9. Трансформација Трансформација у ширем смислу подразумева сваки процес уноса стране ДНК у ћелије домаћина, било у форми линеарног (рекомбинантног) фрагмента или фрагмена убаченог у вектор, при чему долази до инкорпорације стране ДНК у геном и експресије страног генетичког материјала. У ужем смислу трансформација не укључује унос стране ДНК путем вируса или бактериофага, већ се овај процес назива трансдукција. Трансформација еукариотских ћелија у култури in vitro се понекад означава и као трансфекција (мада се у овој књизи користи само уобичајен термин трансформација, без обзира да ли је у питању култура ткива). Код бактерија је уобичајен и латерални преноса гена коњугацијом, која се остварује директним ћелијским контактом и својствена је бактеријама са коњугативним плазмидима (Пог. 8.1). У биотехнологији биљака су битна још два појма: котрансформација, којом се паралелно уводе два или више страних гена и ретрансформација, када се нови страни ген уводи у већ трансформисану биљку. Нуклеинске киселине не могу да уђу у бактеријске или еукариотске ћелије саме од себе, већ им је за пролазак кроз спољашњу мембрану или ћелијски зид и плазмамембрану потребна одговарајућа помоћ. У овом поглављу ће бити описани различити методи за трансформацију бактеријских и биљних ћелија, док о трансформацији гљива (квасца) и анималних ћелија неће бити речи. Методи уноса страних гена се генерално могу сврстати у три категорије: Биолошки или природни механизми: o Унос гена у бактерије помоћу бактериофагних вектора или вектора базираних на фазима (трансдукција). За овај метод нема посебних протокола, довољно је помешати бактерије са бактериофагом и засејати на подлогу. o Унос гена у еукариотске ћелије вирусима (трансдукција) o Унос гена у биљне ћелије посредством A. tumefaciens и A. rhizogenes Хемијски методи o Трансформација бактерија плазмидима (CaCl2/топлотни шок метод) o Трансформација протопласта огољеном ДНК (CaCl2/PEG метод) Физички методи o Електропорација - примењује се на бактеријске ћелије и биљне протопласте, ћелије и ткива, као и на једноћелијске алге o Биолостичка трансформација може да се примени на целе биљке или експланте o Трансформација силикон-карбидним влакнима се углавном користи за трансформацију калуса монокотила o Микроињектирање је применљиво само на огољене протопласте o Трансформација залеђивањем и одлеђивањем (за Agrobacterium). Трансформација биљака подразумева стабилну инкорпорацију страних гена у биљни геном. Најпопуларнији метод за трансформацију дикотила је експлоатација природног механизма за унос страних гена индиректно, посредством A. tumefaciens или А. rhizogenes. Тешкоће са трансформацијом монокотила на овај начин су довеле до развоја различитих метода директног трансфера гена, првенствено физичких приступа као што су биолистички метод и електропорација, који су применљиви и на моно- и на дикотиле. Данас постоје и посбно модификовани протоколи за трансформацију монокотила помоћу A. tumefaciens, иако је ово патоген дикотила. Већина метода за директан унос гена може да се примени и за експерименте привремене или пролазне експресије страних гена у биљним ћелијама (transient expression assays). Метод подразумева само унос и експресију страних
169
гена, без њихове интеграције у геном. Овај поступак је брз и репродуцибилан, а генски продукти се могу детектовати само неколико сати после увођења ДНК, за разлику од стратегије стабилне трансформације, где су потребни месеци за регенерацију трансформаната. Стабилна трансформација има још један недостатак који је немогуће контролисати, а то је велика варијација у генској експресији због позиционих ефеката (нпр. да ли се страни ген уградио у хетерохроматин или у близини неког енхенсера). Експерименти пролазне експресије могу бити и пилот експерименти за пројекте стабилне трансформације, којима се проверава функционалност генских конструката пре него што се уграде у геном неком другом методом. Пролазна експресија се користи за дефинисање функционалних елемената промотора, испитивања ефеката antisense РНК, проучавање интраћелијског транспорта протеина, испиривање генске експресије током ћелијског циклуса и друге типове експеримената.
9.1. Ћелије домаћини Избор ћелија домаћина у које се убацује страни ген (посредством вектора или директно) зависи од сврхе трансформације односно клонирања: Ако је сврха клонирања изолација гена у циљу његовог секвенцирања и проучавања, обично се користе што једноставнији системи, дакле прокариотске ћелике домаћини Ако је сврха експресија одређеног еукариотског протеина, и у том случају је могуће користити бактеријске домаћине, под условом да се ген, односно његов промотор, регулаторне и сигналне секвенце измене и прилагоде прокариотском систему транскрипције и транслације. Често, међутим, експресија еукариотских гена и прокариотским системима не даје функционалне протеине, па се у том случају користе еукариотске ћелије домаћини Ако је сврха добијање трансгеног организма - биљке, наравно да је финални домаћин биљна ћелија, али се у том случају обично користи прокариотски примарни домаћин (E. coli) да би се секвенца изоловала и клонирала, а често и секундарни домаћин (Agrobacterium) да би се секвенца убацила у биљку. Идеалан прокариотски домаћин треба: да се лако размножава и одржава, да постоји велики број различитих генетички дефинисаних сојева и да прихвата различите векторе. Бактерија Escherichia coli испуњава све горње услове и користи се у највећем броју протокола клонирања. Ово је најбоље проучен организам од свих прокариота, са секвенцираним геномом величине 4.6 Mbp, познатом и добро проученом функцијом свих гена и огромним избором различитих сојева, серотипова и генотипова (мутаната). E. coli је Gram-негативна бактерија са једним циркуларним хромозомом спакованим у компактну структуру - нуклеоид. Као и код других прокариота, гени су организовани у опероне, а транскрипција и транслација су повезане, тако да рибозоми почињу да се каче на mRNA, док се ове још нису комплетно ни синтетисале. Примарни транскрипти не подлежу обради као код еукариота. E. coli служи као домаћин за различите типове плазмида, фага, хибридних вектора и вектора великог капацитета (PAC и BAC, Пог. 8.3). Остали прокариотски домаћини. Осим E. coli, за молекуларно клонирање се могу користити и неке друге бактерије, нпр. врсте Bacillus, Pseudomonas и Streptomyces. Међутим, за ове бактерије постоји далеко мањи избор (комрцијалних) вектора, а за потребе примарног клонирања је увек најлакше и најбоље користити добро разрађене и поуздане системе - дакле E. coli. У колико је, из неког разлога, потребно да крајњи
170
домаћин буде нека друга бактерија, ген се увек може клонирати у E. coli, а потом пребацити у другу бактерију. За овекве трансфере се користе посебни вектори који могу као домаћина да користе обе бактерије, тзв. shuttle вектори. Бактерије Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes су од посебног значаја за генетичко инжињерство биљака, па постоје развијени протоколи за њихову трансформацију конструисаним плазмидима. Квасац (Saccharomyces cerevisiae) је један од најједноставнијих и најшире коришћених домаћина од свих еукариота. Квасац се у биотехнологији користи већ вековима за производњу хлеба и пива, тако да је јако добро проучен са биохемијског и генетичког аспекта. Геном квасца је секвенциран и проучен код чак 8 различитих сојева, а има 12 Mb и 16 хромозома. Као једноћелијски организам, квасац има многе предности које имају и прокариоти, а то је лакоћа манипулације и размножавања и велики избор мутаната и генотипова. Користи се како за примарно клонирање великих ДНК сегмената у вештачким хромозомима квасца (YAC), тако и за потребе експресије еукариотских гена. У основним истраживањима квасац се користи за проучавање протеин-протеин интеракција и у другим специфичним протоколима. Друге једноћелијске и филаментозне гљивице попут Aspergillus nidulans и Neurospora crassa се такође користе у биотехнологији и за фундаментална проучавања, али далеко мање од квасца. Chlamydomonas reinhardtii је једноћелијска зелена алга која има све предности једноћелијских организама (лакоћа лабораторијских манипулација) са структурном и функционалном организацијом карактеристичном за биљне ћелије. Chlamydomonas се широко користи за гентичке трансформације у функцији основних истраживања, као што су проучавање структуре и функције фотосистема исл. У главном се трансформише електропорацијом. Ћелије виших биљака се могу трансформисати на различите начине у форми протопласта, ћелијских култура, калуса или експланата, како је шематски приказано на Сл. 2.7. Постоје разлике у методама трансформације моно- и дикотила.
9.2. Agrobacterium tumefaciens и природна трансформација биљака Агробактерије су земљишне, грам-негативне штапићасте бактерије. Род Agrobacterium спада у фамилију Rhisobiaceae, a обухвата врсте: A. radiobacter, A. vitis, A. rubi, A. tumefuciens и A. rhizogenes. A. tumefuciens и A. rhizogenes су биљни патогени који изазивају туморе типа crown-gall односно hairy root респективно, до чега долази због трансфера гена са плазмида које садрже у биљни геном. Врсте и сојеви Agrobacterium-а се разликују по свом спектру домаћина; често је нека биљна врста веома подложна инфекцији једним сојем, али не и осталима. Бактерије које су у стању да инфицирају и трансформишу широк спектар дикотила су познате као WHR сојеви (wide host range), а оне које имају узак избор домаћина су LHR сојеви (limited host range). Agrobacterium tumefaciens је мобилна земљишна бактерија, која напада дикотиле изазивајући туморе на биљкама (crown-gall disease, Сл. 9.1). Познавање интеракције између A. tumefaciens и биљне ћелије, механизама инфекције и трансформације је од огромног значаја за како за агрономију, тако и за фундаментална истраживања интеракција патоген-домаћин и веома ретког примера природног латералног трансфера гена међу царствима. A. tumefaciens има широк избор домаћина и познато да је да може да инфицира 643 врсте из 331 рода. У домаћине спадају и многе културне биљке, првенствено грожђе, ораси, јабуке и руже. Монокотиле нису подложне инфекцији, са изузетком неких врста Liliales и Arales. Могућност експлоатације природног механизма трансформације биљака сврстава A. tumefaciens
171
и њој сродну бактерију A. rhizogenes у најомиљеније алате генетских инжињера биљака.
