INFORME DE LABORATORIO #6 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES, SUPERFICIES Y MANIPULADORES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
RESULTADOS DE LA PRÁCTICA METODO DE MUESTREO: Después de tener todos los implementos desinfectados y limpios nos dirigimos dirigim os a tomar la muestra en el laboratorio de vegetales, allí escogimos el mesón central por que es una de las partes con mayor posibilidades de manipulación y por ende de contaminación. contamina ción. La La 2 parte donde fue tomada la muestra fue en el centro con un área aproximada de 10 cm . En la teoría se recomienda: realizar controles microbiológicos de superficies realizados en zonas limpias utilizando medios de cultivo que incluyen componentes que inhiben los detergentes utilizados en la limpieza de modo que los resultados obtenidos reflejan con mayor exactitud la limpieza de la superficie analizada. Aunque puede evaluarse la situación.
MÉTODO DE ANALISIS DE SUPERFICIE: Recuento de aerobios mesófilos (RAM) Con la ayuda de un delimitador de área frotamos en el área usando una plantilla con una abertura de (10 cm 2); frotando horizontal y verticalmente con un escobillon estéril previamente humedecido en caldo nutritivo y posteriormente se introdujo el escobillón en un tubo de ensayo con 10 ml de caldo nutritivo dejándolo durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodón ala solución. Posteriormente se realizó la siembra de aerobios mesófilos con la dilución 10 1; luego se sembró 0,1 ml en siembra por superficie y por duplicado en cajas de petri con agar PCA fundido y atemperado a 47 oC para el recuento de aerobios mesófilos. Los resultados de crecimiento evidenciados después de 48 horas a 37 oC se reportan a continuación y se reporta aquellas placas que muestren entre 30 y 300 colonias, se expresan los resultados en UFC/cm2.
Análisis: recuento de aerobios mesófilos en la superficie del meson del taller de vegetales de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de Caldas.
Reporte:
Dilución
Placa 1
Placa 2
Promedio
10-1
16
36
26
Recuento de Coliformes Totales y Fecales (EMB): Recuento de coliformes totales y fecales en la superficie del meson del taller de vegetales de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de Caldas. A partir del cultivo en caldo nutritivo utilizado anteriormente se tomo 1 ml de este y se siembra en superficie en una caja de petri con (EMB); luego se incubó durante 24 horas a 37oC. Posteriormente se realizó la lectura de los resultados mediante la determinación de cambio de color del medio de cultivo (verde-azul).
Reporte:
Dilución
Placa 1
Placa 2
Promedio
10-1
0
0
0
Análisis: recuento de en la superficie del mesón del taller de vegetales de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de Caldas.
MÉTODO DE ANALISIS DE AMBIENTES: Recuento mohos y levaduras, coliformes totales y aerobios mesofilos (PCA; YGC, EMB): Llevar las placas que se vana utilizar completamente cerradas, con cuidado de que no se abra durante el transporte, al ambiente cuya carga microbiológica se desee evaluar en este caso el taller de cárnicos de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de Caldas. Dejamos abierto las placas con agar (PCA. YGC, EMB); durante 15 minutos. Luego cerramos las placas y las llevamos a incubar durante: -
48 horas a 37 ºC para recuento de aerobios mesofilos. 4 a 5 días a 25 ºC para el recuento de mohos y levaduras. 48 horas a 37 ºC para el recuento de coliformes totales.
Se realiza el recuento de aerobio mesofilos, mohos y levaduras y coliformes totales y reportar UFC/ 15 min/ 65 cm 2 (diámetro de la caja de petri).
Análisis: recuento de mohos y levaduras del taller de cárnicos de la Unidad Tecnológica de Alimentos (UTA) de la Universidad de Caldas.
Reporte: Placa 1
Placa 2
Placa 3
(Mohos y levaduras)
(Coliformes totales)
(Aerobios mesofilos)
3
0
13
MÉTODO DE ANALISIS DE MANIPULADORES: Recuento S. aureus, Coliformes totales y fecales (BP, EMB): Manos: Humedecemos el hisopo en el agua peptonada y frotamos la superficie de la palma de la mano, zona entre los dedos, entre las uñas; haciendo rotar el hisopo; lavamos el hisopo en el diluyente, drenar el exceso de líquido en la pared del tubo. Finalizando el lavado quebrar el hisopo en el lugar donde se tomó la muestra, dejando caer la porción con algodón dentro del tubo o frasco con diluyente. Repetir la misma operación para la otra mano. Ambos hisopos se colocan en el mismo tubo con diluyente, es decir se consideran una sola muestra.
