alat mikrobiologi

Pengenalan Alat dan Media A. Alat Untuk pemeriksaan mikrobiologi dilakukan peralatan, diantaranya sebagai berikut : 1. Mikroskop a. Mikroskop cahaya

Gambar 1. Mikroskop monokuler

Gambar 2. Mikroskop biokuler

Bagian-bagian mikroskop cahaya : 

Bagian statis : kaki mikroskop(base mikroskop(base), ), tiang mikroskop, tangkai mikroskop(neck  mikroskop(neck ), ), meja preparat( stage),  stage), makrometer(course makrometer(course focus), focus), mikrometer( fine course), course),  pengatur meja preparat (coaxial (coaxial stage controls) controls)



Bagian optik : buluh teropong, lensa obyektif, lensa okuler(eyepiece okuler(eyepiece))



Alat penerangan : lampu, diafragma, kondensor

Cara pemakaian mikroskop cahaya: 1. Membersihkan lensa dan cermin 2. Melihat sumber cahaya 3. Mencari medan penglihatan 4. Memasang preparat 5. Mengatur fokus 6. Paska penggunaan Untuk pemeriksaan mikrobiologi digunakan pembesaran antara 600-1000 kali (lensa okuler pembesaran 6 atau 10, lensa obyektif 100kali). Untuk cara ini dibutuhkan 

Minyak emersi



Lensa obyektif harus terendam dalam minyak emersi



Kondensor dinaikkan maksimal



Diagfragma dibuka selebar-lebarnya

 b. Mikroskop lapangan gelap/dark gelap/dark field: Mikroskop ini digunakan untuk melihat sediaan  basah. Bakteri masih hidup sehingga dapat dilihat pergerakannya yang khas. Bakteri tampak terang latar belakang yang gelap.

c. Mikroskop elektron Dengan menggunakan seberkas elektron yang difokuskan dengan magnet maka mikroskop elektron dapat menampakkan partikel-partikel secara terpisah yang terletak kurang 0,001µm satu terhadap yang lain. Virus dari garis tengah < 0,001- 0,2 µm dapat dengan mudah dilihat secara terpisah satu sama lainnya. d. Mikroskop fase Yang mendasari mekanisme cara kerja mikroskop adalah kenyataan bahwa gelombang cahaya yang melalui benda-benda tembus cahaya, seperti sel, akan keluar lagi dengan fase-fase yang berlainan tergantung pada sifat bahan yang dilalui. Suatu sistem optik khusus dapat merubah perbedaan fase ini ke dalam perbedaan intensitas, sehingga  beberapa struktur terlihat lebih gelap dari yang lainn ya, sehingga dapat digunakan untuk u ntuk memeriksa sel/bakteri hidup tanpa harus diwarnai terlebih dahulu.

2.

Autoclave 

Alat ini digunakan untuk mensterilkan bahan/alat/media dengan cara pemanasan basah (moist heat ) 0

Cara sterilisasi menggunakan autoclave (temperature autoclave (temperature 121 C selama 15 menit) 

Isi autoklaf dengan aquades secukupnya(4-5cm)



Masukkan sampel yang akan disterilkan kedalam dandang bagian dalam.



Penutup autoklaf diolesi vaselin tipis pada bagian luar yang akan menempel di badan autoklaf, kemudian tutuplah autoklaf dengan rapat, anak panah pada penutup

harus bertemu dengan garis di badan autoklaf. Buka katup klep (posisi tegak lurus).





 Nyalakan kompor atau listrik, tunggu sampai klep mengeluarkan uap dan mulai hitung selama lima menit, kemudian tutuplah katup hingga posisi horizontal. 0

Tunggu sampai jarum menunjukkan angka 15 PSI (121 C), biarkan pada posisi tekanan



15 PSI selama 15 menit. Setelah itu matikan listrik atau api lalu buka klep.

3.



Penutup autoklaf jangan dibuka dulu sebelum semua uap keluar.



Setelah itu buka penutup autoklaf.

H ot air ster il izer 

Fungsi : untuk mensterilkan alat dengan cara pemanasan kering (dry heat ). Untuk sterilasi  *

0

160 C selama 60 menit 0

* 170 C selama 40 menit 0

* 180 C selama 20 menit

4.

I ncubator 

Fungsi : 

Untuk mengeramkan mikroorganisme yang telah ditanam  pada media kultur.



