptaciones de los hongos extremotolerantes deben ser considerados como un valioso recurso para mejorar el estrés de tolerancia en el fitomejoramiento en el futuro.
5.6.
BIORREMEDIACIÓN: 5.6.1. Biodegradación de residuos tóxicos industriales: Las bacterias halófilas han alcanzado recientemente un gran interés en el campo de la degradación de los residuos tóxicos. Constituyen una importante alternativa a los tratamientos microbiológicos convencionales en aquellos casos en los que éstos sean ineficaces,
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
26
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS como son los procesos industriales que generan aguas residuales hipersalinas. Esto sucede por ejemplo en la producción de diversas sustancias químicas como los pesticidas, determinados productos farmacéuticos y herbicidas, y los procesos de extracción de petróleo y gas (31).
5.6.2. Biorremediación hidrocarburos:
de
ambientes
contaminados
con
El petróleo crudo es una mezcla de hidrocarburos compuesta principalmente de hidrocarburos oxigenados y no oxigenados. Hasta la fecha muchos estudios han informado de la capacidad de los microorganismos para utilizar los componentes del crudo como sustratos para su crecimiento en ambientes moderados o de alta salinidad. Díaz et al. 2000 (32) han enriquecido consorcios microbianos, MPD-7 y MPD-M de los campos de petróleo del cormorán en el Mar del Norte y sedimentos asociados a las raíces de mangle, respectivamente. Estos cultivos degradan hidrocarburos alifáticos y aromáticos a una salinidad que oscila entre 3,5 y 10% NaCl. La degradación total de petróleo por MPD-7 osciló entre 20 y 38%, mientras que MPD-M degrada mayor cantidad de petróleo crudo que oscila entre 45 y 48%. En un estudio posterior, Diaz et al. 2002 (33) han inmovilizado el cultivo de MPD-M en fibras de polipropileno y mostró que la cepa fue capaz de degradar el petróleo crudo en mucho mayor salinidad de hasta 18% de NaCl. Riis et al. 2003 (34) fueron capaces de mostrar la degradación de combustible diesel en presencia de sal de hasta 17,5% en comunidades microbianas extraídos de suelos salinos argentinas. Además, estos investigadores aislaron varias bacterias halotolerantes de los géneros Cellulomonas, Bacillus, Dietzia, y Halomonas con la capacidad de degradar el petróleo crudo como fuente de carbono. Del mismo modo, muchos otros investigadores han aislado cultivos puros incluyendo Halomonas shengliensis, Halomonas sp. cepa C2SS10, Marinobacter aquaeolei , Streptomyces albiaxialis, Rhodococcus erythropolis, y Dietzia maris a partir de yacimientos petrolíferos, agua de producción, y otros ambientes salinos que degradan el petróleo crudo como la fuente de carbono en presencia de 0-30% de sal. Borzenkov et al. 2006 (35) reportaron el aislamiento de varias cepas de bacterias oxidantes de hidrocarburos que representa los géneros Rhodococcus, Gordonia, Dietzia y Pseudomonas de las aguas de petróleo y estratal de Tatarstán, el oeste de Siberia, y los campos petrolíferos de Vietnam. Recientemente, Al-mailem et al. 2013 (36) han aislado Marinobacter sedimentalis y Marinobacter falvimaris obtenidas de agua y suelo en el estanque hipersalinos de sabkhas (18-20% de salinidad) en Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
27
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS Kuwait. El aislamiento de estos organismos se realizó utilizando placas de agar proporcionados con vapor de petróleo crudo como la única fuente de carbono y 6% de NaCl. Estos estudios también mostraron que ambos organismos eran capaces de fijar el nitrógeno atmosférico y dicho potencial es beneficioso para la biorremediación eficaz de compuestos de petróleo en alta salinidad sin la necesidad de proporcionar fertilizante. Las archeas, por otro lado, poseen un sistema análogo a la bacteriorrodopsina, esta estrategia permitiría utilizar el oxígeno limitado disponible para iniciar la degradación de hidrocarburos en condiciones de alta salinidad. Los estudios también han informado de la capacidad archaeal para degradar petróleo crudo en ambientes hipersalinos. Al-mailem et al. 2010 (37) han aislado cepas archaeas extremadamente halófilas de Haloferax , Halobacterium, y Halococcus