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Oscar Luis Gómez Villamil; (20132150025), Miguel Ángel Fandiño Palacios; (20131150070), Manuel Andrés Prieto Sáenz; (20131150037). 2 Heydi Narváez 1,2 Universidad Distrital Francisco José de Caldas 1 Estudiantes-Biología Molecular 2 Profesor Biología Molecular Bogotá D.C. 3-septimbre-2017
RESUMEN Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación a diferentes condiciones ambientales, para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer sus bases genéticas, es decir, como está organizada la información genética y que mecanismos de variación génica poseen, por tal motivo el siguiente informe tiene como objetivo presentar la metodología empleada que se llevó a cabo para la extracción de ADN plasmídico a partir del cultivo bacteriano de Escherichia de Escherichia Coli, y ADN genómico de los hongos de levadura Saccharomyces Cerevisiae, Cerevisiae, por la acción de detergentes no iónicos iónicos enzimas y calor. De lo que se concluye con cluye que el ADN plasmídico contiene todo la información info rmación genética esencial para la vida de la bacteria, bacteria, la cual se encuentra unida a una sola molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), y del ADN genómico a vista microscópica se observó el proceso de gemación que experimentan estos hongos unicelulares. PALABRAS CLAVES ADN plasmídico, ADN genómico, Bacteria, Levadura, Extracción de ADN, Proteínas, ácidos nucleicos. ABSTRACT The bacteria are microorganisms with an extraordinary ability to adapt to different environmental conditions, to understand the essence of this capacity it is important to know their genetic bases, i.e., how genetic information is organized and mechanisms of gene variation what have, for this reason the following report aims to present the methodology methodolog y that was held for the extraction of DNA plasmid from bacterial culture of Escherichia of Escherichia Coli, Coli , and genomic DNA from fungi of Yeast Saccharomyces Cerevisiae, by Cerevisiae, by the action of detergents, nonionic enzymes and heat. From which it is concluded that the DNA plasmid contains all the genetic information essential to the life of the bacterium, which is attached to a single molecule of deoxyribonucleic acid (DNA), and genomic DNA to microscopic view was observed the process of gemmation that they experience these unicellular fungi. KEY WORDS DNA plasmid, genomic DNA, Bacteria, yeast, DNA, proteins, nucleic acids.
INTRODUCCIÓN Toda la información genética esencial para la vida de una bacteria está contenida en una única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlaces covalentes. En las bacterias dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento.
fosfato unido a un monosacárido (llamado 2 ’desoxirribosa), al que se adhiere una base, a su vez los nucleótidos se unen entre sí en cadenas de poli nucleótidos por medio del hidroxilo 3 de la 2’-desoxirribosa de un nucleótido (fig. 2). [1]
El DNA El DNA está compuesto por cadenas de poli nucleótidos enroscados una alrededor de la otra en la forma de una hélice de doble. En su parte superior al igual que la inferior tienen el mismo aspecto, esto a causa de su naturaleza complementaria (fig1). La columna de cada cadena de la hélice está formada por residuos alternados de monosacáridos y fosfatos; las bases se proyectan hacia el interior pero son accesibles a través de los surcos mayor y menor. [1] La hélice doble se compone de dos cadenas de poli nucleótidos mantenidas juntas por enlaces no covalentes débiles entre pares de bases, la adenina de una cadena serie se aparea con timina en la otra cadena y, del mismo modo, la guanina siempre se aparea con la citosina; las dos cadenas tienen la misma geometría helicoidal pero el apareamiento de la cadena las mantienen juntas con la polaridad opuesta, (5’y 3’). Este modo de apareamiento entre las bases nitrogenadas trae como consecuencia una relación de complementariedad entre la secuencia de bases de las dos cadena entrelazadas y le imparte al DNA su carácter auto codificante. [1] La naturaleza del nucleótido, subunidad fundamental del DNA. Está presente en un
Figura 1. Tomada de Biología molecular del gen pag 108.