Untuk menyimpan bahan pemeriksaan/spesimen



Untuk uji sterilisasi

5. Inspirator/koagulator Fungsi : untuk memadatkan dan mensterilkan media yang mengandung protein dengan cara  pemanasan basah dimana media tersebut tidak dapat disterilkan dengan autoklaf, misalnya  pada media Loeffler atau PAI dan media LJ (Lowenstein jensen) 6. Refrigerator Fungsi : 

Menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu media tersebut tidak rusak/berubah



Menyimpan untuk sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar tidak mengalami perubahan.



Menyimpan cakram antibiotika yang belum dipakai agar tidak berubah



Menyimpan stok mikroorganisme.

7. Alat-alat lainnya a. Timbangan Mechanical scales (Neraca ohauss)

 b. Colony counter

Analytical scales

c. Centrifuges

d. Vortex

e.Anaerobic jar

f. Rak pewarnaan

g. Ose

h. Cawan petri

i. Glass beaker

 j. Obyek glass & cover glass

k. Micropipette

l. Stirrer

m. Pipet Pasteur

n. Tabung

o. Jangka sorong

 p. Pipet filler/Rubber bulb

B. Media Dalam pemeriksaan laboratoris mikrobiologi penggunaan media sangat penting untuk isolasi, identifikasi maupun diferensiasi. Sedangkan media kultur adalah adalah beberapa nutrisi baik organik maupun anorganik yang dapat dalam bentuk cair, semi solid dan padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Untuk mendapatkan suatu lingkungan kehidupan yang cocok bagi pertumbuhan bakteri, maka syarat-syarat media, pembuatan media harus memenuhi beberapa hal dibawah ini : 1. Susunan makanan Dalam suatu media yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri haruslah ada : a. Air  b.  Nitrogen c. Sumber energy d. Vitamin dan mineral e. Gas f.

Solidifying agents 

Gelatin



Agar-agar

2. Tekanan osmose 3. Derajat keasaman (pH) 4. Temperature 5. Sterilisitas

Penggolongan media 1. Berdasarkan jenisnya dibagi menjadi dua, yaitu; a. Media Hidup

Terutama digunakan untuk menanam/mengisolasi virus, di samping itu sering  pula media hidup digunakan untuk mengetahui sifat-sifat tertentu dari bakteri misalanya: untuk mengetahui jenis Escherichia coli yang patogen digunakan tikus putih yang berumur 3-7 hari. Kebanyakan virus hanya dapat ditanam pada  bagian tertentu dari binatang, misalnya: ginjal kera, embryo ayam, dll b. Media buatan

Adalah media yang dibuat, berasal dari kumpulan zat-zat tertentu (organik dan anorganik). Untuk masing-masing bakteri membutuhkan susunan media yang  berbeda-beda. 2. Berdasarkan konsistensinya dikenal adanya :

a. Media padat (datar, padat miring, dan tegak)  b. Media setengah padat (semi solid) Misalnya : SSS (semi solid sucrose medium), MIO (motility indol ornithine). c. Media cair (ex: media gula-gula, media kaldu, kaldu pepton, kaldu darah) 3. Menurut isi dari media

a. Media basal -

Media basal padat

: kaldu agar, TSA (tryptone soy agar)

-

Media basal cair

: air pepton,kaldu pepton

 b. Media campuran

4. Berdasarkan tingkatannya dibedakan menjadi :

a. Media sederhana Hanya mengandung zat-zat kimia yang sederhana, misalnya :

-

Media larutan alkali pepton

-

Media gula-gula

 b. Media kaya Mengandung zat-zat kimia sederhana dan zat organik tingkat tinggi seperti : Serum, darah dan telur. 5. Menurut penggunaannya dapat digolongkan menjadi : a. Media kaya

Digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang tidak dapat tumbuh dalam media sederhana (ex: Gonococcus, Pneumococcus dll). Contoh : media agar darah, agar coklat, kaldu darah b. Media ekslusif

Media ini dibuat khusus untuk bakteri tertentu, dapat berupa : 1. Membuat pH sangat alkalis : - Media cair alkali pepton - TCBS untuk isolasi Vibrio cholera 2. Menambahkan antibiotik tertentu : - Chloramphenicol untuk jamur  Sabourraud - Kanamycine untuk bakteri anaerob  Brucella agar darah

c. Media selektif

Media ini mempunyai susunan sedemikian rupa, sehingga kuman yang dicari akan tumbuh dengan koloni yang khas. Contoh : media tellurit yang digunakan untuk isolasi Corynebacterium diphteriae, dimana koloni difteri akan berwarna hitam. d. Media pembiakan

