11.- ENTEROBACTERIACEAE

PRÁCTICA # 11 “ENTEROBACTERIACEAE” OBJETIVOS: Enumerar las principales especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, señalando su importancia en salud publica y en los laboratorios farmacéuticos Familiariz Familiarizarse arse con las característi características cas microscópica microscópicass y las propiedades propiedades culturales culturales de este importante importante grupo  bacteriano Elegir los medios de cultivo involucrados en el aislamiento y la diferenciación presuntiva de estas bacterias,  señalando los componentes que los hacen selectivos y diferenciales  Seleccionar los medios de cultivo empleados en la diferenciación bioquímica de los diversos géneros involucrados en este grupo bacteriano. Describir técnicas y fundamentos relacionados con la detección de estos microorganismos en las muestras clínicas,  en materia prima y en productos farmacéuticos. 

INTRODUCCIÓN ENTEROBACTERIACEAE  Este grupo de organismos organismos incluye a varios que causan causan infecciones infecciones primarias primarias del tracto gastrointe gastrointestina stinall humano. humano. Por  tanto, se les refiere como entéricos (sin importar si causan o no enfermedades intestinales). Las bacterias que afectan el tracto gastrointestinal, incluyen a ciertas cepas de E. coli  y Salmonella, Salmonella, a las 4 especies de Shigella y a Yersinia entercolítica. entercolítica. La enfermedad reumática, el síndrome de Reiter, puede ser resultado de una previa exposición a Salmonella, Salmonella, Shigella, Shigella, o Yersinia. Yersinia. Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología morfología de bacilos bacilos o cocos. Los miembros miembros de esta familia familia forman parte de la microbiota microbiota del intestino intestino (llamados (llamados coliformes) coliformes) y de otros órganos órganos del ser humano humano y de otras especies especies animales. animales. Algunas Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentación de quesos y productos productos lácteos, alcoholes, alcoholes, tratamien tratamientos tos médicos, producción producción de toxinas en el uso de cosméticos, cosméticos, fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc. Características En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios criterios básicos, adicional adicional a la aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos. No son exigentes, son de fácil cultivo. Son oxidasa negativo, es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. Son anaeróbicos facultativos. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles. Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioautótrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de entre 22ºC y 37ºC. Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos, como la fermentación de los difere diferente ntess azúcare azúcares, s, la produc producció ción n o no de azufre azufre,, la presen presencia cia de enzima enzimass metabó metabólic licas as (β-gal (β-galact actosi osidas dasa, a, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de antígenos en su constitución celular, celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K). Ecología

La mayorí mayoría a de las especies especies pueden pueden aislarse aislarse del intest intestino ino del hombre hombre y de otros otros animal animales, es, de allí allí su nombre nombre enterobacteria (del griego entéron, entéron, intestino. Pueden ser flora o ser transitorias en la cavidad bucal, en las regiones húmedas de la piel, en especial el perineo, las fosas nasales y las vías genitales femeninas. Son abundantes en la natura naturalez leza, a, en partic particula ularr en medios medios húmedo húmedoss y, por ser expuls expulsada adass por las heces, heces, funcio funcionan nan como como medido medidores res epidemiológicos de salubridad e higiene poblacional. En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en grandes números en el colon, donde contribuyen a la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de la fermentación. La especie Escherichia coli  juega una función importante en el control de otras especies intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una concentración aproximada de 10 8 en la materia fecal. Otras especies especies de Enterobacteriaceae con una presencia presencia numerosa numerosa intestinal intestinal son Proteus y Klebsiella, Klebsiella, mientras que otras especies, como Citrobacter , Hafnia, Hafnia, Providencia y Enterobacter están Enterobacter están presentes de manera irregular. En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos, desnutrición, etc. La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparición de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies provocan patologías específicas: La especie Salmonella typhi es typhi es responsable de la fiebre tifoidea. La especie Shigella dystenteriae es el agente responsable de la disentería bacilar. La especie Escherichia coli enterotóxica es responsable de la gastroenteritis infantil. La especie Yersinia pestis es responsable de la peste. La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital. Las Enterobacteriaceae incluyen a organismos que resultan patógenos para el ser humano como la Escherichia coli o la Salmonella, especialmente importantes en la mortalidad infantil en países en desarrollo y patógenos para las plantas como como Erwi Erwini nia, a, en la mayo mayorr part parte e de los los caso casoss caus causan ando do infe infecc ccio ione ness opor oportu tuni nist stas as.. Todos odos los los baci bacilo loss de Enterobacteriaceae son resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina, entre otros.  Aislamiento e identificación de Enterobacteriaceae Estas bacterias son bacilos Gram-negativos anerobios facultativos. Carecen de la enzima citocromo oxidasa y por ello se mencionan como oxidasa negativos. Frecuentemente son aislados a partir de materia fecal en agar conteniendo lactosa y un indicador de pH. Las colonias que fermentan la lactosa producirán suficiente ácido para causar el vire del indicador. E. coli es coli  es un fermentador de la lactosa, mientras que Shigella, Shigella, Salmonella y Yersinia no son fermentadores. Las cepas cepas "No-pa "No-patóg tógena enas" s" de E. coli  coli  (y otras bacterias bacterias entéricas entéricas lactosa-po lactosa-positiva sitivas) s) frecuentemente se encuentran en heces normales. Debido a que es difícil diferenciarlos de las cepas "patógenas" de E. coli, las colonias lactosa-negativas con frecuencia son las que se identifican en las heces. Todas las Enterobacteriaceae aisladas de otros sitios del orga organi nism smo o (los (los cual cuales es cont contie iene nen n meno menorr núme número ro de bact bacter eria iass [ej. [ej. la orin orina] a] o que que normalmente son estériles [ej. sangre]) se identifican bioquímicamente. Los serotipos impo import rtan ante tess se pued pueden en dife difere renc ncia iarr por por sus sus antí antíge geno noss como como el antí antíge geno no O (lipopolisacárido), el H (flagelar) y el antígeno K (capsular). Sin embargo, la serotipificación generalmente no se realiza en el laboratorio clínico de rutina. Fermentadores de lactosa en agar Hektoen, el cual contiene sales biliares e indicadores de la presencia de ácido (azul de bromotimol y fuchsina ácida). Las bacterias gram-positivas se inhiben en estos medios ya que el agar es selectivo para las gram-negat gram-negativas. ivas. Las bacterias bacterias fermentado fermentadoras ras de lactosa lactosa forman forman colonias colonias anaranjadas anaranjadas mientras que las no fermentadoras aparecen en verde o verde-azul. Esto es especialmente útil para distinguir patógenos potenciales de la flora normal en muestras fecales. Sin embargo, es difícil distin distingui guirr entre entre los mismos mismos no-fer no-fermen mentad tadore ores. s. El microo microorga rganis nismo mo en ésta ésta placa placa podría podría ser  Salmonella, Salmonella, Proteus, Proteus, o Shigella. Shigella. Crecimiento de un no fermentador de la lactosa en agar de MacConkey el cual contiene sales biliares y cristal violeta, componentes que inhiben el crecimiento de las bacterias gram-positivas. El agar también contiene lactosa y un colorante rojo que diferencia a los fermentadores de lactosa de los no-fermentadores. Las colonias de las bacterias que fermen fermentan tan la lactos lactosa a van desde un color color rosa rosa hasta hasta rojo mientr mientras as que las no fermen fermentad tadora orass son incolora incolorass o

