VALIDASI ALIDASI & VERIFIKA VERIFIKASI SI METODA MIKROBIOLOGI
Inta Intan n Nurm Nurmal ala a Dewi Dewi,, S STP TP 1
Penen enentu tu Kehan ehanda dala lan n Anali Analisis sis Mikr Mikrob obiol iolog ogii
Metode An Analisa • • •
Metode Standar Modifikasi Penyederhanaan
• • • • •
VALIDASI ALIDASI & VERIFIKASI VERIFIKASI METODE
Analis/Pelaksana
Peralatan Neraca LAF Pipet Inkubator Autoklaf
KALIBRASI
• • •
Pengetahuan Ketrampilan/kompeten Ketelitian
TRAINING & UJI KOMPETENSI 2
Jenis Metode Uji •
Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll
•
Metod etode e Resmi esmi : Farma armak kope, ope, EPA, dll dll
•
Metode yang dikembangkan oleh organisasi profesional yang ang memi memilliki iki reput eputas asii nasi nasion onal al dan dan interna ernasi sion onal al : AOAC
•
Metod etode e Pus Pustaka aka : Jour Journa nall
•
In hous house e meth method ode e
•
Metode Metode Modifi Modifika kasi si
3
Pemilihan Metode Fakt aktor yang ang menj menjad adii pert pertim imba bang ngan an : Stat Status us meto metode de Apak Apakah ah lab. lab. meng mengua uasa saii tekno eknolo logi gin nya ? Apak Apakah ah SDM/ SDM/An Anal alis is kompe ompete ten n? Biay iaya & waktu yang dibu dibuttuhk uhkan Meto Metode de mudah mudah diapli diaplika kasik sikan an Kondi ondisi si akomod omoda asi & per peralat latan lab. lab. mema emadai dai ?
4
Validasi •
Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa metode tersebut telah memenuhi persyaratan yang telah ditentukan.
5
Mengapa dilakukan Validasi ??? ersyara yarata tan n ISO/ ISO/IE IEC C 1702 170255-20 2017 17 klau klausa sall 7.2. 7.2.2 2 Pers Banyak lab. lab. meng mengg gunak unakan an met metode ode uji uji dari dari manu manual al book book//ala alat. Ban Lab. di daer daerah ah kesul esulit itan an mend mendap apat atk kan reag eagensi ensia/ a/me medi dia a tert terten entu tu Lab. sehi sehingg ngga a lab lab mema memang ngka kass meto metode de stan standa darr. In house method sebagai alternatif yaitu dengan memodifikasi
metode metode standar standar..
6
Kapan Validasi dilakukan ??? Apab Apabil ila a Labo Labora rato toriu rium m mengg menggun unak akan an ; ode tida tidak k bak baku Metode Metode de bak baku yang ang dimo dimodi difi fik kasi asi Meto ode bak baku yang ang digu digun nakan akan dilu diluar ar ling ingkup yang ang dima dimak ksud sud Metode Meto Metode de yang yang dik dikemba embang ngka kan n oleh oleh Labo Labora rato tori rium um
7
Verifikasi •
Verifikasi metode adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan yang ditentukan oleh metode yang bersangkutan telah dipenuhi
8
Kapan Verifikasi dilakukan??? dilakukan??? Apabila laboratorium menggunakan metode
baku yang sudah divalidasi oleh organisasi yang berwenang.
9
Mengapa metode standar harus diverifikasi ??? Lab harus meyakinkan bahwa metode tsb dapat diterapkan
terhadap jenis sampel yang diuji Lab dapat mengetahui masalah yang timbul dalam
menerapkan metode tersebut Lab dapat mengetahui unjuk kerja analis dalam melakukan
pengujian dengan metode tersebut Lab dapat menunjukkan bahwa pengujian dilakukan
dengan benar (memenuhi persyaratan tertentu)
10
Met Metode ode peng penguj ujia ian n Kuali ualittatif tif : mene menen ntuk tukan ada ada atau tida tidakn kny ya
mikr mikroo oorg rgan anis isme me ta targ rget et pad pada a samp sampel el uji. uji. Hasi Hasill uji uji umum umumn nya din dinyat atak akan an seba sebag gai posi positi tiff at atau au neg negat atif if Kuan Kuantit titat atif if : menen menentuk tukan an jumla jumlah h mikro mikroor orga ganis nisme me pada pada
samp sampel el uji uji baik baik seca secarra lang langsu sung ng (juml (jumlah ah kolon oloni) i) atau tidak tidak langsu langsung ng (MPN, (MPN, absor absorba bance nce,, dll) dll)
11
METODA PENGUJIAN 1. Kuantitatif Kuantitatif Hitungan Cawan Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae,dll. Spread Plate : Y&M, S.aureus, B.cereus, dll. 2. Semi kuantitati kuantitatif f : Coliform, E.coli , dll. MPN 3. Kualitatif Isolasi
: Salmonella, L.monocytogenes, dll.
12
Acuan valid lidasi metode kuantita itatif Sac-Singlas, 2002. Guidance Notes C&B and ENV 002.