Слика 9.1: Тумор изазван инфекцијом A. tumefaciens
Животни циклус A. tumefaciens: А. tumefaciens живи у земљишту, у ризосфери, где нормално живи хранећи се материјама које биљке испуштају из корена. Ако је биљка у близини бактерије повређена, бактерија долази до места повреде хемотаксијом, привучена хемоатрактантима (амино киселинама, шећерима, органским киселинама и фенолима) које луче повређене биљне ћелије. Приликом инфекције до 200 бактерија може да се прикачи на једну биљну ћелију. Бактерија инфицира биљку и улази у корен или стабло на месту повреде. Долази до интерћелијског размножавања и ширења бактерија у биљном ткиву. Ћелије у околини бактерија почињу рапидно да се умножавају и да расту, формирајући туморе. Вирулентност и способност стварања тумора зависи од присуства Ti плазмида (Tumor inducing) у бактерији. Део Ti плазмида познат као Т-ДНК се пребацује у биљну ћелију и интегрише у геном. Туморске одн. трансформисане биљне ћелије ослобађају посебна једињења опине које бактерија користи за исхрану. Бактерије са површине тумора могу поново доспети у земљиште. Геноми неколико сојева А. tumefaciens су секвенцирани. На пример, сој А. tumefaciens С58 је иницијално изолован из тумора трешања, а индукује производњу опина нопалина и агропина Bo542. Геном овог соја се састоји од једног циркуларног хромозома од 2.84 Mbp, једног линеарног хромозома од 2.07 Mbp и два плазмида. Већи плазмид, означен као pAtC58, има 542.8 Kbp и не учествује у процесу трансформације. Мањи плазмид од 214.2 Kbp је Ti плазмид, означен као pTiC58 и он је одговоран за вирулентност. pTiC58 има 199 гена, од тога 197 гена који кодирају за протеине и 2 псеудогена; ни један плазмидни ген не кодира за РНК.
172
Опини су веома стабилна једињења која продукују трансформисане биљне ћелије, а A. tumefaciens их користи као главни извор азота и енергије. Синтеза опина је катализована ензимима кодираним Т-ДНК генима. Различити сојеви бактерија имају различите Ti плазмиде који диктирају синтезу различитих опина. Сваки сој A. tumefaciens код домаћина индукује синтезу специфичних опина, при чему Ti плазмид у бактерији кодира синтезу одговарајућих ензима за катаболизам опина. На овај начин A. tumefaciens себи стварају посебну еколошку нишу „терајући“ биљку да производи оне опине које само дати сој бактерија може да користи и нико други. Највећи број опина су деривати амино киселина који настају кондензацијом амино киселине и кето киселине или шећера. Иако је структура ових једињења необична, саставни делови су уобичајени метаболити, па је и за синтезу кондензацијом и за разградњу хидролизом потребан само по један ензим (одн. ген), а не цео метаболички пут. Најпознатији опини су нопалин, октопин и манопин (Сл. 9.2). До сада је описано преко 30 врста опина, који се по хемијској структури сврставају у неколико фамилија: Нопалинска фамилија опина (нопалин, нопалинска киселина, леуцинопин, глутаминопин и др.) настаје кондензацијом: амино киселина + αкетоглутарат. Октопинаска фамилија (октопин, октопинска киселина, лизопин, хистопин и др.) настаје кондензацијом: амино киселина + пируват. Манопинска или манитил фамилија (манопин, манопинска киселина, агропин, агропинска киселина) настаје кондензацијом: амино киселина + маноза. Агроцинопини су мала, посебна класа опина која не настаје кондензацијом, већ су по структури фосфодиестри шећера. Нпр. агроцинопин А је фосфодиестар сахарозе и арабинозе.
Слика 9.2: Структуре најпознатијих опина
Ti плазмид (tumor-inducing plasmid) je велики плазмид од око 200 Kbp или више, са око 200 гена, што зависи од типа одн. специфичности за опине (Сл 9.3 и Таб 9.1). Способност A. tumefaciens да доведе до трансформације биљних ћелија и да
173
проузрокује појаву тумора зависи од присуства Ti плазмида. Ово је коњугативни плазмид који је способан за два типа латералног трансфера гена: коњугацијом између различитих сојева бактерија, при чему се преноси копија целог плазмида и за трансфер дела плазмида означеног као Т-ДНК из бактеријске у биљну ћелију. Иако се Ti плазмиди из различитих сојева разликују, сви имају неке заједничке карактеристике: један или више региона Т-ДНК са онкогенима vir регион са генима за вируленцију ORI (origin of replication) tra регион, чији гени омогућавају коњугативни трансфер гене за катаболизам опина
Слика 9.3: Шематски приказ Ti плазмида (нопалинског типа) са назначеним главним елементима, генима и регионима. Делови Т-ДНК су обележени зеленим нијансама, док су гени који се експримирају и бактерији браон или црвени (vir region). Гени нису нацртани у сразмери у односу на величину плазмида (јер је од око 200 гена приказано само десетак кључних). Распоред гена донекле варира од типа до типа. Скраћенице за гене и њихове функције су дате у табели 9.1.
Т-ДНК (transferred DNA) је део Ti плазмида који се физички интегрише у биљни геном, а дефинисан је левим и десним граничником (LB и RB), који представљају неправилне поновке од 24 bp. Било која секвенца која је оивичена граничницима може бити пренета у биљну ћелију, при чему је десни граничник есенцијалан за Т-ДНК трансфер. Т-ДНК носи гене који кодирају за ензиме укључене у синтезу хормона ауксина и цитокинина и синтезу опина. Прекомерна продукција ових хормона у биљним ћелијама доводи до неконтролисане пролиферације ћелија - тумора, па су ови гени у ствари онкогени. Нопалински плазмиди имају једну Т-ДНК од око 20 Kb у којој је идентификовано 13 ORF-ова, док октопински имају два Т-ДНК региона, TL и TR, од 14 и 7 Kb, респективно. Само је TL регион онкоген, тј. носи гене за синтезу хормона, као и ген за синтезу октопина (укупно 8 ORF-ова), док TR има гене за синтезу других опина манопина, агропина и фруктопина. Гени на Т-ДНК су по својим карактеристикама сличнији еукариотским генима него прокариотским. Функције појединих гена су приказане у Таб. 9.1. Вирулентни регион (Vir) садржи гене који омогућавају трансфер Т-ДНК. Ови гени су организовани у најмање 9 оперона (А-Ј), а функције већине гена су дефинисане. Сви вирулентни оперони су индуцибилни, с тим што се virA и virG експримирају на ниском
174
нивоу и без индукције тј. имају базалну експресију и једини су моноцистронски. Већина Vir протеина су цитосолни протеини осим VirA и VirB1-11, који су мембрански. Неки Vir протеини функционишу у бактерији, док други, као нпр. virE2 и virF функционишу у биљној ћелији. Гени и елементи Ti LB
TDNA
auxA или iaaM или tms1 auxB или iaaH или tms2 cyt или ipt или tmr tml nos ocs RB O tra noc occ inc ORI virA virB1-11 virC1 virD1 virD2
VIR
virD4 virE1 virE2 virE3 virF virG virH virJ
Функција Леви граничник (Left Border) нопалински тип: TGRCAGGATATATGKSGKGTAAAC октопински тип: YGGCAGGATATAWCMRTTGTAAWT Триптофан монооксигеназа (синтеза ауксина IAA) Индол-3-ацетамид хидролаза (синтеза ауксина IAA) Изопентил трансфераза (синтеза цитокинина) ген који детерминише величину тумора код неких врста Нопалин синтаза (само код нопалинског типа) Октопин синтаза (само код октопинског типа) Десни граничник (Right Border) - иста секвенца као и за леви Енхенсер или „overdirive“: TAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTG Налази се уз RB; повећава ефикасност трансфера. Гени за транспорт ДНК приликом коњугације. Продукти ових гена чине канал кроз мембрану, врло слично као и VirB протеини. Катаболизам нопалина (само код нопалинског типа) Катаболизам октопина (само код октопинског типа) Гени за инкопатибилност (имунитет на друге плазмиде) Место за почетак репликације (Origin of replication) Рецептор за фенолна једињења; киназа која фосфорилише VirG Компоненте секреционог система типа IV, одн. Т-пилуса Оverdrive-везујући протеин; повећава ефикасност трансфера Протеин који се везује за граничнике и модулише активност VirD2 Nicking ендонуклеаза; штити 5'-крај Т-ДНК; неопходан за трансфер кроз секрециони систем и кроз једарне поре; има NLS сигнал; интерагује са биљним кариоферин-а протеином Компонента секреционог система типа IV, одн. Т-пилуса Протеин потребан за експорт virE2; има чаперонску активност Протеин који се везује за ssDNA, штити Т-ДНК од нуклеаза, неопходан за улазак Т-ДНК кроз једарне поре Помаже интеракцију virE2 са кариоферином-а и улазак у једро Диктира разградњу протеина који облажу Т-Днк; ( само код октопинских плазмида) Транскрипциони фактор одговоран за индукцију VIR региона Сматра се да учестује у детоксификацији околине бактеријске ћелије, јер су неки продукти повређених биљних ћелија инхибиторни за бактерију ( само код октопинских плазмида) Учествује у експорту Т-ДНК
175
Табела 9.1: Функције најважнијих гена и секвенци Ti плазмида
Процес трансформације помоћу A. tumefaciens се одвија у следећим корацима, као што је шематски приказано на Сл. 9.4: 1а- Ослобађање сигналних молекула из повређене биљне ћелије. На месту повреде се ослобаају шећери и фенолна једињења, као што су ацетосирингон, αхидроксиацетосирингон и др. Ова једињења су обично део одбрамбеног система биљке, укључена у синтезу фитоалексина и лигнина, док за бактерију представљају сигнал присуства биљних ћелија компетентних за трансформацију. 1б- Експресија бактеријских хромозомалних гена укључених у ране кораке вируленције: attR је ген који учествује у синтези специфичног полисахарида који је одговоран за иницијално закачињање бактерије за биљну ћелију. Бактерија потом производи мрежу целулозних влакана који учествују у причвршћивању. chv гени (chromosomal virulence genes)су такође укључени у прве кораке инфекције и причвршћивање бактерије за биљну ћелију. chvА и chvВ су одговорни за продукцију и секрецију цикличних 1,2-гликана, док је продукт chvЕ заједно са продуктом плазмидног virA гена образује трансмембрански рецепторски комплекс. pscA је укључен у секрецију још једног екстрацелуларног полисахарида за причвршћивање – сукциногликана. 1в- Експресија првих вирулентних гена Ti плазмида, virA и virG. 2- Препознавање сигналних молекула. VirA је трансмембранска рецепторна киназа која се активира везивањем фенолних једињења, а посебно ацетосирингона. Везивање лиганда доводи до аутофосфорилације VirA, која потом фосфорилише цитоплазматични протеин VirG. Разлике између WHR и LHR сојева се у главном заснивају на разликама њихових VirA протеина, а посебно његовог N-терминалног дела, тј. домена који препознаје сигналне молекуле. Сматра се да сојеви са широким спектром домаћина имају VirA који је сензитиван на више различитих једињења. 3- Индукција vir гена. Фосфорилисани VirG је транскрипциони активатор који се везује за регулаторне секвенце vir оперона, тзв. vir box (TNCAATTGAAAY), индукујући експресију свих vir гена (virB, virC, virD, virE, virF, virH, virJ, укључујући и virA и virG). Многи шећери, а посебно глукоза, галактоза и ксилоза појачавају индукцију vir гена. За овај ефекат је неопходан транспортер за глукозу и галактозу ChvЕ, који функционише у комплексу са VirA. 4- Формирање једноланчане Т-ДНК. Комплекс VirD1/VirD2 препознаје леви и десни граничник Т-ДНК, при чему VirD1 има топоизомеразну активност, док VirD2 има функцију nicking ендонуклеазе која прави једноланчане прекиде између треће и четврте базе са леве стране оба граничника, чиме се ослобађа једноланчана Т-ДНК. У одвајању ланаца вероватно учествује и хеликаза кодирана бактеријским генима. VirD2 се ковалентно везује за ослобођену фосфатну групу 5'-краја Т-ДНК, где и остаје током транспорта у биљну ћелију. Јеноланчани регион у самом плазмиду се попуњава одговарајућом полимеразом. VirC1 се везује за енхенсер (overdive, O) код десног граничника, доприносећи ефикасности Т-ДНК трансфера. 5- Транспорт Т-ДНК/VirD2 комплекса из бактеријске ћелије се обавља кроз специјализовани мембрански секреторни систем типа IV или Т-пилус (инсерт на Сл. 9.4). Т-пилус се састоји од VirB1-B11 протеина кодираних virB опероном и од
176
VirD4. Трансмембрански канал овог система се се наставља у пилус чија је главна субјединица VirB2. Т-пилус служи за активан транспорт Т-ДНК из бактерије у биљну ћелију, али кроз њега се такође транспортују и VirE2 протеини, као и VirF и VirE3. Тпилус је по структури готово идентичан F-пилусу који имају бактерије E. Coli инфициране F плазмидом (Пог. 8.1). Већина субјединица Т и F пилуса су хомологе, само се пар субјединица разликује. У оба случаја систем служи за транспорт ssDNA, али са различитом сврхом. Т-пилус служи за транспорт ДНК између два царства, из бактерије у биљку, дакле за вирулентност, па се гени који га кодирају називају vir генима. F-пилус служи за транспорт ДНК између две бактерије исте или сродних врста у процесу коњугације, а кодиран је tra генима. Како Ti плазмид спада у коњугативне плазмиде, осим vir гена такође има и tra гене, баш као и F плазмид, па се може преносити и у друге бактерије.
