Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Farmacognosia Guía de Trabajos Trabajos Prácticos
Autoras: Dra. Silvia Debenedetti Dra. Erica Wilson
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Guía de Trabajos Prácticos-FARMACOGNOSIA Pr ácticos-FARMACOGNOSIA
FARMACOGNOSIA Guía de trabajos prácticos
C ar r era de Fa F ar mac i a 3º Año Plan 2012 y plan 2008 transición 2012.
Profesoras:
Dra. Silvia Debenedetti. Dra. Erica Wilson
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FARMACOGNOSIA Guía de trabajos prácticos
C ar r era de Fa F ar mac i a 3º Año Plan 2012 y plan 2008 transición 2012.
Profesoras:
Dra. Silvia Debenedetti. Dra. Erica Wilson
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CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE FARMACOGNOSIA. OBJETIVO: - Que el alumno se familiarice con con el manejo de las las drogas vegetales vegetales y sus preparados: preparados: polvos, extractos secos y líquidos,etc. - Que pueda diseñar procedimientos de extracción, métodos cromatográficos, realizarlas y detectar los puntos a mejorar a partir de los resultados obtenidos. UNIDADES: 1. EXTRACCIÓN 2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN IDENTIFICACIÓN (TLC/HPLC) 3. CONTROL DE CALIDAD
BIBIOGRAFÍA: Libros que se detallan a continuación se pueden consultar en la biblioteca o en la Cátedra virtual: -Sharapin, N. (2000).Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos. Ed. R. Pinzón CAB-CYTED. Bogotá, Colombia (Site de Farmacognosia) -Dewick P.M. (2004). Medicinal Natural products, a biosynthetic approach.2ª Ed. John Wiley & Sons, Ltd. (Site de Farmacognosia) -World Health Organization "Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials" cap. 13. (1998) (Site de Farmacognosia) -Elementos de fitoquímica fitoquímica y de farmacognosia. Bruneton, Jean. 1991. xvii, 594 p. Solicitar por: 041349. -Farmacognosia. Evans, William Charles. 1991. 901 p. Solicitar por: 041361. -Farmacognosia : fitoquímica, fitoquímica, plantas plantas medicinales. medicinales. Bruneton, Jean. 2001.1099 p. Solicitar por: 056588 Monografías de plantas medicinales- Publicación de la OMS (inglés) Se los puede encontrar en el site de Farmacognosia. -WHO monographs on selected medicinal plants. Volume 1 (1999) -WHO monographs on selected medicinal plants. Volume 2 (2003) -WHO monographs on selected medicinal plants. Volume 3 (2007) -WHO monographs on selected medicinal plants. Volume 1 (2009) Además se sugiere la consulta en los siguientes sitios: http://www.rain-tree.com/plants.htm Sitio con muy buenas monografías gratis (inglés) FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 2/52
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http://www.herbphoto.com/education/index.html Sitio con algunas monografías gratis (del listado hay algunas que están, otras se pagan) http://barcelonacomenius.googlepages.com/whomedicinalpla http://barcelonacomenius.googlepages.c om/whomedicinalplantsbooks ntsbooks Hay tres volúmenes con monografías monografías de plantas medicinal medicinaleses- Publicación de la OMS (inglés) http://farmacia.udea.edu.co/~ff/ La Universidad de Antioquia, Colombia http://www.profitocoop.com.ar Si se registran tienen acceso a algunas monografías oficiales. Es gratis. http://www.salutia.com.ar/Sitio/Sp/Servicios/Va http://www.salutia.c om.ar/Sitio/Sp/Servicios/Vademecum/Farmaco demecum/Farmacopea_Argentina/s pea_Argentina/sp_Vademe p_Vademe cum_Farmacopea_Index.htm Farmacopea Argentina Farmacopea Argentina http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/octava_edicion.asp Farmacopea internacional http://apps.who.int/phint/en/p/docf/ Farmacopea Brasileira http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm La Cátedra cuenta con un sitio de FARMACOGNOSIA FARMACOGNOSIA en la web donde se ponen a disposición de los alumnos: -el material didáctico utilizado en las clases teóricas y prácticas (presentaciones (presentaciones powerpoint y Guias de Problemas y de Trabajos Prácticos) -Links de consulta -Libros y artículos científicos científicos
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RECORDATORIO DE NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO TODA PERSONA QUE TRABAJA EN UN LABORATORIO DE QUIMICA QUIMIC A ESTA OBLIGADA A APRENDER Y OBSERVAR LAS REGLAS DE SEGURIDAD Recordar que la mayoría de los accidentes en los laboratorios químicos son el resultado del descuido o distracción, falta de criterio o fatiga del accidentado o de alguna de las personas cercanas. El estudiante debe adquirir los hábitos de trabajo de manera de realizar las actividades en el laboratorio con la máxima seguridad para él y sus compañeros.