de una zona costera hipersalina del Golfo Arábigo. Estos organismos también metabolizan diversos hidrocarburos alifáticos y aromáticos como las únicas fuentes de carbono y energía, en alta salinidad. Sin lugar a dudas tales propiedades son importantes para la biorremediación de sitios áridos de alta salinidad impactados por el petróleo crudo. En conclusión, la degradación de hidrocarburos mejorada en presencia de la luz es una observación interesante y merece una mayor investigación sobre por qué las arqueas dominan los ambientes hipersalinos. Este conocimiento podría ser útil para desarrollar estrategias para mejorar la degradación de hidrocarburos en ambientes de alta salinidad. Sólo unos pocos estudios disponibles sobre la capacidad de los hongos para degradar hidrocarburos en ambientes de alta salinidad. Obuekwe et al. 2005 (38) son los primeros en reportar el aislamiento de Fusarium lateritium, Drechslera sp y Papulaspora sp de un pantano de sal en el desierto de Kuwait que son capaces de degradar el petróleo crudo como la única fuente de carbono a la salinidad que van desde 5 a 10%. En general, bacterias, arqueas y eucariotas unos pocos se han demostrado para degradar el petróleo crudo en un amplio intervalo de salinidad (0-30%). De ellos, eubacterias, tales como Marinobacter aquaeolei , albiaxialis Streptomyces, Actinopolyspora sp y arqueas como Haloferax , Halobacterium y Halococcus soportar la salinidad extrema (20-30%) y tales organismos son importantes para la limpieza de ambientes hipersalinos impactados por el petróleo ya que la atenuación natural en estos entornos es demasiado lento (39).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
28
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 11. Se muestran las especies degradadoras de petróleo crudo a distintas concentraciones de sal (39).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
29
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 12. Se muestran las especies degradadoras de hidrocarburos alifáticos a distintas concentraciones de sal (39).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
30
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 13. Se muestran las especies degradadoras de benzeno, tolueno, etilbenzeno y xileno a distintas concentraciones de sal (39).
5.6.3. Biorremediación de ambientes contaminados por colorantes industriales y metales pesados: Existen algunos reportes sobre la capacidad de los microorganismos halófilos para degradar los azo colorantes phenolicos y aniones tóxicos de colorantes textiles en efluentes altamente tóxicos y salino con concentraciones de sal del 15-20 %. Salinococcus iranensis y las Halomonas son especies que coadyuvan a decolorar los colorantes azo y usan el fenol como fuente primaria de energía. Así mismo debido a la producción eficiente de exopolisacáridos las bacterias halófilas tienen la capacidad de captar metales pesados. Aunque los mecanismos de esta actividad aún siguen en estudios.
5.6.4. Biorremediación de suelos salinos-sódicos: La presencia de sodio y condiciones salinas en los suelos, interfiere en el crecimiento adecuado de la mayoría de los cultivos y por lo tanto constituye uno de los problemas más serios que enfrenta la agricultura sostenible en todo el planeta. La FAO y la UNESCO calculan que el área total de suelos salinos en el mundo es de 397 millones de hectáreas y los suelos sódicos corresponden a Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
31
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS 434 millones de hectáreas. La recuperación de los suelos sódicos se ha hecho principalmente cambiando el sodio en complejo coloidal por otro catión, aplicando principalmente sales solubles de calcio ó sales de calcio con baja solubilidad (cal agrícola), siendo esta una opción costosa, Sánchez L. y col . 2006, proponen una alternativa en la cual algunas bacterias halófilas son capaces de capturar sodio in vitro y pueden ser posiblemente utilizadas en un biorreactor para la bioremediación de suelos sódicos y salinos, formando un consorcio entre bacterias autóctonas y bacterias a las cuales se les ha comprobado su capacidad de capturar sodio (40).
VI. 6.1.
INVESTIGACIONES DE HALÓFILOS EN EL PERÚ.