Слика 9.4: Процес трансформације биљних ћелија помоћу A. tumefaciens. Процес је приказан у корацима 1-9, који су објашњени у тексту
6- Транспорт Т-ДНК у једро биљне ћелије. Када Т-ДНК/VirD2 комплекс и VirE2 протеини уђу у цитоплазму биљне ћелије, VirE2 облажу Т-ДНК, чиме настаје зрео Ткомплекс1. Улога VirE2 је да заштите једноланчану Т-ДНК од дејства нуклеаза и да успостве правилну конформацију Т-комплекса за улазак у једро кроз једарне поре (NPC, nuclear pore complex). Показано је да и VirD2 и VirE2 интерагују са различитим биљним цитоплазматичним протеинима, који обезбеђују нуклеарну локализацију Т1
Према алтернативном моделу, VirE2 облаже Т-ДНК у бактеријској ћелији и цео комплекс се транспортује кроз пилус.
177
комплекса. VirD2 има један сигнал за нуклеарну локализацију (NLS, nuclear localization signal), путем кога интерагује са биљним протеином из фамилије кариоферин-α, чија је функција препознавање протеина који треба да се упуте у једро. VirE2 има две NLS секвенце, али се транспорт у једро обавља посредством биљног VIP1 протеина (VirE2-interacting protein 1) и његовог функционалног аналога, бактеријског VirE3. Сматра се да VIP1 и VirE3 олакшавају интеракцију између VirE2 и кариоферина-α и тако омогућавају улазак Т-комплекса у једро. У интеракцијама са VirD2 и VirE2 и транспорту у једро учествују и други биљни протеини, као импортинα, протеин фосфатаза типа 2С, циклофилини и VIP2. 7- Интеграција Т-ДНК у биљни геном. Када Т-ДНК у комплексу са протеинима уђе у једро, долази до интеракција са једарним протеинима који омогућавају интеграцију. Показано је, на пример, да VIP1 интерагује са хистонима Н2А, што је од значаја за позиционирање Т-комплекса на место интеграције. Пре интеграције, међутим, сви протеини везани за Т-ДНК морају бити уклоњени, за шта је одговоран VirF. VirF је бактеријски F-box протеин који диктира деградацију VirE2 и VIP1 у протеозомима. ТДНК се интегрише у биљни геном процесом нелегитимне одн. нехомологе рекомбинације (illegitimate recombination). За разлику од хомологе рекомбинације, нелегитимна рекомбинација не зависи од присуства региона хомологије, већ се може догодити на било ком делу генома, али до инсерције већином долази у регионима са већим %АТ. За овај процес су неопходни биљни једарни протеини иначе задужени за поправку оштећења на ДНК и/или процесе рекомбинације. У геном се независно може уградити и више копија Т-ДНК (код Aabidopsis-a у просеку по 3), а ове копије су најчешће оивичене граничницима, као и у самом плазмиду. 8- Експресија Т-ДНК гена aux, cyt и nos или ocs, доводи до синтезе ензима који катализују синтезу ауксина, цитокинина и опина. Настали хормонски дисбаланс доводи до формирања тумора. Трансформисана ћелија производи опине, који се транспортују у бактеријску ћелију. 9- Катаболизам опина се одвоја у бактерији, ензимима кодираним Ti-плазмидом (noc или occ ген), што представља главни извор енергије и угљеника за бактерију.
9.3. Експлоатација A. tumefaciens: бинарни вектори Убрзо по открићу да A. tumefaciens са својим плазмидима поседује механизам за природно убацивање гена у биљке, овај систем је почеао да се експлоатише у биотехнологији. Иако трансформација посредством A. tumefaciens у неким случајевима није најбољи избор за поједине типове експланата, а код неких дикотила није ни најефикаснији начин трансформације, ипак се овај приступ врло широко користи, како због историјских разлога и обимне литературе одн. разрађених протокола за многе врсте, тако и због предности у поређењу са директним уносом гена. Главне преднсти су мање нежељених реаранжмана трансгена и мањи број копија трансгена у ћелијама. Коинтегративни вектори. Први успех у експлоатацији A. tumefaciens, средином 80тих, се састојао у „разоружавању“ Ti плазмида тј. избацивању онкогена који изазивају тумор и спречавају регенерацију (због неодговарајућег баланса хормона), чиме су добијени разоружани сојеви A. tumefaciens, попут LBA4404. Плазмиди са страним генима су конструисани у E. coli (интермедијерни вектор), а потом интегрисани са разоружаним Ti плазмидима (акцепторни вектор), да би се добили коинтегративни вектори. Овај систем је био функционалан и релативно ефикасан, али су добијени плазмиди били велики, преко 150 Kb. Са овако великим плазмидима је тешко манипулисати, а посебно је тешко проверити њихову структуру рестрикционом аланлизом и електрофорезом.
178
Потом је откривено да се Т-ДНК може активно транспортовати и ако се Vir функције и Т-ДНК налазе на различитим плазмидима, из чега су проистекли модерни методи трансформације. Данас се трансформација биљака посредством A. tumefaciens стандардно обавља системом бинарних вектора. Овај систем се заснива на природном механизму трансформације, али су многе компоненте система у великој мери измењене у циљу олакшане манипулације рекомбинантим конструктима и повећања ефикасности трансформације. Кључна измена се састоји у подели функција оригиналног Ti плазмида на два плазмидна вектора(Сл. 9.5): 1. Вештачки (рекомбинантни) Ti плазмид или бинарни вектор2, који носи страни ген и 2. Помоћни (helper) плазмид, који кодира за Vir функције. Дизајнирање протокола са бинарним векторима подразумева конструкцију рекомбинантог плазмида, избор одговарајућег соја A. tumefaciens, избор експланта за трансформацију, оптимизацију услова трансформације, усаглашавање протокола за трансформацију са протоколом за регенерацију и потврду трансформације код регенераната.
Слика 9.5: Систем бинарних вектора за трансформацију биљака. а - Модификовани Ti плазмид који између левог и десног граничника има убачен страни ген уместо онкогена. Страни ген је убачен у MCS место, које се код многих комерцијалних плазмида налази у овиру LacZ. PSM је биљни селектабилни маркер, нпр. резистентност на канамицин (KanR), док је BSM бактеријски селектабилни маркер, нпр. ген за резистенцију на тетрациклин (TetR). Плазмид има два ORI-ja да би могао да се умножава у две врсте бактерија - E. coli и A. tumefaciens. б - Модификовани Ti плазмид који има избачене готово све гене осим Vir региона, а служи као помоћни плазмид. Иако је овај плазмид приказан као да је мањи од бинарног вектора, он је у ствари око 20 пута већи од њега, због величине Vir региона. в - Плазмид за трансформацију се конструише и размножава у E. coli. г - Плазмид се пребацује из E. coli у A. tumefaciens коњугацијом или електропорацијом. д 2
Термин „бинарни“ се односи на систем од два вектора тј два плазмида, али се главни од та два плазмида, онај који носи страни ген, колоквијално назива „бинарним вектором“.
179
трансформација биљне ћелије помоћу A. tumefaciens која има два плазмида који заједно имају све неопходне функције потребне за трансформацију - граничнике и Vir протеине.