¡Cuales son los accidentes más frecuentes? Las causas más comunes de accidente en el laboratorio son Heridas Quemaduras Proyecciones Proyecciones en los ojos. Las heridas en general son causadas por manipulación de material de vidrio rajado o roto. Las quemaduras por el contacto con álcalis o ácidos, las llamas, la combustión de líquidos inflamables, derrame de líquidos calientes y explosiones. Las proyecciones en general se producen por salpicaduras o por calentamiento de sustancias líquidas o sólidas.
Siempre existe el peligro de intoxicación cuando se manipulan sustancias químicas pues muchas son tóxicas o tienen riesgos biológicos. Usted debe saber : 1-Su localización. localización. 2-Accesos a fuentes de agua, gas g as y desagües 3-Dónde están los matafuegos 4-Donde está la ducha de emergencia y lavaojos 5-Dónde están las distintas puertas de salida.
¿Que elementos necesita Ud. para trabajar con seguridad? 1-Guardapolvo para no llevar ni traer contaminantes del medio ambiente, como barrera de contención de las proyecciones o salpicaduras de elementos corrosivos. No debe colocarse nada encima de él. 2-Guantes para proteger las manos en caso que se usen elementos cáusticos. 3-Anteojos para proteger los ojos de las proyecciones, salpicaduras o radiaciones. 4-Propipetas 4-Propipetas para evitar respirar los vapores y la posible ingestión de distintas sustancias.
JAMÁS PIPETEE NADA CON LA BOCA. 5-Barbijo para evitar la penetración de polvos a las vías respiratorias. FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 4/52
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¿Qué cuidados debe tener Ud. para trabajar? 1-Usar todos los elementos de seguridad en todo momento en que esté realizando una experiencia. 2-NO DEBE FUMAR EN EL LABORATORIO 3-NO DEBE COMER NI BEBER EN EL LABORATORIO 4-No deambule por el laboratorio 5-Debe trabajar con el cabello recogido. 6-No debe usar pulseras ni colgantes. 7-Cuando en alguna etapa de la experiencia puedan producirse vapores irritantes o tóxicos realice su trabajo bajo una campana. 8-Nunca trabaje solo o sin supervisión en el laboratorio. 9-No realice experiencias no indicadas en la guía. 10-No use material de vidrio rajado o roto. 11-Arroje los sólidos (papeles, fósforos, etc) en el tacho de basura. 13-Consulte antes de arrojar líquidos por el desagüe. 14-Cuando caliente NO dirija la boca del tubo u otro elemento hacia su rostro o el de sus compañeros. 15-Consulte si tiene que deshacerse de algún producto químico. 16-Sea precavido al trasvasar líquidos, evite que se derrame sobre el exterior del envase. En este caso, límpielo con una servilleta de papel o un trapo rejilla. 17-Cuando finalice su trabajo deje todo el material limpio y ordenado, las mesadas limpias y controle que las llaves de gas estén cerradas y los equipos eléctricos apagados.
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UNIDAD TEMÁTICA EXTRACCIÓN
PREGUNTAS ORIENTATIVAS SOBRE EXTRACCIÓN Lectura orientativa: Capítulo Extracción de Materias primas vegetales de Elizabeth Valverde Macedo Dos Santos (libro Fundamentos de Tecnología de productos Fitofarmacéuticos de Nicolai Sharapin, 2000) 1-¿Que entiende por extracto de una droga vegetal? 2-¿Como se clasifican los extractos según su consistencia? 3-Que operaciones incluye la fabricación de un extracto o el aislamiento de un principio activo a partir de material vegetal? 4-¿Cual es el objetivo de la molienda? 5-¿En que se basa la elección del solvente de extracción? 6-Ordene los siguientes solventes en orden creciente de polaridad (constante dieléctrica) Tolueno Hexano Etanol Cloroformo Metanol Butanol Acetato de etilo Eter etílico Agua Benceno Cloruro de metileno Propanol 7-¿Qué aspectos se deben tener en cuenta en una industria fitofarmacéutica para la elección del solvente de extracción? 8-¿Que solventes emplearía para extraer la mayor cantidad de metabolitos presentes en una droga vegetal? 9-¿En que se basaría para la elección del solvente de extracción de los grupos fitoquímicos mencionados en la pregunta 2)? Indique para cada uno de ellos el solvente más apropiado.
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10¿Que variables se tienen que tener en cuenta en un proceso extractivo? Fundamente brevemente. 11-Mencione las diferentes técnicas de extracción. Clasifique las técnicas mencionadas según extracciones solido-líquido o líquido-líquido y según sean procesos en frio o en caliente. 12-¿Que tipo de extracto es una tintura? Que proceso de extracción se utiliza para la obtención de tinturas? 13- Si el médico le recomienda a un paciente tomar una infusión de manzanilla. Como le describiría la técnica de preparación?. Como le explicaría la diferencia con una d ecocción? 12- ¿Que procesos conoce para la concentración y el secado de extractos? 13 La HEPATALGINA tiene la siguiente formulación Cada 100 mL contiene: Alcoholaturo de Alcachofa (1:1,75) (Cynara scolymus)………………....……….. Tintura de boldo (concentrado 2/1)..…..…… Alcoholaturo de Daucus Carota (1:1).……… Mentol..………….……………………………..
