Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa

Memoria presentada por D. Julio Luis Gabriel Ortega Para optar al grado de Doctor en Producción Agraria y Biotecnologia por la Universidad Pública de Navarra

Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío ( Phytophthora Phytophthora infestans ) en papa

Directores: Dr. ENRIQUE RITTER AZPITARTE. Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario.

Dr. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ. Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario.

Tutor: Dr. ANGEL MINGO CASTEL. Profesor titular del Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra.

Universidad Pública de Navarra E.T.S. Ingenieros Agrónomos

Pamplona, 2008

D. ANGEL MINGO CASTEL en su calidad de Profesor titular del Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra.

D. ENRIQUE RITTER AZPITARTE en su calidad Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario. y D. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ en su calidad de Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario. .

CERTIFICAN: Que D. JULIO LUIS GABRIEL ORTEGA, Ingeniero Agrónomo ha realizado bajo nuestra dirección, el trabajo de investigación correspondiente a la presente Memoria de Tesis Doctoral in titulada:

“Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en Phytophthora infestans) diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío ( Phytophthora

en papa” Y para que así conste en cumplimiento de la legislación vigente, expedimos el siguiente certificado

Pamplona, 01 de diciembre del 2008

Fdo. Enrique Ritter Azpitarte

Fdo. José Ignacio Ruiz de Galarreta

Fdo. Angel Mingo Castel

Agradecimientos El presente trabajo es el fruto de mucho mucho esfuerzo y dedicación de muchas muchas horas y muchas personas que con su ejemplo, enseñanza, dedicación, amistad y profesionalismo hicieron posible alcanzar esta meta anhelada en mi formación. A todos quienes de una u otra manera contribuyeron a este logro quiero expresar mis sinceros agradecimientos y les ruego me perdonen si no logro nombrar a todos, no es por omisión voluntaria. En principio deseo agradecer de manera especial al Dr. Antonio Gandarillas, Gerente General de la Fundación PROINPA en Bolivia por su amistad, confianza y apoyo permanente para alcanzar esta meta, que es la culminación de un largo anhelo y sacrificio; y por intermedio de él al Directorio y al personal de la Fundación PROINPA, por depositar su confianza en quienes trabajamos en esta noble institución dedicada al desarrollo agrícola de mi país. Por ende, también agradecer al laboratorio de biología molecular en la persona de mi gran amigo y colega Dr. Jorge Rojas y su equipo técnico, Yola Sánchez y Eliana Alba. A Giovanna Plata y al Centro Toralapa por facilitarme los invernaderos y la ayuda necesaria para hacer la evaluación de resistencia en hoja y tubérculo a P. infestans. Quiero agradecer de manera expresa y especial a mis dos directores de tesis, los Dres. Enrique Ritter y José Ignacio Ruiz de Galarreta, de Neiker Tecnalia, no sólo por la dirección de la tesis, sino por por su gran amistad, confianza, apoyo, esfuerzo

y

profesionalismo, razones que me han permitido pueda culminar este trabajo. Agradezco de manera particular a la Dra. Pamela Anderson, Directora del CIP, y por intermedio de ella a la sra. Mercedes Suito, Victor Mares y a todo el equipo que maneja las becas INIA-España, en el CIP - Lima, Perú, por la permanente preocupación para que no me falte nada; y muy especialmente agradezco a la sra. Angeles Angeles Navarrete y la Dra. María Teresa Dobao y a todo el equipo del INIA - España por financiar mis estudios doctorales en la UPNA, España. Gracia por invertir en mi país y mi gente. A la Dirección de Neiker Tecnalia, por haberme acogido en esta prestigiosa institución del país Vasco, España - para realizar los trabajos de laboratorio para mi

formación científica en el mundo de la Biología Molecular durante estos tres años y medio. Al programa doctoral bajo la coordinación del Dr. José Antonio Mendizabal del Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra, por su amistad y por permitirme la presentación del presente trabajo y en especial al Dr. Ángel Mingo Castel por aceptar la tutoría de esta tesis, y facilitarme en los primeros años toda la comprensión y ayuda necesaria; al igual que la Dra. Beatriz Amoreno, que me acogió en un primer momento en el Instituto de Agrobiotecnologia de Arrosadia. Al proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y al proyecto patrocinado por el gobierno de Alemania BMZ, liderado acertadamente por la Dra. Anne Forbes, por apoyar financieramente el presente trabajo de investigación, que sin el patrocinio de estos hubiese sido muy difícil culminar este trabajo. De manera muy especial quiero expresar mi agradecimiento a Mónica Hernández, por su amistad, esmero, dedicación, paciencia y gran profesionalismo, que me enseño y me ayudó a introducirme y entender este complejo mundo de la biología molecular; y de igual manera deseo expresar mi gratitud a Leire Barandalla y Rakel López que con mucho denuedo, paciencia y amistad me han ayudado de manera decidida a alcanzar este logro. Seguro estoy que sin la gran ayuda de todas ellas no hubiese logrado logrado sacar adelante este trabajo. A la Dra. Sonia Castañon, jefa del departamento de biotecnología de Neiker Tecnalia por permitirme trabajar y tener un lugar en el laboratorio de biología molecular. A Maite por su trabajo tan importante como es el preparando el material de laboratorio, para que todos puedan trabajar con las facilidades necesarias. Quiero agradecer de forma muy especial a ese equipo maravillo de personas de Neiker Tecnalia: Noemí, Isi, Ana A., Imanol, Raquel Raquel M., Judith, Ana H., Jhon, Jhon, Monse, Gorka, Nuria, Helena, Carlos, Marina, Arguiña, Ziortxa, Eugenia, Eugenia, Ernesto, Pablo, Inés, Susana, Begonia, Iratxe, por su gran amistad, confianza y constante apoyo, que me han hecho sentir como en mi casa y mi país. A Claudia por su apoyo y facilitación del material bibliográfico en la biblioteca de Neiker Tecnalia.

A Gregorio, Víctor e Ignacio del departamento de mantenimiento de de Neiker Tecnalia, que en muchas oportunidades me facilitaron el transporte a la estación de buses para ir a Pamplona a cumplir las clases en la UPNA. A toda la gente que he conocido durante estos años y que me han ayudado cuando les he necesitado. No puedo puedo dejar de agradecer su confianza, cariño

y apoyo de mi familia,

particularmente de mi madre Elsa Ortega, y mis hermanos Fernando, Edwin y Miguel y mis cuñadas Nevia, Martha y Jimena. En especial agradezco a mi esposa Angélica Angélica por su apoyo, paciencia, esfuerzo, oración, amistad y cariño y a mis hijitas Angy, Keila y Alejandra por soportarme en estos tres largos años y medio de estudio y ausencias de mi hogar y mi país. Agradezco a Rodrigo Rodrigo y Raquel, Job y Mabel, Justo y Julieta, Anita, Marcelino y todas mis sobrinas, Humberto Humberto y Liz Liz Vargas y Roberto Roberto por sus oraciones y su gran amistad. Tampoco puedo olvidar de agradecer a mis grandes amigos amigos y amigas como Hugo Ramírez y su linda familia, Laura N., Salomé P., Lourdes Lourdes G., Juan V., Enrique Enrique C., Pablo M., Noel O., Willman G., Jorge B., Javier F., Esther A., Edson G., Ximena C., Hermeregildo E., Ada A., A., Jimena C., Carolina C, Susana, Ana María C., Elizabeth P., P., Samantha C., Jury M., Raúl G., Rolando O. y a todos que de manera directa o indirecta me han colaborado para alcanzar esta meta.

Muchas gracias.

“ uena es la ciencia con herencia y provechosa para los que ven el sol, porque escudo es la ciencia, y escudo es el dinero; más la sabiduría excede, en que da vida a sus poseedores; mira la obra de Dios, porque ¿quién podrá enderezar lo que él torció?”

Dedicatoria

Al Señor mi Dios, que me ha dado la vida, fortaleza, sabiduría e inteligencia. A mis padres Julio Gabriel A. (+) y Elsa Ortega Orte ga Al Dr. Nelson Estrada (+). A mi esposa Angélica y a mis hijas Angy, Keila y Alejandra. A mis amigos agricultores agricultores paperos de de Bolivia.

Índice 1. Introducción............................................. .................................................................... .............................................. .............................................. .......................... ... 1 1.1. Origen e importancia económica económica y social de la papa ............................................ ............................................ 2 1.2. Factores bióticos que que la afectan ............................................. .................................................................... ................................ ......... 3 1.3. Características biológicas de Phytophthora infestans ........................................... ........................................... 4 1.4. Reproducción............................................. .................................................................... .............................................. ..................................... .............. 5 1.4.1. Reproducción asexual .............................................. ..................................................................... .................................... ............. 6 1.4.2. Reproducción sexual .............................................. ..................................................................... ..................................... .............. 7 1.5. Síntomas causados por P. infestans ............................................. .................................................................... .......................... ... 8 1.5.1. En follaje ............................................................ ................................................................................... ........................................ ................. 8 1.5.2. En tallos .................................................. ......................................................................... ............................................... .............................. ...... 9 1.5.3. En tubérculos ............................................... ...................................................................... ............................................. ......................... ... 9 1.6. Condiciones climáticas favorables para el desarrollo de P.infestans .................. 10 1.7. Distribución geográfica de la enfermedad ................................................ ........................................................... ........... 11 1.8. Importancia económica de la enfermedad ............................................... ........................................................... ............ 12 1.9. Fuentes de resistencia en el género Solanum........................................... ....................................................... ............ 13 1.10. Resistencia genética genética a P. infestans .............................................. ..................................................................... ......................... 15 1.10.1. Tipos de resistencia ................................................................ ................................................................................. ................. 15 Resistencia monogénica .............................................................. ........................................................................ .......... .17 Resistencia oligogénica .......................................................... ......................................................................... ............... .17 Resistencia Poligénica ............................................. .................................................................... .............................. ....... .17 1.11. Componentes de resistencia.................................. resistencia......................................................... .............................................. ........................... 18 1.12. Técnicas Moleculares en la mejora genética ............................................... ....................................................... ........ 19 1.12.1. Marcadores moleculares .................................... ........................................................... ....................................... ................ 19 1.12.2. Mapas Ma pas genéticos ............................................................... ...................................................................................... ......................... 21 1.12.3. Integración de caracteres cualitativos ............................................ ....................................................... ........... 22 1.12.4. Análisis de QTL ........................................... .................................................................. ............................................ ..................... 23 1.12.5. Genotipado de QTA ................................................................. ................................................................................. ................ 25 1.12.6. Identificación e integración de genes candidato ca ndidato....................................... ....................................... 25 1.12.7. Mapas funcionales .......................................... ................................................................. .......................................... ................... 27 2. Objetivos........................................... .................................................................. .............................................. .............................................. ................................ ......... 28 3. Materiales y métodos ............................................ ................................................................... .............................................. ................................... ............ 30 3. 1. Resistencia a tizón en follaje ....................................... .............................................................. .......................................... ................... 31 3.1.1. Material vegetal y preparación ...................................... ............................................................. .............................. ....... 31 3.1.2. Aislados de P. infestans........................................... .................................................................. ................................... ............ 32 3.1.3. Preparación Prepar ación de folíolos .................................. ......................................................... .............................................. ....................... 33 3.1.4. Preparación Preparaci ón de inoculo ............................................. .................................................................... ................................... ............ 33 3.1.5. Inoculación ............................................ ................................................................... .............................................. ............................... ........ 34 3.1.6. Diseño experimental .................................... ........................................................... .............................................. ........................... 35 3.2 Variables de respuesta y análisis estadístico ........................................... ........................................................ ............. 35 3.2.1. Intensidad de Esporulación (IE) ....................................... .............................................................. ........................... .... 35 3.2.2. Área bajo la Curva de Progreso de P. i. total (ABCPPI) ............................. ............................. 35 3.3. Evaluación de la resistencia en e n tubérculos ............................................. ............................................................. ................ 36 3.3.1. Diseño experimental ..................................... ............................................................ .............................................. ........................... 37 3.3.2. Aislados de P. infestans............................................. .................................................................... ................................... ............ 37 3.3.3. Preparación de tubérculos............................................ ................................................................... ................................. .......... 38 3.3.4. Preparación Preparac ión de inoculo .............................................. ..................................................................... ................................... ............ 38 3.3.5. Inoculación ............................................. .................................................................... .............................................. ............................... ........ 38

4.

5. 6. 7.

3.4. Variables de respuesta y análisis estadístico ............................................ ......................................................... ............. 38 3.5. Obtención de mapa de referencia r eferencia para genotipado de QTA ................................... ................................... 39 3.5.1. QTLs y genes de resistencia conocidos para el análisis por SSRs ligados . 39 3.5.2. Proyección de QTLs, genes y SSRs ................................. ......................................................... ........................... ... 42 3.5.3. Otros marcadores y genes utilizados para el QTA genotyping .................... .................... 46 3.6. Técnicas moleculares.............................................. ..................................................................... .............................................. .......................... ... 48 3.6.1. Extracción de ADN ....................................................... .............................................................................. ................................ ......... 48 3.6.2. Cuantificación de ácidos áci dos nucleicos............................................................. nucleicos................................................................ ... 48 3.6.3. Determinación en e n geles de agarosa ............................................................... ............................................................... 49 3.6.4. Análisis de marcadores SSR............................................... ....................................................................... ........................... ... 49 3.6.5. Análisis de genes candidato ........................................... .................................................................. ............................... ........ 52 3.6.6. Análisis de marcadores marc adores CAP .............................................. ...................................................................... ........................... ... 52 3.7 Análisis de alelos ale los .............................................. ..................................................................... .............................................. ............................... ........ 54 Resultados............................................. .................................................................... .............................................. ............................................... ............................ .... 55 4.1. Análisis de resistencia r esistencia ............................................................... ...................................................................................... .............................. ....... 56 4.1.1. Análisis de la resistencia a P. infestans en hoja ........................................... ........................................... 56 4.1.2. Análisis de la resistencia a P. infestans en tubérculo .................................... .................................... 62 4.1.3. Correlación de la resistencia entre hoja y tubérculo ...................................... ...................................... 66 4.3. Análisis de co-localización de SSRs y genes en el mapa poblacional UHD ........... 67 4.4. Resúmen de los resultados del QTA genotyping .................................................... .................................................... 74 4.5. Análisis de genes candidato y otros marcadores ................................................ ..................................................... ..... 79 Discusión ........................................... .................................................................. .............................................. .............................................. ............................... ........ 82 Conclusiones............................................. .................................................................... .............................................. .............................................. ......................... 89 Referencias ............................................... ....................................................................... ............................................... ............................................ ....................... 92 Resumen ............................................ ................................................................... .............................................. ................................................ ............................. 106 Summary ............................................. .................................................................... .............................................. ............................................... ............................ 107 Acrónimos ........................................... .................................................................. .............................................. ............................................... ............................ 108

Aplicación de marcadores marcadores moleculares moleculares para para el cribado de QTLs en diferentes diferentes fuentes fuentes de resistencia a tizón tizón tardío tardío (Phytophthora (Phytophthora infestans) en papa

Julio L uis Gabriel Ortega

1. Introducción 1



1.1. Origen e importancia económica y social de la papa La papa (es su nombre en quechua1) pertenece a la familia de las Solanáceas y al género Solanum

y posee, probablemente, más especies silvestres relacionadas que cualquier otro

cultivo. El género Solanum engloba alrededor de 2.000 especies, las cuales se extienden por todo el mundo, exceptuando el Norte y el Sur más extremos. La evolución filogenética y las fuerzas evolutivas de selección, migración, mutación, hibridación, poliploidización e introgresión, han contribuido a la divergencia y a explicar el origen de la gran variabilidad genética presente en las especies silvestres y cultivadas (Egúsquiza 1987). Probablemente, la papa se domesticó hace 10.000 años en el altiplano, entre Perú y Bolivia, donde se encuentra la mayor variabilidad variabilidad genética de especies especies silvestres y variedades cultivadas (Engel 1964). Las primeras papas domesticadas eran especies diploides de la especie Solanum stenotomum (Hawkes 1979). Estudios citoplasmáticos, consideran que S. andigena

se originó de S. stenotomum y S. phureja. A partir de S. andigena se originó S.

tuberosum.

A través de los años, múltiples cruzamientos con diferentes especies silvestres,

contribuyeron a la introgresión tanto de genes de resistencia como de caracteres de calidad (Grun et al. 1977). El número básico de cromosomas de las papas cultivadas y especies silvestres emparentadas es x= 12. Es una especie poliploide y varía desde 2n=24, 36, 48, 60 y 72 cromosomas. Se cree que la evolución hacia las papas actuales se realizó a nivel diploide (Ross 1986, Hawkes 1990). La papa es uno de los cultivos alimenticios más importantes y difundidos a nivel mundial. En producción de proteína por unidad de tiempo y superficie y en la obtención de energía es superior al resto de los cultivos (Estrada 2000). En cuanto a rendimiento, la papa ocupa el cuarto lugar, después del arroz, trigo y maíz (FAO 2004). En Bolivia ocupa el primer lugar entre los tubérculos cultivados con una superficie aproximada de 130.000 ha y rendimientos promedio promedio de 5 t/ha, mientras que la media mundial mundial se sitúa entre14 y 26 t/ha (Horton 1992, Zeballos 1997). Su cultivo involucra 1

Ipomoea La palabra "papa" es un préstamo lingüístico del término quechua papa, con el mismo significado del cruce entre batata ( Ipomoea batatas), palabra originaria de la isla “La Española” , y papa resulta "patata", nombre que, por la similitud de formas, le fue aplicado en un

principio por los conquistadores tanto a la papa como a la batata. "Papa" aparece por escrito por primera vez hacia 1540 . Por su parte, "patata" se usa en 1606 con el significado de batata y sólo a partir del siglo XVIII con el significado de papa. Así, en la mayor parte de España se llaman "patatas", excepto en las Islas Canarias y en parte de Andalucía , donde predomina la palabra "papa", al igual que en el resto de los países hispanohablantes http://es.mobile.wikipedia.org/transcode.php?go=Solanum+tuberosum&PHPSESSID=c925f5fd1f466d36c446fe1e348156d6)

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aproximadamente a 200.000 agricultores, lo que representa el 50% de las unidades agrícolas del país (Gabriel y Carrasco 1998) y aún hoy es la principal fuente de alimentación e ingresos. El consumo per cápita está de 60 - 80 kg/año (Estrada et al. 1994, Fernández-Northcote et al. 1999).

1.2. Factores bióticos que afectan la papa La producción de papa está fuertemente afectada por diversas enfermedades. Hooker (1980) menciona 25 virus, 38 hongos, hongos, 6 bacterias, 2 micoplasmas micoplasmas y un viroide; además además de 68 especies de nematodos y 128 insectos-plaga, totalizando unos 266 patógenos y plagas. También diezman la papa factores abióticos como las heladas y la sequía. Pero de las más importantes es el oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, que causa el tizón tardío. Esta enfermedad generalmente se controla con fungicidas, que inciden significativamente en los costos de producción, afectan al medio ambiente y la salud humana, además inducen a la aparición de nuevas razas del patógeno que son resistentes a fungicidas (Andrade y Revelo 1994, Pineda y Corzo 1994, Egúsquiza 1994). Por ello es necesario considerar otras medidas de control, como el empleo de variedades resistentes, que además posean altos rendimientos y calidad culinaria aceptable para el mercado. P. infestans,

antiguamente clasificado en el reino fungi, Sub Reino talófitas, en la

División Mycota, en la Subdivisión Eumycotina, en la Clase Oomycetes, Sub Clase Oomycetidae, Orden Peronosporales, Familia Phytiaceae, Género Phytophthora, Especie infestans

(Agrios 1991, Robertson 1991). Se le consideraba como hongo inferior

(Eumycotina), por ser un microorganismo formado por una sola célula continua, tubular, ramificada, sin clorofila, con tejidos conductores y produciendo esporas asexuales en el interior de un saco denominado esporangio. Estudios bioquímicos bioquímicos y moleculares moleculares (Brasier y Hansen 1992) evidencian evidencian características características particulares de los Oomycetes, que los distancian del grupo de los hongos, por lo cual se clasifican clasifican en uno diferente. Evidencias de su similaridad estructural con los flagelados, su aparato mitótico, su oogamia, su retículo citoplasmático, la estructura microfibrilar de su pared celular, el metabolismo oxidativo, el almacenamiento de β 1-3 Glucanasas, sus flagelos Hetecariontes y la secuencia de sus ácidos nucleicos, los encuadran filogenéticamente en el reino de las algas 3



Heterocariontes. El género Phytophthora está actualmente incluido en el reino Choromista (Ribeiro 1995, Dick 1990, Vleeshouwers 2001). 1.3. Características biológicas de P. infestans Si se examina al microscopio un corte transversal de una hoja, de una de las manchas, se observa micelio intercelular, hialino continuo de 3-4 µ de diámetro ramificado en algunos sitios, de paredes delgadas y rico en protoplasma. Es fácil ver en los bordes las manchas; en los tubérculos, el micelio es parecido al de las hojas, pero puede ser hialino o ligeramente parduzco (Urquijo et al. 1971). Los conidios tienen forma parecida al limón y son hialinos y continuos, sus dimensiones son entre 27-30 µ por 15-20µ. La ramificación del conidióforo es simpódica (Fig. 1).

Esporangio (27-30 x 15-20µ)

Micelio (3-4µ Ǿ)

Figura 1. 1. Micelio y esporangios de P. infestans (Foto: Urquijo et al. 1971)

La principal característica de los Oomycetes, es la presencia de un micelio cenocítico, diploide en su estado vegetativo y producir dos tipos de esporas: zoosporas a partir de zoosporangios y oosporas mediante la fusión de gametos morfológicamente distintos (Phillips y Keane 1993). Según el proceso de infección que produce, P. infestans se clasifica como un patógeno hemibiotrófico, porque tan pronto ocurre el proceso de infección, el tejido de la planta hospedante muere, siendo este grupo intermedio entre los patógenos biotróficos y los

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necrótroficos. Es decir que son biotróficos en el perímetro de la lesión, pero necrotróficos cerca al centro de la lesión (Niks y Lindhout Lindhout 1999, Parlevliet 1997a). 1.4. Reproducción A P. infestans se lo considera como el causante de una epidemia policíclica. Para ser considerada como tal, debe tener ciclos de infección completa y repetida, es decir, la infección debe ser seguida por el desarrollo del patógeno, la producción de inoculo nuevo, la dispersión del inoculo a nuevos sitios susceptibles y finalmente nuevas infecciones, todo ello dentro de un solo ciclo del cultivo. Un buen ejemplo es el tizón de la papa, donde en un solo ciclo de infección desarrolla lesiones, esporulación, dispersión de los esporangios (Fig. 2) e infecciones nuevas dentro de cinco días, ocurriendo muchos ciclos superpuestos simultáneamente durante períodos de tiempo favorable. Cada ciclo puede aumentar más de diez veces el número de esporangios que aterrizan sobre sitios susceptibles, que resulta en epidemias explosivas. La mayoría de las enfermedades de plantas ocasionadas por bacterias son policíclicas y muchos de los virus de plantas, con la ayuda de sus vectores de insecto, también

pueden

producir

repetidos

ciclos

de

infección

en

una

temporada

(http://arneson.cornell.edu.)

Figura 2. 2. Ciclo de la enfermedad (epidemia policíclica) (Fuente: Adaptado de Hooker 1980)

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1.4.1. Reproducción asexual Entre tres y diez días después de la infección, según las condiciones ambientales, los órganos portadores de esporas (esporangióforos) emergen a través de estomas en la superficie de las hojas (Fig. 3). Como los estomas son más frecuentes en el envés que en el haz de la hoja, la esporulación en el envés es más abundante que en el haz (Henfling 1987).

Figura 3. 3. Esporulación de P. infestans en el envés de las hojas (Foto: Oscar Navia)

Los zoosporangios (esporangios o conidios), se desarrollan en el extremo de los esporangióforos (Fig. 4); cuando están maduros, estos se desprenden fácilmente y son diseminados por el viento. La mayoría de las esporas caen a los pocos metros. Sin embargo, pueden llegar a recorrer distancias de más de 30 Km. El tamaño de los zoosporangios se encuentra justo debajo del límite de detección del ojo humano. Su forma se parece a la de un limón (Henfling 1987).

Figura 4. 4. Producción de esporangios en el esporangióforo esporangióforo (Foto: Henfling 1987).

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Los zoosporangios pueden germinar directa e indirectamente; la primera a temperaturas mayores de 20 ºC (la óptima es de 24ºC). Un zoosporangio se comporta como una simple espora, forma un tubo germinativo que puede entrar en el tejido de la planta. Estos germinan indirectamente a temperaturas de 12 a 16ºC, desprendiendo entre 10-20 esporas móviles (zoosporas). Activadas por dos flagelos las zoosporas permanecen móviles durante un tiempo que varía de algunos minutos a varias horas. Bajo ciertas condiciones pierden los flagelos, forman una pared celular y a continuación un tubo germinativo (Henfling 1987). En las hojas y en los tallos los tubos germinativos pueden penetrar directamente en la epidermis de la planta (no se requieren estomas). En los tubérculos, los tubos germinativos penetran a través de lentícelas o de lesiones. Como el hongo no puede sobrevivir un tiempo prolongado fuera del tejido hospedante, los zoosporangios o zoosporas mueren si no encuentran un tejido hospedante apropiado (Henfling 1987). 1.4.2. Reproducción sexual Hasta 1984, el estado sexual de P. infestans solo había sido señalado en México y partes de Centro América. Fry et al. (1993) describió su aparición en otras partes del mundo, especialmente en el Este de Europa. Cuando los micelios de diferentes tipos del hongo, llamados tipos de apareamiento A1 y A2 crecen juntos, uno de ellos puede formar células masculinas (anteridios) y la otra célula femenina (Oogonios). El oogonio crece a través del anteridio, permitiendo la fertilización y fertilizado se convierte en una espora de descanso de paredes gruesas (oospora). Las oosporas a diferencia de los zoosporangios y las zoosporas, pueden resistir condiciones desfavorables, como sequías y bajas temperaturas (Fig. 5). La recombinación recombinación genética puede generar nuevas razas virulentas, haciendo que este tipo de reproducción sea peligrosa para el cultivo de papa. La formación de oosporas ayuda a P. infestans y las especies afines a sobrevivir en condiciones adversas como invierno, períodos secos y ausencia de hospederos. Las oosporas de P. infestans germinan mediante la formación de un esporangio que es similar a los descritos en la reproducción asexual (Fig. 5). Después de producirse la infección en un hospedero, las zoosporas resultantes pueden iniciar un nuevo ciclo de vida (Henfling 1987).

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Figura 5. Núcleo del anteridio dentro del Oogonio (Foto: Anónimo).

1.5. Síntomas causados por P. infestans 1.5.1. En Follaje En campo, los primeros síntomas de la enfermedad se presentan con frecuencia en las hojas inferiores. Estos consisten en pequeñas manchas de color verde, entre verde claro y verde oscuro, que se convierten en lesiones pardas o negras según la humedad del ambiente. Las lesiones se inician frecuentemente en las puntas y los bordes de las hojas. Una aureola verde clara o amarilla de algunos milímetros de ancho suele separar el tejido muerto del sano (Fig. 6). Bajo condiciones de alta humedad (mayor a 90%) y temperaturas bajas (0 a 22 ºC) las lesiones se expanden rápidamente. La esporulación puede verse en el envés de las hojas como un moho blanco que rodea las lesiones. Puede volverse poco notable durante el día mientras las lesiones se secan y arrugan. En menos de una semana la enfermedad puede propagarse desde los foliolos infectados en unas pocas plantas, hasta casi todas las plantas de una parcela pudiendo llegar a caerse las hojas (Navia y Fernandez-Northcothe 1996).

Figura 6. 6. Síntomas en hoja del ataque de P. infestans en papa (Foto: CIP 1996)

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1.5.2. En Tallos Las lesiones pueden desarrollarse por infección directa o por extensión a partir de las hojas, en los pecíolos y los tallos, donde se expanden longitudinalmente. Presentan manchas necróticas alargadas de color marrón oscuro, tomando las partes afectadas una consistencia vítrea (Fig. 7). Los tallos infectados se debilitan, pueden tener un colapso y morir de la lesión hacia arriba; además de quebrarse por acción del viento. En algunas zonas los agricultores de Bolivia lo conocen como “p’aqui p’aquí” (es su nombre en quechua) (Navia y Fernández Northcothe 1996).

Figura 7. 7. Síntomas en tallos por el ataque de P. infestans en papa (Foto: Henfling 1987).