Бинарни вектор (рекомбинантни Ti плазмид) се конструише у E. coli, а онда се убацује у разоружани сој A. tumefaciens (обично LBA4404) који има помоћни плазмид. Бинарни вектор има различите елементе, од којих су само граничници и ORI пореклом од Ti плазмида, а сви остали гени Ti гени су избачени као непотребни, па су овакви плазмиди релативно мали и једноставни за манипулацију. Бинарни вектори садрже: Т-ДНК граничнике (LB и RB), између којих се убацују страни ген, биљни селектабилни маркер и репортер. Граничници се обично узимају из добро познатих Ti плазмида, нпр. pTiT37, pTiC58 или pTi15955. Иако су за трансфер довољни конзервативни поновци од 24-25 bp, ипак се за конструкте користе мало дуже секвенце које садрже граничнике, до пар стотина bp, да би се обухватиле и регулаторне секвенце које утичу на ефикасност трансфера, као што су енхенсери (overdrive). Понекад проблем представља трансфер секвенци после левог граничника, тј. делова окоснице плазмида. Ово се може решити једноставним додавањем неколико узастопних копија LB, што ефикасно ограничава трансфер само на секвенце у оквиру граничника. Алтернативно решење је уношење смртоносног гена (killer gene) лево од LB-a, који елиминише оне трансформисане биљне ћелије код којих је дошло до непрецизног трансфера. Полилинкер тј. MCS место, се обично узима из популарних вектора за клонирање, као из pUC8/9, pUC18/19, pBluescript исл. Код многих плазмида је MCS уграђено у 5' део LacZ гена, што омогућава плаво-белу селекцију одн. акомплементацију. (Пог. 10.4). Биљни селектабилни маркери (којих може бити неколико у једном плазмиду) могу бити гени за резистенцију на разне антибиотике (канамицин, хигромицин и сл.) или хербициде (Пог. 10.2). У зависности од биљне врсте, избор селектабилног маркера може доста утиче на ефикасност трансформације. Рестриктивне/ пермисивне концентрације селективног агенса доста да варирају у зависности од биљне врсте, па чак и од култивара. Пракса је показала да је резистенција на канамицин добар избор за већину дикотила, укључујући дуван, парадајз, кромпир и Arabidopsis. Резстенција на хигромицин је погодна за трансформацију пиринча, а за кукуруз и друге житарице је најбоље користити резистенцију на фосфинотрицин. Селектабилни маркер мора бити између граничника и мора да се експримира у оним ћелијама које се трансформишу и из којих се биљке регенеришу, али и у калусима, ембрионима и сл. Због тога је најсигурније да касета маркера има конститутивни промотор. Конститутивни промотори и други типови промотора, као и терминатори који се користе у конструктима трансгена су описани у Пог. 7.17.2. Пожељно је да се маркер налази близу левог граничника, што је и случај код модерних вектора типа pGreen, због поларности трансфера Т-ДНК од десног ка левом граничнику. У колико дође до прекида трансфера, може се уградити само селектабилни маркер а не и страни ген, осим ако маркер није уз LB. Репортер ген је опционални али уобичајен елемент бинарних вектора, који се уграђује поред страног гена, уместо њега или у фузији са страним геном, између граничника. Избор репортера није тако велики, а највише се користе GUS, веријанте GFP-a, луцифераза и др. (Пог. 10.5). Вектор са репортером се назива репортер вектор и може да се користи и без страног гена, као контролни вектор. Трансформација репортер вектором омогућава прикупљање референтних података о свом аспектима трансформације, као што су фреквенција трансформације, раст трансформисаних ћелија, ефикасност регенерације, раст трансгених биљака итд. Коришћење проверених репортер вектора паралелно са истим векторима са страним геном може да олакша
180
решавање евентуалних проблема при трансформацији. Проверено добар репортер вектор је користан и као основа за конструкцију експерименталних вектора, у које се само дода страни ген или се репортер замени страним геном. Репортер касета такође треба да има конститутивни промотор (осим у посебним случајевима, нпр. ако се репортер користи у фузији са промотором који проучавамо). Репортер може да има исти промотор као и биљни селектабилни маркер, али то баш и није препоручљиво, јер присуство региона хомологије може да доведе но нежељених реаранжмана рекомбинацијом. Касета репортера треба да има и терминатор. Страни ген (ген од интереса) се убацује у форми касете са одговарајућим промотором и другим регулаторним секвенцама за жељени тип експресије и локализације продукта у биљним ћелијама (Пог. 7.1-7.2). Страни ген је обавезно лоциран између граничника, а код већине рекомбинантних плазмида се клонира у MCS место које се налази у оквиру 5'-дела LacZ гена. Репликативне функције. Бинарни вектор мора да може да се реплицира и у E. coli и у A. tumefaciens, па зато има ORI-је за оба домаћина, који се налазе изван граничника. Могу се користити два ORI-ја, за сваку бактерију по један специфичан, или један ORI који функционише у обе бактерије. ORI-ји пореклом из плазмида који имају широк спектар домаћина, као што су плазмиди из инкопарибилне групе P (IncP) или W (IncW), могу да се користе за обе бактерије. За репликацију у E. coli су погодни ORI-ји пореклом из ColE1 или F плазмида, а за A. tumefaciens из плазмида рТi, pRi или pVS1. Од типа репликативних функција зависи број копија плазмида и њихова стабилност. IncP плазмид pBI121 је згодан када се клонирају већи фрагменти, јер генерише мали број копија (око 5) у оба домаћина. Мобилизационе функције су опционална компонента бинарног вектора. То су секвенце које омогућавају трансфер бинарног вектора из E. coli у A. tumefaciens путем коњугације, при чему се друге компоненте неопходне за коњугацију (tra гени и др.) могу налазити на неком другом месту (на коњугативном помоћном плазмиду). Ако бинарни плазмид планирамо да убацимо у A. tumefaciens електропорацијом, мобилизационе функције нису неопходне. Бактеријски селекрабилни маркер се налази изван граничника. Гени који доносе резистенцију на канамицин, гентамицин, тетрациклин, хлорамфеникол, спектиномицин и хигромицин су популарни маркери јер се могу користити за селекцију и E. coli и A. tumefaciens. Поједини биљни селектабилни маркери попут Nos-nptII (nos промотор + неомицин фосфотрансфераза II) и 35S-hpt (35S промотор + хигромицин фосфотрансфераза) могу у некој мери донети резистенцију и бактеријама E. coli и A. tumefaciens, иако имају еукариотске промоторе. Ово се објашњава тиме да еукариотски ТАТА бокс има неке сличности са прокариотским промоторима, па се зато ови гени донекле експримирају и у бактеријама. Ако у Т-ДНА секвенци постоји овакав селектабилни маркер са двоструком биљно-бактеријеком функцијом, онда се бактеријски маркер може изоставити да би се конструкција вектора поједноставила.
Конструкција бинарног вектора се спроводи у E. coli, у неколико корака коришћењем готових елемената других вештачких плазмида и унапред конструисаних генских касета селектабилних маркера, репортера и страног гена. Ово је критичан поступак при трансформацији, јер се понекад грешке у конструкцији откривају тек много месеци или чак година, при испитивању добијених трансгена. Приликом додавања сваког елемента структура вектора се проверава рестрикционом анализом, PCR-ом и на друге начине. Прво се комбинују два елемента неопходна да би се плазмид умножавајо у E. coli - бактеријски селектабилни маркер и ORI за E. coli, а потом се један по један убацују остали елементи:
181
Слика 9.6: Поступак конструкције бинарних вектора
Вектор са два селектабилна маркера, као на Сл. 9.5, репортером и страним геном убаченим у LacZ, даје могућност за четири нивоа селекције: само бактерије у које је убачен плазмид (било празан или са страним геном) преживљавају на тетрациклину, а од њих се, на основу боје, пробиру оне колоније које имају страни ген. Ако је рекомбинантна Т-ДНК успешно интегрисана у биљни геном, биљке ће бити отпорне на канамицин. Активност репортера се у форми флуоресценције (GFP) или боје (GUS) прати директно или после једноставног есеја. Житарице и друге монокотиле нису природни домаћини за Agrobacterium, и често их је тешко трансформисати их на овај начин, због тога што другачије реагују на повреде. Житарице се ипак могу трансформисати коришћењем супер-бинарних вектора или супервирулентних сојева Agrobacterium-a. Супер-бинарни вектор има елементе као и бинарни вектор, али и додатне вирулентне гене из Ti плазмида, који омогућавају високу ефикасност трансформације и користе се за трансформацију житарица. Од додатних гена се користе оперони virB, virC и virG, у форми једног фрагмента пореклом из плазмида pTiBo542. Показано је, наиме, да сојеви Agrobacterium-a који имају pTiBo542 имају шири спектар домаћина и већу ефикасност трансформације од сојева са другим Ti плазмидима. Такође је показано да ове вирулентне функције до некле зависе и од броја копија гена (gene dosage effect). Конструкција супер-бинарних плазмида је комплекснија од конструкције обичних бинарних вектора, при чему финални корак подразумева интеграцију интермедијерног вектора са вектором акцептором, што се дешава у самој бактерији A. tumefaciens (за детаље погледати стручну литературу). Постоје многи готови бинарни и супер-бинарни вектори, у које се само треба убацити страни ген. Неки од ових конструката су комерцијални и производе се у серијама код којих се варирају поједини елементи, а други се могу добити директно од аутора. Од готових бинарних вектора се највише користе серије pCAMBIA, pGreen, pPZP, pBin19 и pBI121, које су коришћене у око 2/3 свих радова о трансформацији Agrobacterium-ом. Ови вектори се разликују по селектабилним маркерима и репортер генима које сарже, по пореклу граничника, пореклу и типу ORIја, по композицији MCS места, по могућности мобилизације и другим карактеристикама. Иако не постоји „идеалан“ вектор који би био добар за сваку примену, при избору готовог вектора треба имати у виду: лакоћу пуњења (loading) тј. убацивања страног гена (избор рестрикционих места) лакоћу трансформације (unloading) избор селектабилних маркера (којих може бити и више) типови ORI-ја (број копија плазмида у бактеријама) приступачност истраживачима (вектори који су већ коришћени су проверени) капацитет за клонирање
182
компатибилност са различитим бактеријским сојевима применљивост за различите намене могућност да се компоненте замене или уклоне из конструкта је веома битна, јер овакви вектори могу служити и као извор појединачних елемената или као окосница за конструкцију нових вектора заменом елемената.