46,228 mL 7,544 mL 46,228 mL 0,152 g
Que es un alcoholaturo? Que significa la relación que se encuentra entre paréntesis en los extractos?
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 - MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Conocimientos previos: Estructuras de los principales carotenoides a extraer. Solubilidad de los mismos. Propuesta de solventes posibles para utilizar basado en polaridad, punto de ebullición y toxicidad de los mismos. 1. Objetivo -
Familiarizarse con la metodología de trabajo que se utiliza para la extracción y aislamiento de compuestos a partir de material vegetal Utilizando un ejemplo concreto usarán los siguientes métodos de extracción: sonicación, reflujo, Soxhlet, extracción con agitación mecánica. También se familiarizarán con el uso del evaporador rotatorio y demás equipamiento de laboratorio que utilizarán durante el cuatrimestre. Elegirán un solvente de extracción de acuerdo a las características de la muestra. Se compararán los resultados obtenidos con los diferentes métodos de extracción por un lado y con los distintos solventes elegidos por cada alumno.
2.Material vegetal: Frutos de Capsicum annum desecados y molidos a polvo fino. 3.Métodos: - Reflujo. -Ultrasonido a temperatura ambiente -Soxhlet Agitación mecánica a temperatura ambiente 4.Procedimiento: Se pesan 2 g de la droga vegetal y se coloca en el recipiente adecuado de acuerdo al método a utilizar. Se agregan 150 ml de solvente y se extrae durante 60 minutos (Soxhlet, reflujo), 10 minutos (ultrasonido) y 30 minutos (agitación mecánica). Luego de transcurrido el tiempo preestablecido, se filtra el contenido del recipiente por Buchner , se lleva a sequedad y se pesa. 5. Puesta en común e informe. Se compararán los rendimientos de los extractos obtenidos con el mismo solvente y distintos métodos de extracción, discutiendo la eficiencia de cada uno de ello. Se compararán los extractos obtenidos según el solvente empleado, discutiendo las semejanzas/diferencias y los posibles motivos de las mismas. FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 8/52
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 /3 - EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS - Conocimientos previos: composición química de las drogas a utilizar; estructuras de los derivados hidroxiantracénicos a extraer; propiedades químicas de las mismas. 1-OBJETIVO -Diseñar un procedimiento que permita obtener antraquinonas libres, monoglicosidadas y diglicosidadas en 3 fracciones separadas .
2.MATERIAL VEGETAL Polvo de Cáscara sagrada. Aloe 3.MÉTODO Cada equipo (2 alumnos) elaborará un esquema de extracción que utilizará con una de las drogas. El esquema será discutido con el profesor/ayudante previo a la realización de la actividad. Se trabajará con 1 g de droga y aproximadamente 50 ml de solvente en el caso de la Cáscara sagrada y con 0,5 g en el caso del Aloe. La presencia de los grupos fitoquímicos extraídos se verificará mediante las reacciones de caracterización que se describen en el punto 4. Se reservarán 2 ml de cada fracción en viales de color caramelo identificados con el nombre de los alumnos y su contenido para su análisis por TLC en otro práctico. 4.REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN 4.1 Antraquinonas libres 4.1.1 Reacción de Borntragger directa (Antraquinonas libres) Esta reacción consta de una extracción con solvente poco polar, seguida del siguiente procedimiento. En este caso utilizar 3 ml del extracto etéreo obtenido anteriormente que se colocan en un tubo de ensayo. Agregar 2 ml de una solución de hidróxido de amonio concentrado, agitar suavemente y observar la coloración de la fase acuosa. 4.1.2. Reacciones sobre papel Tomar el filtrado con un capilar y sembrar en forma puntual sobre papel de testeo 5 a 7 gotas de la solución, permitiendo que se sequen entre una gota y otra. Realizar las siguientes bservaciones: i. Observación del color a la luz nautural. FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 9/52
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Exponer el papel a vapores de amoníaco: registrar el color. ii. Observación con luz UV a 366 nm: registrar el color. Exponer el papel a vapores de amoníaco: registrar el color . 4.2 Glicósidos antraquinónicos Reacción de Borntragger indirecta Consiste en realizar la reacción de Borntragger directa sobre un extracto o muestra de droga sometida a un proceso de hidrólisis previa. Se indica el procedimiento según que se realice sobre un extracto acuoso/orgánico o sobre la droga vegetal.