1.5.3. En Tubérculos Los tubérculos son infectados por las esporas que la lluvia lava de las hojas y los tallos y penetran en el suelo hasta llegar a los tubérculos. Presentan en la parte externa áreas irregulares y ligeramente hundidas de color marrón oscuro y de apariencia húmeda; una decoloración superficial e irregular (Fig. 8). Partiendo el tubérculo, se observa una pudrición corchosa de color pardo claro a oscuro debajo de la piel y hacia el interior del tubérculo (Henfling 1987); este síntoma es conocido por los agricultores de Bolivia como “k’anura” (es su nombre en quechua ) (Navia y Fernández-Northcote 1996). Los patógenos secundarios, principalmente bacterias, pueden convertir la casi inodora pudrición seca, típica de P. infestans,

en una pudrición blanda maloliente, lo cual limita la comercialización de éstos

tubérculos. El tizón tardío no se propaga normalmente durante el almacenamiento; sin embargo, las infecciones secundarias pueden contaminar los demás tubérculos (Navia y Fernandez-Northcote Fernandez-Northcote 1996). 9



Figura 8. 8. Síntomas en tubérculos (Foto: Julio Gabriel)

En Latinoamérica no hay muchos estudios sobre la resistencia en el tubérculo, porque no se presentan daños. daños. Sin embargo, embargo, en Europa, es un problema problema importante, importante, así Kapsa (2007), (2007), menciona que la presencia de la enfermedad de tizón es un factor crítico en la sanidad de los tubérculos en Polonia y otros países europeos. Encontró que los síntomas de tizón varían en años particulares. La infección de tubérculos en 1998 fue de 19.5%, en 2003 del 21.8% y en 2006 del 14.8%. La alta incidencia de tizón sobre los tubérculos se relacionó con la presencia de lluvias en agosto y septiembre, correlacionándose con la virulencia del patógeno. Se ha observado en tubérculos un tipo de resistencia horizontal. No se ha encontrado correlación entre resistencia de las hojas y la de tubérculos (Stegemann y Schnik 1985), pero si se ha estudiado los compuestos fenólicos involucrados en la resistencia, tales como lignina, suberina, calosa y las fitoalexinas (Estrada 2000). 1.6. Condiciones climáticas favorables para el desarrollo de P. infestans Henfling (1987) indica que el hongo desarrolla favorablemente a una alta humedad (90100%), propiciada por lluvias frecuentes o rocío abundante y a temperaturas de 9 a 22 ºC. El desarrollo del hongo en la hoja es poco afectado por la humedad del ambiente, pero los esporangios se forman solo cuando la humedad relativa (HR), dentro el follaje es superior a 95%. La enfermedad se desarrolla y propaga con mayor rapidez a temperaturas bajas y alta humedad, puede sobrevivir sobrevivir en el hospedante a temperaturas entre 0 y 28ºC. Cuando la temperatura es óptima se requieren 8 horas de alta humedad para la producción de esporangios, su liberación y penetración. Tiene que existir agua (rocío, lluvia) en la superficie de las hojas durante un mínimo de dos horas para que las zoosporas se formen, germinen y penetren (PROINPA 1998). 10



1.7. Distribución geográfica de la enfermedad La enfermedad se presenta en casi todas las zonas donde se produce papa, abarcando una amplia distribución en la mayoría de los países de los cinco continentes y provocando grandes daños (Junchaya 1983). P. infestans

emigró de México a Estados Unidos y luego a Europa hacias el año 1840

introducido y diseminado en tubérculos-semilla. La dispersión del patógeno se dio en primer lugar desde Europa, por una primera migración. Se presume que existió una segunda migración del patógeno en los años 1970s desde México a Europa (Fry et al. 1993, Forbes 1994, García 1997). En 1845 causó epidemias severas en la papa de Europa y América del Norte, ocasionando la hambruna, migración y muerte de más de un millón de personas en Irlanda. Esto llevo a la institucionalización del mejoramiento genético de la papa y al nacimiento de la fitopatología como una ciencia (Estrada 2000). El tizón en Bolivia (Fig. 9), se encuentra en los departamentos de La Paz, Cochabamba, Santa Cruz, Oruro, Potosí, Chuquisaca y Tarija (PROINPA 1996). Las zonas de mayor incidencia del tizón son: Morochata, Monte Punku, Epizana, Candelaria, Valle de Cochabamba, Escalante y Capinota (Cochabamba); Comarapa, San Isidro y Valle Grande (Santa Cruz); y las zonas bajas de los departamentos de Tarija, La Paz, Potosí, y Chuquisaca. En Cochabamba las zonas endémicas de mayor incidencia de tizón son Morochata, seguida por Chullchunq’ani, Lope Mendoza, Candelaria y Mizque (Otazu et al. 1982).

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o Area de incidencia de A2 Zonas con tizón Figura 9. 9. Distribución del tizón en Bolivia (Fuente: PROINPA 1998)

1.8. Importancia económica de la enfermedad El tizón tardío es considerado como la más grave enfermedad de la papa en todo el mundo. Ocurre en casi todas las zonas donde se cultiva este tubérculo. En los países en desarrollo, la pérdida de rendimiento rendimiento debido debido a la enfermedad se calcula calcula cerca de 2,75 mil millones de dólares (2,20 mil millones de EUR) cada año. Además, son muy cosotosos los fungicidas (http://www.cipotato.org/potato/pests_diseases/late_blight/, Landeo et al. 1998). Por ejemplo, en el norte de Ecuador, los agricultores gastaron, en promedio, 120 dólares (96,3 EUR) por hectárea en fungicidas, que es un 10% del total de sus costes de producción. En Bolivia, en términos económicos, el tizón tardío es una de las enfermedades más importantes de la papa y se estima que más de 40.000 familias de pequeños agricultores paperos se ven afectadas. En las 20.000 hectáreas de papas afectados por la enfermedad, las pérdidas directas son de unos 30 millones de dólares por año (24 millones de EUR). La mayor parte de la zona afectada se encuentra en las regiones productoras de semilla de papa, que en la actualidad, apenas cubren el 5% de las necesidades nacionales de semilla de calidad. Esta 12



pérdida causada por la enfermedad pone de relevancia la importancia de la enfermedad en Bolivia como un factor que limita la producción y la productividad de las papas, principalmente de las variedades Waych’a, Sani Imilla, Alpha, Desirée, etc., que son los más importante en la economía agrícola del país (Bojanic 1995, Estrada et al. 1994, Fernández Northcote et al. 1999, Navia et al. 2002). 1.9. Fuentes de resistencia en el género Solanum Los recursos genéticos de especies silvestres de papa tienen un valor probado en los programas de mejoramiento genético para resistencia a enfermedades, estreses ambientales y otros caracteres agronómicos de interés (Ross 1986, Spooner et al. 1991, Spooner and Bamberg 1994, Ruiz de Galarreta et al. 1998, Jansky 2000, Ochoa 2001, Spooner et al. 2004). Las especies del Norte y Centro América son particularmente ricos en cada característica. Por ejemplo muchas de las especies silvestres tienen alto nivel de resistencia contra P. infestans (Bamberg et al. 1994, Song et al. 2003). A principios del siglo XX se identificaron identificar on especies silvestres tuberíferas tuberífer as como S. demissum

para utilizarlas como fuentes de resistencia a P. infestans. Sobre la base de esta

identificación, se inició la introgresión de genes de resistencia mediante cruzamientos. A partir de 1920, numerosas expediciones científicas a México, América Central y Sudamérica, lugares que corresponden con los centros de origen y diversidad de la papa, permitieron recolectar y describir taxonómicamente unas 200 especies silvestres y ocho especies cultivadas (Hawkes 1990). Diversos fitomejoradores han considerado que el uso de las especies silvestres es tedioso, difícil y de larga espera para obtener logros. Esto posiblemente se ha debido en gran parte a que la mayoría de los fitomejoradores en Europa y Norteamérica han trabajado más que todo en la especie S. tuberosum ssp tuberosum y sus haploides. En ellos la fertilidad, especialmente del polen es muy restringida y también la viabilidad genética. El problema se vuelve más crítico cuando se híbrida con las especies silvestres (Peloquin et al. 1989, Estrada 1991, Gabriel 1994). Realmente sólo después de 1950 Ross (1986) ha intentado utilizar las especies silvestres, especialmente con los trabajos de investigadores holandeses, alemanes, escandinavos, polacos, españoles y rusos. También en Canadá, Estados Unidos y en Latinoamérica (Wastie 1991, Rivera-Peña 1992, Romero 1993, Ruiz de Galarreta 1998). 13



La excepción han sido los trabajos de Peloquin (1989) y su equipo de la Universidad de Wisconsin, que utilizaron dihaploides de S. tuberosum con S. phureja o los trabajos de Simmonds (1977) y Glendining (1975) en Scottish Plant Breeding Station de Escocia y Plaisted et al. ( 1975) en Cornell University que lograron obtener tipos neotuberosum, extraídos de la misma S. andigena, adaptándola en varias generaciones de selección a los días largos del hemisferio norte, obteniendo así los cultivares neotuberosum. En Latinoamérica los mejoradores contaron con ventajas comparativas muy grandes como son la alta fertilidad y la flexibilidad de ploidía que muestran los cultivares nativos (Estrada 1984a, 1984b, 1984b, 1990, 2000, Estrada y Gabriel 1991, 1991, Gabriel et al. 1995, Gabriel et al. 2007, García et al. 2007, Contreras 2008). La manipulación genética bien dirigida ha abierto las puertas para explotar mucho más rápidamente, pocas generaciones (dos o tres), los grandes atributos de muchas especies silvestres. Los trabajos de varios investigadores han contribuido a desarrollar mejores y más eficientes métodos de mejoramiento genético (Peloquin et al. 1989, Rivera-Peña 1992, Nietherhauser Nietherhauser 1993, Estrada 2000). A pesar de la gran diversidad genética disponible en las especies silvestres de este género, sólo un pequeño número de ellas han sido utilizadas para la introgresión de caracteres de resistencia en los cultivares. Se estima que apenas un 5% han sido utilizados en programas de fitomejoramiento fitomejoramiento (Gabriel et al. 1995, Colque 1996, Estrada 2000, Gabriel et. al. 2001, Coca y Montealegre 2006, García et al. 2007). Esto se debe, por un lado, a los problemas que existen entre determinadas especies al cruzarse. El potencial de hibridación de la papa depende, en primera instancia, de la ploidia que presente la especie silvestre o cultivada y del número de balance del endospermo (EBN). S. tuberosum presenta una ploidia/EBN = 4x (4EBN), y el potencial de hibridación es mayor con las especies 4x (4EBN) y 6x (4EBN), mientras que presenta un potencial de hibridación menor con especies 4x (2EBN) y con especies 2x (2EBN) (Spooner y Hijmans 2001). Por otra parte, en los cruzamientos, se produce la introgresión de caracteres silvestres no deseados junto con los caracteres de resistencia. Esto conlleva el desarrollo de múltiples ciclos de retrocruzamientos para eliminarlos. Existen papas nativas cultivadas originarias de los Andes que presentan una gran variabilidad genética, entre las que se encuentra resistencias a factores abíóticos (helada, sequía) y bióticos (hongos, bacterias, virus, nematodos); además de factores de calidad. La 14



introgresión en este germoplasma ha sido mínima y es posible que la evolución de estos cultivares continúe in situ (Ugarte et al. 1994, Estrada 2000, Gabriel et al. 2007). 1.10. Resistencia genética a P. infestans Se entiende la resistencia como cualquier característica heredada de una planta hospedante para reducir el crecimiento y/o desarrollo del patógeno y/o parásito después que se ha iniciado o establecido el contacto. Se debe hacer la distinción de ésta definición con el término tolerancia, que es cuando la planta susceptible, a pesar de estar infectada severamente, soporta el ataque y logra producción. 1.10. 1. Tipos de resistencia La resistencia de las plantas a enfermedades, se puede investigar y determinar desde diversos puntos: a) Los científicos que trabajan en el campo de la patología de plantas tienen mayor interés en los mecanismos que confieren resistencia resistencia a la enfermedad, para lo que se considera: 1) la infección y el establecimiento del patógeno en plantas infectadas, 2) la colonización y esporulación y/o 3) la reducción de los efectos adversos sobre la expresión del rendimiento. rendimiento. Por esta razón hay diferencias importantes importantes entre la resistencia resistencia a la infección, resistencia a la colonización y esporulación y resistencia a la enfermedad o capacidad para no perder rendimiento (Van der Plank 1984; Király et al. 1991, Sutic y Sinclair 1991). b) Los mejoradores de plantas y genetistas han estudiado el grado de especificidad de la resistencia con las razas patogénicas (Van der Plank 1968, 1984, 1991), identificándose dos tipos de relación: 1) resistencia a la raza específica (vertical) (vertical) y 2) resistencia resistencia a la raza r aza no específica (horizontal). El primer tipo de resistencia es efectivo en contra de pocas razas, especificas, del patógeno y ha sido usada intensivamente (Colon y Budding 1988 y 1993); la sintomatología consiste en una reacción hipersensitiva temprana y rápida que produce un área necrótica alrededor del punto de infección; es una respuesta específica la infección de cierta raza (Gabriel et al. 1988, Parlevliet y Niks 1989). El segundo tipo de resistencia resistencia es eficaz en contra de muchas razas patogénicas. Sin embargo, esta resistencia no es perfecta, y no está asociada con una respuesta de hipersensibilidad. Como regla

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general se atribuye que la resistencia no especifica está determinada por el efecto de muchos genes (Simmond y Wastie 1987). c) El interés de los biólogos o bioquímicos en la resistencia es completamente diferente. Ellos hablan acerca de una resistencia preformada (pasiva y activa) e inducida (adquirida). La resistencia preformada pasiva y activa está basada en la existencia de barreras físicas o químicas en las plantas, sean éstas infectadas o no. La resistencia inducida sólo será dada cuando exista inducción de reacción en la relación planta patógeno (Daly (Daly 1984, Parlevliet Parlevliet y Niks 1989, Sutic y Sinclair Sinclair 1991, Király et al. 1991, Agrios 1991). Varios investigadores han revisado los componentes bioquímicos de la resistencia (Sutic y Sinclair 1991). Sin embargo, se han hecho pocas tentativas para relacionar estos con la resistencia de campo; así, Duke y Tomiyama citados por Wastie (1991), examinaron el papel de las glucanasas, quitinasas y componentes fenólicos, que al parecer son capaces de degradar la pared celular del hongo y han sido estudiados muy ampliamente por diversos investigadores. En trabajos realizados por Miller y Bérger citados por Sutic y Sinclair (1991) encontraron que al inocular una raza incompatible de P. infestans, las plantas reaccionaban hipersensitivamente. De igual manera, al inocular una raza compatible en una variedad susceptible de papa, observaron que el patógeno no se establecía. Esto les permitió deducir que existen compuestos que ellos llamaron fitoalexinas, responsables de la resistencia. Sustancias como la risitina (Keen 1982, Agrios 1991) sólo se sintetizan en el momento en que existe una interacción entre la planta y el patógeno. Se sabe, además, que un daño simple sobre las hojas, tallos, raíces, frutos, etc., así como tejidos sometidos a radiación, son capaces de producir fitoalexinas. Sin embargo, Schöber (1992) y Wastie (1991), mencionan que esta respuesta no está necesariamente correlacionada con la resistencia. En resumen, no se puede afirmar con certeza si el patógeno infeccioso en las plantas resistentes es en realidad inhibido como resultado de algún mecanismo, o a la inversa, el patógeno activa mecanismos en el hospedero hipersusceptible. Dentro del carácter de resistencia, es posible considerar aquellos caracteres gobernados por un solo gen, unos pocos genes o muchos genes, recibiendo en cada caso los nombres de monogénica, oligogénica y poligénica, respectivamente. 16



Resistencia monogénica El gen de la resistencia monogénica puede ser estudiado en detalle e identificado individualmente, por letras, números o de ambas maneras, por ejemplo Sr6, Sr11, Sr40, etc., que confieren resistencia en trigo a la roya; los genes R1, R2, R3, R4, …, R10, etc. En S. demissum

para resistencia a diferentes razas de P. infestans; los genes A, B, F, etc. que dan

resistencia a la avena contra la roya del tallo; los genes Lr y Yr para roya de la hoja y roya de las glumas del trigo. La resistencia que estos genes puede ser dominante o recesiva. Cuando la resistencia monogénica prevalece, es posible observar que las progenies segregantes pueden ser clasificadas sin dificultad en clases discontinuas de individuos resistentes y susceptibles (herencia mendeliana). Este tipo de resistencia está íntimamente aociado a la relación gen a gen, que involucra dos pares de genes acoplados: un par está en el hospedante y el otro está en el patógeno (Flor 1971) Resistencia oligogénica La herencia de la resistencia oligogénica es parecida a la resistencia monogénica y, como ésta última, está asociada con genes mayores, los cuales no interaccionan con el ambiente o interaccionan muy poco. Resistencia poligénica La herencia de la resistencia poligénica poligénica es más compleja. Los genes que intervienen, en la mayoría de las veces son difíciles de contarlos e identificarlos individualmente, conociéndose el efecto combinado de dichos genes como un total. Las plantas en las poblaciones segregantes varían continuamente continuamente de resistencia sin poder ser agrupados claramente en grupos definidos. La resistencia poligénica está asociada con genes menores de efectos aditivos los cuales interaccionan fuertemente con el ambiente. Sin embargo, es necesario notar que, normalmente es menos propensa a romperse por la aparición de nuevas razas patogénicas; además su expresión no es siempre del tipo de alta resistencia o inmunidad como en el caso de la resistencia resistencia monogénica (Rivera-Peña (Rivera-Peña 1992, Niederhauser Niederhauser 1993). 1.11. Componentes de la resistencia La introducción de muchos genes deseables de resistencia puede ser posible, pero es difícil identificar éstos individualmente por métodos tradicionales dado su efecto cuantitativo, lo cual hace la investigación, así como el mejoramiento, difícil. Por esta razón, se han hecho 17



diversos intentos para separar los componentes de la resistencia parcial, los cuales van afectando a los diferentes estados en el ciclo del patógeno (Parlevliet 1997a, b, Parlevliet y Niks 1989). Se Se han distinguido distinguido cinco cinco componentes componentes en P. infestans que determinan el desarrollo de la epidemia (Van der Plank 1984, 1984, Colon y Budding 1988, 1988, Király et al. 1991, Sutic y Sinclair 1991) que pueden ser afectados por la planta hospedante y de este modo ser utilizado en el mejoramiento: eficiencia eficiencia de la infección (EI), periodo de latencia (PL), tasa de crecimiento de la lesión (TCL), tamaño de lesión (TL), periodo de infección (PI) e intensidad de la esporulación (IE). Para determinar la contribución relativa de estos componentes de la resistencia se han utilizado generalmente dos procesos (Van Oijen 1992; Colon et al. 1993, Gabriel et al. 2007): 1) determinación experimental de la correlación entre los componentes de la resistencia individual y tasa de progreso de la enfermedad y 2) construcción de modelos matemáticos de los patosistemas y un análisis de sensibilidad. Spielman et al. (1992) midieron tres componentes de agresividad (eficiencia de la infección, área de la lesión y capacidad de la esporulación), para lo cual utilizaron 8 aislados de P. infestans y una variedad susceptible 'Norchip'. Ninguno de los componentes fueron predictores satisfactorios de la agresividad en campo por la influencia de los factores físicos del ambiente. La correlación fue alta y negativa entre el rendimiento en campo y el tamaño de la lesión. Por su parte, Hidalgo et al. (1998) en un estudio de componentes de resistencia resistencia horizontal encontró correlación correlación significativa significativa entre entre EI, PI, TCL y TL con el Area bajo bajo la curva de progreso de P. infestans (ABCPPI). Recomendando la EI, PI, TCL y TL como parámetros de selección para resistencia horizontal en clones previamente seleccionados. Umareus y Lihnell citados por Wastie (1991) hicieron mediciones cuidadosas de la eficiencia de la infección, crecimiento de la lesión y producción de conidios en evaluaciones de laboratorio, y posteriormente posteriormente utilizaron estos parámetros para calcular el área destruida por el patógeno. Esta aproximación analítica es un ejemplo de cómo puede medirse la importancia relativa de los parámetros individuales, así como su valoración como criterios de selección. Por otra parte estudios realizados por Parlevliet (1979 y 1997a, b) sobre el periodo de latencia de la roya de la roja del trigo Puccinia hordeí , mostró que la temperatura, el día largo y la intensidad de luz no son importantes en el PL; pero si el estado de desarrollo de las plantas. Demostrándose que el PL en plántulas no predicen bien el PL relativo de plantas adultas. Trabajos recientes en Bolivia han encontrado una buena correlación entre TL, rango 18



de crecimiento de la lesión (RCL) e IE con el ABCPPI y que estos componentes pueden ser utilizados eficientemente en evaluaciones de plantas en invernadero para selección de genotipos resistentes (Gonzáles et al. 1999, Orellana 2001, Gabriel et al. 2007). 1.12. Técnicas moleculares en la mejora genética Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas basándose en el fenotipo. Las mejoras genéticas eran posible gracias a la variabilidad genética, a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e intensidad de la selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de selección. Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son en muchos casos el número exacto y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter y sus interacciones, así como la localización de estos genes, y el análisis de su función fisiológica. Los avances en la biología molecular y, particularmente, en la genómica y proteómica permiten aplicar nuevas estrategias y técnicas eficientes para el detallado análisis genético de cualquier fenotipo. fenotipo . 1.12.1. Marcadores moleculares Los marcadores moleculares constituyen la herramienta básica para los fines que se describe en el primer párrafo del punto punto 1.12. Los marcadores son elementos elementos discriminativos discriminativos que permiten distinguir y clasificar objetos. Afortunadamente, la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Éstas pueden ser marcadores moleculares como las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (de genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan

hipervariable

(www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/

y

opbs.okstate.edu/~mel opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MG01.ht cher/MG/MG01.html.). ml.). 19



Los primeros marcadores desarrollados en papa a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico. Pero esta técnica tenía una limitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del DNA han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades. El estudio genómico de una especie, normalmente, comienza con el desarrollo de marcadores moleculares. Los primeros marcadores de DNA descritos en papa fueron los RFLPs (Gebhardt et al. 1989a). Esta técnica requiere gran cantidad de ADN, es laboriosa y costosa, aunque presenta una técnica fiable. El descubrimiento y la explotación de la técnica PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) facilitaron enormemente el desarrollo y las aplicaciones de marcadores moleculares. Consecuentemente, se desarrollaron y aplicaron en la papa otros tipos de marcadores, dominantes y codominantes, como los RAPD, AFLP (van Eck et al. 1995), SSR (Milbourne et al,

1998), ISTR, ISSR, SCAR y CAP (Oberhagemann et al. 1999). Entre las aplicaciones

más importantes de estos marcadores figuran la identificación y la determinación de la pureza varietal (Görg et al. 1992) así como el análisis de la biodiversidad y estudios filogenéticos en el género Solanum (Debener et al. 1990). Se pueden distinguir marcadores dominantes y codominantes. Esto implica que los marcadores dominantes pueden ser específicos para un parental o comunes a ambos parentales, segregando 1:1 y 3:1 respectivamente en una progenie. En todos los casos existen alelos nulos (ausencia del marcador dominante) que representan los otros alelos desconocidos en una progenie. Los marcadores codominates revelan cada uno de los diferentes alelos de un locus conocido hasta diferente. A estos pertenecen generalmente los SSRs 2, ESTs y TDFs (van Eck 2

Los SSRs (“Simple Sequence Repeats”), detectan regiones hipervariables del genoma. Un marcador SSR es una repetición de unas pocas bases (2-5) y está flanqueado por un único DNA, son marcadores codominantes y mapean regiones cromosómicas idénticas idénticas en diferentes entornos genéticos. Debido Debido a estas características,

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et al.


1995). Ellos también sirven para alinear los mapas genéticos individuales de cada

parental y producir un mapa integrado (Ritter et al. 2008a). Por otra parte hay marcadores indirectos y directos. Los marcadores indirectos son aquellos que determinan la distancia entre el marcador y un gen de interés. En cambio, los marcadores marcadore s directos permiten la identificación directa de los alelos de un gen de interés y se pueden aplicar independientes del entorno genético. De particular interés son aquellos marcadores que mapean en diferentes entornos genéticos a la misma posición genómica, ya que permiten por ejemplo alinear mapas de diferentes entornos genéticos. Obviamente tienen que ser “single copy” para evitar confusiones. Entre ellos figuran generalmente copias simples de SSRs, TDFs, EST y COS. (Oberhagemann et al. 1999). 1.12.2. Mapas genéticos Para muchas aplicaciones genéticas es necesario localizar el conjunto de marcadores moleculares en el genoma. Para ello sirven los mapas genéticos. El mapa genético se deriva de procesos estadísticos y refleja la estructura física de un genoma con sus correspondientes cromosomas. Los mapas de ligamiento genético se construyen a partir de cruzamientos controlados utilizando marcadores moleculares. En papa se han construido diferentes mapas de ligamiento genético a nivel diploide y tetraploide y en diferentes entornos genéticos. El primer mapa a nivel diploide se basó en marcadores RFLPs (Bonierbale et al. 1988). Luego el construido por Gebhardt et al. (1989b). En la actualidad existen muchos mapas genéticos disponibles basados en diferentes marcadores moleculares y se encuentran alineados con otros mapas de papa y tomate mediante sondas comunes. Cabe destacar que el mapa de SSRs fue descrito por Milbourne et al. (1998), que contiene marcadores RFLPs mapeados también en el mapa de papa de la base de datos Gabi (Pomamo) y sondas de tomate. Este mapa pudo ser anclado al mapa de Coromel et al. (2003), el cual fue obtenido en una población de S. tuberosum x S. spegazzinii y mapa de tomate (Tanksley et al. 1992). El mapa ultradenso (UHD) de papa por Isidore et al. (2004) y van Os estos marcadores son utilizados para el alineamiento entre los lo s mapas individuales obtenidos para cada parental, así como para alinear mapas construidos a partir de diferentes poblaciones (Valadez y Kahl 2005).

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et al.


(2006), que a parte los 10.000 marcadores AFLPs, contiene 40 marcadores RFLPs y

SSRs que se utilizaron como marcadores directos. Por otro lado, este mapa está alineado con el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) mediante sondas RFLPs y cuenta con 66 marcadores comunes al mapa de papa de Caromel et al. (2003). Recientemente, Ritter et al. (2008a), han contribuido con un mapa completo de transcriptoma constitutivo expresando genes del genoma de la papa, que se ha construido utilizando cDNA-AFLP. Los TDFs fueron anclados a las cajas del mapa UHD. 1.12.3. Integración de caracteres cualitativos La disponibilidad de mapas genéticos permite integrar en los mismos datos fenotípicos que pueden ser causados por un gen (carácter monogénico), por varios e incluso muchos genes. Los caracteres monogénicas como por ejemplo la resistencia al virus Y de la papa (PVY) se pueden tratar estadísticamente igual que un marcador molecular (presencia vs. ausencia) para su integración en un mapa. Ritter et al. (2005) menciona que en los mapas genéticos de la papa se han integrado caracteres cualitativos como resistencia monogénica a PVY ( Rysto, Brigneti et al. 1997, Ryadg, Hämäläinen et al. Nx p, Tommiska et al. Gpa1,

1997), PVX ( Rx1, Rx2, Ritter et al. 1991; Nb, De Jong et al. 1997,

1998), nematodos ( Gro1, Barone et al. 1990, H1, Gebhardt et al. 1993,

Kreike et al. 1994, Gpa2, Rouppe van der Voort et al. 1997, Gpa5, Rouppe van der

R1, Leonards-Schippers Voor et al. 2000) y P. infestans ( R1 Leonards-Schippers et al. 1994, R3, El-Kharbotly et al.

1994, R2, Li et al. 1998, R6 y R7 , El-Kharbotly et al. 1996). 1.12.4. Análisis de QTL Sin embargo, la variación cuantitativa observada para la mayor parte de los caracteres fenotípicos en plantas es causada por genes poligénicos, que frecuentemente interacciona con el medio ambiente (Vargas et al. 2006). La acción colectiva de los loci genéticos en la expresión de un carácter se ha denominado QTL (Geldermann 1975). Los efectos cuantitativos de los QTLs no se pueden estudiar mediante el análisis mendeliano, sin embargo cuando un marcador molecular segrega según un patrón mendeliano y está ligado a un QTL, la posición en el cromosoma del QTL y su contribución fenotípica puede ser estimada (Thoday 1961). 22



Hasta ahora, hay numerosos modelos estadísticos para el análisis QTL, que determinan la posición y el efecto de cada loci que influye en el carácter cuantitativo (Lander y Botstein 1989, Knapp et al. 1990, Martínez y Curnow 1992, 1992, Jansen y Stam 1994, 1994, Zeng 1994). En papa, se han desarrollado diferentes análisis de caracteres cuantitativos, considerando resistencias poligénicas a P. infestans (Leonards-Schippers et al. 1994) y G. pallida (Kreike et al. 1993, Caromel et al. 2003). También, se

realizaron otros análisis de QTL considerando considerando los

componentes del rendimiento (Schäfer-Pregl et al. 1998), la tuberización, la dormancia (van den Berg et al. 1996), la forma del tubérculo (van Eck et al. 1994) y el contenido de azúcares y almidón (Menéndez et al. 2002). Los análisis de caracteres cuantitativos han revelado que muchos QTL coinciden o están localizados cerca de genes con determinadas propiedades biológicas. En estudios de resistencia a P. infestans se ha determinado que la posición de un QTL con efecto importante coincide con la del gen R1 y con otros genes Prp, que están involucrados en reacciones de defensa tras la invasión de patógenos (Leonards-Schippers et al. 1994). El presente trabajo se centra en el análisis de QTLs de resistencia a P. infestans. Dada la importancia de este patógeno existen numerosos estudios de QTLs a este carácter en diferentes entornos genéticos. Así, Ghislain et al. (2001) analizaron una población de S. phureja

(phu) con un dihaploide de S. tuberosum (dih tbr), en la que encontraron dos

importantes QTLs (loci de caracteres cuantitativos) en los cromosomas VII y XII como una contribución de ambos progenitores. Otro QTL fue detectado en el cromosoma XI como una contribución del parental phu, y otros tres fueron detectados en los cromosomas III, V y VIII, como una contribución del parental dih tbr. Bormann et al. (2004), seleccionaron 30 marcadores basados en DNA que se conocía estaban ligados con loci de resistencia a P. infestans

en papas diploides y fueron probados como marcadores ligados a loci de caracteres

cuantitativos cuantitativos (QTL) para la resistencia a P.infestans y madurez en dos poblaciones de medioshermanos tetraploides de papa. Sorensen et al. (2006), evaluaron en campo dos poblaciones originadas de un cruzamiento entre un clon de S. vernei y dos clones de S. tuberosum, por su resistencia al tizón. S. vernei no fue fue previamente mapeado para QTLs. El ABCPPIrel fue estimado y utilizado para para el mapeo de QTLs. Se construyó un mapa mapa de S. vernei, con 11 grupos ligados, de los cuales nueve podrían ser asignados a los cromosomas. Los resultados indicaron que la resistencia en S. vernei era de herencia cuantitativa. cuantitativa. Se identificaron, identificaron, asimismo, QTL 23



significativos en los cromosomas VI, VIII, y IX. Adicionalmente, fueron detectados en los cromosomas VII y IX QTLs potenciales. Un QTL posible para rendimiento en tubérculo fue encontrado en los cromosmas VI y VII, pero no estaba asociado a resistencia. El QTL de resistencia a P. infestans fue mapeado para el cromosoma IX, y podría ser utilizado en mejora genética para P. infestans, el mismo está asociado al marcador SSR STM1051, en ambas poblaciones. Un caso interesante es el descrito por van der Vossen et al. (2005), que mencionan una posición clonada de S. bulbocastanum del cual derivó el gen blb2 RPI-gen, el cual cuando se presenta en papa papa confiere confiere una amplia resistencia resistencia al P. infestans. El gen RPI-blb2 fue inicialmente mapeado en varias poblaciones de retrocruzamientos de tetraploides, derivados de un complejo de hibridos interespecíficos con alta resistencia denominado ABPT (un acrónimo de cuatro especies de Solanum: S. acaule, S. bulbocastanum, S. phureja y S. tuberosum), en la misma región del cromosoma VI como el gen Mi-1 de tomate, que confiere

resistencia a nematodos, pulgones y mosca blanca. Los marcadores ligados a QTLs que controlan caracteres de interés, posibilitan la selección asistida por marcadores moleculares (SAM). Sin embargo, si el mapa contiene solo pocos marcadores, la distancia genética existente entre el marcador y el QTL es en muchos casos insuficiente para que este marcador permita un buen diagnóstico del carácter. Con el objeto de resolver esta situación, es conveniente desarrollar mapas de ligamiento genético de alta densidad, para poder disponer de marcadores moleculares física y estrechamente ligados al QTL que controle el carácter de interés (Ritter et al. 2004).