Сој A. tumefaciens који ће бити коришћен може бити битан фактор ефикасности трансформације за врсте које се тешко трансформишу. За већину дикотила се користе стандардни сојеви Agrobacterium-a, као LBA4404. Ако се за трансформацију монокотила користе супер-бинарни вектори, онда се такође користи стандардни сој, LBA4404. Алтернативно, монокотиле се трансформишу супервирулентним сојевима Agrobacterium-a као што су EHA101 и EHA105, који се такође заснивају на додатним копијама одређених вирулентних гена. Сојеви који имају мутантни virG ген, virGN54D, који се конститутивно експримира, дају много веће ефикасност трансформације од дивљих сојева. Избор експланта. Како је сврха највећег броја експеримената трансформације добијање целих трансгених биљака, експлант који се користи за трансформацију мора бити изабран тако да може да се регенерише у целу биљку. Као експланти се могу користити листови, котиледони, хипокотили идр. У неким случајевима се потребно да се експланти претретирају на одређени начин, нпр краткотрајним гајењем на подлози за регенерацију. Развој и/или оптимизација метода за регенерацију одређене биљне врсте обично предходи самој трансформацији. Кокултивација или инокулација подразмева инкубацију биљних експланата са културом A. tumefaciens. Одговарајуће биљно ткиво се површински стерилише или се експланти, нпр. листови, узимају од стерилних биљака из културе in vitro. Експлант се исецка и стави у културу A. tumefaciens на око 10-30 минута, током чега се бактерије прикаче на биљне ћелије. Потом се екпланти изваде из културе и ставе на чврсту MS подлогу без антибиотика. Кокултивација траје око два дана, да би се омогућио трансфер рекомбинантне Т-ДНК. Фактори као што су рН, температура, тип шећера у медијуму, концентрација фосфата, присуство индуцера (ацетосирингона) и др. у многоме утичу на активацију vir гена, па самим тим и на ефикасност трансформације. Елиминација бактерија. На крају се експланти исперу раствором антибиотика који убија бактерије, а не штети биљним ћелијама, обично цефотаксимом (Tolycar). Селекција и регенерација. Експланти се потом пребацују на свежу чврсту подлогу која садржи селективни антибиотик или хербицид (у овом примеру канамицин) који спречава раст нетрансформисаних биљних ћелија. Овај медијум осим тога треба да садржи и антибиотик који убија преостале бактерије (цефотаксим), као и одговарајући ауксин и цитокинин у односу који је потребан за регенерацију дате врсте. Потврда трансформације. Експресија страног гена се проверава најчешће RT-PCRом са специфични прајмерима за страни ген (или алтернативно Northern Blotting-ом). Паралелно се као контрола поставља и реакција са прајмерима за неку секвенцу специфичну за A. tumefaciens, јер би позитиван резултат контролне амплификације указивао на контаминацију културе самим бактеријама. Различите употребе бинарних вектора. Главна примена бинарних вектора је експресија страних гена у биљци. Међутим, модификовани бинарни вектори могу бити коришћени и у друге сврхе.
183
Успостављање протокола за стабилну трансформацију се обаваља, како је већ наглашено, репортер векторима тј. бинарним векторима који садрже репортер ген у фузији са јаким, конститутивним промотором. Експресија страних гена у биљци (или оверекспресија биљних гена) је основна примена бинарних вектора. На сличан начин се конструишу и вектори са наопако окренутим страним геном, који у биљци кодирају за antisense РНК. На овај начин је нпр. направљен парадајз FlavrSavr (Пог. 16.2). Конструкција генских библиотека и изолација гена од интереса. Модификовани бинарни вектори који садрже и cos места, се могу користити за конструкцију козмидних генских библиотека. Како овакви вектори имају велики капацитет, довољно је неколико хиљада клонова да би се покрио читав геном Arabidopsis-a. Практичност примене оваквих „бинарних козмида“ у односу на друге векторе великог капацитета је у томе што се они могу директно искористити за идентификацију гена од интереса, под условом да имамо добро окарактерисане рецесивне мутанте Arabidopsis-a или неке друге биљке. Гени се могу идентификовати и изоловати на основу комплементације мутације код биљке домаћина. Анализа промотора. У репортер векторе којима недостаје промотор се могу клонирати биљни промотори које желимо да анализирамо, чиме се конструише генска фузија промотор/репортер. При конструкцији треба водити рачуна да репортер буде директно везан за промотор, а у случају да између њих има додатних секвенци, број база мора бити такав да не поремети оквир читања тј. транслације репортера. Трансформацијом биљака оваквим конструктима се може проучавати активност, индуцибилност и ткивна специфичност промотора. Директна изолација промотора. Бинарни селекциони или репортер вектори који садрже селектабилни маркер или репортер без промотора се могу користити за изолацију биљних промотора на следећи начин: биљке се трансформишу нпр. геном (без промотора) за резистенцију на канамицин, а онда се регенеранти селектују на канамицину. До резистенције ће доћи само ако се маркер угради иза неког биљног промотора у геному, чиме је промотор обележен познатом секвенцом (маркером) и лако се може изоловати. Овим приступом се промотори изолују насумице. Инсерциона мутагенеза. Инсерција стране ДНК у ген доводи до мутације, при чему се геномске секвенце око уметнуте ДНК познате секвенце могу изоловати и секвенцирати. У овом контексту сама Т-ДНК (без обзира која секвенца конкретно је између граничника) служи као нека врста етикете (tag) којом се ген обележава, и корисна је за идентификацију гена, као и за проучавање његове функције у колико инсерција заиста омета продукцију функционалног протеина. На овај начин су генерисане хиљаде мутаната Arabidopsis-a.
Алтернативни метод трансформације умакањем цветова (floral dip). Горе описани метод трансформације експланата је у широкој употреби, али подразумева регенерацију биљака у култури, што је дуготрајан процес који захтева месеце рада, као и доста лабораторијског простора. Осим тога, током гајења у култури може доћи и до појаве сомаклоналног варирања. Због тога је развијен метод трансформације који има исте молекуларне механизме како је горе описано, с тим што не захтева гајење биљака in vitro већ се примењује in planta. Метод је развијен на Arabidopsis-у, изузетно је једноставан, а заснива на умакању биљака са младим цветовима у културу A. tumefaciens у коју се додаје и сурфактант. Биљке се потом оставе да дају семена, од којих је мали процентан семена трансген. Неколико истраживачких група је независно показало да је хромозомални материјал овула примарна мета трансформације овим путем, а не полен. За сада ова метода има веома малу ефикасност, али је практична за врсте попут Arabidopsis-а, које дају веома много семена. Овај метод је применљив
184
на ограничен број врста и до сада је успешно примењен, осим код Arabidopsis-а, на још неке биљке из фамилије Brassicaceae, на алфалфа и др.
9.4. Трансформација помоћу Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes је земљишна бактерија сродна A. tumefaciens-у, која се такође користи за трансформацију биљака. Биологија ове бактерије и молекуларни механизам трансформације биљних ћелија је веома сличан већ описаном механизму A. tumefaciens, па ће овде бити истакнуте само разлике које постоје између ове две бактерије и специфифичне примене A. rhizogenes. A. rhizogenes код инфицираних дикотила доводи до формирања посебног типа тумора у виду разгранатих и длакавих коренова познатих као hairy roots (Сл. 2.6, в, г, е). Овај фенотип је проузрокован трансфером гена са Ri плазмида (root-inducing), њиховом интеграцијом у геном и експресијом. Ri плазмид је сличан Ti плазмиду и такође поседује Т-ДНК, као и Vir регион. На основу типа опина, сојеви A. rhizogenes се деле на неколико група: Агропински сојеви, нпр. A4T,15834, TR105 - код ових сојева Ri плазмиди садрже два одвојена Т-ДНК региона: TL-DNA и TR-DNA. Агропински Ri плазмиди поседују гене за биосинтезу ауксина, хомологе tms1 и tms2 генима, али упркос добро познатој вези између ауксина и ожиљавања, изгледа да ови гени нису неопходни за вируленцију. У индукцији коренова важнију улогу имају rol гени, који су лоцирани на TL-DNA. TR-DNA садржи онкогене значајне за продукцију агропина (ags), манопина (mas1 и mas1) и ауксина (tms1 и tms2). TR-DNA се не јавља код других Ri плазмида, а по трансферу доводи до појаве коренова који се фенотипски не разликују од нормалних. Ако се трансфером пренесе само TL-DNA, долази до индукције карактеристичних hairy root коренова. Манопински сојеви, нпр. TR7, 8196 - код ових сојева Ri плазмид има Т-ДНК из једног дела, који показује висок степен хомологије са TL-DNA агропинских плазмида. Микимопински сојеви, нпр. A5, A6 Кукумопински сојеви, нпр. 2588, 2657 Rol гени A, B, C и D су онкогени који се налазе на Т-ДНК Ri плазмида (или на TL-DNA ако је Т регион из два дела), који се интегришу у биљни геном. Иако је пре више од 20 година показано да су rol гени одговорни за индукцију hairy roots, као и за карактеристичан фенотип регенереисаних биљака (види доле), њихове биохемијске функције нису у потпуности разјашњене. Интересантно је да rol гени делују синергистички, јер је сваки пар ефикаснији него било који ген појединачно, а индукција коренова је најефикаснија када сви делују заједно. Литературни подаци о функцијама rol гена су контрадикторни, што није ни чудо, јер доводе до више биохемијских и физиолошких промена: Модулатори раста и диференцијације биљних ћелија rolА, rolВ и rolС повећавају сезитивност трансформаната на ауксин 100-1000 пута Утичу на метаболизам полиамина Потентни активатори секундарног метаболизма у трансформисаним ћелијама биљака из разних фамилија, при чему је често довољан само један од rol гена. Доводе до транскрипционе активације гена укључених у одбрану биљке непознатим механизмом Медијатори неуобичајених путева трансдукције сигнала у биљци Функције појединачних rol гена су веома нејасне: rolA - биохемијска функција је непозната. Сматра се да има ДНК-везујући домен. RolA доводи до промене сензитивности на ауксин и поремећаја
185
метаболизма полиамина, а код неких врста стимулише продукцију секундарних метаболита и поспешује раст калуса у култури. rolB - раније се сматрало да кодира за индол-β-глукозидазу која ослобађа ауксине из њихових коњугата, али ово није потврђено. Данас се сматра да овај протеин има активност тирозин фосфатазе и да интерагује са 14-3-3 протеинима3, што указује на улогу у трансдукцији сигнала. Експресије rolB доводи до снажне стимулације секундарног метаболизма, али и до инхибиције раста ћелија, осим ако rolB није у комбинацији са RolA и С. rolC - биохемијска функција је непозната. Раније се сматрало да rolC кодира за цитокинин-N-глукозидазу, цитосолни ензим који доводи до локализованог ослобађања цитокинина из неактивних коњугата, чиме утиче на хормонски баланс ћелија. RolC је, међутим, мали протеин од само 20 KDa, док су остале биљне и бактеријске глукозидазе много веће (50-200 KDa); додатна испитивања нису потврдила гликозидазну активност RolC. Изгледа да RolC има вишеструке ефекте на индукцију одбрамбених механизама биљака, од којих је најважнија стимулација секундарног метаболизма у трансформисаним биљкама и ћелијским културама. Показано је да, у зависности од биљне врсте, доводи до повећања продукције одређених алкалоида, антракинона, гинсенозида и других секундарних метаболита. rolD је једини rol ген чија је функција недвосмислено утврђена, а кодира за орнитин циклодеаминазу, ензим који конвертује орнитин у пролин. Верује се да промена односа орнитина и пролина доприноси морфолошким ефектима овог гена, као што је одржавање раста трансформисаних коренова и бујно цветање регенераната.