Caracterización de bacterias halófilas productoras de amilasas aisladas de las Salinas de San Blas en Junín:
El objetivo de este estudio fue caracterizar bacterias halófilas con actividad amilolítica provenientes de las Salinas de San Blas-Junín, ubicadas en los Andes peruanos aproximadamente a 4100 m de altitud. Este estudio se realizó con 34 bacterias aisladas de muestras de suelos las cuales se cultivaron en agar agua de sales (SW) 5 % conteniendo extracto de levadura 0,5 % y almidón 1 %. El 41 % de bacterias mostró la capacidad de hidrolizar almidón, éstas fueron caracterizadas mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas convencionales. Tres bacterias fueron Gram-negativas y once Gram-positivas. El 21 % (3/14) creció en un amplio rango de concentración de sales, entre 5 y 20 %. El 14 % (2/14) de las bacterias presentó actividad lipolítica, proteolítica y nucleolítica, y el 29 % (4/14), presentó actividad proteolítica y nucleolítica. Las bacterias se identificaron mediante los perfiles de restricción de los genes ribosómicos 16S amplificados, las enzimas usadas fueron Hae III , BstU I , Hinf I y Cfo I . Los genes ribosómicos 16S de siete bacterias que presentaron perfiles de ADN diferentes se amplificaron, secuenciaron y analizaron mediante programas bioinformáticos. Del análisis fenotípico y molecular de las 14 bacterias amilolíticas se obtuvieron dos grupos, uno perteneciente al género Halomonas y el otro, al género Bacillus. Las bacterias amilolíticas caracterizadas podrían ser de potencial uso a nivel industrial (41).
6.2.
Rendimiento de exopolisacáridos emulgentes producidos por bacterias halófilas nativas en tres concentraciones de melaza de S accharum offic inarum L . “caña de azúcar”:
El objetivo del estudio fue determinar el rendimiento y productividad de exopolisacáridos emulgentes por bacterias halófilas nativas en melaza. A partir de muestras de agua y suelo de salinas en los distritos de San José y Santa Rosa, en Lambayeque, se obtuvieron 138 aislados de bacterias en medio sintético malta-extracto de levadura con 5 % p/v de sales. Con el 10,8 % de estas bacterias formadoras de colonias gomosas y cultivadas en glucosa como fuente de carbono se recuperaron EPS, cuyos valores máximos de Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
32
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS emulsión en las mezclas agua fase oleosa fueron 63,3 y 56,6 %, después de 1 y 24 horas. El aislado M510-1C1 identificado como Halomonas sp. M5 sintetizó EPS emulgentes en caldo con 20, 30 y 40 gL-1de melaza, alcanzando 0,296; 0,200 y 0,113 gg-1 de rendimiento Yp/s y 0,016; 0,017 y 0,010 gL-1h-1 de productividad , respectivamente, no existiendo diferencias significativas entre 20 y 30 g L -1. Con el control 10 gL-1 de glucosa se alcanzó un rendimiento Yp/s de 0,171 gg-1 y una productividad de 0,018 gL-1h-1. Se demostró que las bacterias halófilas nativas producen exopolisacáridos emulgentes en melaza como fuente de carbono (42).
6.3.
Bacterias halófilas moderadas productoras de hidrolasas de interés biotecnológico:
El objetivo de este estudio fue caracterizar bacterias halófilas moderadas productoras de hidrolasas de interés biotecnológico. Para ello, se seleccionaron 32 aislados bacterianos aerobios procedentes de ambientes salinos de Pilluana, Huacho, Maras, Chilca, Paracas y Ventanilla. Para todos los microorganismos se determinaron: características morfológicas, fisiológicas y capacidad hidrolítica a diversos sustratos. La caracterización genotípica se realizó amplificando los genes ribosómicos bacterianos 16S y cortando con la enzima Hae III. Los microorganismos presentaron actividad hidrolítica sobre tween 80, aceite de oliva, almidón, caseína, lactosa y ADN; correspondiendo cada una de estas moléculas a los números de aislado 23, 2, 24, 19, 2 y 6, respectivamente. Los aislados L3CH y L2PAR hidrolizaron la mayoría de sustratos a excepción de lactosa y ADN, respectivamente. Por otro lado, los aislados P2RI-17 y M17 hidrolizan solamente Tween 80. Del análisis de restricción del ADN ribosómico 16S amplificado se obtuvieron 12 perfiles genéticos, lo cual indica que al menos existen 12 especies bacterianas con gran potencial biotecnológico en la producción de enzimas hidrolíticas (43).