Media ini digunakan bila dalam suatu material, kuman yang dicari jumlahnya sedikit dan atau terdapat kuman-kuman lain dalam jumlah besar. Oleh karena itu material perlu dimasukkan ke dalam media pembiakan, agar kuman yang dicari dapat tumbuh subur, sedang kuman yang lain akan terhambat pertumbuhannya. Contoh : -

media SC (selenite Cystein) broth yang digunakan sebagai media  penyubur untuk salmonella,

-

media alkali pepton cair yang digunakan sebagai media penyubur untuk vibrio

e. Media untuk mengetahui sifat biokimiawi bakteri terhadap berbagai macam zat

1. Media gula-gula Contoh : glukosa, maltosa, laktosa, sakarosa, manitol, xylose dll Yang perlu diamati apakah bakteri tersebut : - Memecah gula-gula menjadi asam dan gas - Memecah gula-gula hanya menghasilkan asam tanpa gas - Tidak memecah gula-gula

2. Media darah Dalam media ini dipelajari sifat-sifat bakteri terhadap darah,apakah bakteri tersebut : - Menghemolisa darah (β-streptococcus) - Hemodigesh terhadap darah (α- streptococcus) - Tidak berpengaruh terhadap darah (λ - streptococcus) 3. Media yang dapat digunakan mempelajari berbagai sifat bakteri, contoh : a. KIA (Kliger Iron Agar)

Dalam media ini (bentuknya miring) di samping mempelajari reaksi  bakteri terhadap kmponen penyusun media juga diperhatikan adanya  produksi asam atau perubahan warna dari merah ke kuning, baik pada daerah yang miring (slant) ataupun tusukan (butt). Dengan media KIA dapat dipelajari; Reaksi bakteri terhadap gula-gula (lactose dan dextrose) apakah bakteri tersebut: 

Menghasilkan asam dan gas



Tidak memecah kedua gula tersebut



Kemampuan bakteri membentuk H2S

Adanya ferri ammonium sulfat dalam media ini maka bila kuman tersebut membentuk H2S akan diikat sebagai Ferri sulfid yang akan terlihat berwarna hitam. b. TSI (Triple Sugar Iron)

Prinsipnya media ini hampir sama dengan KI-Agar hanya perbedaan  pokok adalah dalam media TSI mengandung tiga macam gula yakni: Dextrose, Lactose, dan Sucrose c. SSS (Semi Solid Sucrose)

Dalam media ini dapat dipelajari: 

Motility (pergerakan bakteri)



Reaksi bakteri terhadap sucrose

Di samping itu bila sucrose diganti dengan gula yang lain ( yang diperlukan) maka dapat diketahui kelakuan bakteri terhadap gula tersebut. d. LIA (Lysin Iron Agar)

Dalam media ini dapat dilihat kelakuan bakteri terhadap: -

L.Lysine

-

Kemampuan membentuk H2S

e. MIO (Manitol Indol Ornithine)

Dalam medium ini dipelajari :

f.

-

Pergerakan bakteri

-

Kemampuan bakteri menghasilkan Indol

-

Reaksi pemecahan ornithine

Media agar

Contoh:media agar padat miring

Disamping itu dewasa ini untuk menyimpan bakteri dalam jangka waktu yang lama (juga virus), dapat ditempuh dengan menyimpan o

o

 bakteri pada suhu kira-kira -60 C (minus 60 C).

Secara garis besar dan dipandang dari segi praktis, maka laboratorium Mikrobiologi membagi media yang dipakai sebagai berikut: 1. Media transport

A. BGS (Buffered Glycerol Saline) B. Cary dan Blair transport medium C. Amies transport medium D. Alkaline pepton water (air pepton alkalis) E. Stuart transport medium F. Kaldu pepton 2. Media untuk isolasi:

A. Kultur umum 1) Agar darah (untuk kultur dan angka kuman) 2) Agar coklat 3) DCLS (Deoxycholate Citrate Lactose Sucrose agar) 4) Media Tellurit 5) Media untuk pertusis (Bordet Gengou Agar) 6) Thayer Martin Medium 7) Mc.Conkey Agar