Método de siembra para el recuento de S t a p h y l o c o c c u
aureus
Sembramos en la superficie de cada una de las 2 placas con agar (PCA), 0,1 ml del líquido del lavado, esparciendo con un “espátula”. Incubar las placas en posición invertida a 35-37 ºC durante 24 y 48 horas. Observar el crecimiento de colonias características en cada uno de los medios de cultivos: colonia violeta con halo del mismo color en el caso de Entrobacteriaceae en placas de VRBG y colonias negras rodeadas por halos claros contrastan con la opacidad del medio Baird Parker en el caso de Staphylococcus aureus.
Método de siembra para el recuento de coliformes totales y coliformes fecales 1. Método para coliformes totales: Sembramos 1 ml de la dilución en superficie en el agar (EMB), Incubamos a 35 ⁰C por 24 horas. Transcurrido este tiempo, realizar la lectura de resultados mediante la determinación del cambio de color del medio de cultivo (verde-azul). El NMP se busca en tablas estadísticas de acuerdo con un código formado por la combinación de los tubos positivos y negativos obtenidos.
2. Método para coliformes fecales: Exponer los tubos positivos de Caldo Fluorocult a la luz ultravioleta. La aparición de fluorescencia y gas lleva a poder inferir la presencia de bacterias coliformes fecales. Para poder considerar que son positivos para coliformes de origen fecal debe agregarse 1 mL de reactivo de Kovacs para la prueba de indol en cada tubo. Observar el desarrollo de color púrpura en la fase orgánica. Con este patrón de tubos positivos, calcular por ambos métodos el NMP de bacterias coliformes fecales / 100 mL de muestra. El NMP se busca en tablas estadísticas de acuerdo con un código formado por la combinación de los tubos positivos y negativos obtenidos.
Análisis:
Reporte: Placa 1
Placa 2
Placa 3
(S. aureus)
(Coliformes totales)
(coliformes fecales)
ANALISIS DE RESULTADOS
De acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba de coliformes totales y fecales (sin presencia) nos podemos dar cuenta que la planta de vegetales de la UTA cumple con los parámetros requeridos teniendo así un producto saludable y óptimo para el consumo humano. La suciedad de los equipos permite el crecimiento microbiano como lo es el caso de los aerobios mesófilos, de tal manera que hace más fácil que los microorganismos pasen al producto en cantidades elevadas, aunque estos M.O no sean tan perjudiciales para la salud.
Cuestionario 1. Cuáles son los tipos de superficie que se deben controlar en industrias de alimentos y bebidas. Para todo establecimiento, ya sea una empresa, una industria, oficinas, organismos públicos, hospitales, escuelas y hasta para nuestros hogares, la limpieza es un factor importantísimo para el buen desarrollo de las actividades que se realizan dentro del espacio destinado para estas. La buena desinfección y limpieza de espacios comunes, a cantidades significativas de personas, como hospitales y escuelas, es primordial para evitar el desarrollo de enfermedades y el contagio a la gente que transita por estos establecimientos. Según el lugar, la aplicación de diferentes productos y herramientas de limpieza varían, ya que no se pueden utilizar los mismos productos para realizar la limpieza industrial que en nuestros hogares. Dentro de los tipos de superficie es importante sacar muestras para analizar de cada equipo, la muestra tiene que ser de todo el equipo o más bien, sacar muestras por cada parte del equipo dependiendo de su tamaño. Cuando nos referimos a equipos de la planta hablamos de equipos con los que se procesa cualquier alimento, también donde se almacene antes de el proceso y después de este. También es importante analizar cada herramienta de trabajo ya que el objeto por más poco que se use puede estar contaminado, lo mismo pasa con los materiales de empaque para el producto. La idea de ser rigurosos es garantizar siempre la calidad y ese es el compromiso social que tenemos como ingenieros de alimentos. El mantenimiento de las instalaciones de las industrias es esencial para el buen funcionamiento de estas, y la limpieza industrial cumple un papel importante, ya que las maquinarias que se utilizan en los diferentes tipos de industrias necesitan un buen funcionamiento para el desarrollo de la actividad correspondiente, y segundo el mantenimiento evita que las maquinarias se arruinen por el uso a través del tiempo y así hacerlas durar mas, teniendo el dueño de la industria un ahorro económico.