Extracto acuoso: Colocar la muestra en un tubo de ensayo. *Agregar 2 ml de NaOH 10% y calentar a baño de maría durante 15 minutos. Enfriar y acidificar con HCl 1M, verificando con papel tornasol. Agregar 2 ml de éter de petróleo y agitar cuidadosamente. Transferir la fase orgánica con una pipeta pasteur a un tubo de hemólisis y agregar 1 ml de NaOH. Observar el color de la fase acuosa. Extracto orgánico: Colocar aprox. 2 ml de la muestra en un tubo de ensayo. Eliminar el solvente por evaporación calentando a baño de maría. Seguir con el procedimiento indicado en el párrafo anterior a partir del asterisco (*) Droga vegetal: Colocar aprox. 1 g de la droga pulverizada en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de NaOH 10% y calentar a baño de maría durante 15 minutos. Filtrar y trasvasar el filtrado a otro tubo de ensayo, acidificar con HCl 1M, verificando con papel tornasol. Agregar 2 ml de éter de petróleo y agitar cuidadosamente. Transferir la fase orgánica con una pipeta pasteur a un tubo de hemólisis y agregar 1 ml de NaOH. Observar el color de la fase acuosa. Informe Elaborar el esquema de extracción utilizado indicando solventes y resultados de las reacciones de caracterización. Indique que otros grupos fitoquímicos pueden estar presentes en cada una de las fracciones obtenidas.
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CUESTIONARIO 1) Además de Cáscara sagrada, ¿Qué otras drogas conoce cuyos principios activos son derivados de antraquinonas? Nombre científico (NC), nombre vulgar (NV) y parte usada de cada una de ellas. 2) Escriba la fórmula de los principales componentes de las drogas mencionadas en (1) e indique sus principales usos medicinales 3) Durante el TP ud. efectuó la separación de los distintos compuestos hidroxiantracénicos de cáscara sagrada (Rhamnus purshiana DC) a) Fundamente en que fracción obtiene las antraquinonas libres de las aloínas y de los cascarósidos presentes en la droga vegetal. b) ¿Que reacciones de caracterización utilizó en cada una de las fracciones? Justifique su respuesta. c) Fundamente el método de separación de O y C heterósidos realizado en el TP
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4- EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES Conocimientos previos: composición quìmica de la droga a utilizar; conocimiento de los métodos de extracción ; estructura de los principales alcaloides presentes en la droga a utilizar. 1-OBJETIVO Extraer los alcaloides de una droga vegetal empleando alguno de los métodos convencionales de extracción de alcaloides: medio ácido, medio básico o con solventes. 2-MATERIAL Quina (Cinchona calisaya- Rubiaceae) 3-MÉTODO Se trabajará con 2 g de corteza de quina y se debe llegar a un volumen final de extracto no mayor a 10 ml de los cuales se utilizarán aproximadamente 2 ml para las reacciones de caracterización, mientras que la muestra restante se guardará en un vial color caramelo rotulado con el nombre de los alumnos del equipo y la droga, para ser analizado por TLC en otro trabajo práctico. 4-REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN 4.1 Reacción de Draggendorff Colocar unas gotas del extracto de cloruro de metileno en una placa de toque o portaobjetos. Evaporar el solvente. Agregar una gota del reactivo de Draggendorf y observar la reacción. Utilizar como control, una solución de sulfato de quinina al 0.1%. Esta reacción se puede realizar también sobre papel, sembrando unas gotas sobre un trozo de papel de filtro y agregando el reactivo. Una vez seco, se debe lavar con agua, considerándose positiva la reacción si se observa una persistencia del color en el p apel. 4.2 Reacción de Mayer Realizar el mismo procedimiento que el indicado en el párrafo anterior, pero colocando el extracto y el reactivo de Mayer en un portaobjetos. Observar la reacción. Esta reacción no se puede realizar sobre papel. Informe Elaborar el esquema de extracción utilizado indicando solventes y resultados de las reacciones de caracterización. Indique que otros grupos fitoquímicos pueden estar presentes en cada una de las fracciones obtenidas.
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PROBLEMAS DE EXTRACCIÓN 1) ¿Qué tipo de compuestos podría encontrar en una infusión de una droga vegetal? 2) ¿Y en un extracto hexánico? 3-Ud. necesita extraer los glicósidos flavonoides presentes en los botones florales de Sofora. a) Describa la metodología a utilizar. Cómo haría para comprobar que agotó el material vegetal 3-Mencione cual/cuales solventes utilizaría para extraer los siguientes compuestos
Acido linoleico
Mentol Rutina
Soforosa
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4- Ud. necesita obtener un extracto conteniendo aglucones antraquinónicos a partir de una planta medicinal cuyo nombre común es Frángula. a) Indique Nombre científico y parte de la planta que utilizaría para la extracción. b) Dibue el núcleo fundamental del grupo fitoquímico que necesita extraer. c) Proponga un método para la obtención del extracto que contenga estos compuestos a partir de la droga (indicando solvente de extracción). d) Explique como verificaría la presencia de dicho grupo fitoquímico (indique nombre de la reacción y justificación).
5) Se procesa una muestra de polvo de droga vegetal de acuerdo al siguiente esquema:
¿En qué fracciones tendría una reacción de Draggendroff (+)? Justifique su respuesta.
6. Esquematice un método de extracción que le permita obtener los siguientes grupos de compuestos en fracciones separadas: Esteroides; aminoácidos; alcaloides tropánicos.
7.
Diseñe un método de extracción y fraccionamiento que le permita separar estos tres ¿Cómo los caracterizaría?
