NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Võ Hà Giang 1 , gô Xuân Bình1 , guyễn Tiến Dũng 1 SUMMARY
Study on the effect of sterile reagents and culture mediums in in vitro propagation of Rhynchostylis retusa [L.] Blume) Duoi Chon orchid ( Rhynchostylis Study on the effect of sterile reagents and culture mediums to the seed germination seed germination of Duoi Chon orchid showed that: the sterile reagents have strongly effected to sterility of culture sample (seed). Treatment with Clorox 7% in 10 minutes obtained alive samples to 33,3%; Sterized by H 2O2 with 10% in 20 minutes obtained the alive samples to 40%; Sterized by Ca (OCL) 2 with 10% in 10 minutes obtained the alive samples to 46,7%; Sterized by burning sample (orchid fruit) with alcohol (96%) within 3 seconds obtained alive samples to 88,9%. The examized culture mediums have obtained rate of seed germination from 6,7% to 66,7%. Suitable culture medium to assist seed germination are 1/2MS, Hyponex and MS. Of which, the medium of 1/2MS obtained highest rate of germination to 66,7% Keywords: Sterility, Duoi Chon orchid, Culture medium, Culture samples, Germination
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Đuôi Chồn ( Rhynchostylis retusa [L.] Blume) là loài lan rừng rất được ưa chuộng vì hoa đẹp và hương thơm. Hiện nay tại các khu rừng ở Việt Nam, các loài lan rừng bị khai thác quá mức, đang có nguy cơ cạn kiệt, trong đó hai loài lan rừng là Đuôi Chồn và Đai Châu đang được khai thác nhiều cho mục đích thương mại và có nguy cơ mất dần trong tự nhiên. Việc nghiên cứu phát triển các loài lan nêu trên, vừa bảo tồn và có khả năng nhân giống cho mục tiêu thương mại là rất cần thiết. Trong hai loài lan nêu trên, loài lan Đai Châu đã được nghiên cứu nhiều và đã có một số kết quả trong nhân giống in vitro còn loài lan Đuôi Chồn chưa được nghiên cứu nhiều, nhất là các nghiên cứu về nhân giống. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi Chồn là rất cần thiết. Phạm vi bài báo trình bày kết quả "Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng và môi trường nuôi cấy trong nhân giống phong lan Đuôi Chồn ( Rhynchostylis retusa [L.] Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào". II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Quả lan Đuôi Chồn độ tuổi khoảng 10-12 tháng được thu hái trong tự nhiên (khu vực 1
Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên.
Vườn Quốc gia Ba Bể) từ những cây lan khỏe mạnh. Hạt được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. 2 Phương pháp nghiên cứu ội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn. Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Clorox đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và được khử trùng bằng dung dịch Clorox dạng thương phm (chứa 5% Javel). Các công thức thí nghiệm bố trí như sau: CT
Thời gian và nồng độ xử lý
CT
Thời gian và nồng độ xử lý
1
Không xử lý
4
10% + 5 phút
2
7% + 5 phút
5
10% + 10 phút
3
7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức.
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu. 2
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
Thí nghiệm 2: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H 2O2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và khử trùng bằng dung dịch H2O2 ở nồng độ và thời gian theo các công thức như sau: CT
Thời gian và nồng độ xử lý
CT
Thời gian và nồng độ xử lý
1
Không xử lý
5
5% + 20 phút
2
3% + 10 phút
6
10% + 10 phút
3
3% + 20 phút
7
10% + 20 phút
4
5% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức.
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống của mẫu (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu. Thí nghiệm 3: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Calcium hypochloride Ca (OCl)2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và khử trùng bằng dung dịch Calcium hypochloride dạng thương phm (chứa 5% Ca (OCl)2). Các công thức thí nghiệm bố trí như sau: CT
Thời gian và nồng độ xử lý
CT
Thời gian và nồng độ xử lý
1
Không xử lý
4
10% + 5 phút
2
7% + 5 phút
5
10% + 10 phút
3
7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng bằng đốt quả đến khả năng vô trùng mẫu nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, lau khô quả, tiến hành đốt quả bằng cách nhúng ngập quả vào dung dịch cồn 96%, đưa quả ra khỏi dung dịch cồn và đốt quả để cồn cháy ở thời gian theo các công thức sau: CT1: (Đ/C): Không đốt; CT2: Đốt trong 3 giây; CT3: Đốt trong 5 giây; CT4: Đốt trong 10 giây; CT5: Đốt trong 15 giây. Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu.