1.12.5. Genotipado de QTA Independiente del modelo particular del análisis de QTL, la estrategia clásica para la detección de genes que influyen en un carácter cuantitativo consiste en: a) establecer progenies apropiadas a partir de cruzamientos, b) la construcción de mapas genéticos basados en marcadores moleculares en estas progenies y c) en la realización de un análisis estadístico de QTLs (Leonards-Schippers (Leonards-Schippers et al. 1994). Esta estrategia representa una tarea laboriosa sobre todo si se quiere procesar varias progenies a su vez. Con el fin de ahorrar trabajo para el análisis de QTLs en diferentes progenies se podrían analizan únicamente aquellas posiciones genómicas de QTLs para resistencia a P. infestans que se hayan publicado previamente. Para ello los SSRs son 24



marcadores ideales, ya que son altamente polimórficos, muestran una herencia codominante y sobre todo mapean en diferentes entornos genéticos a posiciones genómicas idénticas. En el caso de la papa ya existe un mapa denso de SSRs que cubre todo el genoma (Milbourne et al. 1998). Esto permite determinar los QTLs y sus posiciones genómicas en los diferentes parentales de las progenies, así como obtener directamente marcadores (aquí alelos de SSRs) para la selección asistida en los programas de mejora genética. La estrategia que denominamos QTA genotyping (Quantitative trait allele genotyping) también se ha empleado en el presente trabajo, utilizando varias progenies con diferentes parentales como fuentes de resistencia a P.infestans (entornos genéticos diferentes). 1.12.6. Identificación e integración de genes candidato Tradicionalmente, los marcadores empleados para el mapeo de ligamiento y análisis de QTL fueron marcadores neutrales e identificaban DNA genómico en general. Pueden estar más o menos vinculados a un alelo de QTL y su configuración depende de los antecedentes genéticos particulares. particulares. Por lo tanto, sería conveniente para detectar directamente los genes que influyen en un carácter de interés para analizar y comparar los efectos de sus diferentes alelos. Estos tipos de marcadores podrían ser aplicados directamente en la selección asistida por marcadores moleculares con ayuda de la selección, independiente de los antecedentes genéticos y son útiles para establecer mapas funcionales. Los genes candidato, son los genes conocidos o sospechosos de tener un papel funcional en la expresión fenotípica de un rasgo que co-localiza con QTL para el mismo carácter (Pflieger et al, 2001). A este tipo de marcadores pertenecen los CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,

Secuencia polimórfica amplificada y cortada )

descritos

por

Konieczny y Ausbel (1993). Los fragmentos amplificados se someten a una restricción enzimática y se migra en un gel de agarosa, para detectar polimorfismo, después de una amplificación de PCR (Nuez y Carrillo 2000). Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona específica. Se trata de un marcador ampliamente utilizado, sobre todo tras la conversión de otros tipos de marcadores en marcadores de PCR. Bormann et al. (2004) evaluaron marcadores basados en DNA que se sabe están vinculadas a loci de resistencia del patógeno en dos familias tetraploides de papa. En el CIP, Kreuze et al. (2006, no publicado) evaluó en la población PCC1 algunos de estos genes 25



candidatos que fueron objeto en el cromosoma XI y encontró alta asociación con la resistencia a P. infestans. Además, Manosalva et al. (2000) evaluaron los marcadores correspondientes a la planta de genes de defensa a través de la vinculación con el desequilibrio cuantitativo de resistencia a P.infestans en una población diploide y tetraploide mapeadas. Algunos de estos genes resultaron estar asociados con QTLs y basado en PCR marcadores de osmotina y genes STH para PCR, mostró una asociación significativa significativa con la resistencia. resistencia. Kreuze et al. (2006, no publicado), publicado) , diseño primers utilizando secuencias de BAC- finales sobre la base de secuencias del marcador NL27 (Marczewski et al. 2001) y ambos se relacionaron con resistencia a P. infestans en la población PCC1.

Trujillo (2004), reportó cuatro marcadores provenientes de AFLPs, ligados a QTL de tbr en el cromosoma XII. Estos fueron convertidos en marcadores de secuencia específica para facilitar su detección en poblaciones segregantes. Otros genes candidatos desarrollados se obtuvieron a través de análisis transcripcional utilizando microarrays de cDNA y la mayoría está relacionada con el metabolismo, defensa de la planta, señalización y regulación de la transcripción, envueltos todos con el proceso de defensa de las plantas como respuesta a patógenos. Así por ejemplo, Hernández et al. (2008) utilizó cDNA-AFLP diferenciales para detectar cDNAs que se expresan en forma diferencial después de una inoculación con P. infestans y posteriormente se ha analizado su significado biológico. Además, realizaron un ensayo de microarrays para detectar genes de respuesta o de resistencia a la infección de P. infestans, diseñando cebadores de los genes candidatos (nuevos o ya conocidos), con el propósito de integrarlos en el mapa de referencia de la especie. De estos estudios obtuvieron polimorfismos segregantes en el caso de BS2 (TC148920). Este cDNA pudo ser mapeado en un mapa de referencia de papa en el cromosoma XI. Se observó que este cDNA, esta co-localizado con el QTL Pi-11b. Tras el diseño de cabadores apropiados basados en sus secuencias estos genes candidatos se dejan también integrar en un mapa genético si se obtienen productos de amplificación segregantes. Estos se pueden utilizar igual que los otros marcadores para el mapeo. Si están asociados a un particular QTL conocido, entonces puede representar un gen candidato potencial para este este carácter. carácter. En el presente trabajo se han utilizado varios marcadores de genes candidatos para complementar complementar el QTA genotyping con SSRs. 26



1.12.7. Mapas funcionales Es conveniente unir toda la información con respecto a marcadores de DNA, mapas genéticos, caracteres cualitativos, QTLs, genes y otra información en un único "mapa funcional consensuado" (Gebhardt et al. 1999). El volumen de datos que generan los proyectos genómicos genómicos es enorme y es necesario presentar los datos combinados e interpretados a cualquier usuario con el fin de obtener sinergia y colaboración complementaria entre diferentes grupos de investigación. Para maximizar la difusión de resultados y estimular la explotación de los recursos generados es necesario establecer una base de datos en Internet con amplias opciones de búsqueda. En nuestro trabajo hemos utilizado varias de estas bases de datos en Internet I nternet para recabar información sobre marcadores y genes y QTLs de resistencia a P. infestans.

27



2. Objetivos 28



El presente trabajo de investigación se planteó con los siguientes objetivos: 

Evaluar la resistencia a P. infestans en follaje y tubérculo en cinco progenies de papa obtenidas de cruzamientos interespecíficos entre especies silvestres (oka, can, buk, jam, rap) y especies cultivadas (phu, gon y un dihaploide de tbr).



Identificar marcadores discriminatorios para genes de resistencia a P. infestans aplicando como estrategia de “genotipado de QTA” (QTA genotyping) utilizando SSRs ligados a QTLs conocidos de resistencia a P. infestans en las diferentes progenies.



Evaluación de marcadores y genes candidatos conocidos de resistencia a P. infestans en algunas progenies.

29



3. Materiales y métodos 30



3.1. Resistencia a tizón en follaje Los estudios de resistencia fueron realizados en las instalaciones de la Fundación para la Promoción e Investigación de Productos Andinos (PROINPA) en Cochabamba, Bolivia y en Neiker Tecnalia, Vitoria-Gasteiz, Vitoria-Gasteiz, España. 3.1.1. Material vegetal y preparación En el marco del proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y BMZ-CIP, se obtuvo semilla sexual de familias de cruzamientos entre especies silvestres diploides S.okadae, S. canacense, S. bukasovii, S. jamesii

(oka 498063.6, can 310956.8, buk 210042.5,

jam 27521.48 y rap 636) y cultivadas diploides S. phureja, S. goniocalyx (phu 81ccc, gon CIP 703354 y H88.31/34 (dihaploide de Solanum tuberosum). Todas ellas conservadas en el Banco de Germoplasma de Raíces y Tubérculos Andinos de la Fundación PROINPA en Bolivia y una una de ellas (H88.31/34 x rap 636) obtenida en NEIKER derivada del programa de mejora genética de papa (Tabla 1). Las especies silvestres utilizadas en la presente investigación, fueron estudiadas y caracterizadas como nuevas fuentes de resistencia a P. infestans en estudios previos (Colque 1996, Estrada 2000).

Tabla 1. Parentales y progenies de cruzamiento entre especies silvestres ( Solanum okadae, S. canasense, S. bukasovii, S. jamesii y S. raphanifolium ) con especies cultivadas diploides ( S. phureja y S. goniocalyx) y un dihaploide de S. tuberosum. Genealogía

No. genotipos evaluados

Código Hembra Macho experimental oka 498063.6 phu 4238.1 (81 ccc) 50 C can 310956.8 gon 60324/41 (CIP 703354) 83 D buk 210042.5 phu 4238.1 (81 ccc) 66 E jam 27521.48 gon 60324/41 (CIP 703354) 72 G H88.31/34 rap 636 96 N 367 Total oka = S. okadae, can = S. canasense , buk = S. bucasovii, jam = S. jamesii, phu = S. phureja, gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide de S. tuberosum (dih tbr)

Antes de la siembra se sumergió la semilla sexual (TPS) en una solución de ácido giberélico a 1.500 ppm, (disolviéndose 0,75 g en medio litro de agua destilada esterilizada) por 24 horas, con el propósito de romper la dormancia y uniformizar la germinación. 31



Tras secar la semilla, fueron sembrados en bandejas de almácigo utilizando sustrato de musgo, arena, tierra en una proporción 2:1:1. Se sembró 100 TPS/cruza y se regaron los almácigos tres veces al día. Al mes las plantas fueron trasplantadas a macetas de 500 g para su crecimiento, con el mismo tipo de sustrato esterilizado. 3.1.2. Aislados de P. infestans Una vez que se presentó la enfermedad en parcelas de agricultores en la zona de Chullchunq’ani en Cochabamba, Bolivia, se recolectaron hojas de papa, infectadas con tizón de variedades cultivadas en la zona. Las hojas fueron recolectadas en bolsas de plástico, teniendo el cuidado de no tocarlas con las manos. Se guardaron en una caja tecnopor, con hielo, para asegurar que las muestras se conserven en buen estado, hasta su procesamiento en laboratorio. Plata (1998), Colque (1996) y Gabriel et al. (2007) indicaron que la raza de P. infestans de la zona de Chullunq’ani (en Cochabamba, Bolivia) es del tipo de apareamiento A2, es compleja, agresiva y tiene diez genes de virulencia (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11). El patrón de virulencia del aislamiento fue verificado utilizando el set internacional de 11 diferenciales cultivados (Tabla 2). Tabla 2. Set internacional de diferenciales cultivados utilizados para verificar el patrón de virulencia del aislamiento de Chullchunqani. Diferenciales

Genes mayores

702514 (Chata Blanca) 800986 800987 800988 800989 800990 800991 800992 800993 800994 800995 800996 800997 800998 800999 801000 801001 801002 801003 801004 801005 800979

R R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R8 R10 R11 R1R2 R1R3 R1R4 R2R3 R2R4 R3R4 R1R2R3 R1R2R4 R2R3R4 R1R2R3R4

32



La figura 10 muestra la expresión de los síntomas de tizón en foliolos sueltos de diferenciales de raza de papa con diferentes niveles de expresión de la resistencia. RP

S

h

Figura 10. 10. Expresión de síntomas de tizón en foliolos de variedades de papa con diferentes niveles de expresión de resistencia : RP = Resistencia parcial (Isquierda), S = susceptibilidad (centro) , h = hipesensibilidad (derecha). (Foto: Giovanna Plata)

3.1.3. Preparación de foliolos Se prepararon placas Petri con agar-agua, de acuerdo a lo requerido para cada caso con un total de dos placas para cada genotipo. El experimento se realizó con un total de 742 placas Petri de las cinco progenies y cuatro parentales. Los foliolos se recolectaron en invernadero antes de las 9:00 a.m., previo riego de las plantas para que estuvieran turgentes. Los foliolos fueron recolectados en bolsas plásticas, previamente identificadas, se tomaron hojas del tercio superior de la planta; se desinfestaron con hipoclorito de sodio al l% (v/v) durante un minuto, se enjuagó en agua destilada estéril y se secó cuidadosamente con papel toalla. Una vez secos se depositaron en las placas Petri con agar-agua invertidas, con el envés hacia arriba e identificadas. Finalmente las placas conteniendo los foliolos, fueron dispuestas en un estante de crecimiento, con iluminación artificial con temperatura ambiental promedio de 18 ºC. 3.1.4. Preparación de inoculo En la cámara de flujo laminar se lavó cada foliolo recolectado de campo con la ayuda de un bastoncillo y agua destilada estéril. La solución obtenida se filtró a través de una gasa, luego por un filtro de 30 µ y finalmente por un filtro de 10 µ, dejando en el filtro de 10 µ aproximadamente 3-5 ml de solución, que se transfirió a un vaso de precipitación de 200 ml estéril, con la ayuda de una pipeta Pasteur. 33



La concentración de esporangios/ml, se determinó con ayuda de un hematocímetro (Fig. 11). Si la solución era demasiado concentrada, concentrada , se diluyó con agua destilada estéril, hasta alcanzar la concentración requerida. Plata (1998) y Gabriel et al. (2007) encontraron que la concentración apropiada para evaluar componentes de resistencia al tizón es de 20.000 esporangios/ml. Tras contar los esporangios se calculó la concentración empleando la siguiente relación, relación, recomendada por French y Herbert (1982): Concentración = Σ(A+B+C+D+E) x 2000 = esporangios/ml esporangios/ml donde: A, B, C, D = Campos de contaje del hematocímetro hematocímetro

Figura 11. 11. Hematocímetro, empleado para la determinación de la concentración del inoculo Una vez obtenida la concentración de 20.000 esporangios/ml, el vaso de precipitación con inoculo fue fue colocado en una caja caja de tecnopor a una temperatura temperatura de 8-12ºC durante durante dos horas para que los esporangios germinen y liberen las zoosporas. 3.1.5. Inoculación Después de preparar el inoculo se procedió a inocular todos los foliolos, colocando una gota de 20-25 µl a ambos lados de la nervadura central de cada folíolo, agitando la suspensión entre foliolo y foliolo inoculado. En las placas que sirvieron de testigos se colocó gotas de 2025 µl de agua destilada estéril. Las placas fueron colocadas en un estante de crecimiento para suministrar la luz y temperatura adecuada para el desarrollo del tizón (Fig. 12). 34



Figura 12. Estante de crecimiento con las cajas Petri con agar-agua, conteniendo los foliolos desinfestados (Foto: Julio Gabriel). 3.1.6. Diseño experimental Para evaluar la resistencia en invernadero y laboratorio, se distribuyeron cuatro foliolos sueltos por genotipo en diseño completamente aleatorizado (1484 foliolos). Los foliolos fueron depositados depositados en placas Petri (dos foliolos foliolos por por placa). Con Con un total total de 742 placas Petri de 10 cm de diámetro (cuatro foliolos/dos placas). Se evaluaron 371 genotipos de los cruzamientos cruzamientos C, D, E, G y N y de los padres gon, phu, can, jam y rap (Tabla 1) 3.2. Variables de respuesta respuesta y análisis estadístico estadístico 3.2.1. Intensidad de Esporulación (IE) Al 5º, 6º y 7º día después de la inoculación (ddi) se evaluó el porcentaje de área necrosada (esporulación), (esporulación), considerando considerando a cada foliolo como 100 100 %, tal como recomienda recomienda Gabriel et al. (2007). 3.2.2. Área bajo la Curva de Progreso de P. infestans (ABCPPI) El ABCPPI total se determinó en porcentaje de daño-día con la formula desarrollada por Shanner y Finney (1977) (1977) y Cambell y Madden Madden (1990). Se consideraron consideraron dos factores: factores: 1) Factor tiempo de evaluación y 2) Factor familia (cruzamiento). El modelo matemático utilizado fue el siguiente: 35



ABCPPI = Σn ((yi+1 + yi )/2* (ti+1 –ti) donde: ABCPPI = Área Bajo La Curva de Progreso de Phytophthora infestans, tiene unidades de porcentaje-día n = Número de evaluaciones evaluaciones yi = Intensidad de esporulación esporulación (IE) en la fecha fecha i (altura de un rectángulo, rectángulo, estimado como el punto medio entre entre (y i+1 + yi ). (ti+1 –ti) = Tiempo en días días transcurridos transcurridos entre la observación observación y i y yi+1 El valor de ABCPPI se estimó en base a los valores obtenidos de la IE. El ABCPPI es una expresión o medida de avance de la enfermedad o incremento de daño de la enfermedad en el tiempo (porcentaje-días). Para que las familias sean estadísticamente comparables, se cálculo el Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans relativa (ABCPPIrel), dividiendo el ABCPPI total entre el área máxima alcanzada (Bonierbale (Bonierbale et al. 2008) y se transformó a raíz cuadrada empleando el factor √ X + 1, para ajustar a una curva normal. Los análisis de varianza y la comparación de medias fueron realizados utilizando el Proc GLM del SAS para cada una de las variables evaluadas (SAS Users Guide 1998). Pero para la interpretación interpretación de los análisis, se consideraron las medias reales del ABCPPIrel. 3.3. Evaluación de la resistencia en tubérculos Fueron seleccionados cuatro tubérculos sanos de cada genotipo, uno de los tubérculos fue empleado como testigo que fue inoculado con agua destilada estéril. En tres tubérculos se efectuaron heridas con un estilete esterilizado. Los tubérculos fueron dispuestos sobre una rejilla dentro una caja previamente esterilizada donde se colocó papel secante que era mojada dos veces al día para conservar la humedad adecuada para la propagación del patógeno (Fig. 13).

36



Figura 13. 13. Evaluación de resistencia en tubérculos (Foto: Julio Gabriel)

La concentración de esporangios/ml, se determinó con ayuda de un hematocímetro. Si la solución era demasiado concentrada, se diluyó con agua destilada estéril, hasta alcanzar la concentración concentración requerida de 20.000 esporangios/ml. esporangios/ml. 3.3.1. Diseño experimental Para evaluar la resistencia de tubérculos en laboratorio, se distribuyeron cuatro tubérculos por genotipo en diseño completamente aleatorizado (Martinez-Garza 1988). Los tubérculos fueron alojados en cajas húmedas y se evaluaron 294 genotipos de los cruzamientos C, D, E, G y N (Tabla 3). Tabla 3. Número de individuos de la familias C, D, E, G y N, evaluados por su resistencia en tubérculos. Genealogía

No. genotipos evaluados

Código Hembra Macho experimental oka 498063.6 phu 4238.1 (81 ccc) 42 C can 310956.8 gon 60324/41 (CIP 703354) 68 D buk 210042.5 phu 4238.1 (81 ccc) 68 E jam 27521.48 gon 60324/41 (CIP 703354) 58 G H88.31/34 rap 636 58 N Total 294 oka = S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovi, jam = S. jamesii, phu = S. phureja, gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. S. tuberosum tuberosum (dih tbr) tbr)

3.3.2. Aislados de P. infestans Una vez que se presentó la enfermedad en parcelas de agricultores en la zona de Corani Pampa en Cochabamba, Bolivia, se recolectaron hojas de papa, infectadas con tizón de 37



variedades cultivadas en la zona. Las hojas fueron recolectadas en bolsa plástica, teniendo el cuidado de no tocarlas con las manos. Se guardaron en una caja tecnopor, con hielo, para asegurar que las muestras se conserven en buen estado, hasta su procesamiento en laboratorio. La raza de P. infestans de la zona de Corani Pampa (en Cochabamba, Bolivia) es del tipo de apareamiento A2 (Colque 1996), es compleja, agresiva y tiene nueve genes de virulencia (1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11). 3.3.3. Preparación de tubérculos Los tubérculos se recolectaron en el invernadero temprano . Posteriormente fueron llevados a laboratorio y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al l% (v/v) durante un minuto, se enjuagó en agua destilada estéril y se secó cuidadosamente con papel toalla. Una vez secos, cada tubérculo fue herido, en un patrón regular, y luego fueron dispuestos en cajas, sobre una rejilla que tenía en el fondo papel toalla húmedo. 3.3.4. Preparación de inoculo Una vez obtenida la concentración de 20.000 esporangios/ml. Cada vaso de precipitación con inoculo fue fue colocado en una caja caja de tecnopor a una temperatura temperatura de 8-12ºC durante durante dos horas para que los esporangios germinen y liberen las zoosporas. Tras esta operación el inoculo estaba listo para su aplicación en los tubérculos. 3.3.5. Inoculación Previo a la inoculación se hicieron heridas a los cuatro tubérculos y luego se asperjo cada genotipo con 30 ml de inoculo. Para este proceso se emplearon cámaras húmedas. húmedas. 3.4. Variables de respuesta y análisis estadístico Para la evaluación de la resistencia, se estimó el porcentaje de la superficie infectada, empleando una escala porcentual que va de 0 a 100% de tubérculo infectado a los 8, 11 y 14 días después de la inoculación. Con estos datos posteriormente se obtuvo un promedio de porcentaje de infección de tubérculo por genotipo para hacer los análisis de resistencia. Finalmente Finalmente se realizó un análisis de correlación de Pearson de la resistencia resistencia a P. infestans de hoja y tubérculo en las cinco progenies de papa estudiadas.

38



3.5. Obtención del mapa de referencia para el genotipado de QTA (QTA-genotyping) Como mapa de referencia para el QTA-genotiping se utilizó el mapa ultradenso de papa elaborado por Isidore et al. (2003) y van Os et al. (2006) y el desarrollado por varios socios en el marco del proyecto Europeo APHOPHIS (QRLT-2001-01849). En este mapa se integraron todos los QTLs y genes publicados para resistencia a P. infestans como los SSRs de

Milbourne et al. (1998). más cercanos a estos loci. A parte de los

SSR mencionados se ubicaron otros marcadores y genes candidato de resistencia a P. infestans conocidos para el genotipado genotipado de

QTA (QTA-genotyping).

3.5.1. QTLs y genes de resistencia conocidos para el análisis por SSRs ligados Para el genotipado de QTA se ubicaron los QTLs y genes de resistencia a P. infestans que se expresan en la Tabla 4. Leonards-Schippers et al. (1994) y Trognitz et al. (2002) reportaron la presencia del los QTL/genes Pi-7 para resistencia a P. infestans en el cromosoma III. En el cromosoma V Collins et al. (1999) reportó la la presencia del del QTL/gen PIFT-5d. Oberhagemann et al. (1999) y Leonards-Schippers et al. (1994) reportaron en el cromosoma VI un QTL (Pi-6b), asociado con el resistencia a P. infestans. En el cromosoma X, Ewing et al. (2000) reportó en el cromosoma X el QTL Rber involucrado en resistencia a P. infestans.

Gebhardt y Valkonen (2001) detectaron dos clusters en el cromosoma V, uno

para la resistencia a P. infestans y otro para PVX, que previamente fueron observados por en sus estudios sobre la organización de genes R y QTLs en papa. El cluster formado por tres genes que confieren resistencia vertical a P. infestans observado en el cromosoma XI y en el cromosoma IV, posteriormente los mismos autores re-detectaron otro cluster compuesto por el gen R2 y un QTL para el mismo carácter. En el cromosoma IV, el gen R2 que confiere resistencia vertical a varias razas de P. infestans

se asoció con un QTL de resistencia . En el cromosoma XI, se identificó un cluster

formado por tres genes que confieren resistencia monogénica a P. infestans, R3, R6 y R7 . A su vez, en el cromosoma V, observó que el gen R1, que confiere resistencia vertical a varias razas de este patógeno, se localizó junto a dos QTLs diferentes para esta resistencia. Las zonas del genoma más evidentes, donde se congregan múltiples genes R y resistencias cuantitativas a diferentes patógenos, principalmente compuestos por QTLs de 39



resistencia para P. infestans, nematodos del quiste de la papa ( G. pallida y G. rostoquiensis ), y E. carotovora , se mostraron en los cromosomas V, XI, y XII (Gebhardt y Valkonen 2001). Oberhagemann et al. (1999) y Trognitz et al. (2002) encontraron en el cromosoma III, QTls Pi3c, d . asociado con la resistencia a P.infestans, en el cromosoma VII observaron el QTL FB-6 que confiere resistencia a P. infestans. Finalmente observaron la presencia del QTL Pi-7b, que está involucrado en la resistencia a P. infestans.

40



Tabla 4. QTLs y genes de resistencia a tizón ( P.infestans) recopilados en los 12 cromosomas, intervalo de marcadores flanqueantes (MF) para cada QTL/gen y la respectiva referencia bibliográfica. Nº 1 2 3 4 5 6

Gen/QTL Pi-1 Pi-2 Pi-3 Pi-3 FB-1 Pi-4

MF CP11 GP23 GP26 rbcS2-GP504 GP25 GP25

7 8 9

Pi-5 Pi-6 Pi-7

TG135 GP276 4CL

10

Pi-4-1

GP180

11

Pi-4-2

TG123-TG62

Pi-4b R2 PiFTve-5a PiFTve-5b PiFTve-5c PiFTve-5d PiFTve-5ª PiFTve-5b PiFTve-5c PiFTve-5d PiFTve-5ª PiFTve-5b PiFTve-5c PiFTve-5d PiFTve-5ª PiFTve-5b PiFTve-5c PiFTve-5d Pi-5a

Stm3016 TG123-TG22 GP21 Stpto GP179 GP21-GP179 GP21 Stpto GP179 GP21-GP179 GP21 Stpto GP179 GP21-GP179 GP21 Stpto GP179 GP21-GP179 GP21, GP179

Pi-5b Pi-6a Pi-6b

CP113 GP79 GP76

FB-6 Pi-7a

STM1100 GP127-AGPaseB(a)

Pi-7b E-5 E-6 Pi-8

CP134(b) STM1056 STM1024 GbssI(wx), Osm

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Crom I II III

IV V

VI

VII

VIII

40 41

IX

Rblc Pi-9

CP53 Prp1, PALa

42 43

X XI

Rber Pi-11

TG63 GP125

RP-11 RP-11 RP-11 Pi-19 Pi-12 Pi-12

TG105(a), GP185, GP250 GP185, GP250 GP185, GP250 GP185, GP250 GP34 GP34, CP60

44 45 46 47 48 49

XII

Referencia Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 Collins et al, 1999 Oberhagemann et al. 1999 Leonards-Schippers et al. 1994 Ewing et al. 2000 Oberhagemann et al. 1999 Leonards-Schippers et al. 1994 Trognitz et al. 2002 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et al. 1994 Oberhagemann et al. 1999 Leonards-Schippers et al. 1994 Milbourne et al, 1998 Li et al. 1998 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Zimnoch-Guzowskaa et al. 2000 ; LeonardsSchippers et al. 1994 Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et al. 1994 Collins et al., 1999 Oberhagemann et al. 1999 Oberhagemann et al. 1999 Collins et al. 1999 Collins et al. 1999 Oberhagemann et al.1999 Trognitz et al. 2002 Naess et al. 2000 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et al. 1994 Ewing et al. 2000 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et al. 1994 El-Kharbotly et al. 1994 El-Kharbotly et al. 1996 El-Kharbotly et al. 1996 Oberhagemann et al. 1999 Ghislain et al. 2001 Oberhagemann et al. 1999

Crom = cromosoma; MF = marcadores flanqueantes

41



3.5.2. Proyección de QTLs, genes y SSRs Para la recopilación de los QTLs/genes conocidos en papa se utilizaron las publicaciones citadas en la Tabla 4 y bases de datos: Gabi (Pomamo database) y Solgene (USDA-ARS). Se anotaron la posición de cada QTL/gen recopilado, los marcadores flanqueantes al QTL/gen y la posición de estos en el mapa de origen. Para integrar los QTLs/genes recopilados dentro de un bin determinado del mapa ultra denso se utilizó la proyección coseno tal como describe Ritter et al. (1990) y Ritter y Salamini (1996). Este método está basado en la distancia relativa de ese QTL/gen en cuestión, con respecto a un intervalo común en diferentes mapas, asumiendo que la frecuencia de recombinación en esta zona es la misma en las poblaciones comparadas. Los cálculos de este método se basan en el teorema de los triángulos rectángulos rectángulos (Figura 14).

M2r

Cosα=c/a Mapa R b

Cosα=d/b

Dr Xr

a

a/b=c/d α

M1r

α

c

M1p d

M2p

Xp?

Dp Mapa P

Fuente: Sánchez (2006)

Figura 14. 14. Teorema de los triángulos rectángulos (izquierda) aplicado a la proyección de marcadores y QTLs QTLs (derecha). (derecha).

R: Referencia, P: Proyección, M1r y M2r: Posiciones de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el mapa de referencia, Xr: posición del QTL en el mapa de referencia, M1p y M2p: Posiciones de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el mapa de proyección, Xp: posición del QTL en el mapa de proyección, Dr: distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de referencia (M2r-M1r), Dp: distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de proyección (M2p-M1p).

