8. Manual de Inocuidad Microbiana de Los Alimentos

BENE BE NEM M RI RITA TA UN UNIV IVER ERSI SIDA DAD D AUT AUT NO NOMA MA DE DE PUEB PUEBLA LA FACULTAD FACUL TAD DE CIENCIAS CIENCIAS QU QU MICA MICAS S LICE LI CENC NCIA IATU TURA RA:: QU MI MICO CO FARMA FARMACO COBI BI LO LOGO GO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE L ABORATOR ABORATORII O I NOC NO CUI DAD M I CROBI ANA DE L OS ALI M ENTOS ENTOS

AUTORES: M. en C. JUAN CARLOS BENITEZ SERRANO. M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO. D en C. ANA MARTA DE LOS ANGELES LOBO SANCHEZ. M.S.P. JESUS LUZURIAGA GALICIA. D. en C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO. M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRÁN PADILLA. 2013

1



ÍNDICE NÚMERO DE

TÍTULO

PÁGINA

PRÁCTICA Práctica 1

Fundamentos del Lab. de Inocuidad Microbiana de los Alimentos

3

Práctica 2

Preparación de medios de cultivo

8

Práctica 3

Preparación de diluciones

11

Práctica 4

Recuento de bacterias mesofílicas aerobias por la técnica

14

vaciado en placa Práctica 5

Recuento de bacterias coliformes totales por la técnica de

18


Recuento de bacterias lácticas por vaciado en placa

21

Práctica 7

Recuento de hongos y levaduras por vaciado en placa

24

Práctica 8

Recuento de Staphylococcus aureus por aureus por la técnica de

27

extensión en superficie Práctica 9

Cuantificación de Bacillus de Bacillus cereus

30

Práctica 10

Determinación de bacterias coliformes totales en agua e

33

investigación de E. de E. coli en coli en alimentos por la técnica del número más probable (N.M.P.). Práctica 11

Investigación de Salmonella spp

36

Práctica 12

Cuantificación der Clostridium perfringens

41

Práctica 13

Investigación de Vibrio cholerae O1

44

Práctica 14

Determinación de Vibrio parahaemolyticus por parahaemolyticus por la técnica técnica

46

de N.M.P. Práctica 15

Determinación de Listeria de Listeria monocytogenes monocytogenes

48

Práctica 16

Análisis microbiológico microbiológi co de alimentos enlatados

52

Bibliografía

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ÍNDICE NÚMERO DE

TÍTULO

PÁGINA

PRÁCTICA Práctica 1

Fundamentos del Lab. de Inocuidad Microbiana de los Alimentos

3

Práctica 2

Preparación de medios de cultivo

8

Práctica 3

Preparación de diluciones

11

Práctica 4

Recuento de bacterias mesofílicas aerobias por la técnica

14


Recuento de bacterias coliformes totales por la técnica de

18


Recuento de bacterias lácticas por vaciado en placa

21

Práctica 7

Recuento de hongos y levaduras por vaciado en placa

24

Práctica 8

Recuento de Staphylococcus aureus por aureus por la técnica de

27

extensión en superficie Práctica 9

Cuantificación de Bacillus de Bacillus cereus

30

Práctica 10

Determinación de bacterias coliformes totales en agua e

33

investigación de E. de E. coli en coli en alimentos por la técnica del número más probable (N.M.P.). Práctica 11

Investigación de Salmonella spp

36

Práctica 12

Cuantificación der Clostridium perfringens

41

Práctica 13

Investigación de Vibrio cholerae O1

44

Práctica 14

Determinación de Vibrio parahaemolyticus por parahaemolyticus por la técnica técnica

46

de N.M.P. Práctica 15

Determinación de Listeria de Listeria monocytogenes monocytogenes

48

Práctica 16

Análisis microbiológico microbiológi co de alimentos enlatados

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Bibliografía

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DEPARTAMENT DEPAR TAMENTO O DE MICROBIOLOG MICROBIOLOG A

Práctica No. 1 Fundamentos del laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos Introducción. La Inocuidad Microbiana de los Alimentos es una rama de la Ciencia de los Alimentos, cuyo objetivo es ayudar a la elaboración de alimentos sanos inocuos o de buena calidad sanitaria, considerando sus características generales, su ecología, su resistencia al medio ambiente, su capacidad para sobrevivir y desarrollar en los propios alimentos, las consecuencias de ese desarrollo y los factores que influyen en todo esto. Actualmente son cuatro los grupos de interés sanitario, los que llenan el campo de acción de la Inocuidad Microbiana de los Alimentos: a) Microorganismos deterioradores. b) Microorganismos indicadores. c) Microorganismos patógenos, y d) Microorganismos útiles para el hombre

Los microorganismos deterioradores son aquellos que afectan las características organolépticas de los alimentos, con ellos se estudian los tipos de procesos que tienen lugar, las causas que los propician y desencadenan y los medios para evitarlos y controlarlos.

Los microorganismos indicadores, son aquellos que se agrupan en función de ciertas características morfológicas, fisiológicas y ecológicas a través de los cuales adquieren un significado especial. Estos grupos de microorganismos se consideran indicadores de fuentes de contaminación indeseable o de otro tipo de accidente que sugiere la comisión de malas prácticas higiénicas de trabajo durante el manejo del agua y de los alimentos.

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Los microorganismos patógenos, definidos como aquellos que pueden causar algún daño a la salud. Por razones obvias, en el presente manual se describirán sólo algunas de las bacterias patógenas vehiculizadas por alimentos.

Los microorganismos útiles para el hombre, son aquellos que se han adicionado intencionalmente a los alimentos con el propósito de proporcionar alguna característica organoléptica especial.

El Laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos, dentro de la Epidemiología y Tecnología de Alimentos, es un valioso recurso en cuestiones tales como: a)

Control de la calidad sanitaria de materias primas e ingredientes.

b)

Control de la potabilidad desde el punto de vista bacteriológico del agua.

c)

Diagnóstico de la calidad sanitaria de un producto terminado.

d)

Diagnóstico diferencial de la causa de alteración de un alimento.

e)

Evaluación de la eficiencia de los procesos de lavado y desinfección del equipo, utensilios y superficies de trabajo.

f)

Evaluación de la eficiencia de sustancias y agentes germicidas.

g)

Evaluación de la eficiencia de los procesos de pasteurización y esterilización.

h)

Diagnóstico de portadores asintomáticos de microorganismos patógenos entre el personal que maneja alimentos.

i)

Diagnóstico diferencial de la causa de un brote de gastroenteritis y otro tipo de infecciones o intoxicaciones asociadas al consumo de agua y alimentos.

j)

Rastreo de fuentes de contaminación.

k)

Investigación del comportamiento de especies microbianas en alimentos y otros sustratos.

l)

Estudio de la capacidad de autoconservación de un alimento en relación con su actividad microbiana.

m)

Estudio de la eficiencia y óptimas condiciones de operación de conservadores en los alimentos.

n)

Control de la pureza y actividad de los cultivos utilizados en la fabricación de alimentos.

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En el proceso de control la acción primaria que se pone en juego es la inspección. De ella puede emerger la necesidad de practicar análisis de laboratorio en muestras de alimentos, materias primas, especímenes humanos, superficies del equipo, agua, del producto durante su procesamiento o del medio ambiente.

Deficientes manejos en la recolección y transporte de la muestra conducen a resultados ajenos a la realidad que se pretende poner de manifiesto. La realidad es que el reporte de laboratorio refleja justamente la imagen microbiana de una parte del producto al tiempo que se retira la alícuota para iniciar el análisis, no por fuerza la que tenía toda la muestra al ser recolectada.

