«Análisis morfológico de células sanguíneas por medio de tinción nuclear y citoplasmática» Integrantes: Leonardo Altamirano Altamirano Paula Campos Ricardo Godoy Sebastián Hernández Angélica Mariñanco Carrera: Bioquímica Asignatura: Biología celular Profesor: Dr. Marco Paredes Honorato
Introducción •
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En la mayoría de los tejidos celulares su tamaño e incoloridad es una limitante para el ojo humano a la hora de la observación, inclusive a través de lentes microscópicos, microscópicos, por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. En el siglo XIX se llevo a cabo una técnica desarrollada desde un principio por el médico y bacteriólogo alemán, alemán, Paul Ehrlich En 1879-1891 Ehrlich seguido por los médicos alemanes Ernst Malachowski y Dmitry Leonidovich Romanowsky, elevoraron una técnica, en la cuál se reunían la tinción de Giemsa y MayGrünwald - Giemsa entre otras, las cuales son utilizadas para diferenciar los tipos de células en especímenes patológicos. A esto se le llamó , Tinción de Romanowsky
Introducción •
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•
En la mayoría de los tejidos celulares su tamaño e incoloridad es una limitante para el ojo humano a la hora de la observación, inclusive a través de lentes microscópicos, microscópicos, por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. En el siglo XIX se llevo a cabo una técnica desarrollada desde un principio por el médico y bacteriólogo alemán, alemán, Paul Ehrlich En 1879-1891 Ehrlich seguido por los médicos alemanes Ernst Malachowski y Dmitry Leonidovich Romanowsky, elevoraron una técnica, en la cuál se reunían la tinción de Giemsa y MayGrünwald - Giemsa entre otras, las cuales son utilizadas para diferenciar los tipos de células en especímenes patológicos. A esto se le llamó , Tinción de Romanowsky
Objetivos •
Caracterizar y conocer la morfología de las células sanguíneas tales como linfocitos, monocitos, neutrófilos, basófilos, eosinofilos, plaquetas y eritrocitos, mediante procesos de tinción Giemsa y May Grünwald y análisis microscópicos.
Materiales y procedimientos • Aspersor con etanol 75% • Solución de Giemsa • Algodón
• Solución de May-
• Povidona Yodada • Lancetas
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• Portaobjetos
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• Toalla de papel
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• Alcohol al 95 %
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• Frascos de tinción
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Grünwald Recipiente de desechos Estufa de secado Éter de petróleo Microscopios Aceite de inmersión
Aspersor con etanol 75 % •
Extraído de la caña de azúcar y del maíz, y sirve como diluyente de compuestos utilizados en laboratorio.
Algodón •
Extraído de Malvaceae, resultado de un estricto proceso de fabricación. Utilizado para la desinfección y limpieza.
Povidona Yodada •
Solución antiséptica. Utilizado para desinfectar tejidos.
Lancetas • Estériles. Para análisis sanguineo es una rutina frecuente en cualquier laboratorio. Portaobjetos • Fina placa de cristal sobre el cual se disponen objetos para su examen microscópico.
Toalla de papel • Utilizado para eliminar el exceso de tinción y agua de los portaobjetos.
Alcohol al 95 % • Fijación del frotis
Frascos de tinción: •
Solución de Giemsa: colorante eosina, violeta de metilo y el azul de metilo. Utilizado para tinción de frotis
•
Solución de May-Grünwald: colorante aniónico eosina y el colorante catiónico azul de metileno . Utilizado para tinción de frotis.
Estufa de secado: • Utilizada para secar e incubar el frotis. Recipiente de desechos: • Utilizado para depositar los residuos del experimento.
Aceite de inmersión: • Se utiliza cuando se pasa del objetivo 40 al de
100x.
Éter de petróleo: • Se utiliza para limpiar los objetivos cuando
quedan con aceite de inmersión.