6.4.
A ctinomycetes bioactivos de sedimento marino de la costa central del
Perú: En el presente trabajo se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica de actinomycetes marinos sobre patógenos de origen clínico. Asimismo, fueron evaluadas la capacidad de producir enzimas extracelulares como carbohidrasas, lipasas y proteasas. Los Actinomycetes fueron aislados de sedimentos colectados entre setiembre a diciembre del 2005 de las Bahías de Ancón (Lima) e Independencia (Ica) de 34 y 100 m de profundidad. El aislamiento se realizó en Agar Caseína - Almidón (ACA) y Agar Marino (AM) con adición de Cicloheximide (10 ng/mL). Las evaluaciones antimicrobianas fueron realizadas frente a bacterias patógenas antibiótico-multirresistentes y hongos de origen clínico; en tanto, para evaluar su actividad multienzimática se utilizaron sustratos poliméricos diversos. Se aislaron un total de 62 actinomycetes, de los cuales 31 (50%) mostraron actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, 36 (59%) frente a Pseudomonas aeruginosa y 23 (37%) a ambos patógenos. Las Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
33
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS cepas de actinomycetes I-400A y M10-77 identificadas en cada caso como Streptomyces y Thermoactinomyces fueron las que exhibieron mayor actividad inhibitoria frente a P. aeruginosa y S. aureus respectivamente. Asimismo, 13 actinomycetes (20,97%) mostraron actividad antifúngica frente a cultivos de Candida albicans cepa 1511 y 17 (27,42%) frente a Candida albicans cepa 1511MIC; sin embargo, ningún actinomycete presentó actividad inhibitoria frente a Aspergillus niger , Aspergillus fumigatus y Trichophyton mentagrophytes. La mayoría de los actinomycetes mostraron tener actividad multienzimática capaz de hidrolizar compuestos poliméricos como el tween-80 (96%), la gelatina (95%), almidón (93%), lecitina (88%) y la caseína (74%). Extractos del compuesto activo obtenidos de la cepa M10-77 con etil acetato rindieron notable actividad inhibitoria contra S. aureus. Se concluye que el sedimento marino es fuente de Actinomycetes con gran capacidad de producir sustancias bioactivas de importancia médica-farmacológica e industrial (44).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
34
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
VII.
o
CONCLUSIONES:
La sal es un factor inhibitorio de crecimiento microbiano, sin embargo existen microorganismos llamados halófilos que han desarrollado una serie de estrategias para resistir el estrés osmótico originado por las elevadas concentraciones de sales. Debido a que muchas de los procesos biotecnológicos se llevan en condiciones de estrés y se requiere evitar cualquier tipo de contaminación microbiana, los halófilos han captado el interés de muchos científicos que mediante sus investigaciones dilucidan poco a poco el uso óptimo de los halófilos para la producción de enzimas y otras moléculas de interés biotecnológico a nivel industrial.
o
A pesar de que actualmente se usan algunos microorganismos halófilos en distintas industrias, aún son escasas las investigaciones sobre los usos potenciales y/o la optimización del proceso biotecnológico.
VIII.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
35
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
1. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2003. Crecimiento microbiano. Biología de los Microorganismos 10a edición Prentice may; pp 137 – 160. 2. Ventosa, A., Gutiérrez, M.C., García, M.T., Ruíz-Berraquero, F. (1989) Classification of Chromobacterium marismortui in a new genus, Chromohalobacter gen. nov., as Chromohalobacter marismortui comb. nov., nom. Rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 382386. 3. Van den Burg B. Extremophiles as a source for novel enzymes. Curr Opin Microbiol 2003; 6: 1-6. 4. Ramírez N, Sandoval AH, Serrano JA. Las bacterias halófilas y sus aplicaciones biotecnológicas. Rev. Soc. Ven. Microbiol. [revista en la Internet]. 2004 Ene [citado 2015
Jul
31];
24(1-2):
12-23.