El pH, el contenido de humedad, la temperatura del medio, el potencial oxidorreducción, la acumulación de productos metabólicos, el agotamiento de nutrientes y otros factores se conjugan fatalmente y a través de efectos antibióticos, antagónicos, sinérgicos y aún mutagénicos, forman una constelación de efectos y mecanismos en los que difícilmente pueden sustraerse la flora microbiana en su conjunto o individualmente considerada.

Agréguese a lo anterior, que desde el punto de vista puramente analítico, los resultados del laboratorio dependen de: a)

Las condiciones en que se efectúo el muestreo y el transporte de la muestra.

b)

La técnica de análisis utilizada.

c)

La calidad de los reactivos y medios de cultivo.

d)

La destreza del técnico que ejecuta el análisis.

e)

El apego que observe el analista a la técnica prescrita.

f)

La presencia de sustancias que interfieren con el desarrollo microbiano, y

g)

El estado fisiológico de los microorganismos presentes.

Así el resultado es sólo una expresión convencional de la imagen microbiana de un producto, configurada en función de todos esos factores.

Al interpretar, por otra parte el resultado de un análisis de laboratorio hay que considerar otros elementos. La flora microbiana de un alimento está fuertemente condicionada por la tecnología utilizada en su fabricación y por la protección que se le confiera contra el ingreso de

5

microorganismos y su multiplicación. La abundancia y distribución de esos microorganismos en el medio ambiente a su vez se encuentra muy afectadas por las condiciones que en él imperen y aún por los hábitos de las comunidades. La falta de objetividad al interpretar el hallazgo y abundancia de determinados grupos de microorganismos lleva fácilmente a conclusiones erráticas.

RECUENTOS MICROBIANOS Con mucha frecuencia es necesario determinar el número de microorganismos que contiene el agua y los alimentos, durante su fabricación y control sanitario. Entre los objetivos perseguidos pueden citarse los siguientes: a)

Tendencia a correlacionar la abundancia de ciertos microorganismos en algunos alimentos y las condiciones sanitarias en las que fueron elaborados y/o conservados: bacterias mesofílicas aerobias en leche y hongos en mantequilla.

b)

Determinar la calidad sanitaria de las materias primas: cuenta microscópica en leche, hongos en salsa de jitomate, etc.

c)

Evaluar la eficiencia de un proceso de desinfección, purificación o pasteurización: coliformes en aguas negras, coliformes en ostiones, mesofílicos aerobios en equipos y envases.

d)

Determinar el adecuado funcionamiento de cultivos microbianos en la obtención de alimentos madurados: bacterias lácticas en quesos.

e)

La probabilidad de incriminar algunas bacterias como causa de toxiinfección alimentaria: S. aureus, C. perfringens y B. cereus.

f)

Grado de frescura que el alimento guarda: bacterias lácticas en salchichas.

g)

Determinación, en algunos casos, de la vida de anaquel de un alimento: bacterias psicrofílicas en leche cruda.

h)

La evaluación de los medios de cultivo y agentes bacteriostáticos que se incluyen en su formulación.

Dada la gran versatilidad de los microorganismos en cuanto a sus demandas nutricionales y condiciones

para

desarrollar

(tipo

y

concentración

de

nutrientes,

acidez,

potencial

oxidorreducción, salinidad, estado fisiológico de las células, etc.) y de las condiciones del material por estudiar (presencia de inhibidores, presencia de flora asociada, humedad, etc.) no es

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posible disponer de un solo medio de cultivo que permita la proliferación de todas las variedades, y dentro de cada una de éstas, de todas las células viables presentes. Por estas razones más que recuentos lo que estas técnicas proveen son medios para estimar contenido microbianos.

TECNICAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS TECNICA FUNDAMENTO VARIANTE GENERAL Directa sin cultivo Semi - indirecta con cultivo

Indirecta no hay recuentos

Cuenta individual células o grupos Cuenta individual de colonias

Microscopía

Requiere desarrollo Microbiano

Vaciado en placa Inoculación en superficie Filtro de membrana N.M.P. Reductasas

No requiere desarrollo Microbiano

Centrifugación Turbidimetría

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BENEM RITA UNIVERSIDAD AUT NOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QU MICAS LICENCIATURA: QU MICO FARMACOBI LOGO


Práctica No. 2 Preparación de medios de cultivo Introducción. Medio de cultivo es un sustrato que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Comercialmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular, aunque puede presentarse también hidratado y preparado. Por su aspecto físico, los medios de cultivo preparados pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos.

Medios líquidos: se emplean fundamentalmente para: a) Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos, y b) Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, y c)

Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.

Medios semisólidos: se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una con sistencia blanda.

Medios sólidos: se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Por su uso, se clasifican en: a) Medios de pre enriquecimiento: son líquidos y no contienen agentes inhibidores, su

función es revitalizar a los microorganismos estresados.

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b)

Medios de enriquecimiento: medios líquidos que contienen inhibidores y que por lo tanto estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros.

c) Medios selectivos y diferenciales: medios sólidos que contienen inhibidores y que por lo

tanto estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros. d) Medios de transporte: sirven para transportar los especímenes que contienen a los

microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.

Objetivo. Conocer la importancia de la preparación adecuada de los diferentes medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria.

Desarrollo. 1. Leer las cuidadosamente las instrucciones del fabricante, teniendo cuidado principalmente en las condiciones de esterilización o adición de algún material extra. 2. Hacer los cálculos necesarios para conocer la cantidad de medio de cultivo necesario de acuerdo al volumen que se va a preparar. 3. Seleccionar un recipiente de por lo menos el doble del volumen a preparar. 4. Medir la cantidad de agua necesaria y depositar una parte de esta en el recipiente seleccionado. 5. Pesar con ayuda de una balanza granataria o digital. 6. Agregar el medio en el recipiente, agitar suavemente y adicionar el resto del volumen de agua. 7. En el caso de los agares y de algunos caldos, disolver con ayuda de calor. 8. Ya disuelto, colocar en frascos o tubos. 9. Esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Cuestionario. 1. Defina ¿qué es un medio de cultivo? 2. ¿Cómo se clasifican?

9

3. ¿Cuál es la característica principal de un medio de pre enriquecimiento? 4. Qué diferencia existe entre un medio de cultivo de enriquecimiento y uno selectivo y diferencial?

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Práctica No. 3 Preparación de diluciones Introducción. Esta práctica está orientada a proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones para el examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo de aplicación, estas guías pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirse otros métodos diferentes.

Sin embargo, en todos los casos donde sea

posible se recomienda apegarse a estas guías y modificarse únicamente cuando sea necesario. La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.

Objetivo: Realizar las diluciones decimales necesarias para realizar los recuentos de los diferentes microorganismos de interés sanitario, utilizados para la determinación de su calidad sanitaria.

Desarrollo: Preparación de la dilución primaria. Muestras líquidas:

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Muestras líquidas como agua, leche, refrescos, etc., en las cuales la distribución de

I.

microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos. II.

Muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 min y homogeneizar agitando vigorosamente.

a) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 seg o 10 seg en Vortex. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. b) Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió.

Muestras sólidas o semisólidas. Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 y no más de 24 h antes de proceder a su análisis. a) Pesar una cantidad de 10 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado. b) Adicionar 90 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. c) Homogeneizar en el Stomacher por 1 min hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. d) Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensión. El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente).

Preparación de las diluciones decimales adicionales. a) Transferir 1 ml de la dilución primaria 1:10, en un tubo que contiene 9 mL de diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

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b) Agitar el tubo 25 veces en un ángulo de 30 cm durante 7 seg, o bien, durante 10 seg con ayuda de un agitador Vortex. c) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen de: i.