B. Penanaman Mycobacterium tuberculosa Loewenstein medium C. Penanaman bakteri anaerob 1) Brucella Agar Darah 2) Brucella Agar darah dengan kanamycin/antibiotik lain 3) Agar darah 4) Thioglycolat 5) Thioglycolat dengan antibiotik D. Leptospira Fletcher’s medium E. Bagian Mikologi Sabouraud Sabouraud dengan chloramphenicol F. Enterobacter 1) DCLS 2) TCBS 3) Mc.Conkey Agar 3. Enriched media (media penyubur)

A. Selenite Cystein Broth B. Larutan alkali pepton C. Kaldu darah D. Thioglycolat E. Gall kultur

4. Media untuk sensitivitas test

A. Mueller Hinton Agar B. DST Agar C. Supristol Agar D. BHI (Brian Heart Infusion) E. Agar Base 5. Media untuk identifikasi

A. Kultur umum 1) Media gula-gula 2) Deret media komplek untuk identifikasi kuman perut batang gram negatif B. Enterobacter 1)

KIA/TSI Agar

2)

SSS

3)

LIA

4)

MIO

5)

ACE (Acetat Agar)

6)

Urea broth

7)

MR (Methyl Red)

8)

VP (Voges Proskauer)

Beberapa contoh media Tryptic soy agar (TSA)

Tryptic soy agar, uninoculated Type: General Purpose: Cultivation of nonfastidious bacteria Interpretation:  Growth indicates nonfastidious bacteria present

Chocolate agar Chocolate agar, uninoculated Type: Enriched Purpose: Cultivation of fastidious organisms such as Neisseria or  Haemophilussp. Interpretation:  Some organisms grow on chocolate agar that do not grow on standard media Thayer-Martin agar Thayer-Martin agar, uninoculated Type: Enriched and selective; contains three antibiotics -- colistin (kills gram-negative coliforms), vancomycin (kills gram-positives), and nystatin (kills fungi) Purpose: To select for fastidious organisms, such as N.  gonorrhoeae, in patient samples containing large numbers of normal flora, such as from the female genital tract MacConkey (lactose) agar MacConkey agar, uninoculated Type: Selective and differential Purpose: Contains bile salts and crystal violet which selects for gram-negative enterics, differentiates lactose fermenters from nonfermenters. Can include sugars other than lactose for further differentiation (e.g., to differentiate enterohemorrhagic E. coli (EHEC), which does not ferment sorbitol, from other E. coli types which do) Interpretation:  Selects for nonfastidious gram-negatives; red colonies indicate fermentation of lactose, white colonies indicate no fermentation of lactose Hektoen agar Hektoen agar, uninoculated Type: Selective and differential Purpose: Detects lactose fermentation and H2S production, inhibits nonenterics Interpretation:  Lactose fermenters are yellow or salmon while nonfermenters colorless; H2S production causes black precipitate

Mannitol salt agar Mannitol salt agar, uninoculated Type: Selective and differential Purpose: Selects for staphylococci, which grow at high salt concentrations; differentiates Staphylococcus aureus from other staphylococci Interpretation: Staphylococcus aureus is yellow (ferments mannitol), other staphylococci are white Sheep blood agar Sheep blood agar, uninoculated Type: Differential and enriched Purpose: Determine types of hemolysis (i.e., α, β, γ) Interpretation: α, partial clearing, green or brownish ring; β, wide zone of clearing; γ, no clearing, nonhemolytic

Tube TSI slant LIA slant MIO Indole

Salmonella typhi Tube Indole = Negative TSI slant = Alkaline / Acid, no gas production and very weak hydrogen disulfide production LIA slant = Lysine decarboxylase positive, deaminase negative MIO agar = Motility negative, ornithine decarboxylase negative Urea slant = Urease negative Urea slant

TCBS untuk Vibrio cholera

Vibrio cholerae : Tumbuh sebagai koloni berwarna kuning Vibrio parahaemolyticus : Tumbuh sebagai koloni  berwarna hijau Staphylococcus aureus : Tidak tumbuh

SS (Salmonella Shigela agar)

Salmonella typhi: Koloni tak berwarna dengan bagian tengah berwarna hitam  Escherichia coli: Koloni berwarna merah muda

Citrat Agar

Citrat (+) : warna biru ( Klebsiella pneumonia dan Proteus mirabilis) Citrat (-) : warna hijau ( E. coli dan Shigella dysentriae)

KIA

MR (methyl red)