Dependiendo de los datos disponibles en los mapas genéticos utilizados, se hicieron tres casos de proyecciones. En la Figura 15 se pueden observar las diferentes situaciones analizadas. En los casos A y B se dispuso de dos marcadores comunes en el mapa de proyección y en el mapa de referencia. Sin embargo, en el caso C, se detectó sólo un marcador común en ambos mapas. Se aplicó la equivalencia de los triángulos rectángulos y se obtuvo la siguiente relación (Figura 14). 42



Xp=Abs[M1p+(Xr-M1r)*Dp/Dr] (1) Siendo Xp: posición del QTL en el mapa de proyección; M1p: posición del marcador común flanqueante al QTL en el mapa de proyección; Xr: posición del QTL en el mapa de referencia; M1r: posición del marcador común flanqueante al QTL en el mapa de referencia; Dp: distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de proyección (M2p-M1p); Dr: distancia correspondiente correspondiente al intervalo común en el mapa de referencia (M2r-M1r).

B)

A)

C Xp? Xr

M1r

M1p M1r

Xr

Xp?

M2r

M2p

Mapa R

Mapa P

M2r Mapa R

M1p

M1r

M1p

Xr

Xp?

M2p Mapa P

Mapa R

Mapa P

Figura 15. 15. Diferentes casos de proyección A) Cuando dos marcadores (Mi) comunes comunes flanqueantes al QTL están están disponibles en el mapa de proyección (P) y en el mapa de referencia (R), con posiciones M1p, M1r y M2p, M2r. B) Cuando dos marcadores (Mi) comunes adyacentes están disponibles en el mapa de proyección (P) y en el mapa de referencia (R), con posiciones M1p, M1r y M2p, M2r. C) Cuando sólo un marcador común (Mi) está disponible en el mapa de proyección (P) y en el mapa de referencia (R), con posiciones M1p, M1r y M1r se sitúa a menos de 10cM de Xr.

La ecuación (1) no sólo se aplicó para la proyección de QTLs/genes, también fue útil para la proyección de marcadores indirectos utilizados en el proceso de proyección de QTLs/genes. Para las proyecciones de tipo C (Figura 15), si la posición del marcador común en el mapa de referencia (M1r) se localizaba a una distancia relativamente cercana al QTL/gen (menor de 10 cM) la proyección fue directa aplicando la siguiente relación Xp= Abs [M1p+(Xr-M1r)] (2) Siendo Xp: posición del QTL en el mapa de proyección; M1p: posición del marcador común en el mapa de proyección; Xr: posición del QTL en el mapa de referencia; M1r: posición del marcador común en el mapa de referencia. Además, en todos los tipos de proyección, a la hora de alinear mapas, fueron consideradas las cinco inversiones paracéntricas conocidas entre el mapa de papa y tomate (Tanksley et al. 1992). Por ello, en algunos casos, el cromosoma completo y en otros, parte 43



del brazo del cromosoma, tuvo que ser invertido para conseguir una orientación idéntica en diferentes mapas. Las inversiones fueron consideradas utilizando la fórmula:

Xi=Ia+Ib-X (3) Donde: Xi es la posición del marcador invertido X, mientras que Ia e Ib representa el comienzo y el final de la inversión, respectivamente. Las posiciones de los QTLs/genes y marcadores en otros mapas se expresan generalmente en unidades de cM. Para la proyección al mapa UHD, éstas se convirtieron en bins. Un bin representa un patrón de expresión de un fragmento (presencia/ausencia) en los genotipos de la población de mapeo del mapa UHD. En general, un bin corresponde a 0,8 cM, ya que la distancia mínima entre dos bins adyacentes es una recombinación, en un genotipo específico. En el proceso de proyección de QTLs/genes y marcadores moleculares se utilizaron los siguientes mapas genéticos: a) El mapa ultra ultra denso de papa (Isidore (Isidore et al. 2004, van Os et al. 2006). Este mapa, a parte de los 10.000 marcadores AFLPs, contiene 40 marcadores RFLPs y SSRs que se utilizaron como marcadores directos. Por otro lado, este mapa está alineado con el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) mediante sondas RFLPs. b) El mapa de papa de Caromel et al. (2003) obtenido en una población de S. tuberosum x S. spegazzinii.

De este mapa se utilizaron por una parte, 40 marcadores semi-directos, que

también están localizados en los bins del mapa UHD. Estos marcadores posibilitaron el anclaje de ambos mapas. Por otra parte, este mapa contiene 66 marcadores, generalmente RFLPs de tomate (marcadores indirectos) mapeados a su vez en el mapa (c). ( c). c) El mapa de tomate (Tanksley et al. 1992), cuenta con 66 marcadores comunes al mapa de papa de Caromel et al. (2003) que posibilitaron su anclaje. d) El mapa de papa de la base de datos Gabi (Pomamo), disponible en la página web https://gabi.rzpd.de/projects/Pomamo. Contiene unos 865 marcadores de los cuales 30 son de tomate y permitieron relacionar este mapa con el (c). 44



e) El mapa de SSRs de Milbourne et al. (1998) que contiene marcadores RFLPs mapeados también en el mapa de papa de la base de datos Gabi (Pomamo) y sondas de tomate. Este mapa pudo ser anclado al mapa (c) y (d). f) Los mapas involucrados en las publicaciones de los QTLs/genes. Estos mapas fueron relacionados con algún mapa de los anteriormente mencionados por medio de los marcadores adyacentes al QTL. Con objeto de incrementar el número de marcadores proyectables, se consideró que los mapas a, b, c y d estaban altamente saturados debido debido al número de marcadores que tenían. De esta forma, los marcadores distales de cada cromosoma y de cada mapa se localizaron en el cebador (primer) y último bin del mapa UHD, respectivamente. respectivamente. El proceso de proyección siguió el esquema general que se describe en la Figura 16. Se partió del modelo de que en el mapa de estudio el QTL está flanqueado por los marcadores M1 y M2, se pueden distinguir tres casos de proyección. Ambos, sólo uno o ninguno de los marcadores flanquentes flanquentes pueden estar presentes en el mapa UHD (marcadores directos), por lo que, aparte de proyectar el QTL y dependiendo del caso, también tuvieron que ser proyectados individualmente en el mapa UHD los marcadores indirectos. En la mayoría de los casos no existían marcadores directos, y previamente a la proyección del QTL/gen se realizaron múltiples proyecciones a través de los diferentes mapas numerados anteriormente, hasta conseguir la localización de M1 y M2 en el mapa UHD y finalmente finalmente proyectar el QTL/gen (proyecciones indirectas). QTL M1

M2

M1Y M2

SÓLO M1

SÓLO M2

NADA

DISPONIBLES EN EL MAPA UHD

DISPONIBLE EN EL MAPA UHD



PROYECTAR M2

PROYECTAR M1

PROYECTAR M1 Y M2

EN EL MAPA UHD

EN EL MAPA UHD

EN EL MAPA UHD

PROYECTAR QTL EN EL MAPA UHD

Figura 16. 16. Esquema del proceso general general de proyección de QTLs/genes en el mapa UHD donde principalmente se distinguen tres casos de proyección. M1 y M2 representan la posición de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el mapa de referencia y en el mapa de proyección.

45



En función de la disponibilidad de los diferentes tipos de marcadores en los distintos mapas, se distinguieron tres casos de proyección. El diagrama de flujo de toma de decisiones muestra cada caso (Figura 17). En el caso de que MI (marcador flanqueante flanqueante de referencia MI; I = 1 ó 2) fueran sondas de tomate presentes en el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992), se proyectaron al mapa UHD a través del mapa de papa de Caromel et al. (2003) (Figura 17 Caso 1). En el caso de que MI fueran sondas de papa presentes en el mapa de papa de Caromel et al.

(2003) se proyectaron directamente en el mapa UHD. En el caso contrario, los MI se

proyectaron al mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) y se prosiguió como en el caso 1 (Figura 17 Caso 2). En el caso de que los MI fueran SSRs presentes en el mapa de Milbourne et al. (1998), se proyectaron al mapa de papa de la base de datos Gaby (Pomamo) y se prosiguió como se describe en el caso 2 (Figura 17 Caso 3). Caso 1

Caso 2

RFLP de tomate en el mapa UHD?

SI NO

SI NO

No es posible proyectar

SI NO

SI NO

Proyección en el mapa UHD

Posición directa


RFLP de patata en el mapa de Gabi? (2)

Buscar intervalo común en el mapa INRA Proyección en el mapa INRA

SSRsen el mapa UHD?

RFLP de patata en el mapa de patata de Caromel et al . (2003)?


RFLP de tomate en el mapa de tomate de Tanksley et al.,1992? (1)

SI NO

RFLP de patata en el mapa UHD?

Posición directa

RFLP de tomate en el mapa de patata de Caromel et al . (2003)?

Caso 3

SI NO

No es posible proyectar Proyección en el mapa de patata de Caromel et al . (2003) Proyección en el mapa UHD

SI NO

Posición directa

SSRsen el mapa de Milbourn Milbourne e et al. (1998)?

SI NO

No es posible proyectar

Buscar intervalo común en elmapade Gabiy Gabiy continuar en (2)

Buscar intervalo común en el mapa INRA

SI

NO

Buscar intervalo común en el mapa tomate de Tanksley et al., 1992 y continuar en (1)

Figura 17. Diagrama de flujo de toma de decisiones que muestra los 3 casos de proyección en función de que MI (posiciones de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el mapa de referencia, I = 1 ó 2) sean sondas de tomate (caso 1), sondas de papa (caso 2) o SSRs (caso 3).

3.5.3. Otros marcadores y genes utilizados para el QTA-genotyping También se han utilizado otros marcadores para realizar el genotipado de QTA, los mismos que se describen en la Tabla 5. Estos fueron sugeridos y recomendados por el CIP [Gonzáles et al. 2007 (no publicado)]. publicado)]. 46



Tabla 5. 5. Otros marcadores utilizados para el genotipado de QTA. Nombre

Cromosoma

Marcadores SSR

STM5121

CACCGGAATAAGCGGATCT

XI

AGCAGCTCTGATGGCAATGC

GP125

NL25

XI

NL27

XI

Marcadores derivado de AFLPs

E46M42.g

TCTTCCCTTCCATTTGTCA

Protocolo

55

PCR

GAGCCTAGCTGCCCAGCTTC GAGCCTAGCTGCCCAGCTTC 55 AGA GTC GTT TTA CCG ACT TATTGTTAATCGTTACTCCCTC 60 CC CTCCCGTCCTCCTTATTATTC TGCAGAAGCCTTTACCGAACA TGCAGAAGCCTTTACCGAAC A

CAP1 CAP 62

GATATCTTGGAAAGCCTTAG

CTTACAAGGTTGTTGGATG

60

CAP

I (BCT)

GCTATGTCCAACTTGAACGG

AATCCAACCAATCTTTAGCC AATCCAACCAATCTTTAGC C

55

PCR

XII (PDm)

TTGTGATGTAGAGGATTGTTTC

GCATCTTGATTAGTCCGTTTCT

51

PCR

XI (blb8008)

GAGAAATGGCATATGCTGCTC GAGAAATGGCATATGCTGCTC

TGAGGCGATCAAGTATGGTG

55

PCR

Hin1-like

1

T° A (°C)

XII

Genes candidato desarrollado a través de expresión diferencial

Protein phosphatase-2C Gen candidato obtenido por expresión diferencial obtenido por cDNAs y Microarrays Protein BS2 (TC148920)

Cebador reverso

XII (PDf,m)

Genes candidato

Cebador directo

CAP = Cleaved Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, Sequence,

CAP

Secuencia polimórfica amplificada y cortada

La Tabla 6 describe las condiciones de uso de cada CAP, incluyendo las enzimas de restricción adecuadas para cada caso. Tabla 6. 6. Condiciones para el uso de los CAPs. Características T°a CIP T°a MWG Pares de bases Enzima de restricción T° incubación Tiempo T° inactivación Tiempo

GP125 55

NL 25 60

55

60

650

700

Nla III 37°C 5 min 80°C 5 min

NL 27 62

E46M42.g 60

53

47

780 Hpa III Hpa III Hae III 37°C 37°C 5 min 5 min 65°C Fenol/Cloroformo Fenol/Cloroformo 5 min

172 Eco R1 37°C 150 min 65°C 15 min

47



3.6. Técnicas moleculares Las técnicas moleculares fueron realizadas en el laboratorio del Departamento de Biotecnología Biotecnología de NEIKER, en el marco del proyecto FOOD-CT-2005-513959 FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit). 3.6.1. Extracción de DNA Se extrajo DNA genómico de genotipos de las poblaciones D, E, G y N. Para las extracciones se utilizó el kit “DNeasy ® Plant mini” (Qiagen, Izasa S.A. 69106), que incluye todos los componentes necesarios para la extracción, incluido columnas, buffers y enzimas. La cantidad de material vegetal fresco de partida fue de aproximadamente 100 mg. Los foliolos se trituraron hasta convertirlo en polvo con ayuda de nitrógeno líquido, posteriormente se mezcló vigorosamente con 400 ml de buffer de extracción AP1 que previamente fue calentado en un baño maría a 65ºC y con 4 µl de RNasa A (100 mg/ml). Luego se incubó la mezcla 10 min a 65ºC. Se añadieron 130 µl de buffer AP2, se mezcló mediante vortex y se incubó 5 min en hielo. Pasado este tiempo, la mezcla se centrifugó a 6.000 x g durante 5 min y el sobrenadante se añadió a la columna QIAshredder (color lila). Esta columna se centrifugó a 6.000 x g durante 2 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y añadieron 1,5 volúmenes del Buffer AP3 mezclándose mezclándose suavemente. Seguidamente, la mezcla se añadió a una columna Dneasy Mini Spin (color blanco) y se centrifugó 1 min a 4.000 x g. Se descartó la fase líquida del tubo y se añadió sobre la misma columna el resto de la mezcla repitiéndose la centrifugación. A continuación se añadieron 500 µl de buffer AW sobre la columna. Se centrifugó durante 1 min a 8.000 rpm y se descartó la fase líquida. La columna se centrifugó de nuevo para secarse completamente. Finalmente se añadieron 100 µl de buffer de elución AE precalentado a 65ºC y se incubó 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se recuperó el DNA centrifugando la muestra a 6.000 x g durante 1 min. Se tomó una alícuota de 1 µl de la muestra y se visualizó en un gel de agarosa al 1% (p/v) para comprobar la integridad del DNA. 3.6.2. Cuantificación de ácidos nuecleicos La cuantificación del DNA se realizó mediante la determinación de la absorvancia a 260 m en el espectrofotómetro (eppendorf Biophotometer), lo cual permite el cálculo de la

η

concentración de los ácidos nucleicos en la muestra. Una DO=1 corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de ADN de doble cadena, 40 µg/mL del ADN de cadena sencilla y de ARN y 20 µg/ml de oligo nucleótidos de cadena sencilla (Valadez-Moctezuma y Kahl 2005). La relación entre la lectura de absorbancia absorbancia a 260 y 280 nm (DO 260/280) aporta una 48



estimación de la pureza de los ácidos nuecleicos. Las preparaciones puras del ADN y del ARN tienen valores que van desde 1.8 a 2.0 a (DO 260/280) respectivamente. respectivamente. La concentración de ADN en la solución se cálculo con la siguiente fórmula: Concentración Concentración de ADN (µg/ml) ( µg/ml) = [(DO x 100 (factor de disolución) x 50 µg/ml]/1000 3.6.3. Determinación en geles de agarosa El grado de degradación del DNA fue estimado por la electroforesis de una alícuota de la muestra en geles de agarosa. El DNA de peso molecular alto apareció como una banda definida en la parte superior del gel a poca distancia de los pozos, mientras que el material parcialmente parcialmente degradado, formó barrido (parecido a una mancha) de fragmentos pequeños a lo largo del carril haciendo que la definición citada, pierda su nitidez o no se aprecie. La cantidad de de ácidos nucleicos en la muestra fue estimada comparando el campo fluorescente de los mismos respecto a la serie de estándares utilizados como el fago lambda. 3.6.4. Análisis de marcadores SSR Se analizaron 321 genotipos mediante reacciones de PCR utilizando marcadores o primers (SSRs) específicos específicos diseñados diseñados para buscar genes asociados para para resistencia resistencia a P. infestans (Tabla 7).

Inicialmente se realizó una pre-selección en un número pequeño de genotipos elegidos al azar de cada progenie. progenie. Tras de observar la segregación en en estas se aplicaron aplicaron los marcadores a toda la población. Tabla 7. 7. Número de genotipos gen otipos analizados mediante reacciones de PCR, PCR , utilizando uti lizando microsatélites microsatélites (SSRs). Familia Genealogia No. Genotipos evaluados D can 310956.8 gon (CIP 703354) 89 E buk 210042.5 phu (81 ccc) 78 G jam 27521.48 gon (CIP 703354) 58 N H88.31/34 rap 636 96 Total 321 oka =S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovi, jam = S. jamesii, phu = S. phureja , raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. tuberosum tuberosum (dih tbr) gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium,

49



Se han utilizado diferentes marcadores que han sido compendiados en una lista de marcadores potenciales potenciales SSR que están ligados y co-localizados con QTLs para P. infestans en un mapa referencial de papa (Ritter et al. 2005, Ritter et al. 2008 a y b). La Tabla 8 muestra los marcadores microsatélite (SSRs) utilizados en la presente investigación. Tabla 8. 8. Secuencias de los cebadores cebadores utilizados para amplificar amplificar los correspondientes correspondientes SSRs utilizados en las poblaciones D, E, G y N de papa para el cribado de QTL conocidos. Chrom I

1

Marcador Repetición STM2020

(TAA)6

I

STM1029

( C)12

I

STM STM2030 2030

(CA) CA)3(T 3(TA)5 A)5

II

STM0038

(TA)4 ((TG)12

II

STM1064

(TA)12…(TG)4 GT (TG5)

III

STM1054

(AATT)4

III

STM0040

(AT)20 AG…(AT)2 (GT)11

III

STM1025

(T)15 (A)8

IV

STM3016

(GA)27

IV

STM1050

(AT)16

V

STM1020

(T)12 (A)9…(TA)7…(ATA)6

VI

STM0 STM001 0199

(AT) (AT)77 (GT) (GT)10 10 (AT) (AT)44 (GT) (GT)55 (CG) (CG)44 (GT) (GT)44

VI

STM1100

(TA)22

STM1056

(AAAAT)4

VII

STM1003

(TA)10

VII

STM0052

(AC)5…(AC)6 (AC)16

VIII

STM1056

(AAAAT)4

VIII

STM1024

(TTG)6

VIII

STM1005

(GTA)6

IX

STM 1102

(TA)8

IX

STM1051

(TAT)4TTT(TAT)7

IX

STM3012

(CT)4…(CT)8

X

STM0051

(AC)7…(AC)7…(AT)4

XI

STM1009

(AT)30

XI

STM0 STM003 0377

(TC) (TC)5( 5(AC AC)6 )6AA AA…( …(AC AC)7 )7 (AT) (AT)44

XI

STM0025

(TG)13

XII

STM0007

(AC)9

XII

STM0030

Compound ((GT/GC) GT)8

XII

STM2028

(TAC)5…(TA)3…(CAT)3

F (Forward) = Cebador Directo, 2 R (Reverse) = Cebador Cebador Reverso T°a = Temperatura de anillamiento Milbourne et al. (1998)

F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R

Secuencia del marcador (5’- 3’) 1F - 2R CCTTCCCCTTAAATACAATAACCC CATGGAGAAGTGAAAACGTCTG AGGTTCACTCACAATCAAAAGCA AAGATTTCCAAGAAATTTGAGGG TCTTC TTCCCA CCAAAT AATCTAG CTAGA AATAC ATACA ATGC TGC AAAGTTAGCATGGACAGCATTTC AACTCTAGCAGTATTTGCTTCA TTATTTAGCGTCAAATGCATA GTTCTTTTGGTGGTTTTCCT TTATTTCTCTGTTGTTGCTG CACCAAACCTCAACAAAAG ATTTATGGTATTACTTGGGTTACA GCAATAATGGCCAACACTTC TGGGAAATGTTAGTCAAAAATAGC ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA ATTTCGTTGCTTACCTACTA TCAGAACACGCAATGGAAAAC GCTCCAACTTACTGGTCAAATCC CTACATATATACAATTATCTAACCG TTCTCTATGTTAGGCTAGAGTG TTAATATTTTTTACTCGGCTATTG TTCGTTGCTTACCTACTA CCCAAGATTACCACATTC AATA AATAGG GGTG TGTA TACT CTGA GACT CTCT CTCA CAAT ATG G TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG GCTTCGCCATCTTAATGGTTA TCTTCGAAGGTACGTTTAGACAA AGGTAAGTTTTATTTTCAATTGC GGGTATGGGAATAGGTAGTTT CACTTAATATGGATTAGAGGAAGTA GAACTTATGCTTTATCATTCA TAGGCTCGGGTCATTACAATAA GCTCGCCTGTGTTTGTTGT AGGTAAGTTTTATTTTCAATTGC GGGTATGGGAATAGGTAGTTT ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA TCAAAACCCAATTCAATCAAATC ATGCCTCTTACGAATAACTCGG CAGCTAACGTGGTTGGGG GGAAGAATTTGTAGGTTCAA AAAGTGAAACTTCCTAGCATG TCCCCTTGGCATTTTCTTCTCC TTTAGGGTGGGGTGAGGTTGG TCTCACCAGCCGGAACAT AAGCTGCGGAAGTGATTTTG TAGGCTCGGGTCATTACAATAA GCTCGCCTGTGTTTGTTGT ATTAGCATACGACTCAAC TTATTTTCATTTTTCAGC AATT AATTTA TAAC ACTT TTAG AGAA AAGA GATT TTAG AGTC TCTC TC ATTTGGTTGGGTATGATA AACTATCAACTAAATGCCTTTTT TTAATATTTTTTACTCGGCTATTG GGCAAGCTGTGAAGTTTAT AATTGAGAAAGAGTGTGTGTG AGAGATCGATGTAAAACACGT GTGGCATTTTGATGGATT TCTCACCAGCCGGAACAT AAGCTGCGGAAGTGATTTG

T°a (°C) 60.2 58.8 59.8 59 5 9.8 58.7 58.7 59 59.7 53.0 51.0 54.1 58.0 46.0 60.0 49.4 51.0 46.5 50.8 52.0 52.0 52.0 53.9 53.9 53.0 58.0 53.9 53.9 60.0 59.0 53.7 53.9 65.7 65.3 60.3 60.0 52.0 45.2 46.1 47.7 47.7 48.2 53.0 52.0 52.7 54.0 54.1 60.2 60.4

50



Las condiciones de la reacción de la PCR fue la descrita en la Tabla 9 (Ghislain et al. 2004, con modificaciones) modificaciones) Tabla 9. Reactivos necesarios necesarios para la reacción de PCR. Reactivos dd H2O 10 x NH4 PCR buffer 10x MgCl2 (50mM) dNTPs (2,5mM) Primer directo (10 pmol/µ) Primer reverso (10 pmol/µ) IRD M13 (1 µM) Taq DNA polimerasa (5U/ µ) (Invitrogen Inc. Barcelona, España) Volumen final DNA (30 ng)

Volumen 2,0 µl 1,0 µl 0,5 µl 0,8 µl 0,4 µl 0,4 µl 1,8 µl 0,1 µl 7,0 µl 3,0 µl

Todos los productos de amplificación fueron desarrollados en el termociclador Primus 96 (MWG AG Biotech) usando Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen Inc. Barcelona, España). Los productos amplificados se mezclaron con 7 µl de formamida-loading buffer (98% (v/v) formamida, EDTA 10mM pH 8.0, Azul de bromofenol 0,1% (p/v); Xilenecyanol 0,1% (p/v)). Para la amplifación se utilizó el programa de PCR desarrollado por Ghislain et al.

(2004) con modificaciones. La mezcla se desnaturalizó en el termociclador durante duran te 8 min

a 95ºC, y se enfrió rápidamente en congelador a -20 ºC. Posteriormente los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% (p/v) y 7M de urea, y se visualizaron en el analizador LICOR (DNA Analyser Gene Reader 4200, LICOR, MWG-Biotech) utilizando utilizando su manual (Fig. 18).

Figura 18. 18. Imagen del analizador LICOR (Foto: Julio Gabriel)

51



3.6.5. Análisis de genes candidato El gen candidato candidato Protein BS2 (TC148920) (TC148920) descrito en la la Tabla 5 fue detectado detectado por por Hernandez et al. (2008), quienes utilizaron la técnica de cDNA-AFLP diferenciales para detectar cDNAs que se expresen de forma diferencial después de una inoculación con P, infestans

y posteriormente analizaron su significado biológico. Además, realizaron un ensayo

de microarrays para detectar genes de respuesta o de resistencia a infección con P. infestans. Con un microarrays de papa con 10.000 genes o cDNAs del Instituto TIGR (Rockville MD, USA). Este chip detecta genes que se expresan de forma diferencial después de la inoculación con el patógeno utilizando mARN marcados. Luego diseñaron cebadores para los genes candidatos (nuevos o ya conocidos) con el objeto de integrarlos en el mapa de referencia de la especie. Este nuevo cDNA (gen candidato) diseñado para PCR fue utilizado como gen candidato para detectar genes de resistencia en la poblaciones D. E, G y N. La amplificación de este marcador se realizó en un termociclador tipo 2720 A&B (MWG AG Biotech) a una temperatura de anillamiento 55°C. Los productos de amplificación se desnaturalizaron y separaron en geles de poliacrilamida al 6% (19:1) y se visualizaron en un secuenciador 116 LICOR 4200-S1 (LICOR, Lincoln, Nebraska, USA) según el manual del equipo. 3.6.6. Análisis de marcadores CAP Los marcadores CAP se evaluaron inicialmente mediante PCR y posteriormente se procedió a la digestión del producto de amplificación utilizando las enzimas que se indican en la Tabla 6. Previamente, se realizó una pre-selección en seis genotipos elegidos al azar de la progenie N. Despues de observar la amplificación amplificación (producto de PCR) se procedió a realizar la digestión y una vez observado el polimorfismo de bandas a través de diferentes cortes por la enzima utilizada se aplicó a toda la población. Las condiciones para la reacción de la PCR fueron las que se muestran en la Tabla 10.

52



Tabla 10. Condiciones Condiciones de la PCR para CAPs CAPs.. Reactivos dd H2O 10 x NH4 PCR buffer 10x MgCl2 (50mM) dNTPs (2,5mM) Primer directo (10 pmol/µ) Primer reverso (10 pmol/µ) Taq DNA polimerasa (5U/ µ) (Invitrogen Inc. Barcelona, España) Volumen final DNA (50 ng)

Volumen 16,2 µl 3,0 µl 1,2 µl 2,4 µl 0,75 µl 0,75 µl 0,2 µl 30,0 µl 5,0 µl

Todos los productos de amplificación fueron desarrollados en el termociclador 2720 A&B (MWG AG Biotech) usando Taq 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen Inc. Barcelona, España). Para Para la amplifación amplifación se utilizó el programa programa desarrollado desarrollado por el CIP

con

modificaciones (Gonzáles et al. 2007). Posteriormente, los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa preparado con 0,5 g de agarosa + 0,5 ml de TAE 1x al 1% + 0,5 µl de Bromuro de Etidio. Los geles se visualizaron en el transluminador BIORAD utilizando su manual. Una vez que se separó el producto de amplificación en el gel de agarosa y se comprobó que se obtuvo un fragmento del mismo tamaño, se procedió a la digestión del producto de PCR con enzimas de restricción (Tabla 6), las misma que se adquirieron de Fermentas (eurofins MWG Gmb H, Barcelona). Para la digestión se utilizaron los reactivos de la Tabla 11. Tabla 11. Reactivos necesarios para la digestión. Reactivos dd H2O Buffer DNA Enzima (según el CAP analizado) Volumen final

Producto de PCR 17,0 µl 2,0 µl 10,0 µl 1,0 µl 30,0 µl

Los productos digeridos se separaron por electroforesis en gel de agarosa preparado con 0,5 g de agarosa + 0,5 ml de TAE 1x al 1% + 0,5 µl de Bromuro de Etidio. Se preparó el marcador con 2 µl de marcador (1kb Plus DNA Ladder + 5 µl H2O y la muestra con 15 µl del 53



Producto de PCR + 2 µl Louding. Los geles se visualizaron en el transluminador BIORAD,

utilizando su manual. 3.7. Análisis de alelos Las huellas genéticas generadas por hibridación o por PCR, son heredadas a la descendencia de acuerdo las leyes mendelianas (Valadez-Moctezuma y Kahl 2005). Por lo tanto, las bandas que son polimórficas entre los progenitores se pudieron seguir en las poblaciones segregantes de las cruzas y se analizó desde el punto de vista de ligamiento en cada uno de los individuos. Es decir, los marcadores segregantes de cada progenie fueron tratados como un sistema de marcador dominante con un patrón de segregación 1:1 ó 3:1 según el modelo de segregación mendeliana mendeliana (ab x aa), (aa x ab) ó (ab x ab), donde el alelo “a” representa la ausencia de la banda (0), y el alelo “b” representa la presencia de fragmentos amplificados amplificados (1) (Tabla 12). De esta forma, forma, se dedujo fragmentos fragmentos específicos específicos de sólo un parental ab x aa; aa x ab respectivamente y factores comunes a ambos parentales (ab x ab). Los geles fueron analizados de forma visual, utilizando una matriz de presencia-ausencia del fragmento amplificado para el QTA-genotyping. QTA-genotyping. Tabla 12. 12. Nomenclatura de análisis de marcadores moleculares moleculares y/o TDFs. Modelo de Tipo de Ausencia Origen segregación segregación de banda Marcador común ab x ab 3:1 aa Parental aa x ab 1:1 aa Parental ab x aa 1:1 aa

Presencia de banda b- (ab ó bb) ab ab

Codificación de genotipos ab, bb = 1, aa = 0 ab = 1, aa = 0 ab = 1, aa= 0

La presencia o ausencia de cada marcador segregante, tanto de la progenie como de los parentales, se anotó según la codificación codificación de la Tabla 12. Se almacenaron en archivos archivos con formato EXCEL para su posterior análisis estadístico. Para cada marcador ensayado se aplicó un t-TEST para comparar las medias de niveles de resistencia en los genotipos que pertenecen a cada clase de marcadores (ausencia/presencia) en cada caso utilizando Proc t-test del software SAS (SAS Users Guide 1998).