3
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
Ở nội dung 1 (cho cả 4 thí nghiệm), các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 15 bình nuôi cấy (loại 250 ml), mỗi bình nuôi cấy được tính là một mẫu, trung bình lượng hạt của một quả lan được gieo đều cho 3 bình. ội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt phong lan Đuôi Chồn trong nhân giống in vitro. Quả lan sau khi khử trùng được chuyển vào đĩa peptri. Dùng dao tách bỏ vỏ quả và lấy hạt gieo trong bình nuôi cấy (250 ml) đã chu n bị sẵn môi trường khác nhau, trung bình theo công thức thí nghiệm. Hạt thu từ một quả lan Đuôi Chồn được chia đều và nuôi cấy trên 3-4 bình. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 10 bình nuôi cấy (loại 250 ml), mỗi bình cấy được tính là một mẫu. Sau 12 tuần tiến hành theo dõi số bình nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm. Thí nghiệm 5: ghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn. Thí nghiệm bố trí với 5 công thức (CT): CT1: 1/2 MS; CT2: MS; CT3: VW; CT4; N 6; CT5: Hyponex. Ở các công thức, trong 1 lít môi trường bổ sung: Đường 30 g + nước dừa 120 ml + than hoạt tính 2 g + agar 6,5 g. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT
Số bình nuôi
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ chết (%)
1
45
100,0
0,0
0,0
2
45
3
45
4
45
5
45 LSD0,05 CV%
66,7 46,7 42,2
*
13,3
*
20,0
*
33,3
*
20,0 33,3 24,5
37,8
13,3
48,9
5,1
3,6
3,6
8,5
* Sai khác có ý nghĩa.
Công thức 1 (đối chứng không xử lý) sau 10 ngày tỷ lệ các bình nuôi cấy bị nhiễm là 100%. Ở các công thức còn lại, khi quả lan được khử trùng bằng dung dịch nước Clorox nồng độ 7% và 10% trong thời gian khác nhau (5 phút, 10 phút) tỷ lệ hạt lan bị nhiễm giảm so với khi không xử lý (CT1). Tuy nhiên thời gian xử lý và nồng độ càng cao thì tỷ lệ hạt nhiễm giảm nhưng tỷ lệ hạt chết tăng. Hiệu quả khử trùng quả lan tốt
4
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
nhất khi sử dụng Clorox nồng độ 7% trong 10 phút (CT3), tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 33,3% (độ tin cậy 95%). Kết quả ở bảng 2 cho thấy thời gian và nồng độ xử lý H 2O2 ảnh hưởng đến hiệu quả khử trùng quả lan Đuôi Chồn. Bảng 2. Kết quả nghiên cứu khử trùng bằng H 2O2 đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT
Số bình nuôi cấy
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ chết (%)
1
45
100,0
0,0
0,0
2
45
3
45
4
45
5
45
6
45
7
45 LSD0,05
93,3 80,0 66,7 53,3 42,2
*
6,7
0,0 *
6,7
*
13,3
*
20,0
*
26,7
*
13,3 20,0 26,7 31,1
28,9
40,0
31,1
3,9
2,7
2,7
CV%
9,6
*Sự sai khác có ý nghĩa.
Công thức 1 (đ/c) sau 10 ngày tỷ lệ các bình nuôi cấy bị nhiễm là 100%. Ở các công thức còn lại, khi quả lan được khử trùng bằng nước H 2O2 ở nồng độ 3%, 5% và 10% trong thời gian khác nhau (10 phút và 20 phút) tỷ lệ hạt lan bị nhiễm giảm dần. Tuy nhiên thời gian và nồng độ xử lý càng cao thì tỷ lệ hạt nhiễm giảm và tỷ lệ hạt chết tăng không đáng kể. Do quả lan vỏ quả dày nên khi xử lý ở các nồng độ và thời gian như trên thì mẫu chết do hoá chất không đáng kể mà chủ yếu chết do bị tạp nhiễm. Bảng 3. Kết quả nghiên cứu khử trùng của Ca (OCl)2 đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT
Số bình nuôi
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ chết (%)
1
45
100,0
0,0
0,0 *
20,0
*
26,7
*
31,1
*
2
45
62,2
17,8
3
45
40,0
33,3
4
45
28,9
40,0
5
45
20,0
46,7
33,3
5,1
3,6
3,6
LSD0,05 CV%
7,2
* Sai khác có ý nghĩa.