2. Describa los diferentes métodos de muestreo superficies en la industria de alimentos. Método de Contacto con Placa de Agar Para el método de contacto con placa de agar, se aplican a cada localización de muestreo pequeñas placas Petri de plástico desechables (de un diámetro interior de 5,0 o 6,5 cm) con agar para recuento de colonia de bacterias (de conformidad con la versión vigente de la Norma ISO 18593) y otras con agar bilis-rojo neutro violeta cristal con glucosa (agar VRBG de conformidad con la versión vigente de la Norma ISO 18593). Presionar la superficie de contacto del agar firmemente contra la superficie a muestrear, sin realizar movimientos laterales. Los mejores resultados se obtienen con un tiempo de contacto de 10 segundos y una presión de masa de 500 gramos. Cierre inmediatamente la placa y deposítela en el contenedor de transporte. Las placas deben ser transportadas al laboratorio para su incubación, “preferentemente” dentro de 4 horas desde la toma de muestras, de manera de evitar la ocurrencia de contaminación. La superficie de contacto de cada placa es de 20 cm 2. Tras la preparación, del agar, este tiene una duración en almacenamiento de unos 3 meses, conservado a 2 – 4 °C en recipientes cerrados. Poco antes de preparar las placas, se debe fundir a 100 ºC la cantidad de agar necesario y mantenerlo entre 46 – 48 °C para posteriormente plaquear. Las placas se colocan en una cámara de flujo laminar y se incorpora el agar hasta que se obtenga una superficie convexa. Estas placas preparadas deben dejarse secar antes de su utilización, colocándolas en la estufa a 37 °C durante la noche en posición invertida. Lo anterior además constituye un eficaz control para determinar una posible contaminación durante la preparación. Las placas con colonias visibles se eliminan. Una vez preparadas las placas tienen una duración en almacenamiento de una semana a 2 – 4 °C, si se mantienen herméticamente cerradas en bolsas de plástico. En el mercado se comercializan placas.
Método de Hisopo o Tórula Materiales 1. Hisopos o tórulas estériles, de algodón alginato o rayón, de mango quebrable, envueltas individualmente. Certificadas libres de inhibidores. 2. Plantilla estéril de un área interna de 20 cm 2. 3. Tubo con 4 ml de solución de dilución o neutralizante 4. Tubo con 1 ml de solución de dilución o neutralizante para humedecer la Tórula. 5. Cuando se muestree en áreas curvas de pequeñas superficies, se debe cubrir los 20 cm 2 tomando como referencia la platilla, como por ejemplo, de 2 x 10 cm, de 1 x 20 cm u otra según la superficie a chequear. Esta podrá ser de metal, plástico o cartulina estéril.
Procedimiento
1. Las muestras se deberán recoger con hisopos o tórulas de algodón humedecidos con 1 ml de solución de dilución o neutralizante, de una superficie de 20 cm2 marcados con una plantilla estéril (Foto N° 1).
Foto 1
2. Si el muestreo se realiza inmediatamente después del proceso de limpieza y desinfección, se deberá usar una solución neutralizante. En áreas húmedas puede bastar con hisopos de algodón seco. 3. Los hisopos o tórulas se tomarán por el mango sin tocar el algodón. Se deben desenvolver del envaseantes de colocar el guante estéril (Foto N° 2).
Foto 2 4. Colocado los guantes estériles y ayudado por un técnico se saca la tórula para evitar contacto del guante con el envoltorio externo (Foto N° 3).
Foto 3 5. El monitor podrá contar con la asistencia de un técnico. 6.Se humedece la tórula introduciéndola en el tubo con la solución señalada anteriormente, para esto el técnico expone el tubo para evitar contacto del guante con el exterior. Presiona la tórula contra la pared interior del tubo para eliminar el excedente de líquido (Foto N° 4).