54



4. Resultados 55



4.1. Análisis de la resistencia 4.1.1. Análisis de la resistencia a P. infestans en hoja El análisis de ajuste de normalidad de las familias C, D, E, G y N mostró que las distribuciones del Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestan relativa (ABCPPIrel) no se ajustaron a curvas normales (P<0.05), por lo que se transformaron transformaron los datos para su análisis análisis de varianza mediante raíz cuadrada como fue descrito en la metodología. metodología. Con esto se logró el ajuste apropiado, apropiado, obteniendo coeficientes coeficientes de variación variación (C.V.) entre entre 5.44 y 8.36% (Tabla 13). En general todas la poblaciones evaluadas para ABCPPIrel mostraron una distribución asimétrica hacia derecha o izquierda (A > 0 ó A < 0) y con empinamientos platicurticos (K < 3). Tabla 13. 13. Características Características de las distribucione distribucioness del ABCPPrel ABCPPrel de las familias familias C, D, E, G y N. Momentos

Familia C N

Media Media Asimetria (A) C.V. Varianza Empinamiento (K) Pr
0.20 -0.267 5.44 0.004 -1.171 0.0001

Familia D

Familia E

Familia G

200 0.19 0.418 7.04 0.006 -0.835 0.0001

332 0.22 0.269 8.26 0.008 -1.418 0.0001

264 0.18 0.18 0.489 7.21 0.006 -0.958 0.0001

Familia N 288 0.33 -0.332 8.36 0.009 -1.289 0.0001

El análisis de varianza para el ABCPPIrel mostró un C.V. de 7.42%, y fue altamente significativo significativo (Pr<0.01) entre entre las las progenies progenies y parentales evaluados (Tabla 14). Las progenies y parentales involucrados mostraron diferentes grados de resistencia al tizón tardío ( P. infestans)

(Fig. 19). Esto indicó que existieron diferentes niveles de expresión de la

resistencia a P. infestans entre las progenies, en la que estuvieron involucrados posiblemente genes mayores o genes R, genes menores y/o genes R vencidos, que han sido trasferidos de las especies silvestres diploides utilizadas (oka, jam, buk, can y rap). Tabla 14. 14. Análisis de varianza para el ABCPPIrel en hoja. Fuentes de variación Total Familias Error C.V. R 2

Grados de libertad 1386 8 1378

Cuadrados medios

Prob< F

0.112 0.007 7.42 0.09

0.0001

56

288



La separación de medias del ABCPPIrel mediante la prueba de Duncan al Pr < 0.05 (Tabla 15), mostró que las progenies progenies G, C, D, E, N y el parental diploide phu, no fueron significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí (ABCPPIrel = 0.05 – 0.33), pero si significativamente diferentes (Pr < 0.05) al parental diploide cultivado gon (ABCPPIrel = 0.47). Las progenies D, C, E y N no fueron significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí, pero si (Pr<0.05) con gon (ABCPPIrel = 0.47). Las progenies G, D y los parentales jam y can

no muestraron diferencias significativas entre sí (ABPPIrel = 0.00 – 0.18), pero si fueron

significativamente diferentes a gon. Finalmente se observó que la progenie N y el parental gon

(ABCPPIrel = 0.33-0.47) no fueron significativamente significativamente diferentes diferentes (Pr<0.05) entre sí, pero

fueron significativamente significativamente diferentes (Pr<0.05) a los parentales jam y can (ABCPPIrel= 0.00 – 0.05). Tabla 15. 15. Comparación de las medias del Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans relativa (ABCPPIrel), evaluados en foliolos sueltos de plantas adultas, campaña 2007. Genotipo/Familia

Genealogía Hembra

ABCPPIrel* Macho

C 0.00 0.05 C 0.05 B C G jam 27521.48 gon 0.18 B C D can 310956.8 phu 0.19 B C oka 498063.6 phu 0.20 B E buk 210042.5 phu 0.22 B N H88.31/34 rap 0,33 A B 0.47 A gon DMS 0.17 oka = S. okadae, can = S. canasense , buk = S. bucasovi , jam = S. jamesii, phu = S. phureja, tuberosum gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. tuberosum *Medias con las mismas letras no son significativamente diferentes diferente s entre sí al Pr < 0.05 ABCPPIrel = (ABCPPI)/300= Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans Relativa

jam can phu

Para comprender e interpretar los niveles de resistencia de las progenies se hizo un análisis individual de varianza para cada progenie. Se observaron en el análisis de varianza de la progenie C (oka 498063.6 x phu), diferencias altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos, con un coeficiente de variación (C.V.) de 2.44% y un coeficiente de coincidencia de (R 2) de 84%, parámetros que reflejaron un ajuste apropiado al modelo utilizado para el análisis y los datos mostraron mostraro n que existieron diferentes niveles de resistencia al P. infestans en la progenie (Tabla 16). 57



Ningún punto necrótico o manchas herrumbrosas (0). Signo de alta resistencia en el parental S. jamesii . Mancha

necrótica

o

mancha

dendrítica con 0.1 a 60 % de esporulación. Signo de resistencia parcial en el parental S. phureja

Esporulación de 60.1 a 100%. Signo de extrema susceptibilidad en el progenitor S. goniocalyx.

….

Figura 19. 19. Porcentaje de Intensidad Intensidad de Esporulación (IE) en hojas sueltas sueltas (Foto: Julio Gabriel) Tabla 16. 16. Análisis de de varianza del del ABCPPIrel de la la progenie C (oka 498063.6 x phu). FV Total Genotipos Error C.V. R 2

gl 199 49 150 2.44 0.84

SC 0.71 0.60 0.11

CM

F

Pr > F

0.0007 0.0122

17.15

0.0001

Se observa en la Fig. 20, que en la la progenie C (oka 498063.6 498063.6 x phu) tuvo un 44% de de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.21), un 10% de genotipos moderadamente resistentes resistentes (ABCPPI = 0.21 – 0.35) y un 46% de genotipos susceptibles (0.35 – 0.49). El mayor peso en esta esta progenie fue hacia la resistencia resistencia a P. infestans (54%).

Figura 20. 20. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie C (oka 498063.6 x phu ) 58



En el caso de la progenie D (can 310956.8 x phu), se observa en la Tabla 17, diferencias altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos con C.V. de 4.81% y R 2 de 64%. Estos datos de igual manera que el anterior caso, mostraron un ajuste apropiado al modelo utilizado para el análisis y denotó la existencia de niveles de resistencia a P. infestans entre los genotipos de la progenie D. Tabla 17. 17. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie D (can 310956.8 x phu ). FV Total Genotipos Error C.V. R 2

gl 331 82 249 4.81 0.64

SC 1.94 1.26 0.68

CM

F

Pr > F

0.015 0.002

5.58

0.0001

En la Fig. 21, se observa que en la progenie D (can 310956.8 x phu) hubo 81% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.32), 12% de genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.32 – 0.40) y 6% de genotipos susceptibles (ABCPPIrel = 0.40 – 0.64). El mayor mayor peso en esta esta progenie fue hacia la resistencia resistencia a P. infestans (93%).

Figura 21. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie D (can 310956.8 x phu)

A continuación se muestra la Tabla 18, donde se hace el análisis de varianza para el ABCPPIrel de la progenie E (buk 210042.5 x phu). En la que se mostró diferencias altamente altamente significativas significativas (Pr<0.01) entre entre genotipos de la progenie, progenie, con un C.V. de 4.29% y un R 2 de 80%, similar a los dos anteriores casos (Tabla 18).

59



Tabla 18. Análisis de varianza varianza del ABCPPIrel de de la progenie E (buk 210042.5 210042.5 x phu). FV Total Genotipos Error C.V. R 2

Gl 262 65 197 4.29 0.80

SC 2.17 1.73 0.44

CM

F

Pr > F

0.026 0.002

11.88

0.0001

El análisis de la frecuencia absoluta del ABCPPIrel (Fig. 22), mostró que en la progenie E (buk 210042.5 x phu), existió un 62% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.34), 6% de genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.34 – 0.43) y 32% de genotipos susceptibles (ABCPPIrel = 0.43 – 0.58), lo cual se reflejó en la presencia de un mayor número de genotipos de la progenie con resistencia a P. infestans (68%).

Figura 22. Frecuencia del ABCPPIrel ABCPPIrel en hoja en la progenie progenie E (buk 210042.5 x phu).

En el caso de la progenie G (jam 27521.48 x gon), el análisis de varianza realizado para ABCPPIrel (Tabla 19), mostró diferencias altamente altamente significativas significativas (Pr<0.01) (Pr<0.01) entre genotipos de la progenie G, con C.V. de 5.18% y R 2 de 61%. Cuyo comportamiento es similar a las tres anteriores progenies analizadas, denotándose la existencia de diferentes niveles de resistencia entre los genotipos de la progenie. Tabla 19. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie G (jam 27521.48 x gon). FV Total Genotipos Error C.V. R 2

gl 288 71 217 5.18 0.61

SC 1.75 1.07 0.68

CM

F

Pr > F

0.015 0.003

4.86

0.0001

60



La frecuencia frecuencia absoluta del ABCPPIrel de la familia G (jam (jam 27521.48 x gon) reflejada reflejada en la Fig. 23, mostró el 77% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.26), 12% de genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.26 – 0.35) y 12% de genotipos susceptibles (ABCPPIrel = 0.35 – 0.58). La mayor tendencia de la los genotipos de la progenie fue hacia la resistencia a P. infestans (89%).

Figura 23. Frecuencia del ABCPPIrel ABCPPIrel en hoja en la progenie progenie G (jam 27521.48 x gon).

Finalmente, el análisis de varianza de la progenie N (Tabla 20), mostró diferencias altamente significati significativas vas (Pr<0.01) entre genotipos genotipos de la progenie progenie analizada, analizada, con C.V. de 4.48% y R 2 de 81%. Denotando la existencia de diferentes niveles de resistencia entre los genotipos de la progenie. Tabla 20. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie N (H88.31/34 x rap 636). FV Total Genotipos Error C.V. R 2

gl 287 95 192 4.48 0.81

SC 2.64 2.13 0.51

CM

F

Pr > F

0.003 0.022

8.46

0.0001

61



Analizando la Fig. 24 se observa que en la progenie N (H88.31/34 x rap 636), hubo 40% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.25), 11% genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.25 – 0.34) y 49% de genotipos susceptibles (ABCPPIrel = 0.34 – 0.67). Si bien se observó un 51% de genotipos resistentes, es notorio observar que a diferencia de las otras cuatro progenies analizadas previamente, se observa un mayor porcentaje de genotipos susceptible a P. infestans (51%).

Figura 24. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie N (H88.31/34 x rap 636).

4.1.2. Resistencia a P. infestans en tubérculos Se realizó previamente un análisis de ajuste de normalidad de la severidad de infección de tubérculos tubérculos de de las progenies progenies C, D, E, G y N cuyas distribuciones distribuciones no se ajustan ajustan a curvas normales (Pr<0.05) y sus C.V. oscilan entre 22.19 y 47.90% (Tabla 21). Las progenies C, D, E, G y N (A>0) ( A>0) estaban ligeramente inclinadas inclinadas a la derecha. En referencia al empinamiento empinamiento o altura de la curva, se observó (Tabla 21), que las progenies C, D, E y N fueron platicúrticas (K<3), en cambio la progenie G fue leptocúrtica leptocúrtica (K>3). Tabla 21. 21. Normalidad de la distribución de la severidad de infección (%) en tubérculos. Mom Moments nts

Fam Familia lia C

Fam Familia ilia D

7.34 0.94 47.90 1.57 -0.32 0.0001

42 6.78 0.76 38.43 1.00 0.013 0.0001

N Media Asimetria (A) C.V. Varianza Empinamiento (K) Pr
Fam Familia ilia E 68 12.38 0.59 28.77 1.02 -0.06 0.0001

Fami amilia lia G 68 10.77 3.36 42.63 1.81 4.76 0.0001

Fam Familia lia N 58 11.38 0.22 22.19 0.58 -1.79 0.0001

El análisis de varianza de infección de tubérculos (Tabla 22) mostró diferencias altamente significativas significativas (Pr < 0.05) para para las progenies progenies analizadas, analizadas, con C.V. de 37.27%, 37.27%, lo cual indicaba indicaba 62

58



que existen diferencias de expresión de la resistencia a P. infestans en tubérculos entre los genotipos de las progenies evaluadas. Tabla 22. 22. Análisis de varianza para porcentaje de severidad de infección en tubérculos. Fuentes de variación Total Familia Error C.V. R 2

Grados de libertad 294 4 290 35.18 0.12

Cuadrados medios

Prob< F

12.56 1.168

0.0001

Realizando el análisis de comparación de medias a través de la prueba de Duncan (Tabla 23), se observó que las progenies E, N y G (severidad = 10.77 – 12.38 %) no son significativamente significativamente diferentes diferentes (Pr<0.05) entre sí. De igual igual manera ocurre con las progenies progenies G, C y D (severidad = 6.78 – 7.34%), que tampoco fueron significativamente significativamen te diferentes (Pr < 0.005) entre sí. Sin embargo, es notorio observar que las progenies mencionadas, mostraron diferencia significativas significativas (Pr<0.05) con las progenies E, N y G. Tabla 23. 23. Comparación de las medias de la severidad de infección (%) en tubérculos, campaña 2007. Genotipo/Familia Genotipo/Familia

D C G

N

Genealogía Hembra can 310956.8 oka 498063.6 jam 27521.48

phu phu gon H88.31/34 buk 210042.5 phu

Severidad (%)* Macho

rap

6.78 B 7.34 B 10.77 A

11.28 A

E 12.38 A DMS 2.78 oka = S. okadae, can = S. canasense , buk = S. bucasovi , jam = S. jamesii, phu = S. phureja, S. tuberosum tuberosum (dih tbr) tbr) gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. *Medias con las mismas letras no son significativamente diferentes diferente s entre sí al Pr < 0.05 Para deducir el comportamiento de los niveles de resistencia en tubérculos, a continuación se hace un análisis de las frecuencias absolutas de cada una de las progenies evaluadas. En la Fig. 25 se observa que la progenie C (oka 498063.6 x phu) mostró una frecuencia absoluta de severidad amplia, donde 49% de los genotipos fueron resistentes (severidad = 0.5 – 16.5) y 53% genotipos fueron fueron susceptibles susceptibles (severidad = 16.5 16.5 – 26.5%) a P. infestans. 63



Figura 25. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie C (oka 498063.6 x phu).

En cambio en la progenie D (can 310956.8 x phu) se observó 77% genotipos resistentes (severidad = 0.5 – 16.5%) y 23% genotipos susceptibles (severidad = 16.4 – 21.5%). Mostrando esta progenie un mayor porcentaje de genotipos resistentes resistentes (Fig. 26).

Figura 26. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie D (can 310956.8 x phu).

De igual manera se observa en la Fig. 27 que la progenie E (buk 210042.5 x phu), mostró 67% de genotipos resistentes (severidad = 0.5 – 18.5%) y 33% de genotipos susceptibles susceptibles (Severidad = 18.5 – 30.5%), con una proporción mayor a la resistencia.

64



Figura 27. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie E (buk 210042.5 x phu).

Por otra parte, la progenie progenie G (jam 27521.48 27521.48 x gon) tuvo 89% de genotipos genotipos resistentes resistentes (severidad = 0.5 – 20.5%) y 11% de genotipos susceptibles (severidad = 20.5 – 70.5%). Observándose que esta progenie tuvo la mayor proporción de genotipos resistentes (Fig. 28)

Figura 28. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie G (jam 27521.48 x gon).

Finalmente, observando la frecuencia absoluta de la severidad de infección en tubérculos de la progenie N (H88.31/34 x rap 636), se observa (Fig. 29) que tuvo 71% de genotipos resistentes (severidad = 3.5 – 9.5%) y 29% de genotipos susceptibles (severidad = 15.5 – 18.5%).

65



Figura 29. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie N (H88.31/34 x rap 636).

4.1.3. Correlación de la resistencia entre hoja y tubérculo Se realizó la correlación entre la resistencia de hoja y tubérculo para detectar si existía relación. El análisis realizado (Tabla 24) mostró que en general, en todos los casos de las progenies evaluadas, los coeficientes de correlación de la resistencia en hoja y tubérculo fueron muy bajos y negativos (-0.069 a 0.328) y no hubo diferencias significativas (Pr<0.05). Esto indicó, que no hubo correlación entre la resistencia en hoja, respecto de la resistencia en tubérculo; por lo que se asumió que los genes de resistencia de hoja fueron diferentes a los genes de resistencia en tubérculo. Tabla 24. 24. Correlación de Pearson de la resistencia a P. infestans de hoja y tubérculo en cinco progenies de papa. Severidad (%)

ABCPPI (C)

ABCPPI (D)

ABCPPI (E)

ABCPPI (G)

ABCPPI (N)

-0.069

-0.226

0.328

-0.257

0.071

0.742

0.325

0.298

0.273

0.598

Coeficiente de correlación de Pearson/ Prob > |R| bajo Ho: Rho=0 / N

66



4.3. Análisis de co-localización de SSRs y genes en el mapa poblacional UDH La Tabla 25, describe los resultados de los análisis de co-localización entre los marcadores SSR y las posiciones de los QTL publicados para resistencia a P. infestans. En total, 35 QTL – P.infestans y genes (en negrita) se considera que corresponden a 28 diferentes lugares en los 12 cromosomas de papa. Se examinaron un total de 35 marcadores SSR relacionados que se muestran en la Tabla 25. De esta manera, se ha desarrollado una integración genética y fenotípica en un mapa poblacional UHD, el cual considera todos los loci de QTL publicados hasta ahora. Este mapa se muestra en la Fig. 30 a y b. La Tabla 26 a, b, c y d, muestra los resultados de QTA genotipado para tizón en hoja en cuatro poblaciones mapeadas y la Tabla 27, muestra los resultados de QTA genotipado tizón en tubérculo en tres poblaciones. En estas tablas se muestran los análisis de los diferentes SSRs en los diferentes cromosomas de cada población y su asociación con los diferentes QTLs publicados. La segregación de alelos detectados se indican en sus descendencias (DE), el número de fragmentos observados (FR), el valor del promedio de resistencia para cada clase marcador (presencia vs ausencia), la diferencia entre estas medias (Dif) y la significancia de sus diferencias de acuerdo a la prueba del t-Test al Pr<0.05 de probabilidad. Con respecto al tizón en hoja (Tabla 26), se detectó en la progenie D (can 310.956,8 x phu) un QTL en el cromosoma VIII, que desciende de P2 ( phu). En la progenie E (buk 210042.5 x phu) se detectó cuatro QTLs que se encuentra en los cromosomas III, V, VI y X. Sólo un QTL en el cromosoma III viene de la fuente de resistencia P1 ( buk ). ). En la progenie G (jam 27521.48 x gon) se detectaron tres QTLs seleccionables en los cromosomas III, VI y VII de acuerdo a los valores de significancia. QTAlelos significativos fueron observados en el cromosoma VI para el padre P2 ( gon), y dos lugares para el progenitor ( jam). En la progenie N (H88-31/34 x rap 636) fueron detectados tres QTLs seleccionables que se encuentran en los cromosomas V, VI y VIII. Dos de ellos (en los cromosomas V y VIII) descienden de la fuente de resistencia rap. Varios marcadores SSRs incluidos en la evaluación no mostraron segregación de alelos SSR en todas las poblaciones, de modo que no fue posible evaluar estos lugares genómicos. 67



Tabla 25. Lista de marcadores marcadore s potenciales SSRs que están ligados y/o co-localizados co-localizad os con QTLs para P. infestans en un mapa referencial de papa. Crom I Stm1029 Stm2020a Pi-1 Stm2030

SH 30 32 39 46

RH 13 20 29 35

Crom V Stm1041

PiFTve-5a GP 21

Pi-5a, R1 GP 179

PiFTve-5c PiFTve-5b Crom II Stm5011 Pi-2a Stm0038 Pi-2b Stm1064(2) Pi-2c

SH RH 0 0 7 7 10 10 18 19 73 90 75

Stm0013

Pi-5b Stm1020

SH RH 2 12 13 12 13 15 16 19 19 20 30 30 39 56 56 63

Crom VIII

E-5 STM1056 Rblc E-6 STM1024 STM1005 Pi-8

Crom IX Stm 1102 Stm 1051

Pi-9 Stm 3012 Crom VI

Pi-6a Stm 0019 Stm 1100 Crom rom III III Stm 1054 PI-3b Stm 0040 FB-1, Pi-3a Stm 1025 Pi-3c Pi-3d

SH RH 6 6 5 23 35 30 41 53 55 61 58

FB-6 Pi-6b Stm 1056

Stm1009 Stm0037 Crom rom VII VII

Stm 1003

Pi-7b

R2, Pi-4a2 Stm 1050

Rber

Pi-11

Stm 1065

SH RH 1 1 20 23 23 28 33 35

Crom X Stm 0051

Crom XI

Pi-7a

Crom IV Pi-4a1 Pi-4b Stm 3016

SH RH 3 6 9 59 52 59 61 68 83

Stm 0052

SH RH 34 30 36 72 75

RP-11, Pi-19 Stm0025

SH RH 12 21 21 35 56 37 58 58 92 67 95

SH RH 0 0 4 4 11 11 13

SH RH 45 34 49

SH 7 19 22 66 66

RH 10 19 22 85 85

SH 18 22 70 71

RH 25 30 50 51

67 69 83 Crom XII Stm0007 Stm0030 STM2028

Pi-12

QTLs y genes recopilados de la literatura en negrilla bin = representa un patrón de expresión de un fragmento (presencia/ausencia) en los genotipos de toda la progenie SH = Progenitor Paterno RH = Progenitor Materno

68


Chr I S1

STM1029

STM2020a S32

Pi-1 S38 AGA/TAT_342

STM2030

S95

Chr II

╫ R1 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ R13 ║ ║ ║ ║ ╫ R20 ║ ║ ║ AGA/TAC_315 ╫ R29 ║ ║ ║ ║ R35 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ╫ R101

S1

STM5011 Pi-2a S7 AAG/TCT_129

STM0038 Pi-2b S18 AAG/TTA_449

Pi-2c S90

S97

Chr III

╫ ║ ║ ╫ ║ ╫ ║ ║ ╫ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ╟ ╫ ║ ║ ╫

R1

Chr IV

╫ R1 ║ S6 ╫ R5 ║ AAG/TCC_133 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ Stm 0040 ╟ R23 ║ ║ ║ ║ ║ FB-1, Pi-3a S35 ╫ R30 ╟ ACC/TCC_423 ║ ║ ║ Stm 1025 ╟ R41 ║ ║ Pi-3c ║ S53 ╫ R55 ║ ACG/TAC_218 ║ ║ Pi-3d S61 ╫ R58 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ S100 ╫ R80 S1

PI-3b

R7 AAC/TAT_70

S10/R10

R19 AAG/TAG_45

STM1064(2) R73 R75

R80


Chr V

╫ R1 ║ AAC/TAG_133 ║ ║ ║ ║ ║ ║ Pi-4b ║ Stm 3016 S20 ╫ R23 ║ AAC/TAG_264 ║ ║ R2, Pi-4a2 S28 ╫ R33 ╟ Stm 1050 AAT/TTC_124 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ S91 ╫ R105 S1

Pi-4a1

Chr VI

╫ R1 ║ Stm 1041 ║ ║ PiFTve-5 a ║ GP 21 S12 ╫ R13 ║ ACT/TGC_337 S15 ╫ R16 Pi-5a, R1 ║ ║ GP 179 S19 ╫ R20 PiFTve-5c ║ AAG/TAC_84 ║ ║ ACC/TAT_122 S30 ╫ R30 PiFTve-5b ║ ║ ║ ║ Stm 0013 ╟ R39 ║ ║ ║ ║ ║ Pi-5b ║ AAC/TTG_245 S56 ╫ R56 ║ ║ Stm1020 ╟ R63 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ S77 ╫ R78 S1

╫ R1 ║ S3 ╫ R6 Pi-6 a ║ ╟ Stm 0019 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ FB-6 ║ Stm 1100 S52 ╫ R59 ║ ║ ║ Pi-6b ║ S61 ╫ R68 ║ ACT/TAT_243 ║ S68 ╫ R74 S1

ACT/TCC_136

Stm 1056

Figura 30a Chr VII

S1 ╫ R1

║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ Pi-7 a ╟ ACC/TGC_200 S34 ╫ R30 ║ ║ Stm 1065 ╟ R36 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ Stm 1003 Pi-7b ╟ R67 S75 ╫ R69 ║ AAC/TAA_92 ║ ║ ║ ║ ║ ║

Chr VIII

Chr IX

S1 ╫ R1

║ ║ ║ ║ ACC/TTT_410 S12 ╫ E-5 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ Rblc ║ S35 ╫ S37 ╫ E-6 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ╫ AGA/TGG_264 Pi-8 ║ S67 ╫ ║ S70 ╫

STM1056

R21

R56 R58 STM1024

STM1005

R92 R95 R99

╫ R1 ║ STM1051 ║ R4 ║ AAC/TAG_70 S11 ╫ R11 Pi-9 ╟ R13 ║ Stm 3012 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ S84 ╫ R84 STM1102

Ch r X

S1 ╫ R1

║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ Stm 0051 ╟ R45 Rber ╟ ACT/TAA_611 S34 ╫ R49 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ S71 ╫ R102

Ch r X I

S1 ╫ R1

║ Pi-11 ║ ACC/TCC_239 S7 ╫ R10 ║ ║ ║ ║ ║ S19 ╫ STM1009 ║ S22 ╫ STM0037 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ AAC/TAC_146 RP-11, Pi-19 ║ STM0025 S66 ╫ R85 S67 ╫ R86 AAG/TCG_500

Chr X II

S1 ╫ R1

║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ STM0007 ╫ R25 ║ ║ STM0030 ╫ R30 ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ ║ STM2028 Pi-12 ║ ACC/TGA_160 S72 ╫ R51

Figura 30b Figura 30 a y b . Mapa de ligamiento integrado de los 12 cromosomas del mapa UDH mostrando todos los QTL/genes de resistencia a P. infestans publicados y los correspondientes marcadores SSRs para selección molecular asistida. SSRs en color amarillo fueron probados inicialmente, SSRs en color naranja fueron probados posteriormente

69



Tabla 26. Resultados de QTA genotyping para resistencia a P.infestans en hoja en cuatro poblaciones mapeadas a) Genotipado de QTA en la progenie D (can x phu) Crom

SSR

QTL

I I

STM1029 STM2020a

Pi-1 Pi-1

I II II II III III

STM2030 STM5011 STM0038

Pi2a Pi2b

STM1064 STM1054 STM0040

Pi2c Pi3b FB-1, Pi-3a

III IV IV

STM1025 STM3016

Pi3c,d Pi-4a1,4b

STM1050

R2,Pi-4a2

V

STM1041

PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c

V

STM0013

PiFTve-5b

V VI

STM1020 STM0019

Pi-5b Pi-6a

VI

STM1100

FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII

STM0052

Pi7b

VIII VIII

STM1056 STM1024

E-5 Rblc, E-6

VIII

STM1005

Pi-8

IX IX IX X

XI XI XI XII XII XII

STM1102 STM1051 STM3012 STM1051

Pi-9 Pi-9 Rber

STM1009 (via BS2) STM0037 STM0025

Pi-11

RP-11,Pi-19

STM0007 STM0030 STM2028

Pi-12

DE

FR

V1

V0

Dif

Prob

P2

1

57,46

58,45

-0,98

94,3

P1 P1

1 2

61,70 57,21

56,76 61,42

4,94 -4,21

71,2 75,4

P1

1

54,64

65,82

-11,18

42,6

P1

2

65,82

54,64

11,18

42,6

P2 P2 P1 P2 P2

1 2 1 2 3

63,82 53,09 60,65 55,66 53,02

53,09 63,82 47,23 53,09 55,66

10,73 -10,73 13,42 2,57 -2,63

43,5 43,5 34,6 85,2 85,2

P1 C P1 C P2 C

2 3 4 1 1

66,97 51,16 60,95 56,02 62,56

51,04 66,97 56,02 60,95 50,65

15,94 -15,81 4,93 -4,93 11,91

24,0 23,5 73,4 73,4 37,6

2

57,08

60,94

-3,86

81,4

P1 P1 P2 P1

1 2 3 1

56,11 58,99 58,99 57,36

58,99 56,11 57,37 61,33

-2,88 2,88 1,62 -3,97

83,9 83,9 90,4 77,0

P2

2

54,74

77,25

-22,51

4,7

P2 P1 C P1

1 2 3 1

P2

2

51,17 53,42 58,48 45.1 53.7

66,57 65,98 70,38 66.1 64.9

-15,40 -12,56 -11,90 20.0 11.2

27,0 37,3 56,0 14,8 20,8

P2 C

1 2

64,50 58,77

56,51 59,92

7,99 -1,15

57,9 94,0

70



b) Genotipado Genotipado de QTA en la progenie progenie E (buk x phu) Crom

SSR

QTL

I I I II II

STM1029 STM2020a

Pi-1 Pi-1

STM2030 STM5011 STM0038

Pi2a Pi2b

II III III

STM1064 STM1054 STM0040


III IV IV

STM1025 STM3016 STM1050

Pi3c,d Pi-4a1,4b R2,Pi-4a2

V V

STM1041 STM0013

PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c, PiFTve-5b

DE

FR

V1

V0

Dif

Prob

C P1

1 2

No evaluado 72,42 104,23 93,13 63,09

C P1

1 2

67,89 97,19

88,24 51,70 No evaluado No evaluado

-20,35 45,49

32,9 1,0

P1 P1

1 1

87,80 74,44

72,23 79,14

15,56 -4,70

37,4 79,2

C

4

76,66

78,36

-1,70

93,9

C

2

88,86

58,67

30,19

8,9

P2

3

61,47

97,02

-35,55

4,0

P2 P2 P1 P1 P1 P1 P2

1 2 3 4 1 2 3

103,09 62,72 66,63 96,57 66,75 88,85 66,67

62,72 103,09 96,57 66,63 83,53 63,75 81,38

40,37 -40,37 -29,94 29,94 -16,78 25,10 -14,71

1,8 1,8 8,3 8,3 36,6 18,0 44,6

C P2

81,02 82,79 83,68

88,19 81,52 76,62

-7,17 1,28 7,05

77,9 94,5 68,9

-31,81 30,04

10,8 8,5

V VI

STM1020 STM0019

Pi-5b Pi-6a

VI

STM1100

FB-6

VI VII VII

STM1056a STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII VIII VIII

STM0052 STM1056b STM1024

Pi7b E-5 Rblc, E-6

P2

1 2 1

C P2

1 2

83,28 80,66

76,77 80,48

6,51 0,19

71,4 99,2

VIII

STM1005

Pi-8

P2

1

84,46

76,09

8,37

64,5

P2

2

80,22

80,96

-0,74

96,8

C P2

1 3

69,58 107,49

114,99 63,66

-45,41 43,83

P1

2

83,84

74,33

9,52

3,1 1,4 59,2

IX IX IX

STM1102 STM1051 STM3012

Pi-9

X

STM0051

Rber

XI XI

STM1009 STM0037

Pi-11 Pi-11

XI

STM0025

RP-11,Pi-19

XII XII XII

STM0007 STM0030 STM2028

Pi-12

71



c) Genotipado Genotipado de QTA en la progenie progenie G (jam x gon) Crom

SSR

QTL

I I I II II

STM1029 STM2020a STM2030 STM5011 STM0038

Pi-1 Pi-1

II III III

STM1064 STM1054 STM0040


III

STM1025

Pi3c,d

Pi2a Pi2b

DE

FR

V1

V0

C P1 C

Dif

Prob

1 2 1

55,17 47,93 51,40

42,82 56,12 54,15

12,35 -8,19 -2,74

46,7 54,8 84,7

P1 P2 P1 P2

1 2 1

56,28 56,91 38,50

44,37 47,79 61,30

11,91 9,12 -22,80

2

61,71

45,57

16,14

36,4 46,8 4,5 24,0

IV

STM3016

Pi-4a1,4b

IV

STM1050

R2,Pi-4a2

V

STM1041

PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c

P2

1

50,15

58,56

-8,41

56,5

V

STM0013

PiFTve-5b

P2

1

55,26

51,78

3,48

78,9

P2

2

49,48

56,97

-7,48

54,8

P1

3

50,79

59,47

-8,68

54,2

C

4

50,53

58,94

-8,41

53,7

C P1 P2 P2 C

1 2 3 1 2

55,51 55,53 49,74 37,48 51,92

49,40 50,71 67,02 77,02 51,69

6,11 4,82 -17,28 -39,54 0,23

64,9 71,0 28,0 0,3 98,8

P1 P2 C

1 2 3

46,83 48,98 58,07

80,82 55,40 41,70

-34,00 -6,42 16,37

4,4 63,7 19,8

P1 P2 P1 P2

1 2 3 4

41,78 49,91 56,64 54,45

56,64 54,45 41,78 49,91

-14,86 -4,54 14,86 4,54

36,9 71,8 36,9 71,8

C P1 P2 P2

1 2 3

57,00 43,19 51,56

44,89 58,64 59,64

12,11 -15,45 -8,08

39,0 25,1 65,8

4

54,53

51,56

2,97

86,4

C

1 2

54,32 50,73

47,87 54,26

6,45 -3,53

61,9 78,1

V VI

STM1020 STM0019

Pi-5b Pi-6a

VI

STM1100

FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi-7b

VII VIII VIII


Pi7b E-5 Rblc, E-6

VIII

STM1005

Pi-8

IX IX

STM1102 STM1051

IX X

STM3012 STM0051

Pi-9 Rber

P2 XI XI XI XII XII XII

STM2009 STM0037 STM0025 STM0007 STM0030 STM2028

Pi-11 Pi-11 RP-11,Pi-19

Pi-12

72



d) Genotipado Genotipado de QTA en la progenie progenie N (H88-31/34 (H88-31/34 x rap) Cro Crom