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8. Se realiza una extracción S/L semi-contínua de una droga vegetal, pasando sucesivamente hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo, metanol y agua. Se realizan los siguientes ensayos de caracterización sobre las fracciones obtenidas: Rojo de metilo, Liebermann-Bouchard, Shinoda, FeCl 3, Dragendorff, Fehling, Rosenheim. Explique en qué fracciones podría esperar reacciones positivas para dichas reacciones y qué núcleo podría estar caracterizando. 9. Una muestra de polvo de Cáscara sagrada se procesa del siguiente modo:
¿Qué informaría acerca del contenido en antraquinonas de esta muestra?
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10. Una muestra de folíolos de Sen se procesa de acuerdo al siguiente esquema: Sen, folíolos + NaOH 10% (80C /20’)
Tolueno
Fase toluénica (A) + NaOH 2% è Color rojo Sen (misma muestra) + tolueno è Filtrar èExtracto toluénico (B) Extracto toluénico (B) + NaOH 2% è Incoloro ¿Tiene antraquinonas esta muestra? ¿Sirve para detectar todas las antraquinonas que contiene la muestra? Justifique su respuesta.
11. Esquematice un método de extracción y purificación que le permita obtener compuestos de los siguientes grupos fitoquímicos por separado: Carotenoides, glicósidos flavonoides y azúcares.
12. Diseñe un método de extracción que permita obtener los asiaticósidos de la Centella (saponinas triterpénicas) , en un estado lo más purificado posible .
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13. Esquematice un método de extracción que le permita obtener los siguientes compuestos en 3 fracciones distintas. Indique qué ensayos realizaría para caracterizarlos.
14. Diseñe un método para obtener arbutina pura de las hojas de Ilex brasiliensis que contiene aproximadamente 10% (P/P) sobre droga seca.
Arbutina
15. ¿Cómo extraería ácido isoclorogénico libre de cafeína de hojas de té ?
Ácido isoclorogénico
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16- Se realiza un proceso de extracción semicontinuo sólido –líquido a una droga vegetal en polvo, siguiendo el siguiente esquema de fraccionamiento: a) Hexano b) Cloroformo c) Acetato de etilo d) Agua Discuta qué tipo de compuestos podría encontrar en los distintos extractos. 17-Las hojas desecadas de Digital ( Digitalis pupurea, Escrofulareaceae ) contienen heterópsidos cardiotónicos y saponinas esteroides. a) Dibuje la estructura de un heterósido cardiotónico y de una saponina esteroide. b) Cómo procedería para extraer y purificar los heterósidos cardiotónicos presentes en la droga vegetal? Esquematice el fraccionamiento y Justifique su respuesta. c) Como caracterizaría la presencia de dicho grupo fitoquímico en la fracción correspondiente y como caracterizaría la presencia de saponinas en la fracción de descarte? d) Existen en el mercado comprimidos con extracto purificado de glicósidos cardiotónicos? Justifique. 18-El polvo de manzanilla contiene flavonoides libres, flavonoides monoglicosidados y azúcares. a) Indique Nombre Científico (NC) y parte usada de manzanilla (PU). b) Dibuje el núcleo fundamental de cada uno de los grupos mencionados y proponga una metodología para extraerlos (indicando método utilizado y solvente de extracción) d) Esquematice como realizaría la separación de los grupos fitoquímicos mencionados (indicando solventes utilizados) e) Carcaterice la presencia de dichos grupos fitoquímicos en cada fracción (indique reacciones de caracterización). 20-Las semillas de Nuez vómica ( Strychnos nux-vomica, Loganiaceae) contiene alcaloides, lípidos y aminoácidos. a) Proponga un método de extracción que permita separar en tres fracciones los alcaloides, los lípidos y los aminoácidos presentes en esta droga. b) ¿Cómo caracterizaría cada grupo fitoquímico en la fracción correspondiente?
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UNIDAD TEMÁTICA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
PREGUNTAS ORIENTATIVAS SOBRE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 1) Defina un proceso cromatográfico 2) Qué fenómenos físico-químicos intervienen en una cromatografía? 3) Cómo se clasifican los sistemas croamtográficos de acuerdo a las fases intervinientes ? 4) Defina los siguientes términos cromatográficos: soporte, desarrollo, disolvente, sistema cromatográfico, revelador, adsorbente, eluyente, capa, fase estacionaria, fase móvil. 5) Explique los fenómenos de adsorción y partición 6) Defina Rf , Rx y Rg. En qué casos utiliza cada uno de ellos? 7) Cómo influye la temperatura sobre el Rf? 8) Cómo influye la saturación de la cuba en un proceso cromatográfico? 9) Defina los siguientes términos: resolución , eficiencia y selectividad. 10) Establezca y discuta la relación existente entre el diámetro de partícula y la eficiencia de un sistema cromatográfico. 11) Qué factores influyen en la resolución de un sistema cromatográfico. 12) Qué parámetros mantendría constantes para obtener reproducibilidad de los resultados de un método cromatográfico. 13) Qué entiende por revelado de un cromatograma? 14) Que revelador utilizaría para Extracto de cloruro de metileno de Frángula Extracto acuoso de Ginsennosidos Aceite esencial de limón Extracto hidroalcohólico de alcachofa Extracto hidroalcohólico de Centella 15) Cómo elige la fase móvil y la fase estacionaria en un sistema de adsorción? 16) ¿Qué entiende por “perfil cromatográfico”? 17) ¿Qué entiende por extracto patrón y que por sustancia de referencia?