2

transparentes. Este agar no distingue entre las no- fermentadoras de lactosa; un crecimiento como este podría indicar la presencia de varios microorganismos como- Proteus, Proteus, Salmonella o Shigella, Shigella, por ejemplo. En una muestra fecal, estas colonias serían suficiente evidencia para continuar con más pruebas de identificación. Crecimiento de bacterias gram-negativas que no son capaces de fermentar la lactosa en agar de eosina azul de metileno (o EMB por sus siglas en inglés) el cual contiene sales biliares y colorantes que inhiben a las bacterias gram-positi gram-positivas. vas. El crecimient crecimiento o en agar EMB es una herramien herramienta ta diagnóstica útil para distinguir entre los fermentadores de lactosa de los no-fermentadores, los cuales aparecen incoloros. Salmonella y Shigella son patógenos que no fermentan la lactosa, así pueden ser distinguidos de la flora intestinal mas común, la cual sí lo hace. E. Coli  Coli  del tipo tipo hemorr hemorrági ágico. co. Son bacilo baciloss procar procarion iontes tes Gram-n Gram-nega egativ tivos, os, entéri entéricos cos,, anaero anaerobio bioss facult facultati ativos vos.. Potencialmente fatales a los humanos, que se contraen cuando la carne contaminada se cocina de manera inadecuada. Infecciones por enterobacterias El grupo de enterobacterias incluye la bacteria Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonell Salmonella, a, Serratia, Serratia, Shigella Shigella y Yersinia. ersinia. Aunque Escherichia Escherichia coli (E. coli) normalment normalmente e habita habita en el intestino, intestino, determinad determinadas as cepas de E. Coli  puede causar infecciones infecciones intestinal intestinales es que producen producen sangre, sangre, acuosa o diarrea diarrea inflamatoria (diarrea del viajero). En los niños, la diarrea diarrea causada por determinadas cepas de E. Coli puede Coli puede conducir a la destrucción de los glóbulos rojos y la insuficiencia renal (síndrome hemolítico-urémico). E. Coli  también pueden causar infecciones del tracto urinario (especialmente en mujeres) y la bacteriemia y meningitis en recién nacidos (especialm (especialmente ente los recién nacidos prematuro prematuros). s). Las infecciones infecciones causadas causadas por  E. Coli  son diagnosticadas por la búsqueda búsqueda de las bacterias bacterias en cultivos de sangre o fluidos corporales. corporales. La infección infección se trata trata con antibióticos, antibióticos, como trimetoprim-sulfametoxazol Klebsiella, Enterobacter, Serratia y las infecciones infecciones son usualmente usualmente adquiridos adquiridos en el hospital, hospital, principalment principalmente e por  personas que tienen una disminución de la capacidad para luchar contra las infecciones. Estas bacterias suelen infectar  la orina o de las vías respiratorias, a pesar de las quemaduras quemaduras y las heridas a veces se infectan. La neumonía causada por  Klebsiella es una rara, pero grave, la infección pulmonar que es más común en los alcohólicos, las personas mayores y las personas con diabetes. Normalmente, las personas con esta infección infección tosa y pegajoso de esputo que es de color marrón oscuro o rojo oscuro. La neumonía puede llevar a la formación formación de abscesos (colecciones de pus) en el pulmón o en el revestimiento de los pulmones (empiema). Si tratan con tiempo suficiente, esta neumonía puede curarse con antibióticos por vía intravenosa, por lo general las cefalosporinas o quinolonas. Proteus normalmente está presente en el suelo, el agua y las heces. También puede causar infecciones profundas, en particular en el tracto urinario y de la cavidad abdominal. 1 Los bacilos gramnegativos pertenecientes a Enterobacteriaceae son los aislamientos bacterianos recuperados con más frecuencia de muestras clínicas. Distribuidos en la naturaleza en forma amplia, estos microorganismos se encuentran en el suelo y el agua, sobre las plantas, y como lo indica el nombre de la familia, dentro del tracto intestinal de seres humanos y animales. Antes del advenimiento de los antibióticos, la quimioterapia y las medidas inmunosupresoras, las enfermedad enfermedades es infecciosa infecciosass causadas causadas por Enterobact Enterobacteriace eriaceae ae estaban estaban relativam relativamente ente bien definidas definidas.. Se sabía que los síndromes diarreicos y disentéricos, acompañados por fiebre y septicemia en los casos clásicos de fiebre tifoidea eran causados por especies de Salmonella y Shigella. Se sabía que los casos clásicos de neumonía, caracterizados por la produc producció ción n de esputo esputo rojo rojo ladril ladrillo lo o “jalea “jalea de grosel grosella” la”,, eran eran causad causados os por el bacilo bacilo de Friedl Friedland ander er (Klebs (Klebsiel iella la pneum pneumoni oniae) ae).. Escher Escherich ichia ia coli, coli, especi especies es de Proteu Proteus, s, y varios varios miembr miembros os del grupo grupo Klebsi Klebsiell ella-E a-Ente nterob robact acter er se recupe recuperab raban an comúnm comúnment ente e de herida heridass traum traumáti áticas, cas, contam contamina inadas das con tierra tierra o materi material al vegeta vegetall o de incisi incisione oness abdominales luego de una cirugía gastrointestinal. Por lo tanto, los miembros de Enterobacteriaceae pueden ser incriminados en virtualmente cualquier tipo de enfermedad infecc infeccios iosa a y recupe recuperad rados os de cualqu cualquier ier muestr muestra a recibid recibida a de labora laborator torio. io. Los pacien pacientes tes inmun inmunoco ocompr mprome ometid tidos os o debilitados son altamente susceptibles a las infecciones adquiridas en los hospitales, después de la colonización con cepas ambientales o a continuación de procedimientos invasivos, como caterización, broncospopía, colposcopia o biopsias quirúrgicas, en las cuales las membranas mucosas se traumatizan y se cortan. El shock endotóxico es una manifestación potencialmente letal de la infección por bacterias gramnegativas, incluidas las Enterobacteriaceae. Las endotoxinas son lipopolisacáridos farmacológicamente activos que están contenidos dentro de las paredes celulares de las especies gramnegativas. Estos lipoposacáridos están estructuralemente en tres capas: 1) una porción porción variable variable externa externa de carbohidrato carbohidratoss que determinan determinan la especifi especificidad cidad antigén antigénica. ica. 2) Un core medio de polisacári polisacárido do que es es estructura estructuralment lmente e similar similar entre entre las especies especies y 3) Una porción porción lipídic lipídica a central central altament altamente e conservada conservada llamad llamada a lípido A. 1

http://www.merck.com/

3

Los efectos biológicos de las endotoxinas se han demostrado en forma experimental-. Cuando se inyectan en animales pequeñas pequeñas cantidades cantidades por vía intravenosa intravenosa producen fiebre, fiebre, leucopenia, leucopenia, hemorragia hemorragia capilar capilar,, hipotensió hipotensión n y colapso colapso circulatorio.2 Enterobacteriaceae Géneros:  Alishewanell  a Blochmannia Citrobacter

Alterococcus

Aquamonas

Aranicola

Brenneria Dickeya

Budvicia Enterobacter

Ewingella Leminorella

Grimontella Moellerella

Buchnera Edwardsiell   a Hafnia Morganella

Phlomobacte r  Rahnella Sodalis Yokenella

Photorhabdu  s Raoultella Tatumella

Plesiomona s Salmonella Trabulsiella

Arsenophonu    Azotivirga s Buttiauxella Cedecea Erwinia Escherichia

Klebsiella Obesumbacteriu   m Pragia

Kluyvera Pantoea Proteus

Leclercia Pectobacteriu   m Providencia

Samsonia Wigglesworthia

Serratia Xenorhabdus

Shigella Yersinia

Escherichia coli  A nivel de especies, E. coli y Shigella son indistinguibles. Por razones prácticas (principalmente para evitar confusión), no están colocadas en el mismo género. No es sorprendente que haya mucho traslapamiento entre las enfermedades que causan ambos microorganismos. 1) E. coli  Enteropat Enteropatógena ógena (EPEC). Ciertos serotipos se encuentran encuentran comúnmente comúnmente asociados asociados con diarrea en niños. Aparece una lesión morfológica con destrucción de las micro-vellosidades intestinales sin invasión del microorganismo, lo cual sugiere que es importante la adherencia. Clínicamente se observa fiebre, diarrea, vómito y náusea. Normalmente no se presenta sangre en las heces. 2) E. coli Enterotoxigénica coli  Enterotoxigénica (ETEC) produce una diarrea parecida al cólera pero en grado mucho mas leve. Estas cepas causan también la "diarrea del viajero". Producen dos tipos de toxinas codificadas en plásmidos. a) Toxinas lábiles lábiles al calor o termolábiles termolábiles (HLT), (HLT), son similares similares al colerágeno. colerágeno. Activan Activan a la adenil-cicl adenil-ciclasa asa produciendo produciendo AMPAMPcíclico con un incremento en la secreción de agua y de iones. b) Toxinas termo termo estables estables (HST). (HST). Activan Activan a la guanilato guanilato ciclasa ciclasa con inhibición inhibición de la incorporación incorporación de iones iones desde el lumen intestinal. Diarrea acuosa, fiebre y náusea es el resultado en ambos casos. 3) E. coli Enteroinvasiva coli Enteroinvasiva (EIEC ) produce una disentería. 4) E. coli Enterohemorrágica coli Enterohemorrágica (EHEC). 3 Escherichia Escherichia coli  es una de las bacterias más abundantes en el tubo digestivo de los mamíferos. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana humana, a la que se atribuyen efectos beneficiosos para la salud. Existen, sin embargo, cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis. Los síntomas pueden revestir ocasionalmente gravedad en lactantes. Las cepas responsables de patología se han venido describiendo desde la década de los años 40 bajo la denominación de Escherichia coli enteropatógena coli enteropatógena clásica (ECEP clásica). Con posterioridad, se han ido añadiendo a este grupo otras cepas igualmente patológicas que causan enteritis por un mecanismo invasor rigurosamente idéntico al de las shigelas, el microorganismo responsable de la disentería bacilar. A este grupo se le denominó E. coli enteroinvasora (ECEI). No son estos dos los únicos grupos patógenos. Desde finales de los 60 también se conocen otros tipos que producen enteritis por liberación de enterotoxinas de dos tipos, termoestable (ST) y termolábil (LT); este grupo de cepas se denomina E. coli enterotoxigénica (ECET) y son poco frecuentes en nuestro medio, pero causan diarrea en los viajeros a países exóticos. La lista se completa con un grupo de patógenos que causa enteritis por liberación de verotoxina (VT), para la que distintos organismos internacionales de salud recomiendan, como objetivo prioritario, extremar su vigilancia. Causa de la enteritis hemorrágica E. coli forma parte de la flora intestinal y sólo unas cepas específicas de transmisión feco-oral son las causantes de brotes infecciosos El descubrimiento de esta bacteria como causa de enteritis hemorrágica se confirmó en Estados Unidos y Canadá a principios de los 80. Su comportamiento y su difusión, al ser un microorganismo intestinal, se asocia a Salmonella, Salmonella, por lo que las medidas preventivas básicas a tomar son similares para ambos casos. Esto es, debe extremarse la higiene personal, sobre todo en el caso de ser portadores del patógeno, y evitar el consumo de alimentos crudos o poco o deficientemente cocinados. 2