SSR SSR

QTL QTL

Pi-1 Pi-1

I II II


II

STM1064

Pi2c

I I

Pi2a Pi2b

DE

FR

V1

V0

Dif Dif

P2 P1 P1 P2 C

1 2 1 3

99,9 92,3 63,5 103,9

74,8 95,8 81,4 104,0

25,1 -3,5 -17,9 -0,1

32,8 87,4 33,1 99,6

2

111,8

81,0

30,8

21,4

-3,0 -46,9 27,5 35,8

91,9 3,5 22,9 11,3

98,1 80,6

8,3 45,9

72,8 4,7

No se evaluó 110,8 154,4 113,9 116,4 113,8 89,8 93,4 99,5

-43,6 -2,5 24,0 -6,1

38,9 93,6 37,8 80,1

87,3 63,1

-1,7 46,2

94,6 4,9

102,9 98,6 No se evaluó No se evaluó

4,3

85,2

III III III IV IV V

STM1054 STM0040

Pi3b FB-1, Pi-3a

STM1025 STM3016

Pi3c,d Pi-4a1,4b

No se evaluó No se evaluó

STM1050 STM1041

R2,Pi-4a2 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c

V

STM0013

PiFTve-5b

No se evaluó 96,8 99,8 66,8 113,7 121,8 94,3 126,1 90,3

V VI VI

STM1020 STM0019 STM1100

Pi-5b Pi-6a FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII

STM0052

Pi7b

VIII VIII

STM1056 STM1024

E-5 Rblc, E-6

VIII IX IX IX

STM1005 STM1102 STM1051

Pi-8

STM3012

Pi-9

X XI XI XI XII XII


Rber Pi-11 Pi-11 RP-11,Pi-19

XII

STM2028

Pi-12

P1 P2 P2 P1

1 3 1 2

C P1

1 2

C

1 2 1 2

P1 P2

4 2

C P1 C

106,4 116,5

85,6 109,3

Prob

No se evaluó

P2

1

Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR: Número de fragmentos; V1, V0: Característica para la clase de marcador presente, ausente de un alelo respectivamente; Dif: diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de significancia [%] en negrilla; SSR marcado en gris muestra que no hubo segregación.

73



Con respecto al tizón en tubérculo (Tabla 27 a, b, c), se detectó en la progenie D (can 310956.8 x phu) tres QTLs en los cromosomas cromosomas VII, VIII y XI. Sólo un alelo alelo del cromosoma cromosoma XI proviene del progenitor P1 ( can). El QTL en el cromosoma XI se deriva indirectamente indirectamente de cDNA fragmento BS2, que se encuentra cerca de STM1009 en el mapa UHD. En la progenie G (jam 27521.48 x gon) fueron detectados cuatro QTLs seleccionables en los cromosomas cromosomas III, V, VI y X. El locus del cromosoma III mostró efectos significativo significativoss para los alelos de ambos progenitores. También el locus del cromosoma V proveniente de la fuente de resistencia jam. En la familia N (H88-31/34 x rap 636), sólo se detectó un QTL para P.infestans tizón en tubérculo y se detectó que desciende de P1 (H88-31/34) y se encuentra en cromosoma VI. 4.4. Resúmen de los resultados del QTA genotyping genotipados del tizón de hoja y La Tabla 27, resume y compara los resultados de QTA genotipados tubérculos en diferentes poblaciones poblaciones mapeadas. mapeadas. Como puede verse en esta esta tabla, varios QTL son comunes a dos bases genéticas en las progenies G y N a pesar de que descienden de padres diferentes. Sin embargo, se observa QTLs no comunes en cuatro poblaciones. En algunos casos los QTLs también son comunes para la resistencia en tubérculo y hoja en la misma población como en las progenies G, D y N. Mientras que muchos de ellos son específicos para los distintos órganos de la planta como se observó también en las progenies G, D y N.

74



Tabla 27. Resultados del QTA genotyping para Resistencia en tubérculos para tizón en tres poblaciones mapeadas a) QTA genotyping en la progenie D (can x phu). Crom

SSR

QTL

I I I II II II III III

STM1029 STM2020a STM2030 STM5011 STM0038 STM1064 STM1054 STM0040

Pi-1 Pi-1

III IV IV V V

STM1025 STM3016 STM1050 STM1041 STM0013

Pi3c,d Pi-4a1,4b R2,Pi-4a2 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c PiFTve-5b

V VI

STM1020 STM0019

Pi-5b Pi-6a

VI

STM1100

FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII

STM0052

Pi7b

VIII VIII

STM1056 STM1024

E-5 Rblc, E-6

VIII

STM1005

Pi-8

IX IX IX X

STM1102 STM1051 STM3012 STM1051

Pi-9 Pi-9 Rber

XI XI XI

STM1009 (via BS2) STM0037 STM0025

RP-11,Pi-19

XII XII XII

STM0007 STM0030 STM2028

Pi-12

Pi2a Pi2b Pi2c Pi3b FB-1, Pi-3a

Pi-11

DE

FR

V1

V0

Dif

Prob

P2

1

7,9

5,5

2,4

30,7

P1 P1

1 2

5,5 7,6

7,6 5,5

-2,1 2,1

39,1 39,1

P1 P1

1 2

6,3 8,8

8,8 6,3

-2,5 2,5

32,0 32,0

P2 P2 P1 P2 P2

1 2 1 2 3

7,4 6,2 6,6 6,1 7,9

6,2 7,4 7,2 7,9 6,1

1,2 -1,2 -0,6 -1,8 1,8

66,0 66,0 84,6 52,4 52,4

P1 C P1 P2 P2 C

2 3 4 1 1 2

7,6 5,7 7,9 15,3 7,8 4,8 6,3 14,0 5,2 9,1 9,8 5,2

1,9 -7,4 3,0 -7,7 -3,9 4,6

44,1 11,6 21,4 5,0 16,0 31,4

P1 P1 P2 P2 C

1 2 3 1 2

7,0 6,2 6,2 7,0 7,0 6,2 4,6 10,2 8,2 10,3

0,8 -0,8 0,8 -5,6 -2,1

73,5 73,5 73,5 4,8 57,5

P2 P1 C P1 P2

1 2 3

5,6 7,0 13,9 11,4 13,9

6,2 4,3 7,4 4,2 5,1

-0,6 2,7 6,5 7,2 8,8

81,7 25,2 11,5 3,5 4,0

1 2

3,7 9,4

7,0 8,0

-3,3 1,4

18,7 63,8

P2 C

1/3 2/4

75



b) QTA genotyping en la familia G (jam x gon). Crom Crom

SSR SSR

QTL QTL

I I I II II


Pi-1 Pi-1

II III III

STM1064 STM1054 STM0040


III

STM1025

Pi3c,d

IV IV V V

STM3016 STM1050 STM1041 STM0013

Pi-4a1,4b R2,Pi-4a2 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c PiFTve-5b

V VI

STM1020 STM0019

Pi-5b Pi-6a

VI

STM1100

FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII VIII VIII


Pi7b E-5 Rblc, E-6

VIII

STM1005

Pi-8

IX IX IX X

STM1102 STM1051 STM3012 STM0051

Pi-9 Rber

XI XI XI XII XII XII


Pi2a Pi2b

DE

FR

V1

V0

Dif Dif

Prob Prob

C P1 C

1 2 1

7,9 9,8 9,8

15,3 9,0 5,2

-7 - 7,4 0,8 4,6

40,4 81,9 31,4

P1 P2 P1 P2

1 11,1 2 11,9 1 14,1 2 5,4

8,1 7,1 4,9 11,8

3,0 4,8 9,2 -6,4

43,9 29,1 2,0 4,7

P2 P2 P2 P1 C

1 9,8 1 7,2 2 11,0 3 15,3 4 13,9

4,4 12,3 7,6 7,2 7,3

5,4 -5 - 5,1 3,4 8,1 6,6

27,8 33,1 48,1 4,3 11,5

C P1 P2 P2 C

1 6,3 2 7,1 3 10,9 1 10,8 2 9,4

14,0 11,1 3,1 5,6 8,0

-7 - 7,7 -4 - 4,0 7,8 5,2 1,4

11,5 30,3 4,6 12,2 63,8

P1 P2 C

1 2 3

4,4 8,7 8,2

9,8 9,7 10,3

-5 -5,4 -1 -1,0 -2 - 2,1

42,0 82,4 57,5

P1 P2 P1 P2 C P1 P2 P2

1 5,5 2 6,8 3 9,9 4 10,7 1 8,0 2 8,4 3 9,8 4 6,2

9,9 10,7 55,0 6,8 11,2 9,8 7,2 9,8

-4 -4,4 -3 - 3,9 -45,1 3,9 -3 - 3,2 -1 -1,4 2,6 -3 -3,6

33,9 23,0 33,9 23,0 51,0 72,4 69,9 54,1

C P2

1 8,3 2 11,1

10,2 5,2

-1 - 1,9 5,9

68,7 4,1

Pi-11 Pi-11 RP-11,Pi-19 Pi-12

76



c) QTA genotyping en la familia N (H88-31/34 x rap). Crom Crom

SSR SSR

QTL QTL

I I I II II


Pi-1 Pi-1

II

STM1064

Pi2c

III III III IV IV V


Pi3b FB-1, Pi-3a Pi3c,d Pi-4a1,4b R2,Pi-4a2 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c

V

STM0013

PiFTve-5b

V VI VI

STM1020 STM0019 STM1100

Pi-5b Pi-6a FB-6

VI VII VII

STM1056 STM1065 STM1003

PI-6b Pi-7a Pi7b

VII

STM0052

Pi7b

VIII VIII

STM1056 STM1024

E-5 Rblc, E-6

Pi2a Pi2b

DE

P2 P1 P1 P2 C

FR

1 2 1 3 2

P1 P2 P2 P1

1 3 1 2

C P1

1 2

C P1 C C

1 2 1 2

P1 P2

4 2

V1

V0

No se evaluó 6,0 6,6 6,3 6,0 5,3 5,2 6,3 5,8 6,3 5,5 No se evaluó No se evaluó No se evaluó No se evaluó 6,5 6,2 6,7 6,0 5,7 6,5 6,4 5,9 6,6 6,7

6,1 5,6

No se evaluó 6,4 6,2 6,4 6,4 5,9 6,4 6,4 6,2 6,2 5,3

5,6 6,3

Dif Dif

Prob Prob

-0,6 0,3 0,1 0,5 0,8

30,8 61,3 96,2 44,0 20,2

0,3 0,7 -0,8 0,5

70,6 29,0 20,0 37,4

0,5 1,1

47,6 4,9

0,2 0,0 -0,5 0,2

85,6 92,1 43,3 76,0

0,6 -1,0

42,3 14,5

Pi-8 VIII STM1005 STM1102 No se evaluó IX IX STM1051 STM3012 Pi-9 No se evaluó IX STM0051 Rber 1 6,0 6,2 -0,2 61,0 X P2 STM1009 Pi-11 No se evaluó XI STM0037 Pi-11 No se evaluó XI XI STM0025 RP-11,Pi-19 STM0007 XII XII STM0030 STM2028 Pi-12 No se evaluó XII Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR: Número de fragmentos; V1, V0: Característica para la clase de marcador presente, ausente de un alelo respectivamente; Dif: diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de significancia [%] en negrilla; SSR marcado en gris muestra que no hubo segregación.

77

Aplicación de marcadores marcadores moleculares moleculares para el cribado de QTLs en diferentes diferentes fuentes de resistencia resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa

Julio Luis Gabriel Ortega

Tabla 28. Resumen de QTA genotipados genotipados para Resistencia Resistencia a P. infestans (follaje + tuberculos) tuberculos) en cuatro cuatro diferentes diferentes poblaciones poblaciones Progenie: Crom

SSR

QTL

III III

STM0040 STM1025

FB-1, Pi-3a Pi3c,d

V V VI

STM1041 STM0013 STM0019

PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c PiFTve-5b Pi-6a

VI VII

STM1100 STM1003

FB-6 Pi7b

VIII VIII X

STM1024 STM1005 STM0051

Rblc, E-6 Pi-8 Rber

XI XI

E (buk x phu) G (jam x gon) D (can x phu) N (dih tbr x rap) hojas hojas tubérculos hojas tubérculos hojas tubérculos DE fr Prob DE D E fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob P1 2 1,0 P1 1 4,5 P1 1 2,0 P2 2 4,7 P2 P2 P2 P2

3 1 2

4,0 1,8 1,8

P1 P2 P2 P1

1 1

3 3

P1 2

0,3 4,4 P2

1

5,0

4,7 P2

1

4.8

P2 P2 C P2

1 3

3,1 1,4

3

P2 2

3.5

4,3 4,6

2

2

4,7 P1

2

4,9

4,9

4,1

STM1009 Pi-11 Protein BS2

P1 1/3 3,5 P2 2/4 4,0 Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR: Número de fragmentos; Prob: nivel de significancia [%]

78



4.5. Análisis de genes candidato y otros marcadores La Tabla 29 resume los resultados obtenidos en la utilización de los genes candidato y otros marcadores moleculares descritos descritos en la Tabla 4. Tabla 29. 29. Resultados de los marcadores y genes candidato analizados. Marcador

Productos de amplificación

Selección al azar

Digestión

Segregación

X

X

No aplica

No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico

Genes candidato basados en PCR Hin -1 X

X

No aplica

X

No aplica

No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico

X

X

SSR STM 5121

Protein Phosphatase – 2C

X

Marcadores derivados de AFLPs (CAP) E46M42.g X Genes Candidato (CAP)




4.5. Análisis de genes candidato y otros marcadores La Tabla 29 resume los resultados obtenidos en la utilización de los genes candidato y otros marcadores moleculares descritos descritos en la Tabla 4. Tabla 29. 29. Resultados de los marcadores y genes candidato analizados. Marcador

Productos de amplificación

Selección al azar

Digestión

Segregación

X

X

No aplica


Genes candidato basados en PCR Hin -1 X

X

No aplica

X

No aplica

No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico

Marcadores derivados de AFLPs (CAP) E46M42.g X

X

X

Genes Candidato (CAP) GP125

X

X

SSR STM 5121

Protein Phosphatase – 2C

X

X


No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico NL25 X X X No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico NL27 X X X No hubo polimorfismo, se observó que el marcador fue monomórfico Gen candidato obtenido por por expresión diferencial obtenido por cDNAs y Microarrays Protein BS2 X X No aplica Si hubo polimorfismo (TC148920)

En el caso del CAP GP125 se observó una banda clara a los 1000 bp. Con el CAP E46M42.g se observó una banda clara a los 179 bp. Trujillo (2004), observó que el marcador CAP e46m42g estaba a 196 bp. El CAP NL27 mostró una banda a 1000 bp, pero no en todos los genotipos. El CAP NL25 mostró una banda a los 850 bp de altura. Una vez realizado la digestión de todos los marcadores que mostraban una banda de interés en la progenie, está no evidenció ninguna segregación de alelos que indicaran la presencia del gen de interés para resistencia a P. infestans. Se observaron dos bandas que confirman la condición homocigotica de la progenie N , esto significa que los marcadores 79



CAPs probados fueron monomórficos para esta población. Trujillo (2004), encontró dos bandas al aplicar el marcador CAP e46m42g en phu, revelando su condición homocigótica. También se realizó la PCR para los marcadores CAP NL27 y NL25 en las progenies D, E y G, pero no hubo amplificación. amplificación. Por otra parte, en el caso del gen candidato candidato proveniente de de cDNA y microarrays, microarrays, el marcador MA8 (BS2), se observó que los productos de amplificación segregaban en las progenies (SEG), dando polimorfismos polimorfismos en las progenies D, E, G y N. En varios casos no hubo productos de amplifacación (NA) y en varios los productos fueron monomórficos (NS). Este es el caso del 34 K PORIN (MA4) y de marcador MA11 (putativo Acetil CoA deshidrogenasa) en el mapa UHD. El precursor patatin (MA1) segregado en la progenie G MA11 y el segregado en la progenie E. La proteína de resistencia a enfermedades BS2 (MA8) segregó en todos casos estudiados (Tabla 30). Table 30. Evaluación de poliformismo de genes candidato derivado del análisis de cDNAs y microarrays en progenies fenotipadas para resistencia a P. infestans. Código Marcador MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 MA7 MA8 MA9 MA10

Gen

Polimorfismo UHD PrD PrE PrG Pr PrN Precursor putativo sucrosa –no-inducible S. brevidens -NS NS SEG NS Proteina putativa de Resistencia a enfermedades RPR1 -NA NA NA NA Proteina transportadora Ubiquitina 4 -NA NS NA NA 34K porin – papa (S. tuberosum) NS NS NS NS SEG Proteinas específicas serina/tronina-kinasa -NS NS NS NS -NA NA NA NA Proteina resistente a enfermedades Prf – tomate Proteina putativo acompañante de cobre Putative (CCH) -NS NS NS NS SEG SEG SEG SEG SEG SE SEG Proteina resistente a enfermedades enfermedades BS2 Putative disease resistance protein I2 -NA NA NA NA myb-relacionado con la transcripción del factor THM18 - -NS NS NS NS tomate MA11 Putativo acyl-CoA dehydrogenasa NS -SEG NS SEG MA13 Proteina resistente a tizón tardío NS NS NS NS NS PrD PrE PrG PrN = Progenies, NS = No segrega, NA = No Amplifica, SEG = Segrega

Respecto al tizón de hoja no se observó efecto de las bandas de los padres del gen candidato MA1 (patatin precursor). El gen candidato protein BS2, mostró polimorfismo en la progenie D, segregando dos productos de amplificación, uno de cada uno de los padres, que puso de manifiesto marcadas diferencias en los niveles de resistencia a P. infestans entre sus estados alélicos, pero sin significación estadística (Tabla 31a). Los resultados de asociación con el mapa poblacional ultradenso indicaron que este cDNA se asocia con el QTL Pi-11 en 80



el cromosoma XI. Este gen candidato no mostró efectos significativos al Pr<0,05 de probabilidad para P. infestans en la resistencia de hoja en la progenie N y D, así como el gen candidato MA1 en la progenie G. Sin embargo, con respecto a la resistencia en tubérculos se ha detectado en la misma población D efectos significativos al Pr<0,05 del gen BS2 para el alelo de P2 ( phu) (Tabla 31b). El mismo efecto se observó en la resistencia de hoja para el alelo de P2 ( phu) del gen BS2 en E y para la resistencia en tubérculo para el alelo de P1 ( dih tub) en la progenie N. Estos resultados confirman la importancia de este gen de resistencia conocida. Tabla 31. 31. Evaluación de genes candidato proteín BS2 (TC148920) derivado del análisis de cDNAs y microarrays en progenies fenotipadas para resistencia a P. infestans. a. P. infestans en hoja Marcador

Gen

MA1 – P2 Patati Patatinn precur precursor sor MA8 – P1 Resistencia a enfermedades protein BS2 (TC148920) MA8 – P2 Resistencia a enfermedades MA8 – P1 protein BS2 (TC148920) MA8 – P2 Resistencia a enfermedades protein BS2 (TC148920) protein protein BS2 (TC148920) (TC148920) MA8 – P2 MA8 – P1 Resistencia a enfermedades Protein BS2 (TC148920) MA11–P2 Putative acyl-CoA dehydrogenase

Progenie

V1

G D

51.3 51.3 45.1

D

43.7

Dif

Prob

QTL asociado

Crom

52.8 52.8 1.5 66.1 20.0

89.4% 89.4% 14.8%

--Pi-11

---XI

64.9 21.2 20.8% Pi-11 XI 86.3 74.0 12.3 58.5% Pi-11 XI 62.4 62.4 105. 105.00 42.6 42.6 2.4% Pi-11 XI

E E N N

V0

92.0 103.7 11.7 99.9 97.8 2.1

E

63.9% 94.1%

86.6

76.2

10.4

55.6%

V1

V0

Dif

Prob

13.9

5.1

8.8

4.0%

Pi-11 Pi-11 ----

XI XI ---

Continuación Tabla 31... b. P.infestans en tubérculo Marcador Gen MA8 – P1 Resistencia a nfermedades Protein BS2 (TC148920) MA8 – P2 Resistencia a enfermedades Protein BS2 (TC148920) MA8 – P2 Resistencia a enfermedades Protein BS2 (TC148920) MA8 – P1 Resistencia a enfermedades Protein BS2 (TC148920)

Progenie

QTL Crom asociado

D D

N

6.1

6.0

0.1

89.8%

N

6.9

5.1

1.8 4.8%

Pi-11

XI

Pi-11 Pi-11

XI XI

Leyendas: Crom: cromosoma; Característica para la clase de marcador presente, ausente de un alelo respectivamente; Dif: Diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de significancia [%] en negrilla

81



5. Discusión 82



En el presente estudio se analizaron y genotiparon progenies provenientes de cruzamientos entre especies silvestres diploides ( can, buk, jam y rap) y diploides cultivadas phu, gon

y un dih tbr .

Hemos encontrado en todas las progenies una elevada variación de la resistencia tanto en hoja como en tubérculo a P. infestans, como prerrequisito prerrequisito para poder encontrar encontrar QTLs. La correlación entre resistencia resistencia en hoja y resistencia resistencia en tubérculo fueron fueron bajos, negativos (-0.069 a 0.328) y no significativos. Esto indicó que probablemente los genes de resistencia a P. infestans

en hoja y tubérculo fueron diferentes. Estos resultados concuerdan con lo

reportado por Collins et al. (1999), que observaron una correlación negativa de la resistencia a P. infestans entre ambos órganos, en una población segregantes diploide de papa.

Se han descrito QTLs para la resistencia a P. infestans en los 12 cromosomas de papa, parte de ellos validados validados por varios autores. Los marcadores marcadores SSRs establecidos establecidos por Milbourne et al.

(1998), permitieron asociar los marcadores SSRs para todos los loci. La proyección de

los marcadores SSRs a QTLs conocidos permite reducir los esfuerzos en el análisis de las características en un nuevo entorno genético. Todas las posiciones conocidas pueden ser analizadas para detectar la presencia de un QTL, determinando solamente la estrecha vinculación del marcador SSR en una nueva población. Se ha analizado estas posiciones de QTLs por la presencia de QTAlelos diferenciados en cuatro diferentes progenies y se han detectado QTLs seleccionables para resistencia de hoja y tubérculo en todos los experimentos. De esta manera se ha creado una "impresión genotípica genotípica " de cada uno de los parentales (QTA genotipado), indicando posiciones de QTLs seleccionables y los correspondientes marcadores para selección asistida por marcadores moleculares (SAM) en los diferentes entornos genéticos. La progenie C (oka x phu) no fue posible genotiparla, pero si se estudió su resistencia a P. infestans,

por considerársela una fuente valiosa de resistencia a éste patógeno tanto en hoja

como en tubérculo. Cabe mencionar que oka es una especie silvestre diploide tuberífera, que está distribuida distribuida entre Bolivia Bolivia y Argentina (Ochoa (Ochoa 2001, Patiño et al. 2007, García et al. 2007. Coca 2007, Saffarano et al. 2008). Se encontró en el presente estudio que los genotipos de la progenie C mostraron buenos niveles de resistencia a P. infestan en hoja, confirmando lo que afirman algunos investigadores como Barquero et al. (2005), que encontraron en genotipos 83



provenientes de las hibridaciones somáticas y/o cruces con las especies silvestres S. bulbocastanum, S. circaeifolium

y S. okadae, niveles altos de resistencia a P. infestans. De

igual manera Brigneti et al. (2004), han logrado encontrar niveles altos de resistencia en S. bulbocastanum, S. brachistotrichum, S. mochiquense, S. berthaultii, S. microdontum. S . okadae

y S. neorossii y han logrado el mapeo de poblaciones para la mayoría de las

resistencias y el mapeo de genes R en las especies mencionadas. Sin embargo, no se ha encontrado antecedentes de evaluaciones de resistencia en tubérculos en la especie oka y tampoco en híbridos somáticos y/o en cruzamientos. En el caso de la progenie D (can x phu), se observó una mayor proporción de genotipos resistentes que en la progenie C, denotando altos niveles de resistencia en la progenie evaluada. S. canasense es una especie silvestre diploide ampliamente distribuida en Perú y Bolivia, (Ochoa 2001). Esta especie ha sido descrita como valiosa fuente de resistencia a Streptomyses scabies et al.

(Hosaka et al. 2000), al nematodo-quiste ( Globodera pallida) (Castelli

2006) e insectos. insectos. Hawkes (1991), reportó que can es una especie resistente a P.

infestans.

El genotipado de la progenie D detectó un QTL en el cromosoma VIII (Pi-8). Este

QTL fue descrito por Oberhagemann et al. (1999) en un estudio de cinco familias, obtenido del cruzamiento entre siete diferentes clones diploides de papa y Trognitz et al. (2002), lo reportó en un estudio de una población diploide de phu x dih tbr y probablemente un QTL localizado en el cromosoma X (Rber), que fue descrito por Collins et al. (1999), en una población segregante de papa diploide. A nivel de resistencia en tubérculo se detectaron cuatro QTLs en los cromosomas VII (Pi7b), VIII (Pi-8), XI (Pi-11), que provienen de can y phu.

La presencia de estos QTLs QTLs fueron reportados reportados por Oberhagemann Oberhagemann et al. (1999), Collins

et al.

(1999) y Leonards-Schippers et al. (1994). Es importante resaltar que en el presente

estudio el QTL del cromosoma XI (Pi-11) fue detectado via un gen candidato BS2. Una interesante fuente de resistencia a P. infestans ha sido la utilización de la especie silvestre diploide S. bukasovii (progenie E), en el programa programa de mejora genética de papa. Esta especie se distribuye principalmente entre Bolivia y Argentina (Ochoa 2001, Spooner et al. 1994, García et al. 2007, Patiño et al. 2007) y ha sido descrita como resistente a P. infestans por Hawkes (1991). En el presente presente estudio se se encontró que es posible posible transferir transferir genes de resistencia a P. infestans de buk a las cultivadas. En la progenie E, también se encontró altos niveles de resistencia a P. infestans en tubérculos. En esta progenie se detectaron cuatro QTLs seleccionables en los cromosomas III (Pi3c,d), V (PiTFve-5b), VI (Pi-6a) y X (Rber), que 84



provienen de buk . Resultados similares fueron reportados por Oberhagemann et al. (1999) y Collins et al. (1999), que describieron la presencia de estos QTLs. En la progenie G (jam x gon), hay una predominancia de genotipos con alta resistencia a P. infestans,

en follaje y en tubérculo, esto sugiere probablemente la presencia de genes R.