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18) ¿En que caso es imprescindible la utilización de un extracto patrón y en que caso una sustancia de referencia? 19) ¿En que casos utiliza fases móviles que contienen con ácidos y en que casos se agrega a la fase móvil una base? Justifique. 20) ¿Cómo haría para identificar la presencia de Quinina en un extracto de Quina 21) ¿Qué criterios se emplean para seleccionar el sistema de revelado de los cromatogramas?.
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 5/6: APLICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC) AL ESTUDIO DE PRODUCTOS NATURALES I 1-OBJETIVO Desarrollar sistemas cromatográficos para el análisis cualitativo de extractos vegetales. Conocimientos previos: estructura de los componentes de interés de los extractos a analizar; métodos de revelado a utilizar en cada caso. 2-MATERIAL VEGETAL Extracto de Capsicum Extractos de Cáscara sagrada y Aloe obtenidos en el TP Nº 2 Extracto de quina obtenido en el TP Nª 4 3-MÉTODO Se utilizarán Cromatofolios de silicagel como fase estacionaria. La fase móvil será seleccionada por cada equipo. Se realizarán las corridas cromatográficas y se evaluará la resolución del sistema registrando los Rf correspondientes a los compuestos de interés, optimizando el sistema en base a los resultados obtenidos. En todos los casos se deberá informar las condiciones cromatográficas utilizadas para cada prueba realizada, los parámetros cromatográficos obtenidos (k´, α´y Rs) y la justificación de los cambios planteados. Se utilizarán las siguientes sustancias de referencia: Cáscara sagrada: -1,8 diantrona -Aloína Aloe: -1,8 diantrona -Aloína Quina: -Quinina, HCl -Quinidina HCl Informe Realizar un esquema del cromatograma obtenido indicando: Sistema cromatográfico utilizado (FM, FE, y revelado) Tabla de Rfs de las bandas obtenidas en los extractos y sustancias de referencia (color al UV y con reactivo revelados)
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: APLICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC) AL ESTUDIO DE PRODUCTOS NATURALES II 1. OBJETIVO Aplicar la cromatografía en capa fina a la identificación de extractos de drogas vegetales. 2. MATERIAL VEGETAL - Extracto de Cáscara sagrada - Extracto de Frángula. 3. MÉTODO Fase estacionaria: cromatofolios de silicagel 60 GF 254 Merck, 0,25 mm de espesor Fase móvil: Acetato de etilo/ metanol/ agua (100:13,5:10) Siembra: se efectúa con capilares a ~0,5 cm del borde inferior (trabajar siempre con lápiz negro), sembrando: -
Extracto de cáscara sagrada: 10 gotas en banda
-
Solución testigo de aloina: 6 gotas
-
Extracto de frángula: 10 gotas en banda
-
Observación a la luz visible y al UV366 Exposición a vapores de amoníaco AEDBE
Revelado:
4. RESULTADOS: Registrar los Rf de las manchas observadas en los distintos cromatogramas, en tablas similares a las siguientes: a) Observación a la luz visible (Rf) Extracto de R. purshiana.
Extracto de R.frangula
Solución testigo aloína
b) Observación a la luz UV 366 nm (Rf) FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 22/52
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Extracto de R. purshiana.
Extracto de R.frangula
Solución testigo aloína
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 8: APLICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC) AL ESTUDIO DE PRODUCTOS NATURALES III
1-OBJETIVO Identificar un extracto vegetal en un producto terminado. 2-MATERIALES Extracto de Cáscara sagrada Extracto de Frángula Comprimidos de Cáscara sagrada/Frángula 3.MÉTODO Preparación de solución muestra Moler 10 comprimidos a polvo fino y pesar una cantidad de polvo correspondiente a un comprimido. Colocar en un Erlenmeyer de 100 ml y agregar 20 ml de metanol. Sonicar por 5 minutos. Filtrar por papel. Procedimiento Analizar la muestra siguiendo el método descripto en el TP Nª 7
4-CONCLUSIONES Elabore un informe sobre los resultados obtenidos y la identidad del extracto presente en los comprimidos de acuerdo al ensayo realizado.