Existencia de una NOM o criterio microbiológico de aceptación.

ii.

Tratar de obtener una caja contable, y

iii.

Condiciones en que se encontraba la muestra durante su recolección.

d) Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. e) Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido. f) Mientras sé afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

Duración del procedimiento. En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.

Cuestionario. 1. ¿Por qué es necesario diluir la muestra? 2. ¿Cómo saber que diluciones debe utilizar? 3. ¿Qué tipos de diluyente puede utilizar? 4. ¿Cómo agitar los tubos en que se efectúan las diluciones?

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Práctica No. 4 Recuento de bacterias mesofílicas aerobias por la técnica de vaciado en placa Introducción. Este grupo de microorganismos indicadores es el que con mayor frecuencia se utiliza en la Microbiología Sanitaria. El recuento de colonias bacterianas en medios de cultivo con un adecuado soporte nutricional y libre de agentes inhibidores es ampliamente utilizado con diversos propósitos en el análisis de alimentos, perecederos o no, agua, equipo y otros productos. Se pretende contar el máximo número de microorganismos, y cuando la incubación se ha realizado entre 20-37º se le designa como “recuento de bacterias mesofílicas aerobias”.

El estudio de la flora bacteriana mesofílica aerobia es la prueba más utilizada para todos aquellos propósitos que tienden a explorar el efecto de diferentes agentes físicos y químicos en la microbiología de un alimento durante su fabricación o conservación, cuando no existe un problema concreto que implique el uso de otros grupos indicadores específicos. Solo las bacterias psicrotrófas la sustituyen o la complementan en el caso de los productos para los que suele emplearse la refrigeración.

Objetivo: Realizar el recuento de bacterias mesofílicas aerobias a partir de agua y alimentos e interpretar su significado sanitario.

Desarrollo: Preparación de material y de muestras 1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar.

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2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio. Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.

Preparación, selección y medición de la alícuota. 1. La muestra recolectada de un lote debe suponerse representativa de éste. Esa muestra a su vez es objeto de un nuevo muestreo cuando se extrae de ella la alícuota que se va a analizar. Habrá por tanto, de retirarla cuidando de no incurrir en una selección o contaminación. 2. Efectuar la medición o pesada sobre la mesa de trabajo dentro del orden y cuidado necesarios para evitar contaminaciones. El sobrante de la muestra conviene conservarlo en refrigeración, en previsión de algún accidente. 3. El retiro de la alícuota obliga al empleo de utensilios estériles y fácilmente manejables. Para este fin puede hacerse uso de cucharas, cuchillos, espátulas, abatelenguas y pinzas. 4. Cuando el producto es sólido y muy heterogéneo (alimento cocinado) macerar o dividir finamente una muestra grande (100-500 g) y a partir de ésa obtener la alícuota por analizar. 5. De especial interés es el tamaño de la alícuota. Puede establecerse que la precisión y exactitud de los resultados mejoran conforme se hace uso de una alícuota de mayor tamaño. Alícuotas menores a 10 g deben evitarse. 6. Los productos líquidos se miden con pipeta de capacidad conveniente, de preferencia con la correspondiente al volumen a medir.

Preparación de las diluciones. 1. Se requiere hacer diluciones por dos razones básicas: 

Un elevado contenido de microorganismos en el producto.



Tratase de una muestra sólida o insuficientemente fluida que dificulte su incorporación directamente al medio de cultivo.

2. Al preparar diluciones es necesario considerar algunos factores que pueden influir en el resultado: 

La grasa del alimento dificulta la dispersión homogénea de los microorganismos.



El fundamento de la técnica: una colonia se origina a partir de una sola célula viable.



La liberación de los microorganismos de algunos alimentos no ocurre con la misma facilidad.

15



El uso de la licuadora tiene efectos variados sobre los microorganismos y el alimento, por lo que se recomienda actualmente el uso de un homogenizador (Stomacher).



Se recomienda no exceder de 20 min desde que el producto fue puesto en contacto con el diluyente hasta su incorporación con el medio de cultivo.



Las mediciones de los volúmenes de muestras, diluciones e inóculos constituyen una importante fuente de error cuando la maniobra no se realiza en forma correcta.

3. Agitar los frascos o tubos con diluyente y muestra siempre en la misma forma: 25 movimientos en un arco de 30 cm completados durante 7 seg. Si existe una cantidad excesiva de partículas mayores en suspensión o grasa, dejar sedimentar o flotar y tomar la alícuota hacia el centro del recipiente.

Inoculación de las cajas. Colocar 1 mL de cada dilución en el fondo de la caja y destapar ésta solo lo suficiente para introducir la pipeta con una inclinación de unos 45ºC. No soplar.

Adición del medio de cultivo. 1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar cuenta estándar fundido y enfriado en baño María a 45-48ºC. Inmediatamente incorporar el inóculo al medio por rotación de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame de líquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas no excederá de 20 min y preferentemente 10 min. 2. Evitar prácticas viciosas como son la utilización de baños María con un nivel de agua por debajo del nivel del medio de cultivo en las botellas o matraces, introducir estos recién extraídos del autoclave, utilizarlos cuando la temperatura actual se encuentre muy por encima de los 46ºC o reutilizar sobrantes en los frascos para nuev as pruebas. 3. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en idéntica forma, omitiendo la adición de muestra. 4. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para cada caso.

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Incubación. La determinación de bacterias mesofílicas aerobias suele requerir de temperaturas y tiempos de incubación: que dependen del producto en estudio: 24 h en el agua, 48 en la leche y 72 en alimentos desecados.

Recuentos de colonias. El recuento de las colonias por sí mismo demanda cuidado, habilidad, conocimientos y responsabilidad a fin de incluir en el todas aquellas que han desarrollado y no más que puedan resultar por error o confusión.

Para efectuar el recuento es necesario contar con un contador de colonias tipo Quebec que permite la iluminación adecuada sobre un fondo oscuro, un buen aumento y una guía cuadriculada que facilita el trabajo.

La presencia de colonias extendidas, burbujas de aire, y partículas de alimento, son artificios que no el aparato, sino el analista debe ser capaz de interpretar.

Cuestionario: 1. ¿Cuál es el fundamento del recuento por la técnica de vaciado en placa? 2. ¿Qué superficie tiene la caja de vidrio? 3. ¿Cómo se agitan los tubos en que se hacen las diluciones? 4. ¿A qué temperatura se mantienen los medios de cultivo ya fundidos?

17



Práctica No. 5 Recuento de bacterias coliformes totales por la técnica de vaciado en placa Introducción. El concepto de bacterias coliformes, fue aplicado en un principio para referirse a todas aquellas bacterias semejantes a Escherichia coli. Los coliformes se definen como bacterias aerobias o facultativamente anaerobias, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de las primeras 48 h de incubación a 35º. De acuerdo con el desarrollo de las técnicas bacteriológicas, al diseñarse medios como el agar bilis-rojo violeta se encontró conveniente limitar el período de incubación de las placas a 24 h y por razones de orden práctico, aquellas colonias que presentan una determinada apariencia al término del periodo de incubación, se considera como coliformes.

Hay que hacer notar que existen cepas aberrantes (muestran cierta morosidad para fermentar la lactosa) que no se cuentan como coliformes por su comportamiento en esos medios.

Objetivo. Realizar el recuento de bacterias coliformes totales a partir alimentos e inte rpretar su significado sanitario.

Desarrollo. Preparación de material y de muestras. 1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar. 2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio. Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.

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Preparación de las diluciones. Seguir de la misma forma como se señala para el recuento de bacterias mesofilicas aerobias.