Diagnóstico Microbiológico. Koneman, etal. Editorial Panamericana. Quinta edición pag: 172. http://pathmicro.med.sc. http://pathmicro.med.sc.edu/Spanish/chapter edu/Spanish/chapter11.ht 11.htm m

3

4

Su detección, por otra parte, es relativamente simple por los sistemas de control rutinario de cualquier laboratorio. Aunque la normativa actualmente vigente no lo exija, desde distintos sectores se ha venido insistiendo en la necesidad de aplicar estas rutinas con el fin de limitar un riesgo considerado evitable. El control se plantea de forma especial para con los alimentos crudos como la carne y sus derivados, el pescado y sus derivados, y los vegetales. La simple presencia de este microorganismo, o un recuento superior a 100 ufc/g o ml indicará una contaminación fecal con el consiguiente riesgo de que existan cepas patógenas. Las vías de infección Aunque en general las enteritis cursan de forma característica (colitis hemorrágica afebril), la causada por la bacteria verotoxigénica da lugar a manifestaciones variables que van de formas muy leves a formas graves con sangre (colitis hemorrágica). Se ha podido constatar que la fiebre es relativamente frecuente en los casos de enteritis causada por la variante O157:H7, así como la complicación con el síndrome hemolítico-urémico. Los mecanismos por los cuales se producen no se conocen con precisión. La infección por E. coli verotoxigénica parece ser de distribución universal, aunque irregular, pero su prevalencia solamente se conoce con cierto detalle en los Estados Unidos, Canadá, Argentina y Europa Occidental, ya que en el resto de países no ha sido estudiada sistemáticamente. Diversos autores han estudiado en España la frecuencia de La enfermedad se transmite por vía feco-oral y el vehículo más frecuente de infección humana es la carne de bovino, fundamentalmente las hamburguesas poco hechas. También se ha documentado la infección vehiculada por otros alimentos como carne de pavo, salami, leche, yogur, mayonesa, ensaladas, vegetales crudos y agua. Los brotes epidémicos son frecuentes en diversos países como Estados Unidos, Reino Unido, Australia, Argentina y Japón, entre otros. La transmisión de persona a persona también ha sido demostrada y la dosis infectante mínima se estima alrededor de las 100 bacterias. Las distintas formas de Escherichia coli  suelen ser resistentes a las temperaturas extremas y a los ácidos débiles. Los bóvidos parecen constituir el principal reservorio de E. coli O157:H7, encontrado con diferentes prevalencias que oscilan, en animales sanos, entre el 7% y el 30% de los casos estudiados. Parece que estas cepas no son patogénicas para los animales, aunque algunos investigadores las encuentran con más frecuencia en aquellos que tienen diarrea. La prevalencia de otros serotipos de E. coli verotoxigénicos en los animales se desconoce, aunque hay informes de su aislam aislamien iento to en bóvido bóvidos, s, óvidos óvidos,, cabras, cabras, perros perros y gatos. gatos. Desde Desde 1986, 1986, divers diversos os grupos grupos han efectu efectuado ado estudi estudios os prospectivos en nuestro país, que muestran una incidencia muy baja de E. coli verotoxigénica, inferior al 0,3% de los pacientes estudiados. En nuestro país se han detectado algunos brotes, todos ellos con un limitado número de personas afectadas. 4 Escherichia coli enteropatógena coli enteropatógena (EPEC) es una de las principales causas de diarrea en niños menores de dos años en países en vías de desarrollo. La principal característica histopatológica de la infección es una lesión que induce la EPEC en el intestino conocida como la lesión A/E (adherencia y eliminación). Las bacterias se adhieren a los enterocitos y permiten la acumulación de la actina del citoesqueleto en la región apical de la célula, hasta formar una estructura de tipo “pedestal” y causar la eliminación de las microvellosidades intestinales. A pesar de que se conoce de modo detallado el proceso de formación de los pedestales de actina, aún no se ha esclarecido el mecanismo global de la diarrea que induce EPEC. La diarrea se ha vinculado con: a) la destrucción de las microvellosidades del enterocito, b) la salida masiva de iones hacia la luz intestinal y c) la secreción de alguna enterotoxina. En estudios realizados en países en vías de desarrollo se ha demostrado que EPEC es uno de los principales agentes participantes en la diarrea infantil, con elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. El diagnóstico microbiológico de la infección se realiza con metodologías adicionales a las utilizadas con regularidad en el laboratorio de microbiología clínica, entre ellas las siguientes: a) serotificación, b) ensayo de adherencia, c) prueba de FAS (tinción fluorescente para actina) y d) detección específica de genes que codifican a proteínas incluidas en la patogénesis, como el bfpA bfpA y eae. eae. E scherichia coli es coli es el principal anaerobio facultativo de la flora microbiana que reside en el colon humano. El huésped se coloniza desde el nacimiento con una o dos cepas que residen de manera permanente en el intestino y establecen una relación simbiótica con el individuo durante toda la vida.1,2 Sin embargo, se ha precisado que seis grupos grupos patóge patógenos nos o patoti patotipos pos de E. coli  ocasio ocasionan nan diarre diarrea a en sujeto sujetoss sanos: sanos: E. coli  coli  enterotoxigénica (ETEC), entero enteroinv invasi asiva va (EIEC) (EIEC),, entero enterohem hemorr orrági ágica ca (EHEC) (EHEC),, entero enteroagr agrega egativ tiva a (EAEC) (EAEC),, adhere adherente nte difusa difusa (DAEC) (DAEC) y enteropatógena (EPEC). E. coli  enteropatógena (EPEC, por sus siglas en inglés) fue la primera en describirse y es tal vez uno de los microorganismos más estudiados. La infección con EPEC es una de las causas más comunes de diarrea infantil en países en vías de desarrollo, como México. Esto último se debe en gran medida a que en el ámbito local se desconocen muchos aspectos relevantes acerca de la virulencia y el diagnóstico eficaz de EPEC, lo que repercute en el control adecuado de la enfermedad diarreica en los niños. 4

http://www.consumaseguridad.com/sociedad-y-consumo/2003/ http://www.consumaseguridad.com/sociedad-y-consumo/2003/11/07/ 11/07/9262.php 9262.php

5

Escherichia coli enteropatógeno A mediados de la década de los cuarenta se identificaron en Inglaterra brotes de diarrea en niños de guarderías asociados a E. coli. Las bacterias se llamaron E. coli enteropatógenas coli  enteropatógenas (EPEC) para diferenciar a este tipo virulento de las bacterias de flora normal. Una de las principales características de la infección es la diarrea de tipo acuoso, que puede ocurrir en diversos grados de intensidad. Además, es común que los niños infectados presenten vómito y fiebre. El periodo de incubación varía de 3 a 24 horas después de que el individuo ingiere en condiciones experimentales es un inóculo grande de bacterias (109 a 1010 UFC); se cree que el inóculo que infecta de manera natural a los niños es mucho menor. Una vez que la bacteria alcanza la mucosa intestinal, comienza a desencadenarse un mecanismo de patogenicidad complejo, que tiene como resultado la producción de diarrea. Los niños menores de dos años son la población infantil con mayor susceptibilid susceptibilidad ad a la infección, infección, y de ellos, la mayor prevalencia prevalencia se ha observado en lactantes hasta de seis meses.5

Salmonella typhi y paratiphy  Salmonella typhi , typhi , y Salmonella paratiphy A, paratiphy A, B o C. colonizan únicamente a los humanos, lo cual hace necesaria para la transmisión la presencia de casos humanos o de portadores crónicos; ingresan por vía digestiva y llegan al intestino, pasando finalmente a la sangre, causando una fase de bacteriemia hacia la primera semana de la enfermedad. La cantidad necesaria para producir la infección es de 10-5 y 10-9. Las Salmonellas penetran por la boca llegan al intestino delgado y se multiplican durante un periodo de incubación de 3 a 4 días implantándose en las vellosidades del íleon. A través de las placas de Peyer llegan al Epitelio Intestinal