Трансформација са A. rhizogenes. Инокулација се може постићи кокултивацијом експланата са бактеријсксом културом, слично као код A. tumefaciens, са том разликом што се експланти после стављају на медијум без хормона. Као експланти се могу користити листови, хипокотили, котиледони и сл., који морају имати исечену страну. Алтернативно, инокулација се обавља убадањем биљака у стабло или лисну петељку, иглом предходно умоченом у бактеријску културу. Овај метод је погодан како за трансформацију биљака у култури in vitro, тако и in vivo - у стакленику (под условом да је обезбеђена висока влажност ваздуха). Трансформација се веома лако уочава у виду коренова који се појављују на месту убода после десетак дана (Сл. 2.6, в). Трансформисани коренови брзо расту на медијуму без хормона, густо се гранају и имају много коренских длака, а могу се одвојити од оригиналног експланта или биљке и гајити као независна култура (клон), која се повременим пасажирањем може одржавати практично неограничено дуго (Сл. 2.6, г, е). Трансформисани коренови се могу гајити на чврстој подлози, али је за већину апликација течна култура погоднија. Трансформисани коренови предстаљају стабилан фенотип са високим биосинтетским потенцијалом. Регенерација целих биљака из трансформисаних коренова. За разлику од crown gall тумора, који се не могу регенерисати у целе биљке (због чега се онкогени из ТДНК и избацују), hairy roots се могу регенераисати у култури, у неким случајевима и спонтано. Понекад до регенрације изданака долази спонтано, на медијуму без хормона, али регенерација обично захтева пребацивање исечака коренова на медијум за калусирање а потом на медијум за регенерацију, са балансом хормона који зависи од биљне врсте. Биљке регенерисане из трансформисаних коренова, међутим, често показују измењен фенотип, који је последица експресије rol гена, при чему појединачни rol гени на различит начин доприносе карактеристикама фенотипа. 3
14-3-3 су протеинска фамилија присутна код свих еукариота. Ови протеини учествују у бројним ланцима за трансдукцију сигнала, где, између осталог олакшавају протеин-протеин интеракције и штите фосфатне групе на протеинима.
186
Hairy root фенотип регенераната се одликује следећим морфолошким карактеристикама (које не морају све бити испољене код једне врсте): наборани листови скраћене интернодије редукована апикална доминација редукована фертилност промене у цветању (промена времена цветања, већи број мањих цветова) смањење количине полена и редукована фертилност смањење броја семена редукован геотропизам коренова повећана продукција секундарних метаболита у кореновима и регенерантима У неким случајевима се добијају и регенеранти нормалног фенотипа, што се објашњава сегрегацијом rol гена и страног гена или утишавањем rol гена. Примене A. rhizogenes, култура трансформисаних коренова и регенераната су бројне. Продукција секундарних метаболита у културама трансформисаних коренова је једна од најважнијих примена овог система. Трансформисани коренови расту брже од нетрансформисаних, не захтевају хормоне у медијуму, производе доста биомасе, а при томе производе више секундарних метаболита од полазног материјала, чак и без уноса страних гена (осим онкогена са Т-ДНК), што је последица експресије rol гена. Трансформацијом се, наравно, могу унети додатне копије гена за кључне ензиме који ограничавају проток кроз метаболички пут од интереса или се могу увести страни гени којима се преусмерава неки метаболички пут. Страни гени се уносе системом бинарних вектора, слично као код A. tumefaciens. Трансформисани коренови су погодни и за масовну продукцију секундарних метаболита, нпр. алкалоида, терпеноида и флавоноида у биореакторима (Пог. 17.5). Продукција терапеутских протеина у култури коренова Проучавање коренских нодула Проучавање метаболичких путева и одговора биљака на хемикалије Трансформисани коренови се користе као експериментални систем за проучавање интеракција са другим организмима, као што су нематоде, микоризалне гљивице и патогени коренова. Фиторемедијација (акумулација тешких метала, Пог. 18.1) Добијање трансгених биљака регенерацијом из културе коренова, у случајевима када је трансформација посредством A. rhizogenes ефективнија од трансформације са A. tumefaciens. Упркос чињеници да су системи трансформације посредством A. tumefaciens и A. rhizogenes оптимизовани за велики број биљака, у току су истраживања могућности коришћења других бактерија за трансформацију. Разлог лежи у чињеници да су трансформација многим генима помоћу ове две бактерије, као и неки методи и вектори заштићени патентима и другим видовима интелектуалне својине од стране великих компанија, па за комерцијализацију добијених трансгена често постоје бројне легалне препреке. Главни кандидати на којима се врше истраживања су бактерије Rhizobium sp., Sinorhizobium meliloti и Mesorhizobium loti, које нису биљни патогени, већ симбионти или бенигне ендо- или епифите које интерагују са биљкама на разне начине. Прелиминарна испитивања су показала да је ове бактерије могуће користити за трансформацију, мада методи захтевају разраду и оптимизацију.
9.5. Хемијска трансформација 187
Хемијска трансформација се у главном примењује на трансформацију бактерија плазмидима, али може да се примени и на биљне протопласте. Хемијска трансформација бактерија плазмидима. Бактерије (E. coli) се за унос страних гена (у главном у форми плазмида) могу припремити релативно једноставном хемијском обрадом - испирањем у растворима соли. Ћелије спремне да приме страну ДНК се означавају као компетентне ћелије. Већина протокола за припрему компетентних ћелија подразумева испирање у леденом раствору који садржи CaCl2, после чега се ћелијама дода раствор рекомбинантних плазмида и смеша се на кратко загреје на 42оС. Током топлотног шока страна ДНК улази у ћелије, којима је потом потребно неко време да се опораве на оптималној температури (37 оС). Током опоравка селектабилни маркер унет са плазмидом, најчешће ген за резистенцију на неки антибиотик, почиње да се експримира у трансформисаним ћелијама, које се тада могу засејати на подлогу са антибиотиком ради селекције трансформаната. Основни кораци ове методе су приказани на Сл. 9.7.
Слика 9.7: Хемијска трансформација бактерија плазмидима. Објашњења у тексту.
Ефикасност трансформације горе описаном једноставном методом је обично 10 5-106 колонија/μg плазмида, што је довољно за рутинске протоколе типа пропагације плазмида или пребацивања плазмида из једног бактеријског соја у други. Међутим, ако је потребно конструисати генску библиотеку од смеше плазмида са различитим инсертима, када је циљ спасти и умножити све или што више клонова, онда је потребна далеко боља ефикаснот трансформације. Због тога је ова основна метода усавршавана током последњих четрдесетак година. Варијације основног протокола се своде на коришћење комплексних коктела дивалентних јона у различитим пуферима, третирање ћелија редукујућим агенсима или растварачима попут DTT-ја и DMSO-a, коришћење ћелија у различитим фазама раста, гајење култура на различитим температурама пре третмана, оптимизација температуре и трајања топлотног шока исл. Поједини протоколи су тако добро оптимизовани да се постиже ефикасност трансформације до 108 па чак и до 109 колонија/μg плазмида. Треба истаћи да се компетентне ћелије добијене хемијским третманом могу чувати у залеђеним
188
аликвотима, а постоје и комерцијалне компетентне ћелије које се веома добро трансформишу. Механизам успостављања компетенције. Током логаритамске фазе раста, на мембранама E.coli постоје многобројне поре које се називају и адхезивне зоне. Иако су ове поре физички довољно велике да би кроз њих могла да прође петља плазмидне ДНК, до тога не долази јер негативно наелектрисане групе фосфолипида мембране одбијају негативо наелектрисану ДНК. Улога Ca²+ јона (евентуално у комбинацији са другим катјонима) је у неутрализацији негативних наелектрисања, како би ДНК уопште могла да приђе мембрани. Када се смеша инкубира на леду, долази до уређења фосфолипидног билејера, тако да је неутрализација негативних наелектрисања ефикаснија. Нагли пораст температуре, тј. топлотни шок, доводи до брзе мембранске транзиције, што повећава пермеабилност мембране, тако да плазмиди успевају да прођу кроз поре. Хемијска трансформација биљних протопласта. Протопласти се могу учинити компетентним за трансформацију огољеном ДНК третманом полиетилен гликолом (PEG) у присуству двовалентних катјона - обично Ca²+. При томе Ca²+ има сличну улогу као и код бактеријских ћелија, док PEG дестабилизује мембрану и чини је пермеабилном за ДНК. Када уђе у протопласт, ДНК улази у једро и може да се интегрише у геном, мада метод може да се користи и за трансформацију хлоропласта. Ограничења ове технике се односе на тешкоће манипулације протопластима и регенрације из протопласта. Осим тога одољена ДНК (линеарна, без вектора) је подложна деградацији и реаранжманима.
9.6. Електропорација Електропорација је физичка метода трансформације која се примењује како на бактеријске тако и на биљне ћелије. Ћелије се излажу електрошоку, што доводи до отварања привремених пора на мембрани. Кроз ове поре у ћелију могу дифундовати различити макромолекули а не само ДНК за трансформацију, као нпр. боје, антитела, РНК, вирусне честице идр. Електропорација бактерија. Излагање ћелија оштром пулсу електрицитета дестабилизује мембране E.coli и индукује формирање привремених пора кроз које могу да прођу молекули ДНК. Дијаметар ових пора је од 2 до неколико nm. Сматра се да су ове поре у почетку хидрофобне, а веће хидрофобне поре се потом могу претворити у хидрофилне, јер је енергија потребна за формирање и одржавање хидрофилних пора мања кад је трансмембрански потенцијал повишен (слика џџ). У току опоравка ћелија од електрошока, поре се спонтано затварају, што се може успорити држањем ћелија на ниским температурама. Док год су поре отворене, ДНК може да уђе у ћелије. Трансмембрански напон који је неопходан за формирање већих хидрофилних пора је директно пропорционалан дијаметру ћелија. Произвођачи уређаја за електропорацију обично је прецизирају који напон је најбоље користити за који тип ћелија. Ефикасност електропорације бактерија. Електропорација је најлакши, најбржи, најефикаснији и најрепродуцибилнији метод за трансформацију бактеријских ћелија, па према томе метод који треба изабрати при кострукцији геномских или cDNA библиотека. Ефикасност електропорације зависи од три параметра електричног пулса: дужине пулса, која зависи и од капацитета уређаја и од проводљивости медијума јачине поља, која је директно пропорционална напону а обрнуто сразмерна удаљености електрода и облика пулса, који зависи од дизајна самог уређаја.