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1.- Se dispone de un extracto clorofórmico de centella asiática que contiene ácido asiático (triterpeno libre) entre otros compuestos. a) Describa una técnica que permita identificar ácido asiático (triterpeno libre) en dicho extracto. b) Probando distintos sistemas cromatográficos para identificar ácido asiático obtuvo los siguientes cromatogramas:
Qué sistema le parece más adecuado? Justifique su respuesta analizando los parámetros de resolución que se encuentran afectados en cada uno de los sistemas. c.- Cómo procedería para obtener 5 mg de ácido asiático a partir de un extracto clorofórmico de centella asiática. Describa la metodología a emplear detallando los siguientes puntos: I. Sistema cromatográfico a emplear. II. Soluciones a preparar, siembra de las mismas, revelado, etc. III. Interpretación del cromatograma y obtención de la sustancia. IV. Verificación de la pureza del ácido asiático aislado.
2-Se necesita obtener barbaloina a partir de un extracto de acetato de etilo de aloe a) Proponga una técnica que le permita aislar el heterósido antraquinónico barbaloina b) Se efectuó una TLC del extractivo del ítem (b) frente a testigo de barbaloina, obteniéndose el siguiente cromatograma:
T= testigo M= muestra
T
M
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¿Podría utilizar este sistema cromatográfico para identificar barbaloina en el extracto de áloe? En caso necesario, ¿que modificaciones haría para lograrlo? Justifique su respuesta, indicando los factores de resolución (capacidad, eficiencia, selectividad). c)Que sistema utiliza par su revelado? 3.- Usted debe analizar los alcaloides presentes en un extracto cloruro de metileno semipurificado de opio. a) Describa una técnica que permita identificar morfina (alcaloide) en dicho extracto. b) Probando distintos sistemas cromatográficos para identificar morfina, obtuvo el siguiente cromatograma:
M= Muestra T=Testigo (morfina)
¿Podría utilizar este sistema para identificar morfina en el extracto. Justifique su respuesta. En caso necesario ¿cómo optimizaría este sistema?
c.- Usted necesita determinar el porcentaje de morfina presente en un extracto cloruro de metileno semipurificado de opio. Describa la metodología a emplear detallando los siguientes puntos: I. Sistema cromatográfico. II. Soluciones a preparar III. Siembra de las mismas IV.Revelado e interpretación del cromatograma obtenido. V. Cuantificación. 4.- Usted debe analizar por cromatografía sobre planos un extracto acetato de etilo semipurificado de hipérico. a) Describa una técnica que le permita comprobar la presencia de hiperósido (heterósido flavonoide) en dicho extracto. b) Ensayando diversos sistemas cromatográficos para comprobar la presencia de hiperósido en el extracto, obtuvo los siguientes cromatogramas:
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T
M
Que informaría acerca del resultado obtenido?. 5.- Se dispone de un extracto clorofórmico de efedra que contiene alcaloides. a) Describa una técnica que permita identificar efedrina (alcaloide) en dicho extracto. b) Probando distintos sistemas cromatográficos para identificar efedrina, obtuvo los siguientes cromatogramas:
Qué sistema le parece más adecuado? Justifique su respuesta analizando los parámetros de resolución que se encuentran afectados en cada uno. 6.- Usted debe analizar por cromatografía sobre planos un extracto acetato de etilo semipurificado de hojas de Gingko biloba. a) Describa una sistema cromatográfico (FM, FE y Revelado) que le permita detectar la rutina (heterósido flavonoide) presente en dicho extracto. b) Buscando un sistema adecuado para cuantificar la rutina, obtuvo los siguientes cromatogramas: (1)
T
M
(2)
T
M
(3)
T
M
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¿Cuál elegiría para dicha determinación? Justifique en cada caso (analizando los parámetros que inciden en la resolución de cada sistema) su decisión de elegirlo o no para el problema en cuestión. c.- Usted necesita obtener rutina a partir de un extracto acetato de etilo semipurificado de hojas de Gingko biloba. Describa la metodología que emplearía para obtener 10 mg de rutina detallando los siguientes puntos: I) II) III) IV) V)
Sistema cromatográfico. Soluciones a preparar. Siembra de las mismas, revelado. Interpretación del cromatograma resultante y obtención de la rutina. Verificación de la pureza de la rutina aislada..
7.- Se dispone de un extracto clorofórmico de digital que contiene digitoxina (heterósido cardiotónico). a) Describa una técnica que permita identificar digitoxina en dicho extracto. b) Probando distintos sistemas cromatográficos para identificar digitoxina se obtuvo el siguiente cromatograma: Podría utilizar este sistema para identificar digitoxina en el extracto clorofórmico de digital?
Justifique su respuesta. En caso necesario cómo optimizaría este sistema?