Solanum jamessi

es una especie que está distribuida entre México y Estados Unidos y ha sido

reportada como tolerante a helada (Hijman et al. 2003). El genotipado de la progenie G, se detectaron tres QTL seleccionables seleccionables en los cromosomas III (FB-1, Pi-3a), VI (FB-6) y VII (Pi7b). Los QTAlelos significativos fueron observados en los cromosomas VI para gon y dos lugares para jam. Estos resultados confirman lo reportado por Collins et al. (1999) y Oberhagemann et al. (1999). Un aporte importante del genotipado de la progenie ha sido el relacionarlo con la resistencia a P. infestans en tubérculos, en la que se detectaron QTL seleccionables seleccionables en los cromosomas cromosomas III (Pi-3c,d), V (PiFTve-5b), (PiFTve-5b), VI (Pi-6a) y X (Rber). El El locus del cromosoma III mostró efectos significativos de los alelos de los parentales jam y phu. También el locus del cromosoma V fue significativo para el parental jam.

En la progenie N (dih tbr x rap), fueron detectados tres QTLs seleccionables que se encuentran en los cromosomas V (PiFTve-5a, (PiFTve-5a, Pi5a, R1, PiFTve-5c), VI (FB-6) y VIII Rblc, E-6. Dos de ellos (en los cromosomas V y VIII) descienden de rap y una del dih tbr (VI). Sólo se detectó un un QTL para tizón en tubérculo tubérculo en cromosoma VI (FB-6) y que proviene proviene del dih tbr y no así de rap. S. raphanifolium es una especie principalmente distribuida en Perú y se considera que es un híbrido natural entre S. canasense y S. megistacrolobum, lo cual fue mencionado por Ugent en 1970, y confirmado en un estudio por Spooner et al. (2001). Pérez et al.

(2002), reportaron a rap como una especie con alta resistencia a P. infestans, y con

presencia de resistencia cuantitativa y cualitativa. Posteriormente Wulff et al. (2003), encontraron dos especies silvestres promisorias por su resistencia a P. infestans (S. raphanifolium y S. megistacrolobum).

La diferencia en los QTLs seleccionables para P. infestans en cada progenie analizada refleja la “no correlación” de la resistencia a P. infestans en ambos órganos. Al respecto Oberhagemann et al. (1999), observaron que plantas con alelos en el QTL del cromosoma V, mostraron incremento de la resistencia a P. infestans en hoja, pero hubo decrecimiento en la resistencia en tubérculo.

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Es importante resaltar que nosotros sólo podemos diferenciar QTL seleccionables. Esto requiere que tanto el marcador sea polimórfico, como que la configuración alélica del QTL sea apropiada. Se debe enfatizar que lo que se mide son diferencias entre mezclas de genotipos y diferencias de efectos de alelos probables en cada parental: q1/q2 x q3/q4 = [(q1q3 + q1q4)] – [(q2q3 + q2q4)], los efectos entre q1 y q2 tienen que ser diferentes más las posibles interacciones desconocidas. El QTL (gen que influye en el carácter) estará en todo caso, pero no es detectable (configuración alélica desconocida) ni se conocen sus efectos. Respecto al segundo requisito que el marcador indirecto tiene que ser polimórfico, hemos visto que esto no se cumple en muchos casos. Por ejemplo no hemos podido evaluar QTLs en los genotipos genotipos en los cromosomas I, IV, IX y XII de las progenies D, E, G y N, debido debido a que varios SSRs no segregaban en ninguna familia. Por otra parte aunque los SSRs en principio funcionan en diferentes entornos de la misma región genómica, puede desaparecer su polimorfismo si por ejemplo el nuevo parental es homocigoto para el alelo, esto hace que no haya segregación. En el estudio se utilizaron novedosas fuentes de resistencia genética a P. infestans como fueron las especies silvestres diploides (2n = 2x =24) can, oka, buk, rap y las diploides cultivadas phu, gon y dih tbr . Las especies silvestres tienen altos niveles de resistencia a P. infestans

que pueden ser transferidos a sus progenies; sin embargo, la primera generación

filial que producen no son aptas para obtención de nuevas variedades por selección en campo, por lo que será necesario que las progenies obtenidas sean evaluadas y seleccionadas por resistencia a P. infestans en primera instancia y los individuos más aptos podrían entrar en un programa de retrocruzamientos sucesivos hacia tbr y/o adg. Este proceso de retrocruzamiento retrocru zamiento y selección se hace tedioso cuando se deben evaluar muchas progenies, por lo que es en estos momentos cuando la SAM podría tener su aplicación práctica e importante, ya que permitiría en corto tiempo seleccionar de manera segura los genotipos que llevan el carácter de interés. De ahí que en el presente trabajo, se han validado numerosos marcadores moleculares SSRs y genes candidato, que fueron utilizados en otros diferentes entornos genéticos. Sin 86



embargo, con este estudio se ha podido detectar que varios de estos marcadores son válidos y podrían ayudar a la SAM, a pesar de haberse obtenido en entonos genéticos genéticos particulares. Es de resaltar que existen marcadores marcadore s indirectos y directos. En los marcadores indirectos hay ciertas distancias distancias entre el marcador y un gen de interés y puede haber recombinaciones. recombinaciones. A este tipo de marcadores pertenecen los SSRs que son muy polimórficos pero se pueden también seleccionar “falsos alelos”, debido a las recombinaciones. Esto requiere aumentar el número de SSRs disponibles. En cambio, los marcadores directos permiten la identificación directa de los alelos de un gen de interés y se pueden aplicar independientes del entorno genético, son normalmente derivados de regiones codificantes (coding regions) como ESTs, TDFs, utilizando diferentes técnicas moleculares. Los genes candidato son interesantes en este sentido, pero tienen la desventaja de que no son tan polimórficos que los SSRs. Así por ejemplo, nosotros evaluamos CAPs en cuatro progenies, en los cuales no observamos polimorfismo. polimorfismo. Aun cuando se observaron amplificaciones de la PCR con los marcadores CAPs utilizados; sin embargo, no se observó polimorfismo luego de la digestión con enzimas. Esto no implica que los CAPs no funcionen, sino que es probable que en el entorno genético que se evaluó no haya habido reacciones, pero será conveniente seguir afinando el método en otros entornos genéticos para ir saturando los cromosomas donde se hallan posiciones de QTL publicados en el mapa UHD para resistencia a P. infestans. Estos marcadores probablemente se pueden aplicar en los programas de mejora genética de papa para todos los cruzamientos que involucren el genotipo parental correspondiente como fuente de resistencia. La utilización de cualquier marcador para SAM de caracteres monogénicos resulta más sencillo, pero no deja de ser un trabajo arduo, debido a que se debe poner inicialmente a punto las técnicas, encontrando sus temperaturas de anillamiento apropiadas y ver si genera polimorfismo en las poblaciones genotipadas, lo cual lleva tiempo, recurso y trabajo, Esto requiere la automatización del proceso. Por otra parte, existen varias aplicaciones prácticas para genes candidatos detectados como análisis de su diversidad alélica, transformación genética o referencias cruzadas a través de la integración en mapas de ligamiento. Los estudios de diversidad alélica en diferentes 87



germoplasmas puede permitir asociar variantes alélicas específicas con un genotipo particular detectar los alelos más efectivos y de esta manera proporcionar marcadores útiles para la selección asistida (SAM). La referencia cruzada a mapas de ligamiento permite integrar los resultados de diferentes estudios mediante el diseño de cebadores apropiados para mapeo. Si un cDNA particular se integra en el mapa muy cercano a un QTL conocido, entonces dicho TDF puede potencialmente potencialmente explicar explicar el QTL. Así por ejemplo, Hernández et al. (2008) obtuvieron polimorfismos segregantes en el caso de BS2 (TC148920). Este cDNA pudo ser mapeado en un mapa de referencia de papa en el cromosoma XI y fue co-localizado con el QTL Pi-11b. Se observó que este cDNA cDNA segregó en la progenie progenie D (can x phu), y representa el mismo QTL para P. infestans en el cromosoma XI. Sin embargo, un gen ligado puede ser el verdadero responsable del efecto efecto del QTL. Por lo que será necesario necesario en el futuro realizar experimentos de silenciación para verificar la función. Si el gen candidato representara un falso positivo, al menos podría ser utilizado como un marcador de un alelo específico para SAM. Finalmente, las proteínas derivadas de los genes candidato que muestran una eficacia probada contra patógenos, se pueden producir en sistemas de recombinación adecuados para su aplicación como biopesticidas.

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6. Conclusiones

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1. Las progenies provenientes de los cruzamientos entre especies silvestres y cultivadas mostraron una amplia variabilidad frente a la resistencia para P. infestans en hoja y tubérculo. 2. No se ha encontrado correlación significativa entre la resistencia en hoja y tubérculo para este patógeno en las familias generadas en los cruzamientos. 3. La no existencia de correlación se refleja en la detección de diferentes QTLs en hoja y tubérculo. 4. Se ha realizado la integración genética y fenotípica en un mapa poblacional UHD de todos los loci de QTL publicados hasta la fecha. 5. En la progenie D se ha detectado un QTL de resistencia a P. infestans en el cromosoma VIII que proviene de Solanum phureja, lo que muestra que esta especie posee genes de resistencia cuantitativa. 6.

En la progenie E se detectaron cuatro QTLs de resistencia a P. infestans en los cromosomas III, V, VI y X, que provienen de S. phureja y uno en el cromosoma III, del parental S. bukasovii, lo que muestra que ambos parentales son fuentes valiosas de resistencia a P. infestans.

7. En la progenie G, se han detectado dos QTL seleccionables seleccionables en los cromosomas III, y VII, provenientes del parental S. jamessii y un QTL de resistencia a P. infestans en el cromosoma VI de S. goniocalyx, lo cual confirma a S. jamessi como una fuente potencial de resistencia a esta enfermedad. 8. En la población N fueron detectados tres QTLs seleccionables en los cromosomas V, VI y VIII; dos de ellos (en los cromosomas V y VIII) descienden del parental S. raphanifolium,

lo que mostró que ésta última especie se podría utilizar como otro

germoplasma de resistencia a P. infestans. 9. Varios marcadores SSRs utilizados no mostraron segregación de alelos SSR en todas las poblaciones, lo que puede indicar que aunque en principio los SSRs funcionan en diferentes entornos de la misma región genómica puede desaparecer su polimorfismo si el parental es homocigoto para el alelo, lo que hace que no haya segregación. 10. Para tubérculo en la progenie D se han detectado tres QTLs seleccionables en los cromosomas VII, VIII y XI que provienen de S. phureja, lo que confirma a esta especie como una fuente de resistencia en tubérculo para este patógeno. 90



11. En la progenie G, fueron detectados cuatro QTls seleccionables en los cromosomas III, V, VI y X. Dos de ellos (cromosomas III y V) provienen del parental S. jamesii y otros dos (cromosomas VI y XI) de S. goniocalyx. Esto puede indicar que ambos parentales son nuevas fuentes de resistencia. 12. En la progenie N se detectó un QTL en el cromosoma VI que provino del progenitor dihaploide S. tuberosum, lo que mostró que S. raphanifolium, no transfiere genes de interés a la progenie para resistencia a P. infestans. 13. Los QTAs genotipados de tizón de hoja y tubérculo mostraron QTLs comunes a dos bases genéticas en las progenies G y N a pesar de que descienden de parentales diferentes. Se han detectado también QTLs no comunes en cuatro poblaciones. En algunos casos los QTLs también fueron comunes para la resistencia en tubérculo y hoja en la misma población, como en la progenie G, D y N, mientras que muchos de ellos son específicos para los distintos órganos de la planta como las progenies G, D y N. Esto indica que probablemente varios genes de resistencia a P. infestans son comunes en las diferentes especies para resistencia en hoja y tubérculo y que otros solamente lo son para uno u otro órgano. 14. Los marcadores CAPs no mostraron segregación en la progenie N, lo cual indica que fueron monomórficos y la progenie probablemente estaba en fase homocigótica. 15. El QTL del cromosoma XI (Pi-11) fue detectado via un gen candidato BS2, lo cual podría ser útil como un marcador de un alelo específico para la selección asistida.

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7. Referencias 92



Agrios, N.G. 1991. Fitopatología. Fitopatología. 2 ed. Trad. del Inglés por Manuel Guzmán Ortiz. Limusa, Limusa, México. 756 pp. Andrade H y Revelo J. 1994. Breve diagnóstico de la Problemática del cultivo de la papa con énfasis en Resistencia a Enfermedades. p. 79-83 L.H.M. Broers (Ed.) in Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos. Memorias del 1er taller sobre Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos. 30 de mayo–3 de junio de 1994. Quito, Ecuador. Bamberg JB, Martin MW and Schartneret JJ. 1994. Elite selections of tuber-bearing Solanum germplasm. Madison, Wisconsin: University of Wisconsin Press. Barone A, Ritter E, Schachtschabel U, Debener T, Salamini F and Gebhardt C. 1990. Localization by restriction fragment length polymorphism mapping in potato of a mayor dominant gene conferring resistance to the potato cyst nematodo Globodera rostochiensis. Mol Gen Genet 224: 177-182. Barquero M, Gómez L y Brenes A. 2005. Resistencia a tizón tardío ( Phytophthora infestans) en clones promisorios de papa en Costa Rica. Agronomía Costarricense 29(3): 31-45. Bojanic A. 1995. Sondeo sobre demanda nacional de semilla de papa para el sector formal y su pertinencia para la UPS-SEPA. Informe. I nforme. Cooperación Técnica Suiza. La Paz, Bolivia. Bonierbale M, Plaisted Plaisted RL and Tanksley Tanksley SD. 1988. RFLP maps based on a common common set of clones reveal modes of chromosomal evolution in potato and tomato. Genetics 120: 10951103. Bonierbale M, de Haan S and Forbes A. 2008. Procedures for Standard evaluation trials of advanced potato clones in An Internacional Coopertators’ Guide. Internacional Potato Center, Lima-Perú. 124 p. Bormann C, Rickert A, Castillo-Ruiz R, Paal J, Lübeck J, Strahwald J, Buhr K. and Gebhardt C. 2004. Tagging Quantitative Trait Loci for Maturity-Corrected Late Blight Resistance in Tetraploid Potato with PCR-Based Candidate Gene Markers. MPMI. 17: 1126-1138. Brasier CM. and Hansen EM. 1992. Evolutionary biology of Phytophthora. Part II: Phylogeny, Speciatión and Populatión Structure. Annual review of Phytopatholoy 30: 153-171. Brigneti G, García-Mas J and Baulcombe DC. 1997. Molecular mapping of the potato virus Y resistance locus Rysto in potato. Theor Appl Genet 94: 198-203. Brigneti G, Smilde WD, Martin-Hernandez AM, Perkins S, Jones J. 2004. Natural resistance against phytophthora infestans in wild diploid solanum species. Plant & Animal Genomes XII Conference, January 10-14, Town & Country Convention Center, San Diego, CA (Poster). Campbell CL and Madden LV. 1990. Introduction to plant disease epidemiology. Wiley, NY. Caromel B, Mugniery D, Lefebvre V, Andrzejewski Andrzejewski S, Ellisseche D, Kerlan MC, Rousselle P and Rousselle-Bourgeois F. 2003. Mapping QTLs for resistance against Globodera pallida (Stone) Pa2/3 in a diploid potato progeny originating from Solanum spegazzinii . Theor Appl Genet 106: 1517-1523.

93



Castelli L, Bryan G, Blok VG, Ramsay G, Sobczak M, Gillespie T, Phillips MS. 2006. Investigations of Globodera pallida invasion and syncytia formation within roots of the susceptible potato cultivar Désirée and resistant species Solanum canasense . Nematology 1 (8): 103-110. Coca M and Montealegre N. 2006. Short communication. Resistance to Phytophthora infestans in populations of wild potato species in the Sorata microcentre of genetic diversity, La Paz, Bolivia. Spanish J. of Agric. Res. 4(2), 156-160 Coca M. 2007. Peligro de extinción de especies raras de papas silvestres de Bolivia Ecología en Bolivia 42(1): 72-76. Collins A, Milbourne D, Ramsay L, Meyer R, Chatot-Balandras C, Oberhagemann P, De Jong W, Gebhardt C, Bonnel E and Waugh R. 1999. QTL for field resistance to late blight in potato are strongly correlated with maturity and vigour. Molecular Breeding 5 (5): 387-398. Colon LT and Budding DJ. 1988. Resistance to potato late blight ( Phytophthora infestans) in ten wild Solanum species. Euphytica S: 77-86. Colon LT, Pieters MMJ and Budding DJ. 1992. Resistance for management of potato late blight. Page 25-29 in Rousselle-Bourgeois and Rousselle (Eds.). Proceeding of Joint Conference of the EAPR Breeding and Varietal Assessement Section and the EUCARPIA Potato Section. Landernau, France, 12-17 January. Colon LT, Eijlander R, Budding DJ, van Ejzendoon MT, Pieters MMJ and Hoogendoon. 1993. Resistance to potato late blight ( Phytophthora infestans (Mont.) De Bary) in Solanum nigrum, S. villosum and their sexual hybrids with S. tuberosum and S. demissum. Euphytica 66: 55-64. Colque C. 1996. Caracterización Caracteriz ación de genes de virulencia en poblaciones de Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, que infectan a la papa y determinación de la resistencia en Solanum spp. Tesis Ing. Agr. Universidad Mayor de San Simón. Cochabamba, Bolivia 223 p. Contreras A. 2008. Uso de especies silvestres y cultivadas en mejoramiento de la papa cultivada. Páginas 23-30 in E. Ritter y JI Ruiz de Galarreta (eds): Avances en ciencia y desarrollo de la patata para una agricultura sostenible. III Congreso Iberoamericano Patata 2008. 5 al 10 de octubre, Vitoria-Gasteiz, Euskadi, España. Daly JM. 1984. The role of recognition in plant disease. Ann Rev. Phytopathol. 22: 273-307. De Jong W, Forsyth A, Leister D, Gebhardt C and Baulcombe DC. 1997. A potato hypersensitive resistance gene against potato virus X maps to a resistance gene cluster on chromosome 5. Theor Appl Genet 95: 246-252. Debener T, Salamini F and Gebhardt C. 1990. Phylogeny of wild and cultivated Solanum species based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). Theor Appl Genet 79: 360-368. Dick MW. 1990. Phylum Oomycota. In Handbook of Protista. Ed. L. Margullis, J.O. Corliss, M. Melkonion, D.J. Chapmon. P. 661-685. Boston & Bartlett. 914 p. Egúsquiza R. 1987. Botánica, Taxonomía y Mejoramiento genético genético de papa. Páginas 11-36 in El cultivo de papa con énfasis en la producción de semilla. Universidad Nacional Agraria. La Molina Perú. 94



Egúquiza R. 1994. Resistencia Genética Duradera en el Cultivo de la papa en el Perú. p 8993 en: L.H.M. Broers (Ed.); Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos, Memorias del 1er taller sobre Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos. 30 de mayo–3 de junio de 1994. Quito, Ecuador. El-Kharbotly A, Leonards-Schippers C, Huigen DJ, Jacobsen E, Pereira A, Stiekema WJ, Salamini F and Gebhardt C. 1994. Segregation analysis and RFLP mapping of the R1 and R3 alleles conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans in progeny of dihaploid potato parents. Mol Gen Genet 242: 749-754. El-Kharbotly AC. Palomino-Sánchez and F. Salamini. 1996. R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theor Appl Genet 92: 880884. Engel KH. 1964. Methoden der kartoffelzüchtung unter besonderer Berücksichtigung der Selektionsverfahren Selektionsverfahren auf Leistung. Züchter 34: 235-242. Estrada N. 1991. Especies silvestres de la papa y los cultivares nativos de importancia en el mejoramiento genético de la papa in Conferencia de la XIV reunión de la ALAP, Lima, Perú. 26 pp. Estrada N. 1884 a. Acaphu: a tetraploid, fertile breeding line, selected from S. acule x S. phureja cross. Am. Pot. J. 61:1-8. Estrada N. 1884 b. Taxonomía y mejoramiento de la papa in Manual sobre manejo de germoplasma de papa. Documento de capacitación. Centro Internacional de la Papa, Lima, Perú pp. 43-48. Estrada N. 1990. 1990. Híbridos triploides triploides derivados derivados de Solanum stoloniferum Schlechid el Beché y su valor en el mejoramiento de la papa. Revista Latinoamericana de la Papa 3:80-87. Estrada N y Gabriel J. 1991. Utilización de Solanum bulbocastanum en el mejoramiento de la papa. XIV Reunión ALAP, sept. 8-14, Lima, Perú. Estrada N, Fernández-Northcote Fernández-Northcote E, Carrasco Carrasco E y Navia O. 1994. 1994. Mejoramiento Genético Genético para Resistencia a Enfermedades y plagas de la papa en Bolivia. Páginas 86-89 in L.H.M. Broers (Ed.) en: Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos, Memorias del 1er taller sobre Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos. 30 de mayo–3 de junio de 1994. Quito, Ecuador. Estrada N. 2000. La Biodiversidad Biodiversid ad en el Mejoramiento Mejoramien to Genético de la papa. Bill Hardy, Emma Martínez (Ed.) La Paz, Bolivia. 372 p. Ewing EE, Simko I, Smart CD, Bonierbale MB and Mizubuti ESG. 2000. Genetic mapping from field tests of quantitative and qualitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Mol Breed 6: 2536. FAO. 2004. (Faostat) Food and Agriculture Organization of the United Nations Statistical Databases (FAO) (http://faostat.fao.org (http://faostat.fao.org;; 25/04/2004). Forbes G. 1994. Producción de papas papas con resistencia resistencia a Phytophthora infestans Páginas 7278 in Memorias del primer taller sobre resistencia resistencia duradera: Cultivos Andinos de Bolivia, Colombia, Ecuador Ecuador y Perú. 30 de mayo – 3 de junio de 1994. 1994. Quito, Ecuador. Ecuador.

95



Fernández-Northcote E, Navia O, Gandarillas A. 1999. Bases de las estrategias de control químico del tizón tardío de la papa desarrolladas por PROINPA en Bolivia. Revista Latinoamericana Latinoamericana de la Papa 1 (11): 1- 25. Flor H.H. 1971. Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol Phytopathol . 9:275296. French ER y Hebert TT. 1982. Métodos de investigación Fitopatológica. Instituto Interamericano Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA). San Jose, Costa Rica. 279 p. Fry WE, Goodwin SB, Tooley PW, Sujkowski LS, Koh YJ, Cohen BA, Spielman LJ, Deahl KL, Inglis DA and Sandlan KP. 1993. Historical and Recent Migrations of Phytophthora infestans: Chronology, Pathways, Pathways, and Implications Implications.. Plant Disease. Disease. July 1993. 1993. 77 (7): 653-659. Gabriel DW, Loschke DC and Rolfe BG. 1988. Gene-for-gene recognition; The ion channel defense model. In: R. Palacios and D.P.S. Verma (Eds.). Molecular Genetics of Plants; Microbe Interaction. APS Press, St. Paul, Minnesota. pp. 3-13. Gabriel J. 1994. Resistencia de Híbridos Interespecíficos Interespecíf icos de Papa al tizón tardío (Phytophthora infestans (Mont) De Bary, su caracterizaci caracterización ón citologica. citologica. Tesis MSc Especialista en Genética. Colegio de Post Graduados. Instituto de Recursos Genéticos y Productividad. Productividad. Montecillo, México. 89 p. Gabriel J, Castillo Castillo F, Sosa – Moss C y Rivera-Peña Rivera-Peña A. 1995. Resistencia Resistencia de híbridos interespecíficos de papa resistentes al tizón tardío ( Phytophthora infestans (Mont.) De Bary). Revista de Agricultura 26: 38-40. Gabriel J y Carrasco E. 1998. Evaluación Preliminar de la Resistencia Durable al tizón Phytophthora infestans en Cultivos Nativos de Papa del Banco de Germoplasma Boliviano. p 153-158 in Daniel L. Danial y Oswaldo Chicaiza (Ed.) Segundo Taller de PREDUZA en Resistencia Duradera en cultivos Altos en la Zona Andina. 22-24 Septiembre de 1998. Cochabamba, Bolivia. Gabriel J, Carrasco E, García García W, Equize H, Thiele Thiele G, Torrez R, Ortuño N, Navia O, Franco J y Estrada N. 2001. Experiencias y logros sobre mejoramiento convencional y selección participativa de cultivares de papa en Bolivia. Revista Latinoamericana de la Papa 12:169-192. Gabriel J, Coca A, Plata G & Parlevliet JE. 2007. Characterization of the resistance to Phytophthora infestans in local potato cultivars in Bolivia. Euphytica 153:321-328. García C. 1997. A propósito de la introducción de aislamientos de Phytophthora infestans para investigación en Colombia. Agronomía Colombiana Colombiana 14 (2) 154-157. García W, Spooner Spooner D, Gabriel J, Gandarillas Gandarillas A. 2007. Riqueza genética de los Andes de Bolivia: Especies silvestres de papa, su utilización y bases para la conservación in situ. Revista de Agricultura 39: 8-13. Gebhardt C, Blomendahl C, Schachtschabel U, Debener T, SalaminiF and Ritter E. 1989a. Identification of 2n breeding lines and 4n varieties of potato ( Solanum tuberosum, ssp. tuberosum) with RFLP fingerprints. Theor Appl Genet 78: 16-22. Gebhardt C, Ritter E, Debener T, Schachtschabel U, Walkemeier B, Uhrig H, Salamini F. 1989b. RFLP analysis and linkage mapping in Solanum tuberosum. Theor App Genet 78: 65- 75. 96



Gebhardt C, Ritter E, Barone A, Debener T, Walkemeier B, Schachtschabel Schachtschabel U, Kaufmann H , Thompson RD, M Bonierbale, Ganal M, Tanksley SD and Salamini F. 1991. RFLP maps of potato and their alignment with the homeologous tomato genome. Theor Appl Genet 83: 49-57. Gebhardt C, Mugniery D, Ritter E, Salamini F and Bonnel E. 1993. Identification of RFLP markers closely linked to the H1 gene conferring resistance to Globodera rostochiensis in potato. Theor Appl Genet 85: 541-544. Gebhardt C, Schäefer-Pregl R, Oberhagemann P, Chen X, Chalot-Balandras C, Ritter E, Concilio L, Bonnel E, Hesselbach J, Salamini F. 1999. Function Maps of potato. EBPN, Proceedings of Phytosphere 99. Gebhardt C. and JPT. Valkonen 2001. Organization of genes controling disease resistance in the potato genome. Annu Rev Phytopathol 39: 79-102. Geldermann H. 1975 Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers. I. Methods. Theor Appl Genet 46: 319-330. Ghislain M, B. Trognitz · Herrera Ma del R, Solis J, Casallo G, Vásquez C, Hurtado O, Castillo R, Portal L, Orrillo M. 2001. Genetic loci associated with field resistance to late blight in offspring of Solanum phurejaand S. tuberosumgrown under short-day conditions. Theor Appl Genet 103:433–442. Ghislain M, Spooner DM, Rodriguez F, Villamón F, Nuñez J, Vasquez C, Waugh R and Bonierbale M. 2004. Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato. Theor Appl Genet 108: 881-890. Glendining DR. 1975. Neotuberosum: Neotuberos um: new potato breeding material. Potato Res. 18:256261; 343-350; 50:351-362. Gonzáles D, Gabriel J, Carrasco E. 1999. Aptitud Aptitud combinatoria general y específica para la resistencia al tizón [ Phytophthora infestans (Mont.) de Bary] en progenitores elite de papa. Páginas 130-139 in Daniel Danial (Ed.). Tercer Taller de PREDUZA en Resistencia Resistencia Duradera en cultivos Altoandinos. 27-29 sept., Cochabamba, Bolivia. Gonzales G, Trujillo G, Portal L, Carbajulca D, Herrera R, Bartolini I, Guzman F, Nuñez J, Mihovilovich E, Munive S, Forbes A, Simon R, Kreuze H, Ghislain M, Bonierbale M. 2007. Criteria for markers selection from CIP markers database. (Unpublished). Görg R, Schachtschabel Schachtschabel U, Ritter E, Salamini F and Gebhardt C. 1992. Discrimination among 136 Tetraploid potato varieties by fingerprints using highly polymorphic DNA markers. Crop Science 32: 815-819. Grun P, Ochoa C and Capage D. 1977. Evolution of cytoplasmic factors in tetraploid cultivated cultivated potatoes (Solanaceae) Amer J Bot 64: 412-420. Hämäläinen JH, Watanabe KN, Valkonen, AriharaA, Plaisted RL, Pehu E, Miller L and Slack SA. 1997 Mapping and marker-assisted selection for a gene for extreme resistance to potato virus Y. Theor Appl Genet 94: 192-197. Hawkes JG. 1979. Evolution and polyploidy in potato species. En: Hawkes, J.G. (eds.). The biology and taxonomy of the Solanaceae. Linnean Soc Symp Ser. 7. 637-649. Hawkes JG. 1990. The potato, Evolution, Biodiversity and Genetic Resources. London: Belhaven. Hawkes J. 1991. The Potato: Evolution, Biodiversity and Genetic Resources. Belhaven Press, UK. 97