Disponible
en:
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S131525562004000100 004&lng=es. 5. Estrategias de adaptación de microorganismos halófilos y Debaryomyces hansenii (Levadura halófila). Revista Latinoamericana de Microbiología.Vol 44:3-4,2002. 6. Aislamiento y caracterización de microorganismos halófilos de suelos salinos de cuatro ciénagas Coahuila, México. 7. Microorganismos. Investigación y ciencia. Julio 2007.Disponible ( on line) en: file:///G:/HAL%C3%93FILAS%20PROYECTO/BIBLIOGRAF%C3%8DA/Microorgan ismos%20Halofilos%20articulo%20100%25.html 8. Martín I. Diversidad microbiana y taxonomía. Universidad de Granada. Disponible (on
line)
en:
http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article &id=251&Itemid=274 9. DasSarma S. 1995. Halophilic arquea: An Overview, Arquea a laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory Press, USA, pp 3-11. 10. Javor B.J. 1989. Hypersaline env52. Javor B.J. 1989. Hypersaline environments. Microbiology and biogeochemistry.Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. ironments. Microbiology and biogeochemistry. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. 11. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 504-544. 12. Plemenitaš A., Lenassi M., Konte T., Kejžar A., Zajc J., Gostincar C. and Gunde Cimerman N. Adaptation to high salt concentrations in halotolerant/halophilic fungi:
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
36
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
a molecular perspective . Frontiers in Microbiology: Extreme Microbiology Volume 5, Article 199, 2014. 13. Serrano J. Ciclo del glioxilato en el arquea halófilo Haloferax volcanii:anpalisis bioquímico,filogenético y transcripcional. Universitat d´Alacant. Alicante,2000. 14. Roy D. Sleator y Colin Hill. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiology Reviews 26 (2001) 49-71 15. Margesin, R., Schinner, F. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles. 5(2): 73-83.2001. 16. Ventosa, A., Sánchez-Porro, C., Martín, S. and Mellado, E. (2005) Halophilic archea and bacteria as source of extracellular hydrolytic enzymes. In N: Gunde-Cimerman, A. Oren y A, Plemenitas (eds). Adaptation to life at salt concentrations in Archaea, Bacteria and Eukarya, Heildeberg. Spring-Verlag. 17. Luque R. Aislamiento de cepas del género Halomonas con interés biotecnológico en Rambla Salada (Murcia). Ars Pharm 2010; 51.Suplemento 3: 453-462. 18. Castillo L. y Barragán B.
Aplicaciones biotecnológicas de microorganismos
halófilos. Revista Sistemas Ambientales, Vol. 4, No 2, 2011, p. 45-54. 19. Brown A.D. 1976. Microbial water stress. Bacteriological Reviews, 40: 803-846. 20. Louis P., Trüper H.G., Galinski E. 1994. Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compatible solutes. Applied Microbiology and Biotechnology, 41: 648-688. 21. Schwibbert K.,Marin-Sanguino A. ,Bagyan I. ,Heidrich G. , Lentzen G. , Seitz H. , Rampp M. ,Schuster S., Peter H. ,Pfeiffer F. ,Oesterhelt D. and Jörg H. A blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T. Environ Microbiol. 2011 Aug; 13(8): 1973 –1994. doi: 10.1111/j.1462-2920.2010.02336.x 22. Meseguer I. Los microorganismos halofilos y su potencial aplicado a la biotecnología.Ciencia e investigación.Facultad de farmacia y bioquímica. UNMSM 2004. 23. Hsu M-F, Yu T-F, Chou C-C, Fu H-Y, Yang C-S, et al. (2013) Using Haloarcula marismortui Bacteriorhodopsin as a Fusion Tag for Enhancing and Visible Expression of Integral Membrane Proteins in Escherichia coli. PLoS ONE 8(2): e56363. doi:10.1371/journal.pone.0056363
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
37
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
24. Röling W.F.M., Van Verseveld H. 1996. Characterization of Tetragenococcus halophilapopulations in Indonesian soy mash (kecap) fermentation. Applied and Environmental Microbiology,62: 1203-1207. 25. S E Lowe, M K Jain, and J G Zeikus. Biology, ecology, and biotechnological applications of anaerobic bacteria adapted to environmental stresses in temperature, pH, salinity, or substrates. Microbiol Rev. 1993 Jun; 57(2): 451 –509. 26. Todkar S. , Todkar R., Kowale L., Karmarkar K., Kulkarni A. Isolation and Screening of Antibiotic producing Halophiles from Ratnagri coastal area, State of Maharahstra International Journal of Scientific and Research Publications, Volume 2, Issue 4, April 2012 1 ISSN 2250-3153 www.ijsrp.org 27. Llamas I., Amjres H., Mata J., Quesada E. and Béjar V. The Potential Biotechnological Applications of the Exopolysaccharide Produced by the Halophilic Bacterium Halomonas
almeriensis.