Microscopio •
Es un instrumento que permite aumentar el poder de observación de células y microorganismos con mayor detalle de las estructuras celulares.
Sistema óptico -Ocular: lente situado cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo. -Objetivo: Lente situado cerca de la preparación. Amplia la imagen de este. -Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. -Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. -Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico -Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: El pie o base y el brazo. -Platina: Lugar donde se deposita la preparación. -Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. -Revolver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. -Tornillos de enfoque: Micrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.
Procedimientos Actividad 1:Análisis morfológico de leucocitos sanguíneos por tinción de Giemsa. 1. Pinchar con una lanceta estéril el extremo de un dedo previamente desinfectado con yodo. 2. Depositar una gota de sangre sobre la zona media del portaobjeto 3. Esparcir la gota de sangre hacia un extremo del portaobjeto utilizando otro portaobjeto (procure que la capa de sangre o frotis, sea lo mas fina posible) 4. Secar el frotis al aire por 5 minutos 5. Sumergir el frotis en alcohol 95% durante 2 minutos (fijación de la muestra)
6. Retirar la preparación del alcohol y sumergir el frotis en solución de Giemsa durante 5 minutos. 7. Retirar la preparación de la solución y eliminar el colorante sumergiendo el portaobjeto varias veces en un recipiente con agua. 8. Secar la preparación a 35 ºC en estufa por 10 minutos 9. Retire el preparado de la estufa y consérvelo hasta el momento del análisis microscópico.
Actividad 2 : Análisis morfológico de leucocitos sanguíneos por Tinción de May-Grunwald-Giemsa. 1. Preparar un frotis de sangre según procedimiento descrito en los pasos 1, 2 y 3 de la actividad Nº 1. 2. Secar el frotis al aire por 5 minutos. 3. Sumergir el fortis en la solución de May-Grunwald durante 5 minutos. 4. Retirar el frotis de la solución May-Grünwald y se sumergir en Giemsa durante 10 minutos. Verter el colorante aspirando por un costado del portaobjeto con papel desechable .
5. Retirar la preparación de la solución y eliminar el colorante sumergiendo el portaobjeto varias veces en un recipiente con agua. 6. Secar la preparación a 35 ºC en estufa por 10 minutos 7. Retire el preparado de la estufa y consérvelo hasta el momento del análisis microscópico.
Actividad 3: Análisis microscópico de las preparaciones. 1. Colocar el objetivo 10 X en posición de uso y bajar la platina completamente. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 10x 4. Realice el enfoque de acuerdo al siguiente procedimiento: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico sin llegar a tocarla. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora si, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el micrométrico y, cuando se observe algo nítido en la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino y nítido.
c. Pasar al objetivo 40X girando el revolver. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. d. Una vez obtenido el enfoque con el objetivo 40x, girar el revolver hacia el objetivo 100x dejándolo entre Este y el de 40x por un momento. e. Colocar una a dos gotas de aceite de inmersión sobre el circulo de luz en la preparación f. Girar suavemente el revolver hasta la posición del objetivo 100x. g. Enfocar muy cuidadosamente con el micrométrico hasta obtener un enfoque nítido. Nota: Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía con aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
5. Fotografiar la preparación (en 100X) acoplando manualmente una cámara digital al ocular del microscopio. (Utilice zoom digital si es necesario). 6. Una vez finalizada la observación y obtención de fotografías, se baja la platina y se ubica el objetivo de menor aumento girando el revolver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. 7. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un algodón embebido en Éter de petróleo. Comprobar también que el objetivo 40x este perfectamente limpio.
Glóbulos rojos, eritrocitos o hematíes •
Células formadas en forma de disco bicóncavo, con diámetro aprox. de 7 a 8 micrones, 2 micrones de espesor en la periferia y 1 micra de espesor en el centro.