Kết quả ở bảng 3 cho thấy, thời gian và nồng độ xử lý Ca (OCl) 2 ảnh hưởng đến hiệu quả khử trùng quả lan Đuôi Chồn. Công thức 1 sau 10 ngày tỷ lệ các bình nuôi cấy bị nhiễm là 100%. Ở các công thức còn lại, khi quả lan được khử trùng bằng dung dịch Ca (OCl)2 ở nồng độ 7% và 10% trong thời gian khác nhau (5 phút, 10 5
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
phút) tỷ lệ hạt lan bị nhiễm giảm dần. Không xử lý (CT1: đ/c) tỷ lệ nhiễm rất cao. Tuy nhiên thời gian và nồng độ xử lý tăng thì tỷ lệ hạt nhiễm giảm. Bảng 4. Kết quả khử trùng bằng phương pháp đốt cồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT
Số bình nuôi (bình)
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ sống (%)
Tỷ lệ chết (%)
1
45
100,0
0,0
0,0
2
45
2,2
88,9
3
45
0,0
64,4
4
45
0,0
44,4
5
45
0,0
0,0
LSD0,05
3,1
CV%
*
8,9
*
35,6
*
55,6
ns
5,4
100,0 5,4
8,4
ns: Sai khác không có ý nghĩa; * Sai khác có ý nghĩa.
Kết quả bảng 4 cho thấy, khử trùng quả lan Đuôi Chồn bằng phương pháp nhúng quả vào dung dịch cồn 96% rồi lấy ra đốt nhanh trên ngọn lửa đèn cồn cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp khử trùng bằng hóa chất. Tuy nhiên nếu đốt quả quá lâu sẽ ảnh hưởng đến sức sống và khả năng nảy mầm của hạt. Ở công thức 3 khi quả lan được đốt nhanh trên ngọn lửa đèn cồn trong thời gian 5 giây cho tỷ lệ hạt lan sống và không bị nhiễm đạt 64,4%, nhưng hạt lan bị ảnh hưởng do nhiệt đốt nóng (35,6% mẫu bị chết). Khi đốt nhanh quả lan trên ngọn lửa đèn cồn trong thời gian 3 giây (CT2) hiệu quả khử trùng khá cao (88,9% mẫu sống không bị nhiễm) hạt lan bị ảnh hưởng do nhiệt đốt nóng không đáng kể (8,9%). Công thức 4, khi tăng thời gian đốt lên 10 giây tỷ lệ mẫu bị chết tăng lên đáng kể (55,6% mẫu bị chết), tăng 7 lần so với CT2. Công thức 5, khi tăng thời gian đốt lên 15 giây tỷ lệ chết l à 100%. Như vậy khi khử trùng bằng đốt quả lan Đuôi Chồn, CT2 (nhúng cồn và đốt trong 3 giây) cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm là 88,9% (độ tin cậy 95%). Từ các kết quả thu được ở bảng 1, 2, 3 và bảng 4 cho thấy, khi khử trùng riêng rẽ các dung dịch đều cho kết quả khử trùng tương đối tốt. Khử trùng bằng phương pháp đốt cồn 960 trong thời gian 3 giây cho hiệu quả khử trùng tốt nhất. 2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) Bảng 5. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) CT
Môi trường
Số bình nuôi cấy
Số bình có hạt nảy mầm
Tỷ lệ nảy mầm (%)
1
1/2MS
30
20
66,7
2
MS
30
15
50,0
6
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 3
VW
30
10
33,3
4
N6
30
2
6,7
5
Hyponex
30
11
53,3
LSD0,05
9,3
CV%
11,2
Kết quả thí nghiệm ở bảng 5 cho thấy: Ở CT1 (1/2 MS) tỷ lệ hạt lan nảy mầm đạt 66,7%, tỷ lệ nảy mầm giảm dần theo thứ tự các môi trường sau: Môi trường Hyponex (CT5) đạt 53,3%, môi trường MS (CT2) đạt 50,0%, môi trường VW (CT3) đạt 33,3%, môi trường N6 đạt giá trị thấp nhất (6,7%). Môi trường 1/2MS có tỷ lệ hạt lan nảy mầm cao nhất (66,7%) ở mức độ tin cậy 95%. Nhân giống in vitro cây phong lan nói chung có thể sử dụng nhiều loại mẫu khác nhau như: Mẫu lá, đỉnh sinh