Serotipo:

Serogrupo:

Salmonella paratiphi  Salmonella paratyphi  Salmonella paratyphi  Salmonella typhi 

A B C D

Síndrome Fiebre entérica Fiebre entérica Fiebre entérica Fiebre entérica

S. Typhi Typhi tiene una cantidad cantidad extraordinariam extraordinariamente ente grande de cepas: más de 2.000 están descriptas; descriptas; es el agente infecc infeccios ioso o de la fiebre fiebre tifoid tifoidea. ea. Otras Otras serova serovarie riedad dades es son Typhimu yphimuriu rium m (o S. typhimuri puede e prod produc ucir  ir  typhimurium um) pued gastroenteritis humana, referida como una salmonelosis. Esta bacteria se encuentra a menudo en pollos y sus huevos y en reptiles como las tortugas, por eso no es recomendable mantener a estos animales como mascotas. S. typhi es typhi es la única serovariedad que no produce gas en la fermentación de los azúcares. Clásicamente se distinguían tres únicas especies patógenas primarias: S. typhy , S. cholerae-suis y S. enteritidis. enteritidis. A su vez, según la serotipificación de Kauffman y White, eran clasificadas en más de 2000 serotipos en base a los antígenos flagelares H (proteicos) y antígenos somáticos O (fracción polisacárida de lipopolosacarido bacilar). S. typhi  posee además un antígeno de virulencia (Vi). S. Paratyphi Paratyphi se clasifica en; Paratyphi A, Salmonella Paratyphi C y Salmonella Paratyphi B (fiebre paratifoidea). Los tres primeros microorganismos son patógenos exclusivos del hombre y S. Paratyphi B se puede encontrar también en animales. animales.6 Proteus

Clasificación científica Bacteria Filo: Proteo bacteria Clase: Gamma Proteobacteria Orden: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae Género: Proteus  

Especies: mira bilis  P. mirabilis mor ganii   P. morganii  pe nneri   P. penneri  re ttgeri   P. rettgeri  vul garis  P. vulgaris 5 6

http://www.insp.mx/rsp/_files/F http://www.insp.mx/rsp/_files/File/2007/Septiembre%2 ile/2007/Septiembre%20Octubre/7-patogen.pdf  0Octubre/7-patogen.pdf  Biología de los Microorganismos Brock PAG. 938,978974,977-78

6

Proteus es un género de bacterias gramnegativas, que incluye patógenos responsables de muchas infecciones del tracto urinario. Las especies de Proteus normalmente no fermentan lactosa por razón de tener una β galactosidasa, pero algunas se han mostrado capaces de hacerlo en el test TSI ( Triple Sugar Iron). Iron). Son oxidasa-negativas y ureasapositivas. Algunas especies son mótiles. Tienden a ser organismos pleomórficos, no esporulados ni capsulados y son productoras de fenilalanina desaminasa. Con la excepción de P. mirabilis, mirabilis, todos los Proteus reaccionan negativos con la prueba del indol. Hábitat: Proteus es un género de bacterias ubicuo, residente del tracto intestinal del hombre y otros animales. Cultivo: Crecen en medios corrientes y moderadamente selectivos a temperatura corporal de 37ºC. Crecen formando capas diseminadas por virtud de su gran motilidad. Existen variantes inmóviles que forman colonias lisas. Morfología La estructura antigénica está compuesta por antígeno somático O, flagelar H y superficial K. El antígeno flagelar H contribuye a la capacidad invasora de las vías urinarias. La variante X del antígeno somático O está presente en algunas cepas de P. mirabilis. mirabilis . Otros grupos antigénicos definidos son el OX2, OX19 y OXK.4 El grupo OX19 (y a veces el grupo OX2) da reacciones cruzadas (aglutinación) en pacientes con Rickettsia prowazekii  y ésa es la base de la prueba de Weil Félix. Patogenia Hay tres especies que causan infecciones oportunistas en el hombre: P. vulgaris, vulgaris, P. mirabilis, mirabilis, y P. penneri . Causan infeccione infeccioness urinarias urinarias (más del 10% de complicacio complicaciones nes del tracto tracto urinario urinario incluyendo incluyendo cálculos y lesiones lesiones celulares celulares del epitelio epitelio renal), enteritis (especialment (especialmente e en niños), niños), abscesos abscesos hepáticos, hepáticos, meningitis, meningitis, otitis media y neumonía neumonía con o sin empie empiema, ma, entre entre otros. otros. Es un frecue frecuente nte invaso invasorr secund secundari ario o de quemad quemadura urass y herida heridas, s, así como como infecc infeccion iones es nosocomiales. Todas las especies de Proteus son resistentes a la ampicilina. P. mirabilis es sensible a la penicilina. Factores de virulencia Flagelos Fimbrias Proteínas de membrana Ureasa Hemolisinas No

producen toxinas solubles 7

Medios de cultivo: MAC CONKEY  Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigella y coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos. Usos: El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estría superficial, o bien inocularlo en medios líquidos d enriquecimiento, enriquecimiento, tales como caldo tetrationato, tetrationato, caldo selenito cistina o caldo GN. Incubar placas y caldos a 35ºC de 18 a 24 horas. Hacer resiembras de estas últimas en placas de Agar de Mac Conkey y volver a incubar. Se recomienda sembrar simultáneamente las muestras en otros medios mas selectivos tales como Eosina y Azul de metileno, Agar SS, Agar Tergitol Tergitol 7, Agar XLD, Agar Entérico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto (altamente específico para Salmonella tiphy), Agar Verde Brillante, especial para Salmonellas. Los gérmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no fermentadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas. En el Agar MacConkey crecen también bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, como Pseudomonas Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, Asimismo, pueden desarrollar desarrollarse se en número número reducido reducido colonias colonias puntiforme puntiformess de Streptococcus 7ecales de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. Por último, este medio puede usarse en la diferenciación de especies de Mycobacterium. (MANUAL BIOXON BIOXON 26) CARACTERÍSTICAS DE LASA COLONIAS

MICROORGANISM  

Guentzel MN (1996). Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, and Proteus. In: Barron's Medical  Microbiology (Barron S et al, eds.), 4th ed., Univ of Texas Medical Branch.

7

7

O

Puntiformes, rosa pálido, opacas y escasas De rojas o rosadas. No son mucoides. Pueden rodearse de un precipitado opaco de sales biliares. Grandes, rosadas. No mucoides Inco Incolloras oras,, has hastta ca café ve verdos rdosas as.. Ol Olor dulz dulzai ain no car carac actterís erísttico ico Escasas, puntiformes, rojas, opacas y con un halo claro como de 1mm de diámetro alrededor de la colonia

Estafilococos E. Coli  Enterobacter  Pseud seudom omon onas as Enterococos

 AGAR MUELLER HINTON  Pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de Neisseria En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. También se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas) Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño María a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún momento. Usos: Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35ºC, en atmósfera de CO2. El medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodón húmedo y una vela encendida, cerrando luego herméticamente. Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse después de 12 a 18 horas de incuba incubació ción. n. Despué Despuéss de este este tiempo tiempo se tendrá tendrán n que revisa revisarr periód periódica icamen mente te las zonas zonas de inhibi inhibició ción n ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentración del agente antimicrobiano comienza a disminuir. disminuir. Se obtiene mejores resultados resultados para aislar Neisserias Neisserias patógenas patógenas preparando preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adic adicio ioná nánd ndol ole e a cada cada 100 100 ml del del medi medio o term termin inad ado o y flui fluido do 1.0 1.0 ml de la susp suspen ensi sión ón VCN, VCN, mas mas 1.0 1.0 ml del del polienriquecimiento. (MANUAL BIOXON 28) BASE DE CALDO ROJO FENOL Fermentación de carbohidratos; Medio usado para determinar las reacciones de fermentaciones. Usos: El base de caldo rojo de fenol puede usarse en los estudios de fermentación de muchas especies bacterianas. Los tubos de control sin carbohidratos deben inocularse e incubarse en paralelo con las pruebas de fermentación. Deben examinarse los cultivos frecuentemente ya que los diferentes carbohidratos pueden ser utilizados a velocidades variables. La aparición de color amarillo es indicio de fermentación. Para el cultivo de microorganismos anaerobios, el medio debe estar preparado recientemente o calentarse y enfriarse antes de su uso. (BIOXON 41) Ingredientes: (pH 7.4 ±  0.2) Peptona (proteosa o digerido pancreático de caseína) 10g Extracto de carne 1g Cloruro de sódio 5g Rojo fenol 0.018g Água desionizada 1000ml Rojo fenol como indicador de pH  a) Ácido (fermentación): color amarillo, pH 6.8  b) Alcalino: color rosado rojo, pH 8.4 c) Medio Medio sin sin inocul inocular: ar: colo colorr naranja naranja roji rojizo, zo, pH pH 7.4 Interpretación: 1) Posit ositiv ivo o (A (A/F) a) Ácid Ácido: o: colo colorr ama amari rillllo, o, pH 6.8 6.8 b) Prod Produc ucci ción ón de gas gas vari variab able le  Positivo para el gas (G, A )