If the pH indicator (methyl red) is added to an aliquot of the culture broth and the pH is below 4.4, a red color will appear (tube on the left). If the MR turns yellow, the pH is above 6.0 and the mixed acid fermentation pathway has not been utilized (tube on the right)

VP (Voges-Proskauer)

If the culture is positive for acetoin, it will turn “brownish-red to pink” (tube on the left). If the culture is negative for acetoin, it will turn “brownish-green to yellow” (tube on the left)

Tugas mahasiswa :

1. Amati dan gambarlah alat dan media yang ada dalam demonstrasi (warna gambar sesuai dengan asli)! 2. Tuliskan fungsi dari masing-masing alat dan media tersebut ! 3. Buat laporan praktikum masing-masing kelompok satu laporan dengan ketentuan sebagai  berikut : 

Ditulis di folio bergaris (tulis tangan)



Terdiri dari :



o

Judul praktikum

o

Tujuan praktikum

o

Dasar teori

o

Alat dan bahan

o

Hasil pengamatan

o

Pembahasan

o

Kesimpulan dan

o

Daftar pustaka

Laporan dikumpulkan paling lambat seminggu setelah pelaksanaan praktikum.

Pemeriksaan Air Minum Secara Bakteriologis A. Syarat kualitas air minum

Dari segi kualitas, air minum harus memenuhi persyaratan fisika, kimia, bakteriologis dan radioaktif. Di Indonesia syarat kualitas air minum berdasarkan Kepmenkes RI adalah sebagai berikut: a. Syarat Bakteriologis Adapun persyaratan bakteriologis air minum ditentukan oleh ada tidaknya mikroorganisme patogen. Air minum harus bebas dari bakteri patogen karena bakteri  patogen dapat menimbulkan penyakit. Bakteri patogen biasanya berasal dari kontaminasi tinja. Air minum tidak boleh mengandung E. coli ( fecal coli) dalam 100 ml air yang dianalisis. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui adalah sebagai  berikut:

 No

1

Tabel 1. Syarat Bakteriologis Air Minum Parameter Satuan Kadar maksimum yang diperbolehkan Air Minum Jumlah per 100 ml 0  E.coli atau fecal sampel coli Air yang masuk sistem distribusi Jumlah per 100 ml 0  E.coli atau fecal sampel coli Jumlah per 100 ml 0 Total Bakteri sampel Coliform Air pada sistem distribusi Jumlah per 100 ml 0  E.coli atau fecal sampel coli Jumlah per 100 ml 0 Total Bakteri sampel Coliform 

2





3





Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum

 b. Syarat Fisik Syarat fisik air minum adalah air minum tidak boleh berbau, tidak boleh berasa, tidak boleh berwarna, dan jernih. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui adalah sebagai berikut: Tabel 2. Syarat Fisik Air Minum Parameter Warna Rasa dan bau Temperatur Kekeruhan

Satuan TCU -

Kadar maksimum yang diperbolehkan 15 -

0

0

C  NTU

Keterangan

Tidak berbau dan berasa

suhu udara ± 3 C 5

Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum

c. Syarat Radioaktivitas Syarat radioaktivitas air minum adalah air minum tidak boleh tercemar bahan-bahan  buangan radioaktif karena senyawa radioaktif yang memancarkan radiasi alfa (α) dan beta (β) dapat membahayakan kesehatan manusia. Kadar yang diisyaratkan dan tidak  boleh dilampaui: Tabel 3. Syarat Radioaktivitas Air Minum Parameter

Satuan

Gross alpha activity Gross beta activity

(Bq/liter) (Bq/liter)

Kadar maksimum yang diperbolehkan 0,1 1

Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum

d. Syarat Kimia Syarat kimia air minum yaitu air minum tidak boleh mengandung zat-zat yang  berbahaya dan beracun. Kadar yang diisyaratkan dan tidak boleh dilampaui oleh bahan kimia yang kemungkinan dapat menimbulkan keluhan pada konsumen sebagai berikut:

Tabel 4. Syarat Kimia Air Minum Berdasarkan Bahan Anorganik Parameter

Satuan

Ammonia Alumunium Klorida Tembaga Kesadahan Hidrogen Sulfida Besi Mangan  pH Sodium Sulfat Total zat padat terlarut Seng

mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l

Kadar maksimum yang diperbolehkan 1,5 0,2 250 1 500 0,05 0,3 0,1 6,5-8,5 200 250 1000 3