Adición del medio de cultivo. 1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar rojo violeta bilis fundido y enfriado en baño María a 45-48ºC. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio por rotación de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame de líquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la

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primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas no excederá de 20 min. 2. Una vez gelificado el medio, agregar una sobrecapa de 3 – 4 mL. 3. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en idéntica forma, omitiendo la adición de muestra. 4. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para cada caso.

Incubación La determinación de bacterias coliformes totales se incuban por 24 h a 35°C.

Recuentos de colonias. Solo se contaran aquellas colonias de color rojo o guinda con o sin halo rosa, redondas o elipsoidales y que se encuentren dentro del seno de agar.

Cuestionario. 1. ¿A que se debe el color rojo o guinda de las colonias en el agar rojo violeta bilis?

2. ¿Por qué se agrega una sobrecapa del medio de cultivo?

3. ¿Cuál es el significado de la presencia de bacterias coliformes en alimentos cocinados?

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Práctica No. 6 Recuento de bacterias lácticas, por la técnica de vaciado en placa Introducción. En la actualidad se definen como “bacterias Gram positivas, no esporuladas, fermentadoras de carbohidratos con producción del ácido láctico, tolerantes a los ácido (capacidad para desarrollar a pH relativamente bajos), catalasa negativa y hábitat no aeróbico”.

Todas las cualidades

admiten cierta flexibilidad, a excepción de la tinción de Gram. Entre los lácticos existen especies psicrófilas, mesófilas y termófilas. El grupo comparte entre sus miembros una característica significativa: son nutricionalmente exigentes.

Ecología. a) En vegetales: aunque no se recuperan constantemente a partir del suelo, al parecer esto se favorece con la participación de insectos. b) En los alimentos: existen normalmente en una gran variedad de alimentos tanto crudos (verduras y frutas) como procesados (lácteos y cárnicos) en número v ariable. c) En animales y hombre: las bacterias lácticas se localizan en el intestino, cavidad oral y vagina, donde juegan un papel importante en la salud. Materia fecal del hombre, pollos y cerdos: 300 millones UFC/g. En la cavidad oral pueden originar un efecto patógeno, ya que la dentina es susceptible a la acción de los ácidos provenientes de las fermentaciones. En la vagina, los lactobacilos constituyen parte de la flora normal. Su presencia se relaciona con una baja notable de la acidez de esta zona. Por mucho tiempo se pensó que solo L. acidophilus, constituía la única especie que colonizaba la vagina, pero estudios recientes han demostrado la presencia de L. plantar, L. fermenta, L. bullerais y otros.

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Objetivo. Realizar el recuento e identificación de las b acterias ácido lácticas a partir de productos fermentados comerciales.

Desarrollo. Preparación de material y de muestras 1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar. 2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio. Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.


Preparación de las diluciones. Seguir de la misma forma como se señala para el recuento de bacterias mesofílicas aerobias.

Inoculación de las cajas

22

Colocar 1 mL de cada dilución en el fondo de la caja y destapar ésta solo lo suficiente para introducir la pipeta con una inclinación de unos 45ºC. No soplar.

Adición del medio de cultivo. 1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar APT (Agar - Polimixina – Triptona) fundido y enfriado en baño María a 45-48ºC. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio por rotación de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame de líquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas no excederá de 20 min. 2. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en idéntica forma, omitiendo la adición de muestra. 3. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para cada caso.

Incubación. La determinación de hongos y levaduras se incuban a 30°C por 48 h.

Recuentos de colonias. Se contaran como bacterias ácido lácticas aquellas colonias de color blanco – amarillento, de 1 a 3 mm de diámetro.

Cuestionario. 1. ¿Qué características comunes presentan las colonias de bacterias ácido láctico?

2. Diferencie probiótico de prebiótico.

3. Cite por lo menos 2 medios de cultivo utilizados para el recuento de BAL?

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Práctica No. 7 Recuento de hongos y levaduras por la técnica de vaciado en placa Introducción. Los hongos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada.

Objetivo. Realizar el recuento de hongos y levaduras a partir alimentos e interpretar su significado sanitario.

Desarrollo. Preparación de material y de muestras.

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1. Estimar el número de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilución que se vayan a necesitar. 2. Anota clave, fecha y demás información que permita identificar la caja dentro del estudio. Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mínimo.


Preparación de las diluciones. Seguir de la misma forma como se señala para el recuento de bacterias mesofílicas aerobias.


Adición del medio de cultivo. 1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar papa dextrosa acidificado fundido y enfriado en baño María a 45-48ºC. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio por

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rotación de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame de líquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas no excederá de 20 min. 2. Incluir cada día y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en idéntica forma, omitiendo la adición de muestra. 3. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para cada caso.

Incubación. La determinación de hongos y levaduras se incuban a 22°C por 3 – 5 días.

Recuentos de colonias. Se contaran como hongos aquellas colonias de aspecto algodonoso de cualquier color, mientras que las colonias de levaduras, son de generalmente de color blanco, aunque algunas llegan a presentar diferentes colores.

Cuestionario. 1. ¿Qué función tiene el ácido tartárico adicionado al agar papa dextrosa?

2. ¿Qué significado tiene la presencia de hongos en los alimentos?

3. ¿Cuál es el significado de un elevado número de hongos en alimentos lácteos?

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Práctica No. 8 Recuento de Staphylococcus aur eus por la técnica de extensión en superficie Introducción. Las técnicas para el recuento de colonias por inoculación en superficie poseen atributos que para ciertos propósitos desplazan a las de vaciado en placa. Las técnicas más frecuentemente utilizadas son: la técnica de la gota de Miles y Misra y la de extensión en superficie. La técnica es utilizada para la cuantificación de S. aureus.

Entre las ventajas que presenta la técnica están: a) La disponibilidad de placas ya preparadas para efectuar las inoculaciones. b) Una mejor definición de la morfología colonial para fines adicionales al mero recuento. c) Una mayor probabilidad de disponer de subcultivos puros a partir de las colonias desarrolladas. d) Una condición más favorable para el desarrollo de los microorganismos aerobios estrictos. e) La omisión del daño que sufren algunas células durante el vaciado del medio de cultivo caliente (choque térmico). f) La presencia de partículas de alimento o la turbiedad del medio del cultivo que tanto dificultan el recuento de las colonias en la técnica de vaciado en placa, no tiene efecto alguno sobre los recuentos de las colonias desarrolladas en la superficie.

Esta técnica no se recomienda para recuentos menores de 3,000 UFC/g. o mL. S. aureus, son cocos Gram positivos, de 0.5-1.5 μ de diámetro, inmóviles y no esporulados. Se encuentran distribuidos en racimos, son facultativamente anaerobios, de metabolismo oxidativo y fermentativo. Son catalasa positivo, oxidasa negativo. Son halotolerantes (10% de NaCl). Su 27

temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC. Frecuentemente son recuperados a partir de alimentos, polvo y agua. Produce una toxina termoestable causante de intoxicaciones alimentarias. S. aureus es el típico microorganismo causante de una intoxicación alimentaria. Se ha estimado que éste microorganismo es el responsable de alrededor de un 13 a 30% de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s) en los Estados Unidos. Algunos autores marcan que el número en casos de dicho envenenamiento alimentario oscila aproximadamente entre 1 millón y 2 millones por año. La forma de contaminar a los alimentos es por toser o estornudar en los mismos, aunque usualmente es cuando se presenta un manipuleo por portadores asintomáticos.

Se han reportado que en casos severos se presentan calambres musculares y cambios transitorios en la presión sanguínea. La recuperación generalmente toma dos días, sin embargo, esto no es usual por completo, por lo que la recuperación puede tomar hasta tres días y algunas veces más tiempo en casos severos. Una vez remitidos los síntomas, la persona afectada no posee inmunidad demostrable frente a los sucesivos ataques. Aunque los animales se vuelven resistentes a la enterotoxina como consecuencia de la administración de dosis orales repetidas.