8

Negativo para el gas  2) Tardí ardío: o: Col Color or ana anara ranj njad ado o 3) Negativo a) Colo Colorr ros rosa a roj rojiz izo o  b) Peptonas utilizadas con la resultante alcalinidad, pH 8.4 8  AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS)

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la s ales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. El indicador de H 2S es el citrato férrico. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar incubar previamente la muestra en Selenito caldo. Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 8.5 Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato férrico 1.0 Agar 13.5 Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 ± 0.2

Instrucciones

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCL AUTOCLA AVE. Enfria Enfriarr a 45-50° 45-50°C C y distri distribui buir  r  unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. o de agar Mac Conkey. Incubación Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Resultados

Microorganismos Salmonella ty typhimurium ATCC 14 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias Transparentes, ce centro ne negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

Características del medio: Medio preparado: rojo naranja.9

8

MacFaddin MacFaddin,, Pruebas Pruebas bioquímica bioquímicass para la identific identificación ación de bacterias bacterias de importanc importancia ia clínica clínica 3ªEdición 3ªEdición;; ED. Panamericana, Buenos aíres argentina argentina 2003. pp. 59, 67, 68 9 http://www.mcd.com.mx/

9

 AGAR SULFITO DE BISMUTO Es un medio de Wilson y Blair modificado y altamente selectivo para asilar Salmonella typhi, asi como otros bacilos entericos de heces, aguas negras, aguas de bebidas y diversos alimentos. Formula aproximada en gramos: Mezcla de peptonas.................. peptonas....................10.0 ..10.0 Extracto de carne.................. carne.........................5.0 .......5.0 Dextrosa.......................................5.0 Fosfato disódico................. disódico........................... ..........4.0 4.0 Sulfato ferroso..............................0.3 Indicador de Sulfito de Bismuto....8.0 Verde Brillante............................0.025 Agar............................................20.0 Usos: Junto a este medio, por ser fuertemente fuertemente inhibidor, inhibidor, se aconseja aconseja inocular también otros medios selectivos selectivos menos inhibidores, tales como Agar Eosina y Azul de Metileno, Agar Mac Conkey, Agar Tergitol Tergitol 7, Agar Entérico Hektoen, Agar  SS, etc. Por lo común, el agar Sulfito de Bismuto se siembra por estría superficial tratando de obtener colonias muy bien aisladas. Pueden hacerse inoculaciones por vaciado de una suspensión de heces como del 10% en agua destilada o en solución salina estériles. Vaciar aproximadamente 5 ml de la suspensión en no menos de 20 ml del medio previamente fundido y enfriado a unos 45-50ºC. Mezclar perfectamente, dejar que solifique e incube de 24 a 48 hrs. Las placas una vez solidificadas deberan presentar una opacidad crema uniforme,y gradualmente un color verde muy pálido. Si se guarda en refrigeración, el medio que esta en forma reducida, se ira oxidando poco a poco hasta adquirir  un color francamente verde. Al llegar a este momento descártelo. Cook (1952) recomienda dejarlo en refrigeración durante 4 dias antes de usarlo para aislar Salmonella typhimurium con el fin de hacerlo menos inhibidor. En presencia de H2S, las Salmonellas reducen las sales de hierro y bismuto a sulfuro de hierro negro que se deposita en la colonia, y, y, a bismuto metálico que se precipita en el medio de cultivo, formando un halo brillante pero menos oscuro alrededor de la misma. Tanto el color negro de la colonia como el brillo metálico del halo aumentan si la placa se deja de 2 a 3 horas a temperatura ambiente y en presencia de la luz. Las colonias de coliformes, Shigella y Proteus presentan un color verde, café o negro y no ennegrecen el medio. Las placas deberán incubarse hasta 48 horas. Características de las colonias Salmonella Elevadas con centro negro, bordes claros y translucidos. Colonias en “ojo de pescado o de conejo”. typhi  Se vuelve uniformemente negras a las 48 hrs. Entre las 18 y 24 hrs se forma en el medio de cultivo un halo negro grisáceo y con brillo metálico rodeando a la colonia Otras Elevadas y generalmente mas pequeñas que las de S. typhi. Negras si producen H2S. halo negro Salmonellas grisáceo con brillo metálico después de 36 a 48 hrs de incubación. Verdosas si no son productoras de sulfuros como S. paratyphi A. Pequeñas y pardas como S. choleraesuis y S. gallinarum, que son bastante inhibidas. Arizona yGrandes Grande   s elevadas, elevadas, negras grisáceos, como gotas de plomo. Halo gris negro y con brillo metálico. metálico. Citrobacter  Las cepas no fermentadoras de la lactosa varían del verde al café Coliformes, Desarrollo ocasional. Colonias que pueden ser verdes, cafés y aún negras. Estas últimas mas Proteus pequeñas que S. typhi y por lo general sin brillo metálico en el medio que rodea a la colonia Shigella Casi todas inhibidas. En el caso de crecer. Sh.flexneri y Sh.sonnei son de color café, deprimidas en el centro y con borde elevados (crateriformes).  AGAR HIERRO Y TRIPLE AZUCAR (TSI) Diferenciación e identificación de enterobacterias Medio Medio difere diferenci ncial al muy usado usado en la identi identific ficaci ación ón de entero enterobac bacter terias ias patóge patógenas nas y saprof saprofiti iticas cas en los anális análisis is bacteriológicos rutinarios de heces, principalmente. Este medio se usa como clave para iniciar la identificación de entero enterobac bacter terias ias en alguno algunoss esquem esquemas as del FDA. FDA. Medio Medio univer universal salmen mente te emple empleado ado para para la difere diferenci nciaci ación ón de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. Formula aproximada en gramos por litro: Mezcla de peptonas.................. peptonas........................... ...............20.0 ......20.0

10

Cloruro de sodio.........................................5.0 Lactosa.....................................................10.0 Sacarosa..................................................10.0 Dextrosa.....................................................1.0 Sulfato de Amonio Férrico.................. Férrico.........................0.2 .......0.2 Rojo fenol...............................................0.025 Agar..........................................................13.0 Tiosulfato de sodio.....................................0.2 Usos: Su modo de acción es semejante al medio de Kligler que contiene dos azucares, adicionado además con 1% de sacarosa. Esto permite el reconocimiento y exclusión de Proteus. Hafnia y Providencia no fermentan la lactosa o lo hacen muy lentamente y si en cambio fermentan la sacarosa con bastante rapidez, lo cual permite excluir a ese grupo de bacterias de Salmonella y Shigella. Fundamento: En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Siembra: A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubación a 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pi 1-Pico co alca alcalilino no/f /fon ondo do ácid ácido o (pic (pico o rojo rojo/f /fon ondo do amar amarilillo lo): ): el micr microo oorg rgan anis ismo mo sola solame ment nte e ferm fermen enta ta la gluc glucos osa. a. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pi 3-Pico co alca alcalilino no/f /fon ondo do alca alcalilino no (pic (pico o rojo rojo/f /fon ondo do rojo rojo): ): el micr microo oorg rgan anis ismo mo es no ferm fermen enta tado dorr de azúc azúcar ares es.. 4-La 4-La pres presen enci cia a de burb burbuj ujas as,, o rupt ruptur ura a del del medi medio o de cult cultiv ivo, o, indi indica ca que que el micr microo oorg rgan anis ismo mo prod produc uce e gas. gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 A: ácido K: alcalino

Pico/Fondo

Producción de gas

A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/K

+ + + + -

Producción deácido sulfhídrico + + + -

 AGAR HIERRO Y LISINA (LIA) Diferenciación temprana de Salmonella y Arizona Medio muy útil para diferenciar tempranamente cepas de Salmonella y Arizona de Citrobacter. Se basa en las descar descarbox boxila ilació ción n de la lisina lisina,, formac formación ión de sulfur sulfuros os y fermen fermentac tación ión de glucos glucosa. a. Tambié ambién n podem podemos os detect detectar ar la desaminación del aminoácido lisina. Formula aproximada en gramos por litro: Peptona de Gelatina................ Gelatina......................... ................5.0 .......5.0 Extracto de Levadura................. Levadura........................... ..............3.0 ....3.0 Dextrosa...................................................1.0 L-Lisina....................................................10.0 Citrato de Amonio Férrico.................. Férrico........................0.5 ......0.5 Tiosulfato de Sodio.................................0.04 Purpura de Bromocresol................ Bromocresol.........................0. .........0.02 02 Agar desecado................... desecado............................ ................... ............13.5 ..13.5