Molecules 2012, 17, 7103-7120; doi:
10.3390/molecules17067103. 28. Ventosa A. 1988. Taxonomy of moderately halophilic heterophilic eubacteria, En F. Rodriguez-Valera (ed), Halophilic Bacteria. Boca Raton CRC Press, USA,pp. 71-84. 29. Reda E.A. Moghaieb, Akiko Nakamura, Hirofumi Saneoka & Kounosuke Fujita (2011) Evaluation of salt tolerance in ectoine-transgeni c tomato plants (Lycopersicon esculentum) in terms of photosynthesis, osmotic adjustment, and carbon partitioning , GM Crops, 2:1, 58-65 30. Gasparic M., Lenassi M., Gostincar C., Rotter A., Plemenitas A., Cimerman N., Gruden K., Zel J.(2013). Insertion of a Specific Fungal 39-phosphoadenosine-59phosphatase Motif into a Plant Homologue Improves Halotolerance and Drought Tolerance of Plants. PLoS ONE 8(12): e81872. doi:10.1371/journal.pone.0081872 31. Oren A., Guverich P., Azachi M., Henis Y. 1993. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations, En E. Rosenberg (ed). Microorganisms to Combat Pollution. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. pp. 263-274. 32. Diaz M. P., Grigson S. J. W., Peppiatt C. J., Burgess J. G. (2000). Isolation and characterization of novel hydrocarbon-degrading euryhaline consortia from crude oil and mangrove sediments. Mar. Biotechnol. 2, 522 –532 10.1007/s101260000037 [PubMed] [Cross Ref] 33. Diaz M. P., Boyd K. G., Grigson S. J. W., Burgess J. G. (2002). Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
38
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
consortium MPD-M, immobilized onto polypropylene fibres. Biotechnol. Bioeng. 79, 145 –153 10.1002/bit.10318 [PubMed] [Cross Ref] 34. Riis V., Kleinsteuber S., Babel W. (2003). Influence of high salinities on the degradation of diesel fuel by bacteria consortia. Can. J. Microbiol. 49, 713 –721 10.1139/w03-083 [PubMed] [Cross Ref] 35. Borzenkov I. A., Milekhina E. I., Gotoeva M. T., Rozanova E. P., Belyaev S. S. (2006). The properties of hydrocarbon-oxidizing bacteria isolated from the oilfields of
Tatarstan,
Western
Siberia,
and
Vietnam.Microbiology
75,
66 –72
10.1134/S0026261706010127 [PubMed] [Cross Ref] 36. Al-Mailem D. M., Eliyas M., Radwan S. S. (2013). Oil-bioremediation potential of two hydrocarbonoclastic, diazotrophic Marinobacter strains from hypersaline areas along the Arabian Gulf coasts. Extremophiles 17, 463 –470 10.1007/s00792-013-0530-z [PubMed] [Cross Ref] 37. Al-Mailem D. M., Sorkhoh N. A., Al-Awadhi H., Eliyas M., Radwan S. S. (2010). Biodegradation of crude oil and pure hydrocarbons by extreme halophilic archaea from hypersaline coasts of the Arabian Gulf.Extremophiles 14, 321 –328 10.1007/s00792-010-0312-9 [PubMed] [Cross Ref] 38. Obuekwe C. O., Badrudeen A. M., Al-Saleh E., Mulder J. L. (2005). Growth and hydrocarbon degradation by three desert fungi under conditions of simultaneous temperature
and
salt
stress.
Intern.
Biodeter.
Biodegrad.