189
број пулсева
1
3
2
4
Слика 9.8: Хипотетичке промене плазмамембране током електропорације. 1 - интактна мембрана; 2 хидрофобне примарне поре кроз које могу да прођу јони и мањи молекули; 3 - хидрофилна пора и 4 - улазак ДНК кроз хидрофилну пору. Осим приказаних постоје и прелазне форме пора између стања 1 и 2, као и поре које су делимично хидрофобне (са једне стране) а делимично хидрофилне (са друге стране). Ни за једну од ових пора не постоје директни докази, већ се њихова структура претпоставља на основу интерпретације резултата различитих типова експеримената. Измењено према Sambrook & Russell (2001).
Слика 9.9: Основни кораци електропорације бактерија. Објашњења у тексту.
Код E.coli се најбоља ефикасност трансформације добија са једним електричним пулсом у трајању од око 5 ms, при јачини поља од 12.5-15 kV cm-1. Ове услове преживи око 50% ћелија. Метода се може оптимизовати варирањем различитих параметара, као што су јачина електричног поља, дужина пулса, концентрација ДНК и композиција пуфера за електропорацију. Ефикасност добро оптимизоване електропорације достиже 1010 трансформаната/μg плазмида или до 80% ћелија, мада постоје и извештаји о достизању теријског максимума - 100% ефикасној трансформацији, када је трансформисана свака (преживела) ћелија. Ефикасност зависи и од величине плазмида, тако да се високе ефикасности у главном односе на мање плазмиде (око 2.6 Kb), док су за велике плазмиде (око 85 Kb) ефикасноти мање, око 107 колонија/μg плазмида. Једини недостатак електропорације је - цена. Метода захтева скупу опрему (извор струје односно апарат за електропорацију) и посебне кивете у чије зидове су
190
уграђене електроде у којима се ћелије излажу електрошоку. Кивете се продају у различитим димензијама и предвиђене су за једнократну употребу иако су врло скупе. Електропорација биљних ћелија. Електропорација се може применити на протопласте, суспензије биљних ћелија, културе калуса, неке типове експланата (незреле ембрионе, делове цвета итд.), као и на културе Chlamydomonas-a. Сам процес трансформације је исти као код бактерија, а варијације се односе на композицију пуфера, дужину пулса исл. Електропорација се успешно користи за трансформацију главних житарица - кукуруза, пшенице и пирича. У почетку, док метода још није била у потпуности развијена, били су коришћени само протопласти, али се показало да се и ћелије са зидом такође могу електропорирати. У већини случајева електропорација је ефикаснија од других физичких метода трансформације као што је биолистички метод. Осим тога, код електропорације нема ограничења у смислу подобности биљне врсте, као код биолошких система са агробактеријама. ДНК за трансформацију електропорацијом. За унос ДНК могу користити најједноставнији бактеријски плазмиди, јер је циркуларна ДНК стабилнија, при чему гени у њима нормално морају да садрже биљне регулаторне секвенце. Никакве посебне секвенце нису потребне за интеграцију стране ДНК у геном. Међутим, неке студије су показале да коришћење линеарне а не циркуларне/суперхеликалне ДНК повећава ефикасност трансформације, при чему се у инкубациони пуфер додаје и спермидин, који индукује кондензацију ДНК. За експерименте привремене експресије се користе плазмидни експресиони вектори. Уз жељени генски конструкт или вектор се обично додаје и ДНК носач (carrier DNA), која служи као алтернативни супстрат за ендогене нуклеазе, чиме штити циљну ДНК од деградације. Ефикасност електропорације код биљних ћелија највише зависи од биљне врсте, типа ћелија, стања ткива, вијабилности протопласта ако се користе протопласти и претретмана. Као третман пре и после електропорације се обично користе пуфери високог осмоларитета. Ефикасност зависи и од фактора као што су концентрација, чистоћа и топологија ДНК, присуство ДНК носача, јонска јачина пуфера, као и фактора везаних за јачину и дужину пулса. Ефикасност стабилне трансформације је обично око 40-60%, при чему око 50% ћелија преживљава третман. Електропорација се успешно може користити и за привремену експресију страних гена у биљним ћелијама. Код добро оптимизованих протокола привремене експтресије може се достићи ефикасност и до 90%. Чак и при оптималним условима количина ДНК која уђе у сваку ћелију је релативно мала, што је добро, јер се не добијају трансгени са великим бројем копија страног гена.
9.7. Биолистичка трансформација Биолистичка трансформација (biolistic, gene gun или particle bombarment method) је најефикаснија и највише коришћена физичка метода трансформације, која се првенствено користи за монокотиле, али и за дикотиле и друге организме. При биолистичкој трансформацији се милиони металних честица обложених са ДНК великом брзином испааљују у целе биљке, експланте или ћелијске културе. По уласку у ћелију ДНК се спира са пројектила, и ако уђе у једро може доћи до привремене експресије и/или до стабилне уградње у хромозоме домаћина. Ефикасност стабилне трансформације је у овом систему много мања од ефикасности привремене експресије. Биолистичка метода може да се користи и за увођење других супстанци а не само ДНК у интактне ћелије и ткива различитих организама. Методу је 1987. године увео John Sanford са колегама са Cornell Универзитета, који је успео да трансформише житарице помоћу металних пројектила обложених са ДНК, пуцајући у меристеме целих биљака из 22-калибарског пиштоља. Ова група научника је и
191
осмислила кованицу „биолистички“ (biolistic4, biological + ballistics). У међувремену су развијени далеко софистициранији апарати за биолистичку трансформацију који се данас рутински користе за трансформацију житарица. Највећи број (ако не и све) комерцијалне трансгене житарице (као нпр ВТ кукуруз, Пог. 13.2) су добијене на овај начин. Далеко највише коришћен систем за биолистичку трансформацију биљака је Biolistic® PDS-1000/HE Particle Delivery System, Bio-Rad Laboratories (Сл. 9.10, а). Овај систем ради са хелијумом под великим притиском, који се у тренутку опаљивања пропушта кроз диск да би потиснуо макроносач (мембрану) напуњен милионима микроносача - честица обложених са ДНК. При томе зауставни екран задржава макроносач, док честице настављају у правцу циљног ткива брзином од преко 1700 km/h и улазе у ћелије. Узорак ткива се налази у вакуумираној комори. Овај систем је једноставан за руковање и има само неколико параметара које треба подесити. Постоје и ручне варијанте уређаја, познате као генски пиштољи (Сл. 9.10,б), који се могу користити на експерименталним пољима, при чему се циља у меристемске регионе биљака. Везивање ДНК за микроносаче. Као микроносачи се користе честице злата или волфрама, које се пре наношења ДНК оперу у етанолу и стерилној води. Припремљене суспензије честица се могу чувати у аликвотима на -20 оС. ДНК се везује за честице преципитацијом са калцијум хлоридом и спермидином или другим полиаминима који кондензују ДНК. У задње време се уместо CaCl2 и спермидина за облагање честица користе аминосилоксани, који доводе до веће ефикасности при мањим концентрацијама ДНК. Када је ДНК прецитипитирала на површини честица, оне се исперу и ресуспендују у етанолу (ДНК се не раствара у етанолу, већ остаје везана). Микроносачи се наносе на мембрану тј. макроносач у виду етанолне суспензије, где се оставе да се осуше пре употребе. Премало ДНК даје ниске ефикасности трансформације, а превише до генских реаранжмана и великог броја копија трансгена. Параметри за оптимизацију биолистичке трансформације: Физички и хемијски параметри o Састав микроносача - честице злата униформне величине дају најбоље резултате, али се користи и волфрам, који је јефтинији o Величина микроносача је обично око 0.7-1 μm o Распоред микроносача на макроносачу треба да је равномеран Параметри инструмента o Притисак хелијума (обично око 7500-7600 kPa) o Дужина пута микроносача (6.0–10.0 mm) Биолошки параметри o Генски конструкт може да буде у форми циркуларног или линеарног плазмида или линеарне експресионе касете (промотор+ген+терминатор). Коришћење линеарних експресионих касета је један од видова „чисте технологије“ (clean gene technology) o Тип ткива. Обично се користе примарни експланти код којих се после бомбардовања индукује соматска ембриогенеза или ембриогене културе (калуси) које после бомбардовања наставе да пролиферирају да би се на крају довеле до регенерације. Могу се користити и ћелијске суспензије и целе биљке. Битни фактори су величина ћелија, старост ћелијске културе, фаза митозе, опште стање ћелија, густина ћелија и притисак тургора. Ћелије морају добро подностити вакуум, повреде и бити компетентне за 4
Biolistics је заштићено име компаније E. I. du Pont de Nemours and Co., и било је коришћено за продају апарата које данас производи и прави Bio-Rad.
192
трансформацију и за регенерацију. Да би ћелије лакше поднеле повреде, као претретман се понекад користе осмотикуми. o Тип и концентрација селективног агенса (у главном је боље почети са нижим концентрацијама и поступно их повећавати) o Потреба за периодом опоравка после бомбардовања и услови опоравка Фактори средине пре, за време и после бомбардовања су: o Температура је битан фактор током гајења биљних култура и у периоду опоравка, али нема радова који испитују ефекат температуре на облагање честица са ДНК, па неки истраживачи ово раде на ниским температурама, а неки на собној o Интензитет и квалитет светлости утиче на физиологију ткива, па самим тим и на ефикасност трансформације. o Влажност је битан фактор не само за раст биљака пре и после бомбардовања, већ и током припреме пројектила. Висока влажност може да доведе до агрегације честица и њиховог слепљивања за макроносач, што умањује ефикасност процедуре.
Слика 9.10: а - Шематски приказ апарата за биолистичку трансформацију (Bio-Rad Biolistic PDS-1000/HE transformation system). б - генски пиштољ за трансформацију in planta.