11

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismo microorganismoss que no producen producen lisina decarboxila decarboxilasa, sa, pero que son fermentado fermentadores res de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Usos: Algunas Algunas cepas de arizona pueden fermentar, fermentar, o no rápidamente rápidamente la lactosa lactosa y formar formar colonias colonias incoloras o de color rosa hasta el rojo en medios tales como el Mac Conkey o el Agar Desoxicolato. Las cepas que fermentan rápidamente la lactosa producen una gran cantidad de ácido cambiando al amarillo el color original de esos medios. Esto puede interpretarse erróneamente y confundir una cepa de Arizona como si fuera coliforme. coliforme. El medio de Agar de Hierro y Lisina esta especialmente adaptado para evitar dicha confusión, Salmonella y Arizona alcalinizan el medio al descarboxilar la lisina comunicándole a este un color azulado púrpura en toda la superficie. Proteus y Providencia presentan en la superficie del medio un color característico rojo-anaranjado. Y en el fondo existe producción de acido que se manifiesta por un color amarillento, y que es debido a la desaminación de la lisina. Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) GERMENES SUPERFICIE INCLINADA FONDO Arizona Alcalino Alcalino Salmonella Alcalino Alcalino (excepto S. paratyphi A) Alcalino Acido Enterobacter  Alcalino Alcalino aerogenes Enterobacter cloacae Alcalino Alcalino Klebsiella Alcalino Alcalino Hafnia Alcalino Alcalino Serratia Alcalino Alcalino Citrobacter (E. Freundii) Alcalino Ácido Escherichia Alcalino Ácido o neutro Alkalescens-Dispar Alcalino Ácido o neutro Shigella Alcalino Ácido Proteus rojo Ácido Providencia rojo Ácido

H 2S + + + -

10

 AGAR MIO

10

Manual de BIOXON. P.p. 22,23-24, 30-31

12

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol. Fundamento Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color  púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador  hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo. Fórmula (en gramos por litro) Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 3.0 Peptona 10.0 Tripteína 10.0 Clorhidrato de L-ornitina 5.0 Agar 2.0 Púrpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 ± 0.2

Instrucciones Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121°C.

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por punción profunda con asa recta. Incubación En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 °C. Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se r ealiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento. Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071

Crecimiento Bueno Bueno Bueno

Movilidad + +

Indol + -

Ornitina decarboxilasa + +

Características del medio: Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente. MEDIO Christensen (Urea Agar Base) Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

13

Fundamento En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

Fórmula (en gramos por litro) Tripteína 1.0 Glucosa 1.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato monopotásico 2.0 Rojo de fenol 0.012 Agar

15.0

Instrucciones Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar  en autocl autoclave ave a 121°C 121°C durant durante e 15 minuto minutos. s. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por  filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemóli hemólisis sis y solidi solidific ficar ar en pico pico de flauta flauta con fondo profundo.

pH final: 6.8 ± 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Incubación En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. Resultados

Microorganismo Proteus mirabilis ATCC 43071 K. pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 S. typhimurium ATCC 14028

Actividad ureásica Positiva Positiva débil Negativa Negativa Negativa

Color del medio Rojo-Rosado Rojo-Rosado Amarillo Amarillo Amarillo

Limitaciones -Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación. -No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente. Características del medio: Medio preparado: amarillo  AGAR XLD El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella y Providencia. El Agar XLD fue desarrollado por Taylor para incrementar la eficiencia en el aislamiento e identificación de patógenos entéricos, particularmente de Shigella. Los patógenos son diferenciados no sólo de los no patógenos fermentadores de lactosa, sino también de varios no patógenos no fermentadores de la lactosa o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de gérmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente tóxicos. El Agar XLD está incluido en la USP para los métodos de límite microbiano y las pruebas de “presencia-ausencia de Salmonella” En este medio el extracto de levadura provee la fuente de nitrógeno, carbono, vitaminas y cofactores. La xilosa, lactosa y sacarosa son los carbohidratos fermentables. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico son adicionados para ver la producción de H2S. El rojo de fenol actúa como indicador. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es adicionado como agente solidificante. Fórmula (g/L): Xilosa 3.5 Extracto de Levadura 3.0 L- Lisina 5.0

14

Rojo de Fenol 0.08 Lactosa

7.5 Desoxicolato de Sodio 2.5 Sacarosa 7.5 Tiosulfato de Sodio 6.8 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriológico 13.5 Citrato Férrico de Amonio 0.8 pH 7.4 ± 0.2 Método: Suspender 55g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. Enfriar a una temperatura entre 45- 50°C y vaciar en placas de Petri estériles. Procedimiento: Las muestras fecales o hisopos rectales pueden ser sembradas directamente en las placas. Las muestras pueden ser  enriquecidas previamente utilizando Caldo Tetrationato Tetrationato o Caldo Selenito. Resultados: La degradación de la xilosa, lactosa y sacarosa genera la producción de ácido cambiando el color del medio de rojo a amarillo. La producción de H2S bajo condiciones alcalinas, da colonias con el centro negro. Esta reacción es inhibida en condiciones condiciones ácidas. La descarboxil descarboxilación ación de la lisina en ausencia de fermentaci fermentación ón de lactosa o sacarosa, sacarosa, ocasiona la reversión del medio a alcalino y el color del medio regresa a rojo.

MATERIAL  1 espátula

1 agitador de vidrio

30

3

tubos de ensaye chicos con tapa de rosca Papel craft 1 pipeta 5ml Mechero 3 portaobjetos 1 vaso de pp. de 250ml Gasa Torundas con alcohol Hisopos estériles

matraz erlenmeyer 500mL Gradilla 30 cajas petri estériles 5 asas y portasas 1 probeta 250ml Algodón Papel filtro 2 Asa y portasa recta 

REACTIVOS Medio

Mac Conkey de Caldo Rojo Fenol Base de Agar Salmonella y shigella Base de Agar Sulfito de bismuto Base de Agar Hierro y triple azúcar (TSI) Base de Agar LIA Base de Agar MIO Base de Agar UREA Base de Agar XLD Aceite mineral Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Alcohol Base

MATERIAL BIOLÓGICO Microorganismos desconocidos a identificar (Cepa 1 y 2; sembrados en caldo) Microorganismos de las especies: E.coli, Salmonella typhi, S. paratyphi, Proteus

15

EQUIPO  Incubadora  Autoclave Refrigerador  Parrilla eléctrica  Balanza  Microscopio

PROCEDIMIENTO Primera sesión Se procede a preparar los medios que se van a utilizar para la identificación de posibles microorganismos. Una vez preparados los medios Se siembra en: Mac Conkey  cepa 1  sembrar estria cruzada E.coli Mac Conkey  cepa 2  sembrar estria cruzada Salmonella Muller Hinton  mezcla de los dos anteriores por estria cruzada Se incuban a 35ºC por 24 horas Segunda sesión Observación de las características macroscópicas en c ada medio sembrado Realización de frotis al Gram de 2 colonias. Observación a inmersión Siembra de la colonia pura Preparación de las pruebas bioquímicas: urea, LIA, TSI, MIO, rojo fenol. Se inoculan las pruebas bioquímicas realizadas y se incuban a 35ºC por 24 horas Tercera sesión: Observación de las características macroscópicas en c ada medio sembrado Interpretación de las bioquímicas realizadas, identificación de los microorganismos que presentan estas características Siembra de colonia pura por estria cerrada, para poder hacer antibiograma con alguno de los siguientes antibióticos: 1. AM amopic opicililiina 2. CF ce cefalotina 3. CTX CTX cef cefotax otaxim ima a 4. CAZ CAZ cef cefttazid azidiima 5. CXM CXM cefu cefuro roxi xima ma 6. DC dic diclo loxa xaci cillina ina 7. E eri eritro tromicin icina a 8. GE gent gentam amiicina cina 9. PEF pef pefloxa loxaci cina na 10. 10. PE peni penici cililina na 11. TE tetrac tetracicl iclina ina 12. SXT trimetiop trimetiopin in con sulfam sulfametoxazo etoxazoll Cuarta sesión Observación de las características macroscópicas en la prueba de sensibilidad. Medir el halo de inhibición se presentó) con un regla y determinar posible tratamiento. Realización de frotis de Gram del cultivo obtenido. Observación a inmersión. Identificación de microorganismo a partir de los resultados obtenidos.