Henfling J W. 1987. El Tizón Tardío de la papa Phytophthora infestans. 2ª ed. Revisada. Boletín de Información Técnica Técnica 4. Centro Internacional Internacional de la Papa. Lima, Perú. Perú. 25 p. Hernández M, Ruiz de Galarreta JI, Ritter E. 2008. Detección de genes candidato de resistencia a Phytophthora infestans, mediante técnicas de expresión diferencial; cDNAAFLP y microarrays. Páginas 115-119 in E. Ritter y JI Ruiz de Galarreta (eds): Avances en ciencia y desarrollo de la patata para una agricultura sostenible. III Congreso Iberoamericano Iberoamericano Patata 2008. 5 al 10 de octubre, Vitoria-Gasteiz, Euskadi, Euskadi, España. Hidalgo N, Cuesta X, Garcés S, Revelo J y Oyarzún P. 1998. Componentes de resistencia a Phytophthora infestans en progenitores de papa en Ecuador. Páginas 147 -150 in Daniel Danial y Oswaldo Chicaiza (Eds.), II Taller de PREDUZA en resistencia duradera en cultivos altoandinos. Cochabamba, Bolivia, septiembre 22-24, 1998. Hijmans RJ, Jacobs M, Bamberg Bamberg JB & Spooner DM. DM. 2003. Frost tolerance tolerance in wild potato potato species: Assessing the predictivity of taxonomic, geographic, and ecological factors. Euphytica 130: 47–59. Hooker WJ. 1980. Compendio de enfermedades de la papa. Nematodos parásitos de la papa. Centro Internacional de la Papa (CIP). Lima. Perú. p. 131-134. Horton D. 1992. La Papa. Producción, Comercialización y Programas. CIP, Lima y Hemisferio Sur, Montevideo, Uruguay. Hosaka K, Matsunaga H and Senda K. 2000. Evaluation of several wild tuber-bearing Solanum species for scab resistance. Amer J of Potato Res 77: 41-47. http://arneson.cornell.edu. http://www.cipotato.org/potato/pests_diseases/late_blight/ Isidore E, H. van Os, S. Andrzejewski, J. Bakker, I. Barrena, G. J. Bryan, B. Caromel, H. van Eck, B. Ghareeb, W. de Jong, P. van Koert, V. Lefebvre, D. Milbourne, E. Ritter, J. R. van der Voort, F. Rousselle-Bourgeois, J. van Vliet, and R. Waugh.(2003). Toward a Marker-Dense Meiotic Map of the Potato Genome: Lessons From Linkage Group I Genetics,165(4): Genetics,165(4): 2107 - 2116. Jansen RC and Stam P. 1994. High resolution of quantitative traits into multiple loci via interval mapping. Genetics 136: 1447-1455. Jansky SH. 2000. Breeding for disease resistance in potato. Plant Breed Rev. 19 : 69 - 155 Junchaya G. 1983. Phytophthora infestans en la Zona central del Perú: Rango de Hospedantes Variabilidad y Resistencia Varietal. Tesis M.Sc. Fitopatología Lima, Perú 211 p. Kapsa J. 2007. Effect of climatic conditions on infection pressure of Phytophthora infestans and harmfulness of the pathogen to potato crops. Journal of Plant Protection Research 4 (47): 357-366. Keen NT. 1982. Specific recognition in gene-for- gene host- parasitic system. In: D.D. Ingram and P.H. Williams (Eds.). Advances in Plant Pathology. Vol 1. Academic Press, London. pp. 35-82. Király Z, Irsek T, Barna A, Adam A and Gullner G. 1991. Pathophysiological Pathophysiological aspect of plant plant disease resistance. Acta Phytopathologica and Entomologica Hungarica 26 (3-4): 233250. Knapp SJ, Bridges WC and Birkes D. 1990. Mapping quantitative trait loci using molecular marker linkage maps. Theoretical and Applied Genetics 79: 583-592. 98



Konieczny A and Ausbel FM. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutation using codominant ecotype-specific PCR-based markers Plant. J. 4: 403-410. Kreike CM, de Koning JRA, Vinke JH, van Oijen JW and. Stiekema WJ. 1994. Quantitatively inherited resistance to Globodera pallida is dominated by one mayor locus in Solanum spegazzinii. Theor Appl Genet 88: 764-769. Landeo J. Gatelo M, Zapata J y Flores F. 1998. Cuantificación de la Resistencia Horizontal al Tizón Tardío Tardío de la papa en la población población del CIP. Páginas Páginas 54-55 in XVIII Reunión ALAP (Asociación Latino Americana de la papa). 9- 13 de febrero de 1998. Cochabamba, Bolivia. Lander ES and Botstein D. 1989. Mapping mendelian mendelian factors underlying underlying quantitative quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-199. Leonards-Schippers C, Gieffers W, Schäfer-Pregl R, Ritter E, Knapp SJ, Salamini F and Gebhardt C. 1994. Quantitative resistance to Phytophthora infestans in potato: a case study for QTL mapping in an allogamous plant species. Genetics 137: 67-77. Li X, van Eck HJ, Rouppe van der Voort JNAM, Huigen DJ, Stam P, Jacobsen E. 1998. Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theor Appl Genet 96: 1121-1128. Manosalva P, Torres S, Trognitz F, Gysin R, Niño-Liu D, Simon R, Herrera M, Pérez W, Landeo J, Trognitz B, Ghislain M, and Nelson R. 2001. Plant defense genes associated with quantitative resistance to potato late blight. Pages 27-38 in Scientist and Farmer: Partners in Research for the 21st Century. International Potato Center, Program Report 1999-2000. International Potato Center, Lima, Peru. Marczewski W, Flis B, Syller J, Schafer-Pregl R. and Gebhardt C. 2001. A major quantitative trait locus for resistance to Potato leafroll virus is located in a resistance hotspot on potato chromosome XI and is tightly linked to N-gene-like markers. Mol. Plant-Microbe Interact. 14:1420-1425. 14:1420-1425. Martinez O and Curnow RN. 1992. Estimating the locations and the sizes of the effects of quantitative quantitative trait loci using flanking mapping. Heredity 73: 198-206. Martínez-Garza A. 1988. Diseños experimentales: métodos y elementos de teoría. Trillas, México D.F., México. México. 756 p. Menendez CM, Ritter Ritter E, Schäfer-Pregl R, Walkemeier Walkemeier B, Kalde A, Salamini Salamini F and Gebhardt C. 2002. Cold Sweetening in Diploid Potato: Mapping Quantitative Trait Loci and Candidate Genes. Genetics 162: 1423-1434. Milbourne DRC. Meyer AJ, Collins LD, Ramsay C. Gebhardt and R.Waugh. 1998. Isolation, characterisation and mapping of simple sequence repeat loci in potato. Mol Gen Genet 259: 233-245. Naess SK, Bradeen JM, Wielgus SM, Haberlach GT, McGrath JM and Helgeson JP. 2000. Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor Appl Genet 101: 697-704. Navia O y Fernández-Northcote Fernández-Northcote E. 1996. Manejo Integrado del tizón (MIP- TIZON). TIZON). Programa de Investigación de la Papa (PROINPA). Fitopatología ficha técnica 4: 1-4. Navia O, Torrez R, Trujillo A, Fernández-Northcote E, Gandarillas A and Gabriel J. 2002. Bolivia Late Blight Profile. Páginas 1-11 in Enrique Fernandez-Northcote (Ed.), 99



Memorias del Taller Internacional: Complementando la resistencia al tizón (Phytophthora infestans) en los Andes. GILB, Cochabamba, Cochabamba, Bolivia. Niks RE y Lindhout WH. 1999. Curso sobre Mejoramiento Mejoramiento para Resistencia a Enfermedades Enfermedades y Plagas. 2ª ed. PREDUZA, organizado organizado por Daniel L. Danial. Danial. Quito, Ecuador. Ecuador. 227 p. Niedherhauser J. 1993. International cooperation cooperation in potato research and development. development. Ann. Rev Phytopathol 31:1-21. Nuez F y Carrillo JM (eds). 2000. Los marcadores genéticos en la mejora vegetal. Universidad Politécnica de Valencia, Valencia, España. 579 p. Oberhagemann P, Chalot-Balandras C, Bonnel E, Schäfer-Pregl R, Wegener D, Palomino C, Salamini F, Gebhardt C. 1999. A genetic analysis of quantitative resistance to late blight in potato: Towards marker assited selection. Mol Breeding 5: 399-415. Ochoa C. 2001. Las papas de Sudamérica : Bolivia. Plural editores/CID. 535 p. Orellana L. 2001. Caracterización de la resistencia al tizón [ Phytophthora Infestans (Mont.) De Bary] en Progenitores y progenies de primera generación filial (F1) obtenidas por recombinación de cultivares nativos de papa boliviana. Tesis Ing. Agr. UMSS. Cochabamba, Bolivia. Bolivia . Otazu V, Hoopes RW y Caero G. 1982. El tizón tardío tardío de la papa y su control. Ministerio Ministerio de Asuntos Campesinos y Agropecuarios (MACA), Instituto de Tecnología Agropecuaria (IBTA). Cochabamba, Bolivia. Parlevliet J. 1979. Components of resistance that reduce the rate of epidemic development. Ann. Re. Phytopathol Phytopathol 17: 203-222. 203-222. Parlevliet J. 1997a. Resistencia Resistencia Durable Durable a Patógenos y como como mejorar mejorar para este tipo tipo de Resistencia. En: Daniel L. Danial (Ed.) p 1-15 en: Primer Taller de PREDUZA en Resistencia Duradera en Cultivos Altos de la Zona Andina 22-24 de septiembre de 1997. Quito, Ecuador. Parlevliet J. 1997b. 1997b. Selección de Componentes Componentes de Resistencia Resistencia Parcial. Páginas 238-259 in Daniel L. Danial (Ed.); Primer Taller de PREDUZA en Resistencia Duradera en Cultivos Altos de la Zona Andina 22-24 de septiembre de 1997. Quito, Ecuador. Parlevliet J. and Niks RE. 1989. Breeding for resistance against diseases and pest. Wageningen Agricultural University, Department of plant breeding. 166 pp. Patiño F, Terrazas F, Salas A, Cadima X. 2007. Los parientes silvestres silvestres del cultivo de papa en Bolivia. Revista de Agriculrura 40 (59): 19 – 28. Peloquin SJ, Jansky SH. and Yerk GL. 1989. Potato cytogenetics and germplasm utilization. Am. Potato J. 66:629-638. 66:629-638 . Pérez W, Salas A, Raymundo R, Huamán Z, Nelson R, and Bonierbale M. 2002. Evaluation of Wild Potato Species for Resistance to Late Blight. Page 49-62 in CIP Program Report 1999 – 2000.International Potato Center, Lima Perú Pflieger S, Lefebvre V. and Causse M. 2001. The candidate gene approach in plant genetics: A review. Mol. Breed. 7:275-291. Philips W y Keane PJ. PJ. 1993. El Género Phytophthora. Características Generales. Manejo Integrado de Plagas. Costa Rica, Nº 27. Pineda R y Corzo P. 1994. Desarrollo y Mejoramiento Mejoramiento Genético Genético del cultivo cultivo de la papa en Colombia. Páginas 83-89 in L.H.M. Broers (Ed.); Resistencia Resistencia Duradera en Cultivos Alto 100



Andinos, Memorias del 1er taller sobre Resistencia Duradera en Cultivos Alto Andinos. 30 de mayo – 3 de junio de 1994. Quito, Ecuador. Plaisted RL, HD. Thurston and W.M. Tingey, 1975. Five cycle of selection within a population population of Solanum tuberosum ssp andigena. andigena. Am. Potato Potato J. J. 52:280 (Abstr.). Plata G. 1998. Fenotipos de Virulencia en Morochata y Tipo Sexual de Apareamiento en Bolivia de Phythothora infestans , que afecta al Cultivo de la papa. Tesis Ing. Agr. Universidad Mayor Mayor de San Simón. Cochabamba, Cochabamba, Bolivia. Bolivia. 95 p. PROINPA, 1996. Informe Anual (compendio) 1994-1996. PROINPA. Cochabamba, Bolivia. Bolivia. PROINPA 1998. Informe Anual (compendio) 1997-1998. PROINPA. Cochabamba, Bolivia. Ribeiro OK. 1995. Some Aspects Aspects of Phytophthora Phytophthora diseases World-wide. In: Phytophthora infestans. Ed. L.J. Dowley et al., EAPR. Baule Press, Dublin Irland. 150: 311-317. Ritter E, Gebhardt C, Salamini F. 1990. Estimation of recombination frequencies and construction of RFLP linkage maps in plants from crosses betwen heterozygous parents. Genetics 224: 645-654. Ritter E and Salamini F. 1996 The calculation of recombination recombina tion frequencies in crosses of allogamous plant species with application to linkage mapping. Genet Res 67: 55-65. Ritter E, Debener T, Barone A, Salamini F and Gebhardt C. 1991. RFLP mapping on potato chromosomes of two genes controlling extreme resistance to potato virus X (PVX). Mol Gen Genet 227: 81-85. Ritter E, Ruiz de Galarreta JI, Castañon S, Sánchez I, Barrena I, Bryan G, Waugh R, Rousselle-Burgeois F, Lefebre V, Gebhardt C, Van Eck H, Taco J and Bakker J. 2004. Recursos genómicos en la papa y posibilidades de su explotación. Actas de horticultura: 165-167. Ritter E, Lucca F, Sánchez I, Ruiz de Galarreta JL, Aragonés A, Castañón S, Bryan G, Waugh R, Lefebvre V, Rousselle-Bourgoise Rousselle-Bourgoise F, Gebhardt C, van Eck H, van Os H, Taco J and and Bakker J. 2005. Genomic resources in potato and possibilities for exploitation. En: Potato in progress (Eds.: Haverkort AJ & PC Struik), Wageningen Academic Publishers, Holanda, pp 55-64. Ritter E, Sánchez I, Villabuena J & Ruiz de Galarreta JI. 2005. Page 62 -65 in Developing a transcriptome map of potato. 16 TH triennial conference of the EARP – Abstracts of Papers and Posters – Vitoria-Gasteiz Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2005. Ritter E, Ruiz de Galarreta JI, van Eck HJ, Sánchez I. 2008a. Construction of a potato transcriptome transcriptome map based on the cDNA-AFLP technique. technique. Theor. Appl. Genet. (in press). Ritter E., J. Gabriel, I. Sánchez, J.L.Ruiz de Galarreta, M. Hernández. 2008. Detection of candidate genes for useful traits applying different molecular tools. 2008. Page 61-62 in Potato for a Changing world (Abstracts of papers and posters). 17th Triennial Conference Conference of the European Association for Potato Research (EAPR2008), July 06-10, 2008, Brasov, Rumania Rivera-Peña Rivera-Peñ a A. 1992. Use of wid tuber-bearing tuber-bear ing species of Solanum for breeding potatoes against Phythopthora infestans (Mont.) de Bary. In: Rousselle-Bougeois and Rousselle (eds.). Page 12-17 in Proceding of Joint Conference of the EAPR breeding and Varietal 101



Assessement Section and the EUCARPIA Potato Section. Landernau, France, 12-17 january. Robertson NF. 1991. The Challenge of Phytopthora Diseases World-wide. In Phytophthora infestans Ed. By D.S. Ingram and William Cambridge. Academic Press. Advances in plant patology. 150: 1-30. Romero CS. 1993. Hongos fitopatógenos. fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México. 347 pp. Ross H. 1986. Potato breeding-problems and perspectives. En: Horn, W y Röbbelen, G. (eds.). Advances in Plant Breeding 13. Berlín y Hamburgo: 1-132. Rouppe van der Voort J, Wolters P, Folkertsma R, Hutten R, van Zandvoort P, Vinke H, Kanyuka K, Bendahmane A, Jacobsen E, Janssen R and Bakker J. 1997. Mapping of the cyst nematode resistance locus Gpa2 using a strategy based on comigrating AFLP markers. Theor Appl Genet 95: 874-880. Rouppe van der Voort J, van der Vossen E, Bakker E, Overmars H, van Zandvoort P, Hutten R, Klein Lankhorst R, Bakker J. 2000. Two additive QTLs conferring broad spectrum resistance in potato to Globodera pallida are localized on resistance gene clusters. Theor Appl Genet 101: 1122–30. Ruiz de Galarreta JI, Carrasco A, Salazar A, Barrena I, Iturritxa E, Marquinez R, Legorburo FJ and Ritter E. 1998. wild Solanum species as resistance sources against different pathogens of potato. Potato Res. 41: 57 – 68. Saffarano SK, Espinillo JC, Camadro EL, Simon PW. 2008. Cytological mechanisms of 2n pollen formation in the wild potato Solanum okadae and pollen-pistil relations with the cultivated potato, Solanum tuberosum. Genet Resour Crop Evol 55:471–477 Sánchez I. 2006. Construcción Construcció n de un mapa genético funcional y detección de genes de resistencia frente a factores bióticos en patata ( Solanum tuberosum L.). Tesis doctoral, Universidad del país Vasco, dpto. de biología vegetal y ecología, Facultad de Ciencias, Vitoria-Gasteiz, Vitoria-Gasteiz, España. España. 204 p. SAS Institute Inc. 1998. SAS/STAT Users Guide, Version 6, Fourth Edition, Vol. 2, SAS Institute Inc., Cary, N.C. Schäfer-Pregl R, Ritter R, Concilio L, Hesselbach J, Lovatti L, Walkemeier B, Thelen H, Salamini F and Gebhardt Gebhardt C. 1998. 1998. Analysis Analysis of quantitative quantitative trait locis (QTLs) and quantitative trait alleles (QTAs) for tuber yield and starch content. Theor Appl Genet 97: 834-846. Schöber B. 1992. Control of late, Phytophthora infestans, in integrated crop management. Neth. J. Pl. Path. 98 (2):251- 256. Shanner G, Finney RN. 1977. The effect of nitrogen fertilization on the expression of slowmildewing resistance resistance in knox wheat. Phytopathology Phytopathology 67: pp. 1051-1056. Simmonds NW. 1977. Neotuberosum and the genetic base in potato breeding, ARC Research Rev. Rev. Scott Pl Breed Breed Sta. 2:9-11. Simmonds NW and Wastie RL. 1987. Assessment of horizontal resistance to late blight of potatoes. Ann. Appl. Biol 111: 213-221. Song J, Braden JM, Naess SK, Raasch JA, Wielgus SM, Haberlach GT, Lin J, Kuang H, Austin-Phillips Austin-Phillips S, Buell Buell SR, Helgeson Helgeson JP and Jang J. 2003. Gene RB cloned cloned from 102


Solanum bulbocastanum ,


confers broad spectrum resistance to potato late blight Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 9128 – 9133. Sorensen KK, KK, Manden MH, Kirk HG, Manden Manden DK and Torp M. 2006. Linkage Linkage and quantitative trait locus mapping of foliage klate blight resistance in the wild species Solanum vernei. Plant Breeding 125: 268-276 Spielman LJ, Mc. Master J and Fry WE. 1992. Relationships among measurement of fitness disease severity in Phytophthora infestans. Plant Pathology 41:317-324. Spooner DM, Bamberg JB, Hjerting JP and Gomez J. 1991. Mexico 1988 potato germplasm collecting expedition and utility of the Mexican potato species. Amer. Potato J. 68: 29-43 Spooner DM, van der Berg R, García W, Ugarte M. 1994. Bolivia potato germplasm collection expeditions 1993, 1994: Taxonomy and new germplasm resources. Euphytica 79: 137 – 148. Spooner DM DM and Bamberg JB. 1994. Potato Potato genetic genetic resources: sources of resistance resistance and and systematics. Amer. Potato J. 71 : 325-337. Spooner DM, Sytsma KJ, Smith JF. 2001. A molecular reexamination of diploid hybrids speciation speciation of Solanum raphanifolium. raphanifolium. Evolution 45 (3): 757-764 Spooner DM and Hijmans RJ. 2001. Potato systematics and germplasm collecting, 1989– 2000. American Journal of Potato Research 78: 237-268. Spooner DM, van der Berg RJ, Rodriguez A, Bamberg J, Hijman RJ and Lara Cabrera SI. 2004. Systematic botany monographs : Wild potatoes (Solanum section petota : Solanaceae) Solanaceae) of North and Central America. The American Society of Plant Taxonomists. Taxonomists. 209 p. Stegemann H and Schnik D. 1985. Europuischer kartoffelsorten. Mitt. Biol. Bundesans Braunschweig, 227. 126 p. Sutic DD and Sinclair JB. 1991. Anatomy and Physiology of Diseased Plants. CRC Press, Boca Raton, Florida. 232 p. Tanksley SD, Ganal MW, Prince JP, de Vicente MC, Bonierbale MW, Broun P, Fulton TM, Giovannoni JJ, Grandillo S, Martin GB, Messeguer R, Miller JC, Miller L, Paterson AH, Young ND. 1992. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132: 1141-1160. Swiezynski K. 1990. Resístanse to Phytophthora infestans. In the potato. Institute Potato Ressearch. Bonin, Poland. Thoday JM. 1961 Location of polygenes. Nature 191: 368-370. Tommiska TJ, Hämäläinen JH, Watanabe KN and Valkonen JPT. 1998. Mapping of the gene Nxphu that controls hypersensitive resistance to potato virus X in Solanum phureja IvP35. Theor Appl Genet 96: 840-843. Trognitz F, Manosalva Manosalva P, Gysin R, Nino Nino Liu D, Simon R, Herrera MD, Trognitz B, Ghislain Ghislain M and Nelson R. 2002. Plant defense genes associated with quantitative resistance to potato late blight in Solanum phureja x dihaploid S. Tuberosum hybrids. Mol PlantMicrobe Interact 15: 587-597. Trujillo G. 2004. Desarrollo de Marcadores SCAR Y CAPS en un QTL con efecto importante sobre la Resistencia al Tizón Tardío de la Papa. Tesis para optar el Título Profesional de Biólogo con Mención en Genética. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. LimaPerú. 103



Ugarte ML, Estrada N, García W y Carrasco E. 1994. Identificación, Identificación, evaluación, evaluación, caracterización y conservación del germoplasma de papa, raices y tubérculos andinos en Bolivia. Ed. Lenka Céspedes y Carol Perpich. Página 295 in Primera Reunión Internacional de Recursos genéticos de papa, raices y tuberculos andinos. IBTA, PROINPA, IBTA-CIP-COTESU. IBTA-CIP-COTESU. 7-10 de febrero de 1994. Cochabamba, Cochabamba, Bolivia. Urquijo LP, Rodriguez Rodriguez SJ y Santaolalla Santaolalla A. 1971. 2ª ed. Revisada y ampliada. ampliada. Edit. .Mundi .Mundi Prensa. Madrid, España. España. 756 p. Valdez – Moctezuma E., Kahl G. 2005. Huellas de ADN en genomas de plantas. MundiPrensa, México, S.A. de C.V. Universidad Autónoma de Chapingo. 147 p. Van den Berg JH, Ewing E, Plaisted RL, McMurry S and Bonierbale M. 1996. QTL analysis of potato tuber dormancy. Theor Appl Genet 93: 317-324. Van der Plank JE. 1968. Disease Resistance in Plants. Academic Press, New York. 206 p. Van der Plank JE. 1984. Disease Resistance in Plants. Academic Press, New York. 194 p. Van der Plank JE. 1991. The two gene-for-gene hypothesis and a test to distinguis them. Plant. Pathology 40: 1-3. Van Eck HJ , Jacobs JME, Stam P, Ton J, Stiekema WJ and Jacobsen E. 1994. Multiple alleles for tuber shape in diploid potato detected by qualitative and quantitative genetic analysis using RFLPs. Genetics 137: 303-309. Van der Vossen E, Gros J, Sikkema A, Muskens M, Wouters D, Wolters P, Pereira A and Allefs S. 2005. The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum broad-spectrum late blight resistance in potato. Plant J. 2 (44): 208222 Van Eck HJ, Rouppe van der Voort J, Draaistra J, van Zandvoort P, van Enckevort E, Segers B, Peleman J, Jacobsen, Helder J and Bakker J. 1995. The inheritance and chromosomal location of AFLP markers in a non-inbred potato offspring. Mol Breeding 1: 397-410. Van Oijen M. 1992 . Evaluation of breeding strategies for resistance and tolerance to late blight in potato by means of simulation. Neth. J. Pl. Path. 98: 3-11. Van Os, H.; Andrzejewski, S.; Bakker, E.; et al. 2006. Construction of a 10.000-Marker Ultradense Genetic Recombination Map of Potato: Providing a Framework for Accelerated Gene Isolation and a Genomewide Physical Map. Genetics 173: 1075–1087. Vargas M, van Eeuwijk FA, Crossa J and Ribaut JM. 2006. Mapping QTLs and QTL x environment interaction for CIMMYT maize drought stress program using factorial regression and partial least squares methods. Theor Appl Genet 112 (6): 1009-1023. Vleeshouwers V. 2001. Molecular and cellular biology of resistance to Phytophthora infestans in Solanum species Hoogleraar in the Fytopathologie Wageningen University. 136 p. Wastie RL. 1991. Breeding for resistance. In: D.D. Ingram and P.H. Williams (Eds.). Phytophthora infestans, the Cause of Late Blight of Potato. Vol 7. Academic Press, London. pp. 192-224. Wulff EG, Gonzales EV, Ortega JA, Torres S, Perez W, Nelson R and Bonierbale M. 2003. Comparative analysis of new sources of late blight resistance using phenotypic and molecular genetics approaches. Acta Hort. 619:23-29 www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/yopbs.okstate.edu/~melcher/MG/M G01.html. 104



Zeballos H. 1997. Aspectos Económicos de la Producción de papa en Bolivia. COSUDE, CIP (Centro Internacional de la Papa). Lima, Perú. Zeng ZB. 1994. Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics 136: 1457-1468. Zimnoch-Guzowskaa Zimnoch-Guzowskaa E, Marczewskia W, Lebeckaa R, Flisa B, Schäfer-Preglb R, Salamini F, Gebhardt C. 2000. QTL Analysis of New Sources of Resistance to Erwinia carotovora ssp. atroseptica in Potato Done by AFLP, RFLP, and Resistance Gene like Markers. Crop Science 40: 1156-1167. 1156-1167 .

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Resumen En el presente estudio fueron analizados y genotipados progenies resistentes a Phytophthora infestans , derivados del cruzamiento entre especies silvestres ( oka, can, buk , jam y rap) y especies cultivadas diploides de papa ( phu, gon y dih tbr ). ). Diferentes niveles de resistencia al oomycete P. infestans en hojas y tubérculos fueron encontrados en las cinco progenies evaluadas. El análisis de co-localización entre los marcadores SSR y QTLs posicionados publicados para resistencia a P. infestans reveló 28 marcadores SSR ligados y localizados en los 12 cromosomas cromosomas de papa. Por otra parte suficientes suficientes variaciones en los niveles de resistencia se han obtenido dentro de la progenie de todas las fuentes de resistencia, lo que permitió un eficiente análisis de QTL. La selección de QTLs para resistencia a P. infestans en hojas a través de marcadores SSR reveló que en la progenie D (can x phu), sólo un QTL fue detectado detectado en el cromosoma cromosoma VIII, que desciende desciende de phu. En la progenie E (buk x phu) se ha detectado cuatro QTL seleccionables ubicado en los cromosomas III, V, VI y X. Sólo uno en el cromosoma III descendiente descendiente de can. En la progenie progenie G (jam 27521.48 27521.48 x gon) se detectaron tres QTLs seleccionables seleccionables en los cromosomas III, VI y VII de acuerdo a los valores de significancia. QTAlelos significativos fueron observados en los cromosomas VI para el parental gon, y dos lugares para jam. Algunos marcadores SSR no mostraron segregación de alelos SSR en la población. La selección de QTL también se realizó para tubérculo de P.infestans en tres poblaciones. El análisis de correlación de los niveles de infección de hoja y tubérculo fueron bajos (-0.069 a 0.328) y no significativos. Esto también se reflejó en QTLs detectados en cada población de resistencia en tubérculos. En la población G fueron detectados tres QTLs seleccionables. El QTL en el cromosoma VI que desciende del parental gon fue común para resistencia en tubérculo y hojas. Los otros dos QTLs se encontraron en los cromosomas X y V y desciendieron de jam y gon, respectivamente. En la población D el QTL de phu en el cromosoma VIII fue común para P. infestans de tubérculo y hoja. Además, fue detectado un QTL en el cromosoma XI a partir del gen candidato BS2 que puede coincidir con el QTL Pi-11 publicado. Se ha creado una "impresión genotípica" de cada uno de los parentales, indicando las posiciones de QTLs seleccionables y los correspondientes marcadores moleculares SSRs para la selección asistida por marcadores (SAM) en diferentes progenies. Estos marcadores pueden ser aplicados en los programas de fitomejoramiento de papa para todos los cruzamientos que involucran el correspondiente genotipo parental como fuente de resistencia.

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Summary In the present study were analyzed and genotyped progenies resistant to Phytophthora infestans, derived from crosses between wild diploid ( oka, can, buk, jam and rap) and cultivated species diploid potato ( phu, gon and dih tbr ). ). Different levels of resistance to oomycetes P. infestans in the leaves and tubers were found in the five tested progenies tested. tested. Co-location analyses between SSR markers and published QTLs positions for P.infestans resistance revealed 28 linked SSR markers located on all 12 potato chromosomes. On the other hand sufficient variations in resistance levels were obtained within the progenies of all resistance sources, allowing an efficient QTL analyses. QTL screening for P. infestans resistance in leaves through linked SSR markers revealed that in progeny D (can x phu) only one QTL was detected on chromosome VIII which descends from phu. In progeny E (buk x phu) we have detected four selectable QTLs located on chromosomes III, V, VI and X. Only one on chromosome III descended from can. In progeny G (jam x gon) were detected three selectable selectable QTLs on chromosomes III, VI and VII. Significant QT allele effects were observed on chromosome VI for parent gon, and at two locations in jam. Some SSR markers did not show segregating SSR alleles in the populations, so that it was not possible to evaluate the corresponding genomic locations. QTL screening was also performed for tuber infections with P. infestans in three populations. Correlation analyses between leaf and tuber infection levels were low (-0.069 a 0.328) and not significant. This is also reflected in the detected QTLs in each population. In population G three selectable QTLs for late blight resistance were detected. The QTL on chromosome VI descending from gon was common for leaf and tuber resistance. The other two QTLs were located on chromosomes V and X and descended from jam and gon, respectively. In population D the QTL from phu on chromosome VIII was common for tuber and leaf blight. In addition one QTL was detected on chromosome XI which showed significant QTAllele difference between published QTLs for P. infestans resistance and cDNAs. Moreover, on chromosome VII an additional, significant SSR allele common to both parents was observed. We have thus created a "genotypic fingerprint" of each of the parent, indicating positions of QTL selectable the corresponding SSR markers for molecular markers assisted selection (MAS) in different progenies. These markers can be applied in programs of potato breeding program for all crosses involving the corresponding parental genotype as a source of resistance.

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Acrónimos ABCPPIrel = Area Bajo la Curva de progreso de P. infestans relativo AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphisms bp = base pairs (pares de bases) CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence ( Secuencia polimórfica amplificada y cortada)

cDNA = DNA complementario complementario COS = Conserved Ortholog Set EST = Expressed Sequence Tag ISTR = Inverse Sequence-Tagged Repeat ISSR = Inter-Simple Sequence Repeat PCR = Polimeraza Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) QTA = Quantitative Trait Alello QTL = Qantitative Trait Loci RAPD = Random Amplified Polymorphic

RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción) r estricción) SAM = Selección Asistida Asistida por Marcadores moleculares SCAR = Sequence Characterized Amplified Amplified Region SSR = Simple Sequence Repeats (secuencia simple repetida o microsatélite) TDF = Target DNA Fragment (Marcador segregante) segregante) UHD = Ultra High Density (mapa ultradenso)

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Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa

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