La cantidad mínima de toxina que se necesita para causar la enfermedad en el hombre es de aproximadamente 200 ng, aunque unos autores muestran que una dosis de toxina menor que un microgramo (μg) en un alimento contaminado puede producir síntomas de intoxicación alimentaria estafilocócica, éste nivel de toxina es alcanzada cuando la población del estafilococo excede las 100,000 cel/g.

Objetivo. Conocer un método alternativo de recuento de bacterias y valorar sus ventajas con respecto a la técnica de vaciado en placa.

Desarrollo. Preparación de material, muestras, selección y medición de la alícuota y de las diluciones. Semejante que en la técnica de vaciado en placa.

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Inoculación de las cajas Colocar 0.1 mL de cada dilución seleccionada sobre placas con Agar Baird Parker. Extender con ayuda de una varilla de vidrio, hasta que el inóculo se seque.

Incubación. Semejante que en la técnica de vaciado en placa.

Recuentos de colonias. Semejante que en la técnica de vaciado en placa.

Cuestionario. 1. Cite por lo menos 4 ventajas de la técnica de extensión en superficie, sobre la de vaciado en placa.

2. ¿Cuál es el medio de elección para el recuento de S. aureus a partir de alimentos?

3. Menciones las características morfológicas de S. aureus en ese medio de cultivo?

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Práctica No. 9 Cuantificación de Baci ll us cer eus Introducción. El interés sanitario por este microorganismo se ha manifestado hasta hace muy pocos años en América, aunque el primer reporte confirmado de su papel como agente etiológico de gastroenteritis se remota al año de 1950 en Europa.

Bacillus cereus pertenece al tipo de los bacilos aerobios esporulados, cuyo cuerpo no se deforma por la espora, es vacuolado y tiene un diámetro mayor de 0.9 micras por 2.9 a 5.2 de longitud. Forma cadenas cortas o hasta de 10 células y sus esporas son ovales y centrales o paracentrales. La bacteria es móvil y los extremos de su cuerpo cuadrados o ligeramente redondos. Es Gram positivo, aerobio, catalasa positiva, hidroliza el almidón, la caseína y fermenta la glucosa, sacarosa y trehalosa. Es Voges-Proskauer positivo y reduce los nitratos a nitritos. No fermenta la xilosa, lactosa, sorbitol, inositol, manitol, arabinosa, galactosa, manosa y dulcitol; no produce H2S ni indol. Produce beta hemolisis. El germen es resistente a la acción de la penicilina (penicilinasas) y produce fosfolipasas (lecitinasa C), prueba base para su identificación presuntiva y una toxina letal para el ratón.

B. cereus se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, hecho importante en el establecimiento de medidas para su control en los alimentos. Es un contaminante común de los productos lácteos.

Puede concretarse que la presencia de este microorganismo es un hecho común en los alimentos, especialmente en aquellos que han estado en contacto con el polvo o bien en otros

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alimentos cocinados o procesados, en los cuales el tratamiento antibacteriano aplicado (fumigación con óxido de etileno o de propileno, o el calor) no es bastante para destruir al germen presente en los ingredientes utilizados.

Ocasionalmente B. cereus al desarrollar en leche cruda o pasteurizada, puede dar lugar a alteraciones como proteólisis ácida, coagulación dulce y solidificación de la crema en partículas flotantes.

Aparentemente B. cereus no compite favorablemente con otros gérmenes saprófitos y más abundantes en los alimentos, lo que contribuye a explicar las bajas tasas de gastroenteritis que suelen observarse en el hombre por esta causa.

La gastroenteritis por B. cereus en el hombre está caracterizada por un período de incubación de 2 a 6 h y síntomas moderados consistentes en diarrea, náusea y dolor abdominal, no hay fiebre y la letalidad es del 0%.

Objetivo. Cuantificar Bacillus cereus a partir de alimentos involucrados en brotes de intoxicación alimentaria.

Desarrollo. Preparación de material, muestras, selección y medición de la alícuota y de las diluciones Semejante que en la técnica de vaciado en placa.

Inoculación de las cajas. Colocar 0.1 mL de cada dilución seleccionada sobre el Agar MYP (Manitol - Yema de huevo – polimixina), ya preparado y contenido en cajas de Petri. Extender con ayuda de una varilla de vidrio, hasta que el inoculo se seque.

Incubación. Incubar las placas ya inoculadas, a 30°C por 24 h en condiciones de aerobiosis.

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Recuentos de colonias. Serán consideradas colonias sospechosas de ser B. cereus, aquellas de color rosa, planas, con aspecto de vidrio esmeril y que presenten un halo transparente.

Cuestionario. 1. ¿Mencione las características morfológicas de B. cereus en el medio MYP?

2. ¿Tipo de hemolisis que produce B. cereus?

3. ¿A qué tipo de flora inhibe la polimixina?

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Practica No. 10 Determinación de bacterias coliformes totales en agua e investigación de E. coli en alimentos por la técnica del número más probable (N.M.P.) Introducción. N.M.P. es el valor que resulta de la estimación de un contenido microbiano, con base a la probabilidad, cuando se aplica una técnica en tubo de dilución múltiple en el análisis de un producto. Esta técnica se recomienda emplear cuando se estima que el grupo o microorganismos sometidos a estudio se encuentran en baja concentración ó se encuentran estresados.

En general la técnica del Número más Probable consta de tres pruebas: a) Prueba presuntiva: la cual se realiza en un medio líquido (caldo) sin inhibidores o con la presencia de estos a bajas concentraciones. Ejemplos: caldo lactosado, caldo lauril sulfato de sodio, caldo Mc Conkey, etc. b) Prueba confirmatoria: se realiza en medios líquidos o sólidos selectivos, y en ocasiones se recurre a la incubación a temperatura elevada. Ejemplos: caldo lactosa bilis verde brillante, caldo EC, agar TCBS, agar verde brillante, etc. c) Prueba completa: donde generalmente se recurre a la realización de pruebas bioquímicas que nos permitan identificar los diferentes microorganismos.

Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios subgrupos. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias pertenezcan a un solo género taxonómico. La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es que aunque, Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes

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que no producen gas de la lactosa o lo hacen después de 48 h, por lo que no se les identifica por medio de ésta técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha demostrado su efectividad. El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias (UFC) o el uso de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Objetivo. Conocer una técnica para estimar el número de coliformes, u otros grupos, presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP) después de la incubación a 35°C en un medio líquido.

Desarrollo. Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mínimo de una bacteria con 10 mL de producto líquido y una bacteria por gramo de alimento sólido.

Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100/mL o g de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.

Esta técnica establece el método microbiológico para estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP) después de la incubación a 35°C en un medio líquido.

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I.

Determinación de bacterias coliformes totales por la técnica de N.M.P. en agua:

a) Prueba presuntiva: transferir 10 mL de la muestra a 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado (se inoculan un total de 5 tubos). Utilizar una pipeta estéril para la inoculación de todos los tubos. Incubar los tubos a 35°C/24-48 h y observar si hay formación de gas.

b) Prueba confirmativa: de cada tubo con formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 3 mL de caldo lactosa bilis verde brillante. Incubar a 35°C/24-48 h.

Interpretación de resultados. Tomar los tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.

Informe de la prueba. “Número más probable (NMP) de colif ormes por 100 mL de muestra”

II.