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PROBLEMAS COMBINADOS DE EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA 1.- Se dispone de un extracto clorofórmico de centella asiática que contiene ácido asiático y ácido madecásico (triterpenos libres) entre otros compuestos. a) Describa una técnica que le permita detectar la presencia de ácido asiático en dicho extracto.
b) Probando distintos sistemas cromatográficos para identificar ácido asiático obtuvo los siguientes cromatogramas:
Qué sistema le parece más adecuado? Justifique su respuesta analizando los parámetros de resolución que se encuentran afectados en cada uno de los sistemas. 2.-Usted debe analizar una muestra de polvo de raíz de Ginseng. Diseñe la metodología que utilizaría para los siguientes ensayos. a) Obtención de un extracto que contenga las saponinas triterpénicas (ginsenósidos considerados como los principios activos), azúcares y triterpenos presentes en esta droga b) Fraccionamiento de dicho extracto en tres fracciones diferentes que contengan estos grupos fitoquímicos c) Verificación de la presencia de los mismos en la fracción correspondiente. d) Como haría para verificar la presencia de ginsenósido Rg 1, en la fracción de las saponinas. FARMACOGNOSIA ‐ F. DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES ‐ UNIVERSIDAD DE BELGRANO Página 29/52
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3- Proponga una metodología para: a) Obtener un extracto que contenga heterósidos flavonoides (principios activos) separados de los triterpenos y azúcares que contienen las hojas de una droga vegetal. b) Comprobar la presencia de dichos grupos fitoquímicos en las tres fracciones obtenidas. c) Se sospecha de la presencia de quercetina 3-O-glusósido en el extracto. Describa una técnica que le permita comprobarlo
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE UN EXTRACTO VEGETAL POR HPLC
1-OBJETIVO Que el alumno realice un ensayo de cuantificación siguiendo un procedimiento descripto en una farmacopea (Farmacopea Española 2005). 2-MATERIALES Comprimidos con extracto de Gingko biloba Quercetina (sustancia de referencia). 3.MÉTODO Se implementará el método según lo descripto en la monografía adjunta ( ver Apéndice). Se trabajará en equipos de 2 alumnos. 4-INFORME Se elaborará un informe en el cual se detalla el sistema cromatográfico empleado, la preparación de las soluciones, los datos obtenidos y el procesamiento de los mismos.
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 10:CONTROL DE CALIDAD TALLER: ANÁLISIS DE MONOGRAFÍAS DE DISTINTOS TIPOS DE PRODUCTOS BOTÁNICOS 1. OBJETIVO Que el alumno pueda interpretar una monografía farmacopeica de un producto botánico, comprendiendo los distintos tipos de ensayos de identificación, pureza y valoración de acuerdo a las características de la droga descripta. 2. MATERIALES Se trabajará con las monografías adjuntadas en el APÉNDICE y se contestarán las preguntas correspondientes en cada caso en equipos de 2 personas, luego de lo cual se discutirán las conclusiones de forma grupal.
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PROBLEMAS DE CONTROL DE CALIDAD 1) ¿Qué ensayos realizaría sobre una droga vegetal para evaluar si: a) Está contaminada con tierra y/o arena. b) Tiene un contenido de humedad > 12%. c) Ha sido adulterada con otra especie semejante. d) Está agotada en sus principios activos. e) (Droga aromática) ha sido desecada a alta temperatura. 2) Enumere los ensayos que realizaría sobre los siguientes productos botánicos para determinar su calidad: a) Aceite de ricino para cápsulas b) Cáscara sagrada según Farmacopea Argentina. c) Cáscara sagrada en polvo según Farmacopea Argentina. d) Comprimidos de Cáscara sagrada según USP. e) Extracto seco de Ginkgo con 24 % de glicósidos flavonoides expresados como rutina. f) Comprimidos de extracto seco de Sen (conteniendo 8% de sennósidos expresados como sennósido B) y 200 mg de polvo de Regalíz. g) Tisana con 20% de hojas de boldo, 30% de semillas de anís y 50% de tallos de Cola de caballo. h) Polvo de belladona con 0.08% de alcaloides totales expresados como hiosciamina. 3) ¿ Qué ensayo específico para su actividad realizaría sobre: a) un extracto de Quillaja saponaria (que contiene saponinas) que se utiliza en un shampoo de uso veterinario. b) Una muestra de polvo de semillas de Psillium que se utiliza para un laxante de acción mecánica. c) Aceite de almendras de uso cosmético. 4) Para elaborar un fitoterápico sedante, un laboratorio compra un extracto hidroalcóholico de Passiflora cuyos principios activos son glicósidos flavonoides. a) ¿Qué ensayos realizaría sobre dicho extracto para controlar su calidad? b) ¿ Y sobre el producto terminado? 5) Diseñe un método de control de calidad para unas gotas coleréticas que contienen extracto hidroalcóholico de alcachofa y extracto de boldo.
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6)Desarrollo un método de control de calidad para comprimidos que contienen extracto seco de manzanilla y polvo de corteza de frángula. 7) Se desea evaluar el reemplazo de una esencia de lavanda de Egipto (de calidad óptima) por una de otro origen. Desciba un procedimiento que le permita saber si dicho reemplazo es factible 8) ¿ Cómo procedería para reemplazar un extracto hidroalcóholico de Sylibum marianum de un determinado proveedor (principios activos: flavonoides) por otro de distinto proveedor? 9) Explique qué ensayos realizaría sobre unas gotas antiespasmódicas que contienen tintura de belladona y clorhidrato de papaverina para comprobar si las mismas cumplen cuali y cuantitativamente con la fórmula declarada.
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-APÉNDICEMONOGRAFÍAS
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