Sumber: Kepmenkes No.907/Menkes/SK/VII/2002 tentang persyaratan kualitas air minum

B. Pemeriksaan air minum secara bakteriologis

1. Standar Air Minum Standar air minum yang dipakai adalah dari WHO (Edisi III thn 1971). Semua sampel tidak boleh mengandung E. coli dan sebaliknya juga bebas dari bakteri Coliform. Standar WHO tersebut adalah:

(1) Dalam setiap tahun 95% dari sampel-sampel tidak boleh

mengandung Coliform dalam 100 ml; (2) Tidak boleh ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml; (3) Tidak boleh ada sampel yang mengandung Coliform lebih dari 10 dalam 100 ml; (4) Tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dari dua sampel yang  berurutan. 2. Frekuensi Sampling Lebih baik sering mengambil sampel dan diperiksa dengan cara yang sederhana daripada  jarang mengambil sampel walaupun cara pemeriksaannya lebih lengkap. Pengambilan sampel perlu ditingkatkan pada keadaan hujan deras terus-menerus, sangat panas, kecepatan aliran berkurang, angin kencang, dan angin yang berdebu.

3. Metode Sampling dan Pengirimannya Pada waktu sampling harus selalu dijaga agar tidak terjadi kontaminasi. Untuk itu digunakan botol steril yang tertutup ( screw cup) yang dibalut dengan celophan sebelum diotoklaf. Bila sampel yang akan diambil adalah air yang telah diklorinasi, botol diberi sedikit larutan Na2S2O3 misalnya 0,1 ml dari 3% Na2S2O3  tiap 100 ml air sebelum disterilkan. 4. Pengujian Bakteriologis dari Air Minum Pengujian bakteriologis terutama berhubungan dengan kesehatan konsumen dan meniadakan bakteri patogen untuk air minum. Karena kuman patogen biasanya ada dalam  jumlah kecil, maka tidak sesuai bila yang digunakan sebagai standar untuk pengujiian adalah ada atau tidaknya kuman patogen dalam air. Oleh karena itu adanya bakteri yang  berasal dari faeces dipakai sebagai indikator adanya kuman patogen dari kuman perut. Kuman patogen dapat berasal dari manusia, binatang (piaraan atau liar), dan burung. Walaupun demikian tidak dapat diasumsikan bahwa air dari persediaan yang tertutup untuk pabrik (diisolasi) dan distok akan bebas dari kuman perut, walaupun biasanya derajat kontaminasinya jauh berkurang. Yang biasa digunakan sebagai indikator dari  polusi faeces adalah  E. coli, Streptococcus faecalis, Clostridium perfingens, dan virus  perut. Pemeriksaan bakteriologis air minum terdiri dari: a. Pemeriksaan Kualitatif Pemeriksaan ini mempunyai langkah-langkah sebagai berikut: 1) Uji Presumptif (Presumptive Coliform Count), uji untuk mengetahui angka terkaan tertinggi (Most Probable Number) kuman Colilform  tiap 100 ml contoh air. Ada 2 metode yaitu; a) metode 155, digunakan bila contoh air yang akan diperiksa tampak

cukup jernih; b) metode 333, digunakan bila contoh air yang akan diperiksa tampak cukup keruh; 2) Uji Eijkman (Differential Coliform Test), uji ini untuk mengetahui angka terkaan tertinggi (Most Probable Number) kuman E. coli tiap 100 ml contoh air; 3) Completed Test, uji ini dilakukan untuk menegakkan diagnosa akhir kuman yang ditemukan pada Differential Coliform Test. 1) Uji Presumtif (Presumptive Coliform Count)/Metode 333 Pada metode ini terdapat tiga kelompok tabung reaksi yang berisi medium cair laktosa atau medium cair Mac. Conkey modifikasi dan tabung Durham (tabung kecil yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan mulut tabung menghadap ke  bawah). Kelompok pertama: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 10 ml medium, ditambahkan 10 ml contoh air. Kelompok kedua: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 1 ml medium, ditambahkan 1 ml contoh air. Kelompok ketiga: terdiri dari 3 tabung reaksi dan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 0,1 ml medium, ditambahkan 0,1 ml contoh air. Semua tabung reaksi o

tersebut diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Bila tidak terdapat cukup gas (<10%) pada tabung Durham, dinyatakan presumtif negatif, diinkubasi 24 jam lagi. Bila ternyata terdapat cukup gas (10% atau lebih) pada tabung Durham, dinyatakan  presumtif positif. Kemudian dicatat banyaknya tabung reaksi yang presumtif positif  pada masing-masing kelompok. Menggunakan tabel Mc Crady  untuk mengetahui  Most Probable Number  (MPN) kuman Coliform tiap 100 ml contoh air. 2) Uji Eijkman ( Differential Coliform Test )