Investigación de E. coli por la técnica de N.M.P. para alimentos: A partir de la muestra recolectada, separar 10 g de esta y colocarla en un frasco con 90

mL de diluyente. A partir de esta dilución, preparar las diluciones 1:100 y 1:1,000.

a) Prueba presuntiva: transferir 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio (se inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estéril para cada dilución. Incubación. Incubar los tubos a 35°C/24 h y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 h.

b) Prueba confirmativa: de cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 3 mL de caldo EC Incubar a 44.5°C/24 h.

Interpretación de resultados. Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.

Informe de la prueba. “Número más probable (NMP) de coliformes por g o mL de muestra”.

Cuestionario. 1. ¿Cuándo es recomendable utilizar la técnica del N.M.P.? 2. ¿De cuantas pruebas consta la técnica? 3. ¿Qué tipo de medio son los caldos lactosado y el EC-MUG?

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Practica No. 11 Investigación de Salmonella spp Introducción: Son bacilos Gram negativos aerobios o facultativamente anaerobios, móviles por flagelos perítricos, no esporulados, catalasa positiva, oxidasa negativa, fermentan la glucosa, producen gas, no fermentan la lactosa ni la sacarosa, no producen indol, no hidrolizan la urea, descarboxilan la arginina, lisina y ornitina, temperatura mínima de crecimiento 6.6-7.7ºC, con una temperatura óptima de 37ºC. Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección. Las modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.

Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de pre enriquecimiento, enriquecimiento, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.

La presente técnica para la determinación de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

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1.

Pre enriquecimiento. Es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo que permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.

2.

Enriquecimiento. Empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

3.

Aislamiento en medios sólidos. En este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.

4.

Identificación bioquímica. Este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

5.

Confirmación serológica. Es una técnica que permite la identificación plena del género e incluso el serotipo de Salmonella. Esta técnica es de gran importancia en el estudio de brotes de intoxicación alimentaria.

Objetivo. Investigar la presencia de Salmonella spp a partir de alimentos, mediante la utilización de pasos de pre-enriquecimiento, enriquecimiento, aislamiento selectivo y diferencial, identificación bioquímica y confirmación serológica.

Desarrollo. Preparación de la muestra. El siguiente método se basa en el análisis de 25 g. de la muestra en una proporción de 1:10 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.

Pre enriquecimiento Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador (Stomacher). Adicionar 225 mL del medio de pre enriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado) y homogenizar en Stomacher si es necesario durante 1 min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con

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la tapa bien enroscada. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8+0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24+2 h. a 35°C.

Enriquecimiento. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los recipientes con los cultivos de pre enriquecimiento y agitar suavemente, transferir 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml. de caldo tetrationato adicionado de 0.2 mL de yodo y a otro con 10 mL de caldo RappaportVassiliadis. Incubar de 18-24 h. a 43 y 35°C respectivamente.

Aislamiento de Salmon ell a. Al término de la incubación, mezclar los tubos de enriquecimiento, estriar en agar verde brillante y agar sulfito de bismuto. Incubar las placas por 24-48 h a 35°C, respectivamente.

Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella de acuerdo con las siguientes características: a) Agar verde brillante: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por un halo rojo, las bacterias fermentadoras de la lactosa dan co lonias verdes o verde-amarillas. b) Agar sulfito de bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras: con o sin brillo metálico. Generalmente presentan un halo café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.

Identificación bioquímica. Seleccionar las colonias típicas de cada medio selectivo que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular tubos con: agar triple azúcar hierro (TSI) y agar hierro lisina (LIA) (por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo), y medio MIO (por punción). Incubar por a 35°C/24 h.

Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: a) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original

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debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico. b) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen H2S en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción. c) Medio MIO: Se observa un color gris-púrpura debido a la descarboxilación de la ornitina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del medio.

Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas serológica s.

Identificación serológica. Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en LIA. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente 1 min Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva

La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.

Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.

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Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes). Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.

Si no se cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio

de

Enterobacterias

del

Instituto

Nacional

de

Diagnóstico

y

Referencia

Epidemiológicos de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública. Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (antisuero polivalente H).

Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35° hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticasaína e incubar a 35ºC/24 h (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2.5 mL de solución salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

Colocar 0.5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13x100 mm aproximadamente). Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina formalizada con 0.5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de 1 h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.

Cuestionario. 1. ¿Qué enfermedades producen los miembros del género Salmonella? 2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el ejecutar la etapa de pre-enriquecimiento? 3. ¿Cuál es el límite permitido de Salmonella en alimentos? 4. ¿A qué temperatura debe incubarse el caldo tetrationato?. Justifique su respuesta.

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Practica No. 12 Cuantificación de Clostr idi um

per fr in gens

Introducción. C. perfringens es un microorganismo que normalmente se encuentra en el contenido intestinal del hombre y de muchos animales, así como en el suelo y en el agua. Es probablemente la bacteria anaerobia patógena al hombre más extensamente estudiada. Durante los pasados 90 años, esta bacteria había sido asociada más cercanamente con la gangrena gaseosa.

C. perfringens es un bacilo anaerobio estricto, Gram positivo, con longitud variable de 3 a 8 por 0.4 a 1.2 μ de ancho, es inmóvil y está rodeada por una cápsula; la espora que forma es oval, terminal y más ancha que el cuerpo bacteriano. Produce beta hemólisis, licua la gelatina y en medios con yema de huevo, las colonias se observan con un halo de opalescencia. Reduce los nitratos a nitritos, fermenta la glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, no produce catalasa; su pH y temperatura óptimos de crecimiento es de 7.2 y 30-47ºC, respectivamente. Fermenta la leche en forma tormentosa.

Objetivo. Realizar el recuento de una de las bacterias anaerobias más frecuentemente involucrada en intoxicaciones alimentarias.

Desarrollo. 1. Se recolectan muestras entre 25 y 30 g en frascos estériles y se transportan en enfriamiento rápidamente para su procesamiento y análisis. En un área estéril, auxiliándose de cubiertos en las mismas condiciones, se pesan 15 g de la muestra del alimento en el interior del vaso de una

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licuadora previamente tarado. Se adicionan 135 mL de agua peptonada al 1% y sé licuan durante 1 min (dilución 1:10). 2. Se continúan las diluciones decimales en tubos conteniendo 9 mL de agua peptonada al 1% a partir de la dilución 1:10, hasta la dilución 1:100,000. Los tubos deberán agitarse 25 veces en un ángulo de 30 cm durante 7 seg. 3. Se inocula por la técnica de extensión en superficie, 0.1 mL por dilución en una caja de Petri conteniendo 20 mL de Agar SFP (Shahidi-Ferguson-Perfringens) y en otra con Agar TNS (Triptosa-Sulfito-Neomicina), se deja que se absorba la muestra en la superficie y se agrega una sobrecapa de 10 mL de medio basal, estéril y mantenido a 45ºC. 4. Incubar en anaerobiosis a 35ºC/18-24 h. 5. perfringens forma colonias típicas negras de 2-4 mm de diámetro con un halo opalescente. Se selecciona la placa que contenga entre 50 y 100 UFC sospechosas. Reportar este dato, considerando la dilución de la muestra, como el contenido presuntivo de C. perfringens/g de alimento. 6. Confirmar el estudio de la siguiente forma: 

Transferir por separado 10 colonias bien aisladas de la placa seleccionada a tubos con caldo tioglicolato. Incubar a 35ºC/18 a 24 h en anaerobiosis.



Tomar una asada del caldo incubado y realizar un frotis que será tenido por la técnica de Gram, con la finalidad de comprobar la pureza del cultivo. En caso de estar contaminado, se hace una resiembra en placas de SFP o de TNS.