Примене биолистичког метода у биотехнологији биљака су спедеће: привремена експресија страних гена у биљним ћелијама стабилна трансформација биљака (једарна трансформација); код неких генотипова ово је једини успешан метод трансформације
193
трансформација хлоропласта трансформација митохондрија котрансформација са два или више различитих плазмида или линеарних конструката је једноставна, јер се различити конструкти само помешају при облагању честица. инокулација биљака виралним патогенима унос других макромолекула осим ДНК у ћелије
Предности и недостаци биолистичког метода. Код трансформације Agrobacteriumом у неким случајевима може доћи до хиперсензитивног одговора и смрти ћелија, што се не дешава при биолистичкој трансформацији. Осим тога, при биолистичкој трансформацији нема лажних позитивних клонова као у случају кад агробактерије остану да се размножавају у ткиву. Конструкција плазмида је једноставнија, а могу да се користе и просте генске експресионе касете, у ком случају нема бојазни да се секвенце окоснице плазмида уграде у геном. Међутим, биолистичка трансформација је често мање ефикасна од трансформације Agrobacterium-ом, а апарат за бомбардовање, као и пројектили, који су потрошни материјал, су скупи. Главни недсостаци методе су насумична интеграција страних гена у геном, чести реаранжмани векторске ДНК и уградња више копија инсерата, што може довести до утишавања гена (Пог. хх). Установљено је да се у фази пре интеграције молекули вектора у једру обрађују и рекомбинују на неки начин, што доводи до формирања фрагмената са две или више копија гена, који се потом уграђују у геном. Ово место онда постаје „врућа тачка“ где се уграђују и друге копије гена. Резултат је уградња великог броја копија гена у један или мали број локуса, што може да буде корисно у потоњим програмима укрштања.
9.8. Остали физички методи трансформације Трансформација залеђивањем и одлеђивањем (freeze-thaw method) се понекад користи за трансформацију A. tumefaciens и A. rhizogenes бинарним плазмидима. Бактерије се гаје у харанљивом медијуму (LB), центрифугирају, исперу у пуферу (TE), ресуспендују у медијуму и заледе у течном азоту. Добијене компетентне ћелије се могу чувати пар месеци на -80 оС. Пре трансформације ћелије се полако отопе на леду и помешају са плазмидима. Следе три инкубације од по 5 мин на различитим температурама, прво на леду, па у течном азоту и на крају у воденом купатилу на 37 о С. Ћелије се потом пар сати опорављају на 28 оС, пре засејавања на чврсту селективну подлогу. Као и код других физичких метода трансформације, и овај метод се заснива на пермеабилизацији мембране, у конкретном случају на мембранским транзицијама изазваним наглим променама температуре, чиме се омогућава улазак стране ДНК. Трансформација силикон-карбидним влакнима је једноствна техника која не захтева никакву специјалну опрему. Регенерабилни биљни материјал (обично растресити калуси пореклом од ембриона, ембриони или ћелијска суспензија) се стави у пуфер који садржи страну ДНК и силикон-карбидна влакна и вортексује се. Влакна, која треба да буду дебљине око 0.3-0.6 μm и дугачка 10-100 μm, пенетрирају ћелијски зид и мембрану, омогућавајући улазак ДНК. Ограничење технике је приступачност одговарајућег биљног материјала, јер је најпогодније користити растресите калусе, које продукују само неки култивари кукуруза и овса, док већина других житарица ствара компактне калусе који нису погодни за овај метод. Постоје и друге физичке методе трансформације које нису толико популарне ни репродуцибилне као предходно описане технике, као нпр. микроињектирање (директан унос ДНК иглом у протоплсте), као и унос гена уз помоћ ласера и
194
ултразвука (сонификација). Примењују се и комбинације техника, као нпр. трансформација силикон-карбидним влакнима олакшана сонификацијом или ласером. Ове технике се у главном користе само за пролазну експресију, али су забележени и случајеви стабилне трансформације.
9.9. Трансформација хлоропласта Принцип стабилне трансформације хлоропласта се разликује од насумичне интеграције страних гена у једарни геном, а заснива се на хомологој рекомбинацији (Сл. 9.11). Док у једру биљних ћелија не постоји ефикасан систем хомологе рекомбинације, у хлороплостима је хомолога рекомбинација врло ефикасна. Унос страних гена у хлоропласте се најчешће обавља биолистички, али може и хемијском трансформацијом PEG-ом. На хлоропластном геному, укључујући и инвертоване поновке, постоји неколико одређених интергенских места која се користе за инсерцију страних гена, како се не би пореметила функција хлоропластних гена. Међутим, ако нам је циљ да заменимо део неког гена модификованом (мутираном) секвенцом, онда се као секвенце хомологије користе управо секвенце циљног гена, које окружују део који желимо да мутирамо хомологом рекомбинацијом in situ (Пог. 7.3). Иницијално се трансгени интегришу у само један или неколико копија хлоропластног генома у ћелији, али је довољно двадесетак циклуса ћелијских деоба под селекционим притиском да се добије хомогена популација трансгених хлоропласта. У колико се трансген интегрише у инвертоване поновке, по интеграцији у један поновак долази до феномена корекције копирањем (copy correction) при чему се уведени страни ген дуплира и уводи и у други поновак. Вектори за трансформацију хлоропласта се дизајнирају тако да касету са страним геном и селектабилним маркером са обе стране ограничавају секвенце хомологе хлоропластним секвенцама (око 1 Kb), што је неопходно за рекомбинацију. И страни ген и селектабилни маркер треба да имају хлоропластне промоторе, као и одговарајуће 5'-регулаторне секвенце за оптималну експресију и 3'-секвенце одн. терминаторе. Вектори могу имати и ORI за репликацију у хлоропластима, чиме се умножава циљни ген пре интеграције и повећава вероватноћа интеграције. Како је генска експресија у хлоропластима слична прокариотској, у вектор за трансформацију се може унети и неколико разних гена у виду оперона под контролом једног промотора. Експресија гена у хлоропластима уместо у једру нуди неке јединствене предности: Опасност од неконтролисаног ширења страних гена поленом је далеко мања, јер је наслеђивање хлоропласта код највећег броја врста матернално. Због тога је генетско инжињерство хлоропласта много безбедније по околину и боље је прихваћено у јавности. Могућност хиперекспресије гена. Код нуклеарне трансформације се често јавља проблем ниске експресије страног гена, што што код хлоропласта никад није случај. Ако, на пример, биљна ћелија листа садржи око 100 хлоропласта, а сваки хлоропласт има око 100 копија генома, то значи да је сваки ген репрезентован са око 10.000 копија по ћелији. Ако се ген налази на инвертованим поновцима (Сл. 3.7 и 9.11), онда га има у 20.000 копија. Нема проблема са позиционим ефектом5, јер се код хлоропласта гени уграђују хомологом рекомбинацијом само на одређено место.
5
Интеграција трансгена у биљни геном је случајан процес, без обзира на методу трансформације. Због тога се регенеранти добијени трансформацијом истим геном и истом методом могу међусобно доста разликовати по нивоу експресије трансгена. Позициони ефекат представља зависност експресије трансгена од места инсерције у геном.
195
Нема проблема са утишавањем гена, јер су ензими укључени у утишавање локализовани у цитоплазми. Постоји могућност симултане уградње више гена у виду оперона у једном кораку. Не уграђују се секвенце вектора, које леже изван региона хомологије Постоји једноставан начин за елиминацију маркера после селекције, који се такође базира на хомологој рекомбинацији (детаљније у Пог. 10.6).
Слика 9.11: Трансформација хлоропласта. а - генски конструкт са селектабилним маркером и геном од интереса (о типовима селектабилних маркера који се користе за хлоропласте видети Таб. 10.1). Промотори, 5'-регулаторне секвенце, секвенца за везивање рибозома (rbs - ribosomal binding sequence) и 3'-регулаторне секвенце са терминаторима за експресију маркера и гена од интереса се узимају из хлоропластних гена, као што су rrn - rRNA, psbA- протеин D1 фотосистема II, rbcL - велика субјединица RUBUSCO, atpB - βсубјединица АТР синтазе, petD - субјединица IV цитохромног b6/f комплекса и rps16 - рибозомални протеин S16. б- полицистронска експресиона јединица (оперон) са једним маркером и три гена од интереса, под контролом једног промотора. У оваквим конструктима сваки ген треба да има посебну rbs секвенцу ради ефикасније транслације. в - интеграција генског конструкта у геном хлоропласта хомологом рекомбинацијом. Ако се генска касета интегрише у инвертовани поновак (IRa или IRb), и други поновак добија копију трансгена у процесу познатом као корекција копирањем.
Трансформација хлоропласта се користи за експресију фармацеутских и терапеутских протеина у биљкама, као и за увођење жељених агрономских особина. До сада су у хлоропластима успешно експримирани хумани соматотропин, колера токсин, фактор раста IGF-1, интерферон, серум албумин, моноклонална антитела, вакцина за кугу и др. Од протеина битних за отпорност биљака у хлоропластима се могу експримирати инсектицидални Cry протеини, CP4 EPSPS (отпорност на хербицид глифозат), bar ген (отпорност на глуфозинат) као и гени одговорни за резистенцију на сушу (tps) и др. Модел системи и најбоље разрађени објекти за трансформацију хлоропласта су дуван и њему сродно поврће, парадајз и кромпир.
Референце
196
An G (1995): Binary Ti Plasmid Vectors. In Methods m Molecular Biology Vol 44: Agrobactenum Protocols. Edited by KMA Gartland & MR Davey, Humana Press Inc , Totowa, New Jersey p. 47-58 Bulgakov VP (2008): Functions of rol genes in plant secondarz metabolism. Biotechnology Advances 26: 318-324 Christey MC & Braun RH (2005): Production of Hairy Root Cultures and Transgenic Plants by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 47-60 Clough SJ (2005): Floral Dip: Agrobacterium-Mediated Germ Line Transformation. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 91-102 Dandekar AM & Fisk HJ (2005): Plant Transformation: Agrobacterium-Mediated Gene Transfer. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 35-46 Daniell H, Ruiz ON & Dhingra A (2005): Chloroplast Genetic Engineering to Improve Agronomic Traits. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 111-137 Fisk HJ & Dandekar AM (2005): Electroporation: Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 79-90 Hellens R, Mullineaux P & Klee H (2000): A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science 5: 446-451 Kikkert JR, Vidal JR & Reisch BI (2005): Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics. In Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols. Edited by L Peña, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, p 61-78 Komari T, Takakura Y, Ueki J, Kato N, Ishida Y & Hiei Y (2006): Binary and Super-binary Vectors. In Methods in Molecular Biology vol 343: Agrobacterium Protocols, 2nd edition, Vol 1 .Edited by K Wang, Humana Press, Totowa, New Jersey, p 15-41 Michael T & Spena A (1995): The Plant Oncogenes rolA, B, and C from Agrobacterium rhizogenes. Effects on Morphology, Development, and Hormone Metabolism. In In Methods m Molecular Biology Vol 44: Agrobactenum Protocols. Edited by KMA Gartland & MR Davey, Humana Press Inc , Totowa, New Jersey p. 47-58 Sambrook & Russell (2001): Molecular cloning: a laboratory manual, 3 rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press Slater A, Scott NW & Fowler MR (2008): Plant Biotechnology. The Genetic Manipulation of Plants, 2nd Edition. Oxford University Press, Oxford, p 54-76; 98
197