RESULTADOS: MEDIO Y/O PRUEBA

CARACTERÍSTICAS

IMAGEN  

16

MEDIO MacConkey CEPA: E. Coli 

MEDIO MacConkey CEPA: Salmonella Typhi 

MEDIO MacConkey CEPA 1: (problema) Identificado como E. Coli 

MEDIO MacConkey CEPA 2: (problema) Identificado como: Salmonella  paratyphi  MEDIO Mueller-Hinton MEZCLA DE CEPA 1 Y 2: (problema) Identificado como: Muy poca Salmonella y más E. Coli 

Colonias moradas, rosas, opacas, cremosas, circulares, convexas con elevación y bordes uniformes, regulares, no adherentes. Medio morado con halo rosa alrededor de las colonias, por lo tanto lactosa positiva (halo de lactosa y piruvato ya que es grande). La disponibilidad de carbohidratos es buena. Bacilos gramnegativos pequeños

Vire del medio a naranja ya que no pudo desdoblar la lactosa; bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias ambarinas, pequeñas, transparentes y butílicas no mucoides. Bacilos gramnegativos demasiado pequeños.

Colonias rosas mexicano, opacas, cremosas, circulares, convexas con elevación y bordes uniformes, regulares, no adherentes. No son mucoides. Rodeadas de un precipitado opaco de sales biliares. Medio morado con halo rosa alrededor de las colonias, lactosa positiva.

Vire del medio a naranja ya que bajo el pH ya que no pudo desdoblar la lactosa. Colonias ámbar, pequeñas, transparentes y butílicas no mucoides, colonias expandidas, lo que da indicios de ser paratiphy.

Vire del medio se encontraba color amarillo-ámbar  Salmonella: Colonias ámbar, pequeñas, transparentes y butílicas no mucoides en poca cantidad. E. Coli: Colonias ámbar, grandes, opacas, cremosas, circulares, convexas con elevación y bordes uniformes y regulares en gran cantidad.

17

MEDIO Mueller-Hinton MEZCLA DE CEPA 1 Y 2: (problema) Identificado como: más Salmonella y   poco E. Coli  MEDIO MacConkey CEPA: Proteus

Base de Rojo Fenol

Medio amarillo ámbar. Salmonella: Colonias ámbar, pequeñas, transparentes y butílicas en gran cantidad (casi toda la placa las contiene). E. Coli: Colonias ámbar, grandes, opacas, cremosas, circulares, convexas con elevación y bordes uniformes y regulares. En casi nula cantidad; solo se observan algunas colonias asiladas.

Vire del medio a naranja. Colonias pequeñas, transparentes que se difunden en el medio. No fermentador de lactosa (lactosa-)

Caldo

E.

Coli: amarillo, por lo tanto ácido y fermentativo (A/F) Salmonella: Rosa, por lo tanto alcalino (K) Proteus: Rosa, por lo tanto alcalino (K) Control: Naranja rojizo

E. Coli: Pico amarillo, fondo amarillo (A/A) con Base de Agar   producción de gas. Hierro y triple Salmonella: Pico rojo, fondo amarillo (K/A) sin azúcar (TSI) producción de gas y con producción de ácido sulfhídrico. Proteus: Pico rojo, fondo amarillo (K/A) con producción de gas y H2S (parte negra en el medio).

Base de Agar LIA

E. Coli: Pico púrpura, fondo púrpura;

descarboxilación de lisina Salmonella: Pico púrpura, fondo púrpura (A/A); descarboxilación de lisina con ennegrecimiento del medio (produce H2S) Proteus: Pico azul, fondo amarillo (K/A); desaminación de lisina Base de UREA Christensen

Agar   E. Coli: Amarillo; Ureasa de Salmonella: Amarillo; Ureasa Proteus: Rojo; Ureasa +

18

Base de Salmonella shigella

Agar   E. Coli: Colonias rosas (B) y Salmonella: Colonias transparentes con centro negro (C) Proteus: Colonias transparentes con centro negro (D) * (A= Klebsiella pneumoniae; D = Pseudomona aeruginosa)

Base de Agar MIO

E. Coli: Movilidad + (turbidez); Indol + (anillo rosa);

Ornitina descarboxilasa + (púrpura/azul) Salmonella: Movilidad +(turbidez); Indol - (anillo amarillo); Ornitina descarboxilasa - (anillo amarillo) Proteus: Movilidad +(turbidez); Indol – (anillo amarillo); Ornitina descarboxilasa + (púrpura/azul)

DISCUSIÓN DE RESULTADOS  Se sembró primero en medio MacConkey las cepas de E. Coli y Salmonella, en donde aunque se sembró en el







 



mismo medio, las características observadas fueron muy diferentes ya que para E. Coli, el medio vario de color  dando un color del medio entre rosa y morado al bajar el pH con un halo turbio alrededor demostrando el desdoblamiento de la lactosa, es decir que la fermenta (lactosa+), esto debido al indicador que contiene el medio (rojo neutro), razón por la cual las colonias fueron rosa-moradas. Se realizó un frotis de las colonias y estas dieron bacilos gramnegativos y eran pequeños, pero no se tomo foto ya que la cámara no pudo enfocar el microscopio. Para Salmonella en MacConkey el medio viró a naranja ya que no es un microorganismo fermentador de lactosa, por lo que las colonias dieron color ámbar (por el color del medio). Se realizó un frotis y se observaron bacilos gram - demasiado pequeños. No crecieron otro tipo de microorganismos en el medio ya que por ejemplo los gram+ son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta que contiene el medio. Después se realizó la siembra de 2 cepas desconocidas (de un paciente) también en MacConkey. Se clasificaron como cepa 1 y 2. Para la cepa 1 las colonias fueron de las mismas características que para E. Coli, por lo que se dedujo que la cepa era de este microorganismo; Para la cepa 2, se observ aron las mismas características que para Salmonella, sin embargo había una diferencia: las colonias se expandían levemente en el medio, lo que nos daba indicios de que el microorganismo se trataba de Salmonella paratiphy. Se realizaron también 2 siembras de la mezcla de la cepa 1 y 2, realizada cada una por dos personas diferentes, por lo que se encontraron encontraron algunas algunas variantes en los medios: medios: En la primer mezcla se observó observó que habían habían colonias tanto de E. Coli como de Salmonella y estas se distinguían ya que las c olonias de E. Coli eran más grandes y había mayor cantidad de ellas en el medio; en cambio para la segunda siembra, las características eran iguales a la anterior, sin embargo, había mayor cantidad de Salmonella que de E. Coli ya que de este solo había algunas colonias aisladas. Estas variaciones se pueden ver debido a como se mezclaron las cepas por cada persona que realizó la siembra. Se resembró en medio MacConkey la cepa de proteus, observando así un vire del medio a naranja, por lo que se deduce que es lactosa negativo negativo ya que contienen β galactosidasa Las colonias fueron transparentes y se difunden también en el medio, sin observarse realmente colonias aisladas en el medio. Para el caldo rojo fenol apenas se observó una variación en el medio, pero las características observadas fueron: para E. Coli, un leve color amarillento, lo que indica acidez en el medio y por lo tanto fermentación; para salmonella y proteus se observó un color levemente rosado, por lo que indica a comparación con el control una alcalinidad en el medio, por lo que no son fermentadoras e indica que utilizaron las peptonas contenidas en el medio para su En el medio TSI, TSI, para E. Coli Coli se observó el pico y fondo amarillos amarillos (A/A) (A/A) por lo que son ácidos ya que por la fermentación de los carbohidratos del medio (en el pico lactosa y sacarosa y en el fondo glucosa), el rojo fenol viró a amarillo. Se observaron burbujas en el medio medio indicando la producción de gas. Para salmonella salmonella se observó pico rojo (alcalino) y fondo amarillo (ácido) (K/A), lo que el microorganismo microorganismo solamente fermenta la glucosa indica que sin producción de gas y hubo ennegrecimiento del medio lo que indica la producción de ácido sulfhídrico ya que el tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Por último para proteus se observó pico rojo, fondo amarillo (ya que solo fermenta glucosa) (K/A) con producción de gas y H2S.

19

 En el agar LIA se observó para E. Coli el pico y fondo púrpura lo que indica descarboxilación de lisina detectándose

así la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. Aunque E. Coli es fermentador de glucosa, el medio dio púrpura debido a la desaminación y producción de la amina cadaverina que alcalinizó el medio. Para salmonella se observaron las mismas características que para E. Coli, pero con producción de H 2S por medio de los indicadores de citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio dándole una coloración negra. Para Proteus se observó pico azul (aunque debería de haber salido rojo, posiblemente por una variación en el indicador), con fondo amarillo indicando alcalinidad en pico y acidez en fondo y la desaminación de lisina por producción de un ácido alfa-cetocarbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio, sin embargo en nuestra prueba en vez de rojo nos nos dio un color azulado. Amarillo (por el rojo de  Por último se realizó la prueba de la Urea en la que para E. Coli y salmonella el medio viró a Amarillo fenol) indicando actividad actividad Ureásica negativa y para proteus proteus el vire fue a rojo indicando actividad actividad ureásica positiva ya que hidroliza la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo.  Los medios SS y MIO no se realizaron, pero las características que debieron haberse observado para cada bacteria utilizada son: En el medio SS para E. Coli se acidifica el medio virándolo a rojo y obteniéndose así colonias rosas debido a la fermentación de lactosa; Para proteus y salmonella se observan colonias transparentes con un centro negro, lo que indica la producción de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio, y el indicador que le da el color  es el citrato férrico. No crecen otras bacterias ya que el medio contiene verde brillante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas. turbidez en el medio, Indol + por la formación de  En el medio MIO para E. Coli se observa movilidad + por reflejo de turbidez un anillo rosa en la superficie superficie ya que el microorganismo microorganismo contiene contiene la enzima enzima triptofan triptofanasa asa que produce produce el indol y Ornitina Ornitina + ya que contiene ornitina ornitina descarboxilasa descarboxilasa dando así la coloración coloración púrpura/azul púrpura/azul del medio (K). Para salmonella se observa movilidad +, Indol – reflejado por un anillo amarillo ya que no contiene triptofanasa y Ornitina descarboxilasa – observándose así un anillo anillo amarillo. Por último último para Proteus hay movilidad movilidad +(turbidez), Indol – con anillo amarillo amarillo y es Ornitina descarboxilasa + .