56,
197 –205
10.1016/j.ibiod.2005.05.005 [Cross Ref] 39. Babu Z. Fathepure. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons
in
hypersaline
173.2014.Disponible
environments. on
Front
Microbiol.
line
2014;
5:
en
:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4005966/pdf/fmicb-05-00173.pdf 40. Sánchez L. y Arguello H. Capacidad de bacterias halófilas para capturar sodio in Vitro y su posible aplicación en bioremediación en suelos salinos-sódicos. Nova publicación científica vol.4 no. 6 junio - diciembre de 2006:1-114 41. Canales P., Chávez E., Zavaleta A. Caracterización de bacterias halófilas productoras de amilasas aisladas de las Salinas de San Blas en Junín . Rev. colomb. biotecnol
vol.16
no.2
Bogotá
jul./dic.
2014.
Disponible
en:
http://www.sci.unal.edu.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S012334752014000200018&lng=es&nrm=iso.
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
39
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
42. Fuentes A., Carreño C., Llanos C. Rendimiento de exopolisacáridos emulgentes producidos por bacterias halófilas nativas en tres concentraciones de melaza de Saccharum officinarum L. "caña de azúcar". Scientia Agropecuaria, ISSN-e 20779917, Vol. 4, Nº. 2, 2013, págs. 111-120 43. Mónica L. Flores, Amparo I. Zavaleta, Yanina Zambrano, Liliam Cervantes, Víctor Izaguirre. Bacterias halófilas moderadas productoras de hidrolasas de interés biotecnológico. Facultad de Farmacia y Bioquímica UNMSM 2010. Ciencia e Investigación 2010; 13(1): 42-46. 44. León J., Liza L., Soto I., Cuadra L., Patiño L. y Zerpa R. Actinomycetes bioactivos de sedimento marino de la costa central del Perú. Rev. peru biol. v.14 n.2 Lima dic. 2007. 45. Pfeifer F. Haloarchaea and the Formation of Gas Vesicles. Life 2015, 5(1), 385-402; doi: 10.3390/life5010385. Disponible (on line) en: http://www.mdpi.com/20751729/5/1/385/htm
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
40
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
IX.
ANEXOS:
ANEXO 1. Se presentan imágenes relacionadas al tema.
FIGURA 1. Gradiente de protones utilizado para generar ATP fuente (on line) disponible en: https://en.wikipedia.org/wiki/halobacterium_salinarum
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
41
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 2. Colonias (a) y células de Halobacterium ( Hbt. )salinarum vesículas de gas que produce (b, c). ( un ) Las colonias sobre medios sólidos cultivaron durante una semana a 40 ° C y tres semanas a temperatura ambiente. Vesícula (Vac +células) forman colonias blancas rosadas, mientras que las colonias de Vac - mutantes son el rojo y transparente. ( b ) las células cultivadas en medios líquidos observadas por microscopía de luz de contraste de fase. ( c ) células de un Vac +colonia investigado por microscopía electrónica de transmisión.La forma de las células pleomórfico crecido durante tres meses en medios sólidos se diferencia de las células con forma de bastón visto en cultivo líquido (45).
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
42
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
FIGURA 3. Estructura de la bacteriorrodopsina. Fuente (on line) disponible en: http://es.slideshare.net/jarconetti/tema-10-6796319
FIGURA 4. Flujograma general de obtención de plantas de tomate (Lycopersicum sculentum variedad "Momotaro") transgénicos resistentes a suelos salinos. Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
43
2015
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS HALÓFILAS
1. Bacteriorrodopsina: memorias ópticas, almacenamiento y procesado de información, holografía, moduladores espaciales de luz, etc.
2. Solutos compatibles: estabilizadores de biomoléculas y células, antagonistas de sales, agentes protectores de estrés, etc
a. Exopolisacáridos: espesantes, emulgentes y gelificantes. 3. Biopolímeros
b. Liposomas: transporte de compuestos en medicina y cosmética. c. Acido poli-glutámico (PGA): humectante, espesante, etc. d. Polihidroxialcanoatos: plásticos biodegradables, prótesis, etc.
4. Enzimas
a. Hidrolasas b. Isomerasas
5. Halocinas como el PINHE : protector en el infarto de miocardio (entre otros usos) 6. Vesículas de gas: separación, presentación de antígenos y desarrollo de vacunas 7. Pigmentos carotenoides: suplementos y pigmentación de alimentos
FIGURA 5. Resumen de las aplicaciones biotecnológicas de los halófilos.
Facultad de ciencias biológicas Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica
44