trưởng, chồi cuống hoa... [1],[2],[6]. Các loại lan công nghiệp (Hồ Điệp, Địa Lan, Vanda..) khi nhân giống có thể sử dụng mẫu khác nhau tùy vào điều kiện, môi trường và mục đích nhân giống [3]. Tuy nhiên, với các loại lan rừng như Đai Châu, Đuôi Chồn, việc nhân giống từ hạt có ý nghĩa quan trọng, các thí nghiệm nhân giống in vitro từ mẫu lá ở cây lan Đuôi Chồn cho kết quả chưa khả quan. Vì vậy, nguồn hạt phong lan có thể là mẫu nuôi cấy rất cần được quan tâm nghiên cứu. Trong tự nhiên hạt lan thường rất khó nảy mầm vì hạt không chứa abumin và một phôi chưa phân hóa; hạt lan rất nhỏ không dự trữ hoặc dự trữ rất ít dinh dưỡng; để nảy mầm được hạt lan phải cộng sinh với nấm [5]. Tỷ lệ hạt lan nảy mầm trong tự nhiên chỉ vào khoảng 1-2% [5]. Quả và hạt phong lan có thể được hình thành qua quá trình tự thụ và có thể sử dụng làm mẫu nhân giống in vitro. Năm 1992 Knudson cho rằng có thể trợ giúp hạt phong lan nảy mầm trên môi trường nhân tạo có bổ sung nguồn dinh dưỡng khoáng và đường mà không cần sự có mặt của nấm. Có nhiều loại môi trường sử dụng để nảy mầm hạt các loài phong lan khác nhau [5], [6]. Tuy nhiên, đối với môi trường nuôi cấy hạt lan Đuôi Chồn, cho đến nay, chưa có các nghiên cứu cụ thể. Kết quả nội dung 2 cho thấy: có thể sử dụng môi trường 1/2MS và Hyponex và MS trong nuôi cấy hạt phong lan Đuôi Chồn. Mẫu hạt nảy mầm được tiếp tục nuôi cấy để phát triển thành cây hoàn chỉnh, hiện nay nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ mẫu hạt phong lan Đuôi Chồn đã nảy mầm trong thí nghiệm nêu trên. IV. KẾT LUẬN Phương pháp khử trùng quả lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu nuôi cấy trong nhân giống in vitro có hiệu quả tương đối tốt là các phương pháp: Xử lý quả với Clorox nồng độ 7% trong 10 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 33,3%); khử trùng bằng nước H2O2 nồng độ 10% trong 20 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 40,0%); khử 7
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
trùng bằng dịch Ca(OCl)2 nồng độ 10% trong 10 phút (tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm đạt 46,7%); khử trùng bằng phương pháp nhúng cồn và đốt nhanh cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm đạt 88,9%. Các môi trường này nuôi cấy, hạt nảy mầm đạt tỷ lệ từ 6,7% đến 66,7%. Môi trường phù hợp giúp cho hạt ny mầm là môi trường 1/2MS và Hyponex hoặc MS, Trong đó môi trường 1/2 MS cho tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt giá trị cao nhất (66,7%). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 guyễn Công ghiệp, 1998. Trồng hoa lan, N XB. Trẻ TP. Hồ Chí Minh. 2 Hội Lan Hà ội, 2005. Sổ tay người trồng lan, N XB. N N Hà N ội. 3 Arditti, 1982. Orchild Biology. Reviews and perspective II. Cornell Univ. Press, Ithaca: 1-310. 4 Bermard, 1999. Introduction of some orchid species. Ann. Sci. Bot.9: 1-196. 5 Knudson, 1992. Use of seed for orchid propagation in vitro. Bot. Gaz.73: 1-25. 6 R.L.M. Pierik, 1987. In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers. gười phản biện: TS. Trịnh Khắc Quang
8