7. La superficie de muestreo se frotará diez veces de arriba hacia abajo, con una fuerte presión (Foto N° 5). Cada hisopo se recogerá en el tubo estéril que contiene los 4 ml de solución de dilución, para esto coloque la tórula en el tubo y quiebre o corte asépticamente el mango. Si el hisopo es colocado en otro recipiente estéril con diluyente, deberá especificarse en el protocolo el volumen exacto del diluyente, para realizar los cálculos posteriores.
Foto 5 8. Las muestras recogidas con los hisopos o tórulas se mantendrán entre 1 – 4 ºC hasta su procesamiento. Deberán ser transportadas “preferentemente” dentro de 4 horas y deben ser analizadas antes de las 24 horas desde su muestreo (Norma ISO 18593). Las tórulas una vez rotas deberán quedar en el interior del tubo para su envío al laboratorio (Foto Nº 6).
Foto 6 9. Los frascos deberán agitarse vigorosamente antes de realizar las diluciones sucesivas, en caso de ser necesario, o de efectuar la siembra.
Método de muestreo Los métodos de monitoreo microbiológico serán el método de la placa por contacto y la técnica del hisopo o tórula (usar uno u otro). El método de placa es aplicable sólo a superficies planas. El método de hisopo o tórula puede ser usado en todo tipo de superficies. La utilización de estos métodos se limita al análisis de superficies limpias, desinfectadas y secas. En el caso de no poder obtener
superficies secas, se deberá utilizar el método de hisopo de algodón seco. Se utilizarán siempre antes de comenzar la producción, nunca durante la misma. Si hay suciedad visible, la limpieza se considerará inaceptable y no se procederá a la evaluación microbiológica correspondiente a la (s) superficie (s) afectadas. La empresa deberá hacer un nuevo sorteo de otras superficies de contacto para realizar el reemplazo de las no tomadas. En el caso que el MVIO detecte este tipo de falla en su verificación semanal, deberá levantar una “Planilla de No Cumplimiento” y verificar que las acciones correctivas implementa das por la empresa corrigen la falta. Los resultados deben expresarse en UFC/cm 2 de superficie muestreada. Después del muestreo, si es necesario, la superficie debe ser limpiada y desinfectada ya que pueden permanecer trazas de nutrientes derivados del proceso de muestreo. Cuando se espera encontrar residuos de desinfectantes, deben adicionarse los neutralizantes apropiados al líquido de dilución y al medio usado en las placas de contacto, para prevenir el efecto inhibitorio de los desinfectantes sobre el crecimiento de los microorganismos
Método de Contacto con Placa de Agar Para el método de contacto con placa de agar, se aplican a cada localización de muestreo pequeñas placas Petri de plástico desechables (de un diámetro interior de 5,0 o 6,5 cm) con agar para recuento de colonia de bacterias (de conformidad con la versión vigente de la Norma ISO 18593) y otras con agar bilis-rojo neutro violeta cristal con glucosa (agar VRBG de conformidad con la versión vigente de la Norma ISO 18593). Presionar la superficie de contacto del agar firmemente contra la superficie a muestrear, sin realizar movimientos laterales. Los mejores resultados se obtienen con un tiempo de contacto de 10 segundos y una presión de masa de 500 gramos. Cierre inmediatamente la placa y deposítela en el contenedor de transporte. Las placas deben ser transportadas al laboratorio para su incubación, “preferentemente” dentro de 4 horas desde la toma de muestras, de manera de evitar la ocurrencia de contaminación. La superficie de contacto de cada placa es de 20 cm 2. Tras la preparación, del agar, este tiene una duración en almacenamiento de unos 3 meses, conservado a 2 – 4 °C en recipientes cerrados. Poco antes de preparar las placas, se debe fundir a 100 ºC la cantidad de agar necesario y mantenerlo entre 46 – 48 °C para posteriormente plaquear. Las placas se colocan en una cámara de flujo laminar y se incorpora el agar hasta que se obtenga una superficie convexa. Estas placas preparadas deben dejarse secar antes de su utilización, colocándolas en la estufa a 37 °C durante la noche en posición invertida. Lo anterior además constituye un eficaz control para determinar una posible contaminación durante la preparación. Las placas con colonias visibles se eliminan. Una vez preparadas las placas tienen una duración en almacenamiento de una semana a 2 – 4 °C, si se mantienen herméticamente cerradas en bolsas de plástico. En el mercado se comercializan placas.
3. Especifique los ensayos (análisis microbiológico) a realizar según sea el tipo de superficie.