EL GEONOMA PROCARIOTA Es comparativamente, de pequeño tamaño y relativamente sencillo. Se reduce a un único cromosoma formado por una molécula circular de DNA, localizada en suspensión en el citosol pero anclada a la membrana constituyendo la zona nuclear o Nucleoide, sin membrana que la delimite. Es frecuente encontrar, además, una pequeña cantidad de material genético extra, no esencial, en forma de pequeña moléculas circulares de DNA, llamadas plásmidos. [2] Los plásmidos son fragmentos extracromosómico de ADN que se presentan en el citoplasma de los procariotas, presentan las siguientes características esenciales: es bicatenario y de forma circular, tienen un solo origen de replicación, regulan su propia
replicación a través de una proteína o RNA represor, pueden aparecer uno o varios en una sola célula procariota, los genes no son siempre los mismos puesto que codifican para enzimas que les dan ventaja para poder sobrevivir como lo son la resistencia, la capacidad de degradar sustancias, la fertilidad y virulencia, esta molécula es independiente del cromosoma de ADN y está separada de este mismo. Su facilidad para la reproducción y para combinarse con otros segmentos de ADN para formar ADN recombinante que puede generar varias copias de esta misma son una característica muy importante para que se usen como medios de clonación para segmentos de ADN. [3]
mayoría forma fimbrias y pilis, muchas cepas producen una pequeña micro capsula, y muy pocos elaboran macro capsulas y no fabrican esporas. En las pruebas bioquímicas es positiva al indol, decarboxilasa de linasa, fermentación de manitol y gas a partir de la glucosa; tiene su información genética en los plásmidos su genoma tiene un total de 5000 genes y su transcripción se encuentra el siguiente factor sigma.
EL GENOMA EUCARIOTA Debe distinguirse entre el genoma nuclear y el de los organelos; el genoma nuclear aparece bajo 2 formas estructuralmente diferentes a lo largo del ciclo celular: la cromatina como material filamentoso disperso por la mayor parte del núcleo en la interfase y los cromosomas fácilmente observables como entidades morfológicas o corpúsculos independientes en los momentos previos a la división celular. Ambas formas están constituidas por las mimas moléculas lineales muy largas de DNA bicatenario, estrechamente asociado a la proteína. El genoma de orgánulos (cloroplastos y mitocondrias) está formado por cromosomas circulares, al igual que el de procariotas para una mejor diferenciación se puede observar la siguiente tabla. [2]
LA ESCHERICHIA COLI Es un bacilo gramnegativo, con una sola cadena espiral de DNA móvil, aerobio y aerobio facultativo, co flagelos peritricos. La
EXTRACCION DE DNA
Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. 3. Purificación. Consta de 3 fases: • Precipitación del ADN. El ADN es
insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol y
recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. • Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
frío volviendo a centrifugarse • Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etilo y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos. El propósito de esta práctica consistió en la extracción de ADN plasmídico de una bacteria Escherichia Coli y ADN genómico del hongo de la levadura Saccharomyces Cerevisiae para un proceso siguiente que pretende cuantificar dicho ADN por un método de electroforesis en gel. SACCHAROMYCES CEREVISIAE La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen, de Saccharo azúcar, myces hongo y cerevisiae cerveza) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. En su ciclo de vida alternan dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas
biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. Tiene un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb).
METODOLOGÍA Tomada de la GUÍA N° 1 DE AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO DE LEVADURAS Y ADN PLASMÍDICO DE BACTERIAS (profesora: Heydi Narváez) ANÁLISIS Y RESULTADOS Extracción de ADN plasmidico de Escherichia Coli. La lisis alcalina es el método más utilizado para el aislamiento de plásmidos circulares, provenientes de células bacterianas. A continuación, se describe lo que ocurre en cada proceso. [6] a. Se remueve las células del medio de cultivo en caldo (centrifugación)
b. El sobrenadante es descartado, para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del huésped. c. Se re suspenden las células que contienen un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa (solución 1). La función que cumplen estos amortiguadores es inicialmente la re suspensión de las células, estos se encuentran en un sistema buffer a un pH 8 (pH básico), es decir a baja concentración de H+, favoreciendo la repulsión entre cargas negativas de los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, como también la repulsión entre cargas negativas de las cabezas polares de los fosfolípidos de las membranas celulares. Específicamente la utilización del quelante (EDTA), que contiene cationes divalentes (Ca2+, Mg2+), secuestra iones Mg2+ que son cofactores de las nucleasas impidiendo que estas enzimas degraden. Secuestra iones Ca2+ desestabilizando las membranas de las bacterias, además por ser una solución hipotónica favorece el ingreso de agua a las células por osmosis y se favorece su ruptura por la diferencia de presiones. [7] d. Ruptura de la membrana celular por la acción de NaOH y SDS (solución 2). El Dodecilsulfato sódico es utilizado para romper las membranas y paredes celulares. Es un detergente (tensoactivo) que golpea químicamente provocando agujeros en estos orgánulos celulares para que deshagan mecánicamente. Al romperlas es más sencillo obtener el ADN u otro contenido celular.