Si se cuenta con un cultivo puro, se inoculan tubos con: gelatina-lactosa, leche tornasolada y movilidad-nitrato. El primer y el tercer tubo se inoculan por picadura y se sellan con una sobrecapa de aceite mineral. El segundo tubo se inocula con 1 mL de caldo tioglicolato adicionado con una pipeta Pasteur en el fondo del tubo. Se incuban a 35ºC/18-24 h en anaerobiosis.

En el medio de gelatina-lactosa, C. perfringens produce compuestos ácidos (amarillo) y gas e hidroliza la gelatina aún después de 10-20 min de refrigeración, fermenta la leche en forma tumultuosa y en el medio de movilidad-nitrato, después de la adición de alfa-naftil amina (0.5 mL.) y ácido sulfanílico (0.5 mL), produce una coloración entre rosa y rojo en un periodo de 15 min como máximo y la bacteria es inmóvil. A partir del porcentaje de colonias confirmadas y del

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número de colonias presuntivas contadas en la dilución de la placa seleccionada, calcular en número de bacterias por gramo de alimento muestreado.

Cuestionario. 1. ¿En qué condiciones de atmosfera, debe incubar las cajas para la investigación de Cl. perfringens?

2. La prueba debe ser cuantitativa o cualitativa. Explique su respuesta.

3. ¿Qué tipo de toxina es la producida por este microorganismo?

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Practica No. 13 Investigación de Vi bro cholerae O1 Introducción: Pertenece

a

la

familia

Vibrionaceae,

filogenéticamente

cercana

a

la

familia

Enterobacteriaceae. Mide de 1.5 a 3  de longitud por 0.5 a 0.8  de diámetro, posee cápsula. Se presenta solo, en parejas o cadenas cortas, que semejan espirilos. Durante el cultivo prolongado los vibriones pueden convertirse en bacilos rectos, que se parecen a las bacterias intestinales Gram negativas, estos microorganismos son oxidasa positivos, con excepción de V. metschnikovii. No son halofílicos pero necesitan trazas d e iones sodio para su crecimiento. Se encuentran en hábitat acuáticos en una gran variedad de salinidad. Son muy comunes en ambientes marinos, algunas especies se encuentran sobre la superficie y en el contenido intestinal de animales marinos. También se pueden encontrar en agua dulce donde sobreviven unas horas y algunas semanas si esta se encuentra contaminada con materia orgánica y tiene un pH entre 6 y 9. Es susceptible a la desecación, la ebullición, el cloro, otros desinfectantes y a las tetraciclinas. V. cholerae sobrevive por periodos hasta de 7 días fuera del organismo, especialmente en ambientes húmedos y templados. V. cholerae sé subclasifica con base en sus antígenos somáticos (Ag O), en 139 serovares que se denominan con números, de tal manera que se hace referencia a V. cholerae 01, V. cholerae 02, etc. Es común referirse a todos los serovares diferentes de V. cholerae 01, como V. cholerae NO 01. Existen 2 biotipos de V. cholerae 01: el biotipo Clásico y el biotipo El Tor, que pueden ser considerados como dos variantes de un mismo microorganismo. Para fines de diagnóstico no se requiere especificar el biotipo y ambos pueden tomarse como similares. A su vez ambos biotipos pueden subdividirse en los subtipos Inaba, Ogawa e Hikojima.

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Objetivo. Aislar e identificar a Vibrio cholerae, a partir de agua y productos de origen marino.

Desarrollo. Agua Es recomendable utilizar la técnica del Hisopo de Moore o de la torunda, la cual se expone a la corriente por un periodo de 18-24 h. a) El hisopo es transportado al laboratorio en frascos que contengan 450 mL de agua peptonada alcalina, de preferencia con pH 10.0. En ellos mismos se incuban por 18-24 h. a 35ºC. b) Finalizada la incubación, a partir de la superficie del agua peptonada alcalina, se tomara de una a tres asadas y se inoculará una placa con agar TCBS. Estas se incuban de 18-24 h a 35ºC. V. cholerae, produce colonias amarillas, de 3 a 5 mm de diámetro, planas con bordes regulares. c) A partir del TCBS, seleccionar las colonias características e inocular tubos con agar TSI, LIA, MIO y agua peptonada. Incubar a 35ºC por 18-24 h. V. cholerae, acidifica el TSI, es lisina y ornitina descarboxilasa positiva, es móvil y produce indol. d) De obtenerse una bioquímica típica de V. cholerae, confirmar serológicamente con antisuero polivalente O y antisuero específico

Alimentos. a) Colocar 50 g de muestra en 450 mL de agua peptonada alcalina. b) Homogeneizar en licuadora por 1 min e incubar a 35ºC por 18 - 24 h. c) Continuar como se indica en el inciso b para el análisis de V. cholerae en agua.

Cuestionario. 1. ¿Qué tipo de alimentos pueden ser considerados como vehículo de transmisión de V. cholerae? 2. Describa la morfología colonial de V. cholerae en el agar TCBS?? 3. ¿Qué significa TCBS? 4. ¿Cuál es el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria?

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Practica No. 14 Determinación de Vi bri o par ahaemolyticus por la técnica de N.M.P. Introducción: V. parahaemolyticus fue conocido primeramente en Japón como patógeno transmitido por alimentos 15 años antes de que lo fuera en Estados Unidos de Norteamérica. Se sabe que en Japón provoca de 300 a 500 brotes anuales, ocupando cuando mucho la primera causa de gastroenteritis de etiología conocida.(5,7)

El descubrimiento de V. parahaemolyticus se originó a partir de un brote de intoxicación alimentaria ocurrido el 21 de Octubre de 1950 en Osaka, Japón; en el cual de 272 pacientes que sufrieron gastroenteritis aguda, 20 murieron. El alimento sospechoso de esta intoxicación fue una sardina semiseca nombrada en japonés “shirasu”. El 23 de Octubre los investigadores iniciaron inmediatamente un estudio para determinar al agente causante de la enfermedad en el Instituto para Enfermedades Microbianas, en la Universidad de Osaka.

Objetivo. Estimar el contenido de Vibrio parahaemolyticus a partir de productos de origen marino, mediante la técnica de N.M.P.

Desarrollo. a) Prueba presuntiva. Transferir 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de agua peptonada alcalina (se inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estéril para cada dilución. Incubación. Incubar los tubos a 35°C/24 h y observar si hay turbidez.

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b) Prueba confirmativa De cada tubo que muestre turbidez, tomar una azada y sembrar en un número igual de placas con Agar TCBS. Incubar a 355°C/24 h.

c) Prueba completa. De cada placa con Agar TCBS que contenga colonias azules, planas de 3 – 4 mm de diámetro, inocular un juego de pruebas bioquímicas (TSI, LIA y MIO ajustadas al 3% de sal).

Interpretación de resultados. Tomar la serie de tubos de la prueba completa y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.

Informe de la prueba. “Número más probable (NMP) de V. parahaemolyticus por g o mL de muestra”.

Cuestionario. 1. ¿Qué tipo de enfermedad produce V. parahaemolyticus?

2. ¿Por qué es importante estimar el contenido de V. parahaemolyticus a partir de alimentos?

3. ¿Qué tipo de medio es el Agar TCBS?

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Practica No. 15 Determinación de L ister ia monocytogenes Introducción. Es una bacilo Grampositivo, no esporulado, movilidad positiva a 25ºC, crecimiento aerobio a microaerófilo, con metabolismo fermentativo, producción de ácido, pero no de gas a partir de la glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa, no presenta cápsula. Se encuentran ampliamente distribuidas (suelo, agua y vegetación). Causan infecciones en peces, aves y mamíferos (aborto en vacunos y borregos). Por lo tanto es considerada una enfermedad ocupacional. Produce listeriosis, cuyas manifestaciones clínicas son: meningitis, infección en órganos sexuales femeninos, infecciones en recién nacidos o sepsis neonatal (desde conjuntivitis hasta neumonías y por lo tanto la muerte). En adultos produce faringitis febril y daño a nivel de S.N.C. La bacteria tiene tropismo positivo hacia S.N.C. y placenta. La listeriosis se presenta en pacientes inmunocomprometidos.