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Los eritrocitos se caracterizan por no poseer núcleo, mitocondrias y el retículo endoplasmatico se encuentra muy disminuido. Durante la Eritropoyesis los hematíes han debido pasar por varias etapas, en las cuales, pierden su núcleo y los organelos mas importantes y solo sintetizan la Hemoglobina que les ayuda a cumplir su única función: El transporte de gases atmosféricos por la sangre del organismo.
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Los glóbulos rojos circulan en un numero enorme de 5.000.000 por milímetro cúbico de sangre en el hombre y 4.500.000 en la mujer, aprox.
Glóbulos blancos o leucocitos •
Son unidades móviles de la sangre, poseen núcleo, no tienen forma definida y son de un tamaño ligeramente mayor que los glóbulos rojos, Sin embargo el numero de ellos que circula es menor (5000 a 7000 por milímetro cúbico de sangre).
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En general cumplen un importante papel en la defensa del organismo contra las diversas infecciones producidas por microorganismos. Cuando alguna bacteria u otro agente patógeno ingresa al organismo humano, se liberan ciertas sustancias químicas que tienen la facultad de atraer a los leucocitos, este fenómeno se ha denominado quimiotaxis. Por otro lado para que el leucocito logre llegar al lugar en que se esta multiplicando la bacteria, estos deben atravesar la pared de los vasos sanguíneos, por un proceso llamado diapédesis.
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Morfológicamente se distinguen en dos grupos: Granulocitos y Agranulocitos.
Granulocitos: En ellos se observa pequeños gránulos citoplasmáticos y núcleo con varios lóbulos al microscopio óptico. Aquí se encuentran Eosinófilos, Neutrófilos y Basófilos. •
Eosinófilos: Son aquellos que presentan afinidad tintorial por los colorantes ácidos (Eosina), y sus gránulos se tiñen de color rojo anaranjado. Su núcleo puede ser bi o trilobulado. Constituyen el 1 al 3% de todos los leucocitos. Son fagocitadores poco intensos y presentan quimiotaxis moderada.
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Neutrófilos: Son aquellos leucocitos que presentan afinidad con colorantes de pH neutro, y los gránulos tiñen de color lavanda pálido. Son los mas numerosos, pues representan el 65% de los leucocitos y son los mas activos en cuanto a defensa contra infecciones.
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Basófilos: Presentan afinidad por colorantes básicos (azul de metileno), les dan color azul intenso a los gránulos del citoplasma. Son de poca movilidad, ya que su función principal es liberar alguna sustancia hacia la sangre, tales como la heparina, sustancia que evita la coagulación sanguínea, son importantes en algunos tipos de reacciones alérgicas. Su porción en la sangre es del 2 al 3%.
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Agranulocitos: Son aquellos que no contienen gránulos en sus citoplasma, y sus núcleos no son lobulados, sino que esféricos. Aquí se encuentran Monocitos y Linfocitos.
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Monocitos: Tienen un núcleos grande en forma arriñonada o herradura, que tiñe de color púrpura, son de gran tamaño 12 a 20 micras. Juegan un papel importante en la inflamaciones e infecciones crónicas, ya que son fagocitadores activos (Macrófagos), los cuales presentan gran movilidad. Su concentración sanguínea es de un 5% aprox.
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Linfocitos: Son células de tamaño aproximado a los hematíes, de núcleo redondo, grande y citoplasma escaso. Son muy abundantes en la linfa y representan del 25 al 30% de los leucocitos en la sangre normal. Se tiñen de color púrpura.
Plaquetas o trombocitos •
Son las células mas pequeñas, ya que miden sólo 2 a 4 micrones. Existen aproximadamente 300.000 a 500.000 por milímetro cúbico de sangre.
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Su vida media es de 4 días aprox. No se conoce aún el lugar del organismo donde son destruidas.
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Cumplen un rol de suma importancia en la coagulación sanguínea.
Tinción •
Es una técnica auxiliar en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. En Bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Esto es similar al marcado fluorescente.