Biakan tiap tabung reaksi yang presumtif positif ditanam pada tabung reaksi yang berisi medium cair Mac Conkey modifikasi dan tabung Durham. Kemudian o

diinkubasi pada suhu 44 C selama 24 jam. Bila terdapat gas, dinyatakan positif dan dianggap mengandung E. coli. Kemudian dicatat banyaknya tabung yang positif dari masing-masing kelompok. Menggunakan tabel  Mc Crady  untuk mengetahui  Most  Probable Number  (MPN) kuman E. coli tiap 100 ml contoh air. 3) Completed Test  Biakan dalam tiap tabung pada nomor 2 yang positif, ditanam secara goresan  pada lempeng agar  Eosin Methylen Blue  (EMB). Kemudian diinkubasi pada suhu o

37 C selama 24 jam. Koloni kuman  E. coli  pada medium agar EMB menunjukkan gambaran metallic sheen. Terhadap koloni ini dilakukan penanaman secara goresan o

 pada lempeng agar nutrien. Setelah diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, lakukanlah pewarnaan gram terhadap kuman yang tumbuh. Bila kuman yang diperiksa berbentuk batang gram negatif dan tidak membentuk spora, dikatakan completed test  positif.  b. Pemeriksaan Kuantitatif Pada pemeriksaan ini dilakukan perhitungan terhadap semua kuman yang tumbuh dari sejumlah contoh air yang diperiksa. Bila koloni kuman yang tumbuh  begitu banyak, hingga secara makroskopik tidak dapat dihitung, maka dipakai alat  penghitung koloni dari Quebeck . 1) Total Plate Count (TPC) Satu mililiter contoh air yang tidak diencerkan ditanam pada lempeng agar nutrien dengan metode tuang. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Kemudian dihitung jumlah koloni kuman yang tumbuh (bila perlu digunakan Quebeck Colony Counter ). Bila koloni yang ditemukan antara 30-300, jumlah tersebut menyatakan jumlah kuman tiap mililiter contoh air. Bila koloni yang tampak sukar dihitung secara langsung, dapat digunakan kotak-kotak berarsir pada alat  penghitung koloni ini sebagai pembantu. Kemudian dihitung koloni kuman pada 10 kotak berarsir, kemudian dihitung rata-ratanya. Bila angka tersebut dikalikan luas  permukaan medium, dianggap menyatakan jumlah koloni kuman yang tumbuh pada medium lempeng agar tersebut dan sekaligus menyatakan banyak kuman dalam sejumlah volume bahan cair (1 ml contoh air) yang telah ditanam pada medium lempeng agar itu. Tabel 5. Persyaratan air minum menurut WHO MPN Coliform MPN E. coli TPC

0/100 ml air 0/100 ml air 100 kuman/ml air

Tabel 6. Persyaratan air minum menurut Menteri Kesehatan RI MPN Coliform MPN E. coli TPC

C. Media spesifik pembiakan

0/100 ml air 0/100 ml air 200 kuman/ml air

E. coli 

Eosin Metilen Blue

Media ini mengandung zat warna eosin dan metilen blue, juga mengandung laktosa. Medium ini bisa membedakan kuman yang memfermentasi laktosa dan yang tidak memfermentasi laktosa.  E. coli  menimbulkan warna metallic sheen, karena asam yang dihasilkan akibat fermentasi laktosa akan membuat zat warna eosin dan metilen blue

mengadakan presipitasi dalam permukaan agar. Koloni kuman enterobactericeae  yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna. Gambar :

Cara kerja untuk menghitung MPN, uji coliform

Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.

Cara kerja : 1. Sediakan 9 tabung berisi LactoseBroth (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). 2. Kocok botol yang berisi air sampel. 3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama, secara aseptis. 4. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua, secara aseptis. 5. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 0,1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga, secara aseptis. 6. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. 7. Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.

Tabel 7. MPN metode 333

Contoh :



Didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 312 maka jumlah bakteri coliform adalah 120 sel/100 ml.