ANTIBIOGRAMAS: CRITERIOS DE INTERPRETACIÓN BASADOS EN EL MÉTODO DE KIRBY-BAUER DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD PARA MICROORGANISMOS DE FÁCIL CRECIMIENTO Contenido del disco

Agente Antimicrobiano  Ampicilina Enterobacteriaceae Estafilococos Enterococos Estreptococos hemolíticos Penicilina G Estafilococos Enterococos Estreptoco Estreptococos cos hemolíticos Cefotaxima Cefoxitina Ceftacidima Cefuroxima sódica parenteral  Cefalotina Gentamicina Eritromicina Tetraciclina

Diám Diámet etro ro de la zona zona de inhi inhibi bici ción ón en mm Resistente Sensible Intermedio <ó= >ó=

10 µg 10 µg 10 µg β 10 µg

13 28 16 18

14-16 ....... ....... 19–25

17 29 17 26

10 U 10 U β 10 U

28 14 19

......... .......... 20–27

29 15 28

14 14 14 14 14 12 13 14

15-22 15-17 15-17 15-17 15-17 13-14 14-22 15-18

23 18 18 18 18 15 23 19

10

11-15

16

30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 10 µg 15 µg 30 µg 1.25/23.75 Trimetoprima – Sulfametoxazol  µg

RESULTADOS: MEDIO DE CULTIVO

OBSERVACIONES

IMAGEN

20

Y MICROORGANISMO INHIBICIONES (SENSIBILIDAD) (SENSIBILIDAD) Es inhibido por las tetraciclinas, sulfametaxoltrimetropim, ampicilina, penicilina Halo de inhibición: Mueller-Hinton E. Coli 

CI (cloranfenicol) de 1mm (muy poco sensible o casi resistente) AM (ampicilina) de 2mm (muy poco sensible o casi resistente) PEF (pefloxacina) de 6 mm NF (nitrofurantoina) de 4 mm CF (ceftriaxona) de 6 mm CRO (ceflaxona) de 8 mm SXT (trimetroprim/sulfametoxazol) (trimetroprim/sulfametoxazol) de 1 cm CTX (cefotaxima) de 1cm AK (amicacina) de 1 cm NET (metilmicina) de1 cm GE (gentamicina) 6 mm RESISTENTE Solo a CB (garbenmicina) no presento halo de inhibición

CONCLUSIONES En esta práctica se identificaron algunas de las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae como fueron en este caso: Proteus, Proteus, E.coli, E.coli, Salmonell Salmonella a. Determinan Determinando do y afirmando afirmando sus característi características cas microscópic microscópicas, as, culturales culturales y bioquímicas de cada una de ellas, diferenciándolas unas de las otras. La familia de Enterobacteriaceae tiene como características generales ser bacilos Gram Negativos, sin agrupación, miden de 0.6 – 0.8 µ de ancho por 2 a 4 µ largo, son móviles o inmóviles, inmóviles, no esporulados, esporulados, catalasa catalasa positivo, positivo, oxidasa negativos, reducen el nitrato a nitrito, son fermentadores de glucosa. Este tipo de familia familia son recuperados recuperados muy fácilmente fácilmente de muestras muestras clínicas, especialment especialmente e de heces, ya que como su nombre los dice se encuentran en los intestinos. Para E.coli se E.coli se sembró en una mezcla con Salmonella en el medio de Muller Hinton para poder diferenciar una de otra en un mismo cultivo. Donde se concluye que E.coli se E.coli  se determino del cultivo en Cepa 1 de un paciente, donde las colonias son de rojas a rosadas. No son mucoides, rodeadas de un precipitado opaco que es de las sale biliares. En la prueba de rojo de fenol se torno ligeramente a amarillo demostrando su capacidad de formación de ácidos y fermentación. En la prueba de TSI se coloro todo el tubo de color amarillo por la formación formación de ácidos. ácidos. En el medio LIA el pico y el fondo se presento presento un color púrpura por la descarboxilación con pH alcalino. Y por ultimo en urea viro el medio a color amarillo, dando como prueba positiva ya que esto demuestra que la hidroliza la urea por medio de la enzima ureasa. Salmonella en el medio Mac Conkey viro el medio a un color naranja esto debido a que fermenta la lactosa. Se determino de la Cepa 2 que era Salmonella que cumplió con las características de crecimiento de esta misma como es ser incoloras, transparentes o un rosa muy tenue, pero con la única diferencia diferencia de que esta cepa se expandió por lo que se determino que era Salmonella paratyphi . Para la prueba de rojo de fenol el color presentado fue un rosa lo cual nos indica su alcalinidad en el medio. En TSI se observo un pico alcalino y fondo ácido esto debido a que se fermento la glucosa y hubo producción de ácido sulfúrico por la coloración negra presentada en el medio. En LIA hubo una descarboxilación con producción de gas (CO2). Y en urea viro el medio a amarillo dando positivo esta muestra como fue también el caso de E.coli. Para Proteus se sembró en medio Mac Conkey donde viro el medio a naranja ya que son lactosa negativos y tiene betagalactamasa, las colonias fueron transparentes y se difunden en el medio. En el rojo fenol al igual que Salmonella demostró alcalinidad por la misma coloración presentada. En TSI el pico fue alcalino y fondo ácido. Y en urea solo cambio un poco la coloración del medio a un rosa mexicano dando una urea negativa con producción de gas.

21

En la prueba del antibiograma se utilizo una cepa pura de E.coli donde E.coli  donde se inoculo con estría cerrada con un hisopo colocándole un disco con 12 antibióticos para bacilos gram negativos, en donde se observo que E.coli es E.coli es sensible a casi todos estos a excepción de CB (garbenmicina) y un poco en CI (cloranfenicol) y AM (ampicilina).

REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6.

http http:/ ://w /www ww.m .mer erck ck.c .com om Diagnóstico Diagnóstico Microbi Microbiológic ológico. o. Koneman, Koneman, etal. Editori Editorial al Panamericana Panamericana.. Quinta edición edición pag: 172. http://pa http://pathmi thmicro.m cro.med.sc ed.sc.edu/ .edu/Span Spanish/ch ish/chapter1 apter11.ht 1.htm m http://www http://www.consu .consumaseg maseguridad uridad.com .com/socie /sociedad-y-c dad-y-consum onsumo/200 o/2003/1 3/11/07/ 1/07/9262. 9262.php php http://www http://www.insp .insp.mx/ .mx/rsp/_f rsp/_files/ iles/File/ File/2007/ 2007/Sept Septiembr iembre%20O e%20Octubre ctubre/7-pat /7-patogen. ogen.pdf  pdf  Biología Biología de los Microor Microorganism ganismos os Brock Brock PAG. PAG. 938,97 938,978974,9 8974,977-78 77-78 7. Guentzel MN (1996). Escherichia Escherichia,, Klebsiella Klebsiella,, Enterobact Enterobacter er,, Serratia, Serratia, Citrobacter Citrobacter,, and Proteus. Proteus. In: Barron's Barron's Medical Microbiology (Barron S et al, eds.), 4th ed., Univ of Texas Medical Branch. 8. Manual Manual Biox Bioxon, on, p.p 26, 26, 28, 28, 29, 29, 33, 39, 41, 52 52 9. http://www http://www.mcd. .mcd.com.m com.mx/pdf x/pdfs/aga s/agar_casm r_casman.pd an.pdf  f  10. http://www.britanialab.com.ar/esp/ http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/christensemed.htm productos/b02/christensemed.htm MacFaddin, Pruebas bioquímicas bioquímicas para la identifica identificación ción de bacterias bacterias de importanci importancia a clínica clínica 3ªEdición 3ªEdición;; ED. 11. MacFaddin, Panamericana, Buenos aíres argentina 2003. pp. 59, 67, 68 12. www.rci. www.rci.rutge rutgers.edu rs.edu/... /.../sal /salmonel monellashi lashigella gella.htm .htm

22