Figura 2. Dodecilsulfato sódico (esquema molecular). [7]
e. Unión de las hebras de ADN y remoción de contaminación al agregar acetato de potasio. Esto provoca que se cierre covalentemente el ADN plasmidico y la precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato). Después se procede a la precipitación del ADN plasmidico mediante etanol y una sal (Acetato de sodio). El etanol limpia el ADN de otras biomoléculas por medio de la precipitación. En este proceso el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean. [7] f. Enguaje del material genético con EtOH al 70%. Parte del ARN precipita, pero siempre quedan cantidades detectables de esta molécula, a menos que se utilicen RNasas durante el proceso de extracción.
Extracción de ADN genómico En primera instancia se procedió a la activación y visualización de las células de la levadura Saccharomyces Cerevisiae, a la cual se calentó agua desionizada hasta 40 °C, se disolvió azúcar y luego fue agregada la levadura, y se dejó reposar a temperatura ambiente sin entrada y salida de oxígeno. Lo que se quería demostrar con esto es que las levaduras son organismos unicelulares y realizan importantes funciones de nutrición e incorporación de energía que utilizan para sus procesos vitales, cuando se agregó sacarosa, que está compuesto por una molécula de glucosa y una fructosa, las levaduras utilizaron este azúcar como fuente principal de energía alimentándose de este carbohidrato y produciendo una liberación excesiva de CO2 altamente visible. Y al contener las levaduras se derivó a su posterior visualización en un microscopio óptico de luz visible, donde se observó los hongos unicelulares de la
levadura Saccharomyces Cerevisiae y el proceso de gemación que sufren estos organismos unicelulares.
el ADN que es soluble en agua por lo que se encontrará en la fase acuosa de la solución y los restos proteicos entre otros, que serán desnaturalizados por acción del fenol. [5]
CONCLUSIONES
Figura 3: Observación microscópica de los hongos de la levadura
Para la extracción de ADN genómico se utiliza buffer TE el cual tiene como propósito solubilizar el ADN mientras que lo protege de la degradación y buffer de lisis, que esta compuesto de NaCl 0,1M; Tris HCl 10mM pH 8,0; EDTA 1mM pH 8,0 y Tritón X-100 al 5%. Cuando los iones salinos del NaCl son atraídos hacia las cargas negativas pertenecientes a los grupos fosfatoo del ADN, permiten producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina. [4] Se empieza por romper las células mediante un detergente, en este protocolo se utiliza SDS, y a su vez por el empleo de esferas de vidrio de 0,5 mm que al ser expuestas al efecto producido por el vórtex, produce el rompimiento celular con mayor eficacia; vaciándose su contenido molecular en una disolución que en ese momento contiene ADN y una mezcla de restos moleculares, entre los que se pueden mencionar: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se fraccionan en cadenas más pequeñas y separadas por acción del detergente. El fenol: cloroformo se utiliza para precipitar
Se extrajo ADN de hongos de la levadura Saccharomyces Cerevisiae empleado un método tradicional cuyo ADN será implementado para posterior análisis electroforético, se logró observar mediante el microscopio óptico de luz visible, el proceso de gemación que sufren los organismos unicelulares. Para obtener DNA plasmídico este debe ser replicado en una célula anfitriona. Con frecuencia se utilizan cepas de E. coli por las facilidades que ofrecen para su manipulación y por ser un organismo muy estudiado, el cultivo bacteriano debe provenir de una sola colonia, la cual debe ser cultivada en 5 ml de medio líquido. Utilizando el agente selectivo adecuado (antibiótico)
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[5] Fraga, Rodríguez, Fuentes, Castex & Fernández. (2004). Comparación entre 5 métodos para la extracción de ADN de Triatomíneos: su utilización en la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Recuperado de Revista cubana de Medicina Tropical. [6] Pinto (2006). Guía de laboratorio de Biología Molecular: Preparación de DNA plasmídico por lisis alcalina con sds. PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL. UNIVERSIDAD DE SANTANDER Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Recuperado de: http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com /file/view/PRACTICA_No_4_EXTRAC CION_DNA_PLASMIDICO.pdf [7] Navarro, Sánchez, Urrego. (2014). Extracción de plásmidos y ADN en cromosómico en bacterias. Universidad de panamá, facultad de medicina, departamento de biología. Recuperado de http://es.calameo.com/read/00378924513 77bff8ba7b