Para la investigación de Listeria se recomienda el procedimiento propuesto por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), el cual incluye enriquecimiento primario en caldo UVM (caldo de enriquecimiento universal de Vermont) durante 24 h a 30ºC seguido de enriquecimiento en caldo Fraser; de los tubos positivos (ennegrecidos), se procede a su aislamiento en agar MOX (Oxford modificado) y agar LPM (Litio-Feniletanol-Moxalactamo). Las colonias sospechosas de Listeria se identifican mediante pruebas bioquímicas, morfológicas y serológicas. Este método debe realizarlo un microbiólogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas de producción de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta técnica por ningún motivo debe

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aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.

Objetivo. Aislar e identificar a la actualmente considerada una bacteria más frecuentemente involucradas en brotes y casos de enfermedades asociadas al consumo de alimentos.

Desarrollo. Procedimiento de enriquecimiento. Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior. Colocar 25 mL o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 mL de medio de enriquecimiento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen células de Listeria spp dañadas, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0.1 % (p/v) incubado a 30ºC por 6 h sin suplementos. Después de las 6 h de incubación los suplementos deben agregarse y continuar la incubación a 30ºC hasta un total de 48 h.

Aislamiento. Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ángulo de 45º (iluminación de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. Ver la figura 1. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono café oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. Seleccionar cinco o más colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente más de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse como mínimo cinco colonias.

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Identificación. Entre las pruebas bioquímicas utilizadas se encuentran las siguientes: a) Prueba de movilidad en fresco. Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina al 0.85%. La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersión en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las células de Listeria son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria. b) Prueba de catalasa. Las especies de Listeria son catalasa positiva. Nota: Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas. c) Tinción de Gram. Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos Gram positivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. d) Prueba de hemólisis. Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura. e) Prueba de reducción de nitratos. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe agregar 0.2 mL del reactivo A y 0.2 mL del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa - naftilamina, que es carcinogénica. f) Prueba de movilidad en agar. Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-25ºC), observar diariamente. Las especies de Listeria son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas.

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g) Prueba de utilización de carbohidratos. Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una coloración amarilla indica una prueba positiva. Todas las especies de Listeria dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa.

Cuestionario. 1. ¿Defina que es listeriosis?

2. ¿Cuál es la población más frecuentemente atacada por esta bacteria?

3. ¿Cuáles son los alimentos más frecuentemente contaminados con Listeria spp?

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Práctica No. 16 Análisis microbiológico de alimentos enlatados Introducción. Los productos objeto de esta norma por su naturaleza se clasifican en: 1. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético con pH < 4,6. a) Alimentos sometidos a tratamiento térmico envasados asépticamente. b) Alimentos ácidos y poco ácidos-acidificados, fermentados, encurtidos, alimentos elaborados a base de frutas (como jugos, néctares, mermeladas, jaleas, ates, etcétera) y frutas envasadas en recipientes de cierre hermético y sometidas a tratamiento térmico. 2. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético con pH > 4,6.

a)

Vegetales, productos cárnicos, platillos preparados con carne, productos lácteos y mezclas, envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico que asegure su esterilidad comercial.

b)

Alimentos sometidos a tratamiento térmico envasados asépticamente.

3. Otros productos con las mismas características y sujetos al mismo proceso.

Objetivo. Conocer la metodología para llevar a cabo el análisis microbiológico de productos enlatados.

Desarrollo. Examen microbiológico de latas no alteradas. Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes, que resistieron el tratamiento térmico debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias pudieran desarrollarse, produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el

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consumidor.

Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos

termofílicos, las cuales son muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones normales de almacenamiento y no producen problemas de descomposición del producto ni representan un peligro para el consumidor. La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse por la observación y análisis del contenido del producto, su apariencia, color, olor, pH y examen microscópico. Estas observaciones se hacen después de la incubación de las latas y siempre comparándolas con otras no incubadas. Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto después de incubarse presenta cualquier cambio, ya sea en apariencia, olor, color, pH, o bien presencia de gas o espuma, proceder como se indica en 5.1 o 5.2, dependiendo del pH del alimento.

Examen microbiológico de latas alteradas. Este análisis tiene por objeto determinar el origen de la alteración, la cual puede ser causada por microorganismos que sobreviven al tratamiento térmico o por la introducción de éstos después del tratamiento, por defectos de las cerraduras o por golpes que lesionen el envase. Conociendo la naturaleza del alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteración.

Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relación con el grado de acidez del alimento procesado, por lo que éstos se dividen en dos grandes grupos: a)

Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos cárnicos, lácteos, marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etcétera.

b)

Alimentos ácidos, con pH < 4,6, entre los que se encuentran tomates, frutas, jugos de cítricos, encurtidos, entre otros.

Incubación de productos en envases de apariencia normal. La prueba más confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubación del producto a temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el envase o en el producto. Incubar de 30 a 35°C por 10 a 14 días.

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Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados y en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas. En cuanto se detecte hinchazón en el producto o cualquier otra desviación suspender la incubación. Al final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que el producto no está comercialmente estéril y se debe proceder como para los envases alterados.

Incubación de envases sospechosos o alterados. Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no presenten alteración evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35°C/10-14 días. Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse. Aquellas que se clasifiquen como grado III o IV de no analizarse en el momento, deberán refrigerarse.

Área de trabajo. Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra-limpio. La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la concentración recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes de efectuar el trabajo. Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centro del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación. Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubículo perfectamente limpio, lavado con agua y jabón, desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajará entre dos mecheros Bunsen.

Personal. El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso de mascarillas quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir en el análisis.

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Preparación de latas o envases normales. a)

Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar.

b)

Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el lote. Escurrir el líquido y secar con la flama de un mechero.

c)

Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.

d)

En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por la cara opuesta.

Frascos de vidrio. a) Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de manera que quede cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg. b) Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. c) Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.

Preparación de latas o envases alterados a) Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabón; enjuagar y secar. b) Si la lata está muy inflada, mantener en el refrigerador antes de abrirla. c) Limpiar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 100 mg/kg o yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril. d) En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario hacer una prueba para hidrógeno, con objeto de conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal. Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequeña explosión indica la presencia de hidrógeno. No debe flamearse directamente el orificio de la lata. e) Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodón estéril sobre la tapa y picar con un picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.

Procedimiento a) Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical.

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b) Tomar porciones tanto del contenido sólido como del líquido; si es posible, homogeneizar. c) Utilizando utensilios adecuados a la naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximadamente 2 g o 2 mL del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento. d) Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquier aclaración o para efectuar pruebas biológicas. e) Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y sólo el examen microscópico puede dar una idea de los microorganismos involucrados en la descomposición. f) Preparar las extensiones mediante una asa de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cantidad de xilol con posterioridad a su fijación por calor.

Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia, etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su interior, anotando el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o de la tapa, etcétera. Tener cuidado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales.

Cuestionario: 1. ¿Qué tipos de enfermedades pueden transmitirse por el consumo de alimentos enlatados contaminados?

2. ¿Cómo se clasifican este tipo de alimentos?

3. ¿Qué tipo de precauciones debe tener al abrir la lata o envase?

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8. Manual de Inocuidad Microbiana de Los Alimentos

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