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Las tinciones y colorantes se usan con frecuencia en biología y en medicina para destacar estructuras en tejidos biológicos para observación, a menudo con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
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Las tinciones pueden ser usadas para definir y examinar tejidos en bruto (resaltando, por ejemplo, fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (clasificando diferentes células sanguíneas, por ejemplo) u orgánulos dentro de células individuales.
Colorantes •
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
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Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
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Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Tinción Giemsa Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
Resultados : - Citoplasma: rosa - Gránulos de las células cebadas: púrpura - Núcleos: azul - Bacterias:azul - Eritrocitos: rosa – naranja - Parásitos: azul
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Monocito 400x
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Neutrófilo 400x
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A,B,C.- Neutrófilos D.- Linfocit
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Plaquetas 400x
A.- Neutrófilo • B.- Monocito
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Plaquetas 1000x
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Superior.- Neutrófilo • Inferior .- Linfocito
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Linfocito 1000x
Tinción May-Grünwald Giemsa Como el resto de las coloraciones basadas en la técnica de Romanowsky, la técnica MGG permite diferenciar cualitativa y cuantitativamente los principales elementos formes de la sangre. En los laboratorios clínicos de hematología resulta especialmente útil para la demostración de alteraciones en el número, proporción y morfología de las células sanguíneas. También puede ser adaptada para su utilización como una técnica de tinción clásica para cortes histológicos. • Esta técnica se basa en la acción complementaria de dos colorantes neutros y en la afinidad de los elementos celulares por los colorantes ácidos o básicos. Estos dos colorantes son MayGrünwald y Giemsa. Ambos colorantes son solubles en alcohol metílico y son, por lo tanto, inactivos: es el contacto del agua el que les da un poder colorante. Las sales se disocian entonces coloreando ácido (eosina) y básico (azul de metileno). •
May-Grünwald y Giemsa, se conocen con el nombre de tinción panóptica de May-Grünwald Giemsa, esta tinción resalta de manera especial las granulaciones “El empleo combinado de los colorantes
leucocitarias y mejora la coloración de los eritrocitos.” (Vives y Aguilar,
3° edición 2006) Técnica: - Fijación - Tinción con May-Grünwald - Lavado y rehidratación - Tinción con Giemsa - Observación
Resultado: - Los núcleos aparecen en colores que van del color azul al púrpuranegro. - Los citoplasmas de las células maduras aparecen de un color violeta muy pálido o marrón muy pálido. - Los glóbulos rojos, ricos en hemoglobina aparecen de colores entre rosados y beige. - Los gránulos de los neutrófilos aparecen de colores entre violeta y marrón. - Los gránulos de los eosinófilos aparecen de color naranja. - Los gránulos de los basófilos de color entre azul y negro. - Los gránulos de los linfocitos grandes aparecen de color púrpura. - Las células con gran producción de ARN (como linfocitos productores de inmunoglobulinas y células inmaduras) presentan un citoplasma de color azul intenso.” (Colaboradores de Wikipedia, 2012)
Células sanguíneas 100x
Células
Linfocito 1000x
Monocito1000x
Neutrófilo1000x
Basófilo1000x
•
la
Plaquetas 1000x
Neutrófilos 1000x
Eritrocitos 1000x
Eosinófilo1000x
Neutófilo1000x
Neutrófilo1000x
Conclusiones •
Durante este trabajo experimental se pudo observar las distintas células sanguíneas a través de dos métodos de tinción de laboratorio, con el fin de obtener una mejor nitidez de imagen al momento de la observación en el microscopio óptico.
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Se ha logrado complementar algunos conocimientos sobre las diversas morfologías celulares, proporcionándonos una mayor precisión para distinguir las células a base de sus propias estructuras.
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La experiencia durante este experimento ha servido para aprender sobre el manejo y función de los distintos elementos del laboratorio, tales como el microscopio y las tinciones, indispensables para la correcta investigación en el ámbito científico.