Method Validation of Microbiological methods ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs Alternative Methods
Protocol for the Validation of
—
AOAC, 2012, International Methods Committee
Guidelines for Validation of Microbiological Methods for Food and Environmental surfaces NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods, against a reference method. 2 June 2016 13
Acuan valida idasi metode kualit litatif ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs —Protocol for the Validation of Alternative Alternative Methods AOAC, 2012, International Methods Committee Guidelines
for Validation of Microbiological Methods for Food and Environmental surfaces US-FDA 2015, Guidelines for the Validation of Analytical
Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods in Feeds. 2nd edition NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods, against a reference method. 2 June 2016. 14
Validasi alidasi & Veri Verifik fikasi asi Metode Metode Kuant Kuantit itati atif f
Method Validation of Microbiological Methods, Guidance Note : C & B and ENV 002. Singapore Acreditation Council, July 2002
15
Umum mikrobiologi untuk makanan, air dan Lingkup pedoman validasi metode mikrobiologi produk farmasi, dengan penekanan khusus pada metode kuantitatif kuantitatif di mana perkiraan kuantitatif didasarkan pada penghitungan partikel pada dasar pertumbuhan (multiplikasi) menjadi koloni atau kekeruhan. kekeruhan. Prinsip-prinsip dan prosedur dalam lingkup ini umumnya dikenal sebagai
jumlah total koloni, koloni, jumlah paling mungkin (MPN) dan jumlah koloni koloni organisme target khusus pada media selektif. Pedoman ini tidak berlaku untuk validasi metode cepat (rapid methods)
yang tergantung pada pengukuran produk atau perubahan karena aktivitas mikroba tetapi tidak mengatasi deteksi partikel individu dan metode pengujian mikrobiologi menggunakan mikroorganisme sebagai alat uji. Singapore Acreditation Council, July 2002.
16
Laborat atori orium um dihar diharapk apkan an menggun menggunak akan an refe refere rensi nsi/me /metod tode e stand standar ar yang yang Labor dipubl dipublik ikasi asika kan n untuk untuk penguj pengujian ian mikr mikrobi obiolo ologi. gi.
Laborat atori orium um yang yang menggun menggunak akan an refe refere rensi nsi/me /metod tode e stand standar ar tidak tidak Labor diha diharu rusk skan an untu untuk k menu menunj njuk ukka kan n vali valida dasi si dari dari meto metode de ini, ini, teta tetapi pi hany hanya a perl perlu u menun menunjukk jukkan an valid validasi asi sekund sekunder er (juga (juga disebu disebutt verif verifik ikasi asi). ).
erifikasi asi diperl diperluka ukan n penggun pengguna a labor laborat atori orium um hanya hanya untuk untuk memve memverif rifik ikasi asi Verifik bahw bahwa a met metode ode dapa dapatt meme memenu nuhi hi tuju tujuan an dan dan per persyarat aratan an untu untuk k apli aplik kasi asi analisis analisis yang dimaksud. dimaksud.
Singapore Acreditation Council, July 2002.
17
laboratorium untuk mengembangkan in-house Dalam situasi di mana laboratorium metode, membuat modifikasi standar metode / referensi atau menggunakannya menggunakannya di luar penggunaan penggu naan yang dimaksudkan, laboratorium harus melakukan validasi metode.
Mikroorganisme acuan yang digunakan untuk validasi harus diperiksa Mikroorganisme kemurniannya kemurniannya dengan cara plating permukaan non-selektif dan selektif media yang tepat dan pemeriksaan mikroskopis. mikroskopis. Uji kemurnian kemurnian kultur dapat menggunakan metode konvensional atau rapid methods yang disetujui untuk digunakan dalam referensi/metode referensi/metode standar jika diperlukan. Singapore Acreditation Council, July 2002.
18
Parameter Validasi Metode Analisis Mikrobiologi 1. Akurasi 2. Presisi (repeatability, reproducibility , dan intermediate precision) 3. Sens Sensit itif ifit itas as & Spe Spesi sifi fisi sita tass 4. Sele Selekt ktif ifit itas as 5. Rela elatif tif reco recove very ry rat ate e 6. Rentang hit hitung ung yang dit diterima rima (acceptable), ba batas atas dan bat batas baw bawah dari dari rent entang ang perh perhit itun ung gan 7. Ketanggu gguhan (Robustness) Singapore Acreditation Council, July 2002.
19
1. Akurasi Akur Akuras asii adala adalah h ketep etepat atan an/k /ked edek ekat atan an dari dari suat suatu u
metode ode pen penguji gujian an ant antara ara nilai ilai hasil asil uji yang ang diuk diukur ur deng dengan an nila nilaii bena benar/ r/ni nila laii konve onvens nsio iona nal/ l/ni nila laii acuan. Akur Akuras asii dapa dapatt dila dilak kukan ukan deng dengan an :
1. Pengg enggu unaa aan n bahan ahan acua acuan n atau bahan ahan acua acuan n kerja yang tertelusur. tertelusur. 2.Bahan in house (disi (disiapk apkan an oleh oleh labor laborat atori orium um). ). 3.Me 3. Memb mban andi ding ngk kan hasi hasill dari dari meto metode de yang yang seda sedang ng dival ivalid idas asii den dengan hasil sil dari ari metode kedu edua yang ang telah telah diket diketahu ahuii akura akurasin sinya ya.. 20
2. Presisi (Keseksamaan) Presis isii adal adalah ah ting tingk kat keses esesua uaia ian n anta antarra hasi hasill peng penguj ujia ian n Pres indivi individua duall deng dengan hasil hasil ratarata-ra rata ta penguji pengujian an yang yang dilakuk dilakukan an berul berulang ang pada pada samp sampel el yang yang homo homoge gen. n. Repeatability (within lab), Reproducibility (between lab),
Intermediate precision (within laboratory variation)
Parameter : Relatif Standar Deviasi Koefisien Variasi Singapore Acreditation Council, July 2002.
21
(keterula rulanga ngan) n) Repeatability (kete
: variasi dalam dalam independ independent ent test test
terha erhada dap p samp sampel el yang ang sama sama oleh oleh anal analis is yang ang sama sama deng dengan an int interv erval waktu waktu yang yang singka singkat. t. Reproducibility (kete (ketertiru rtiruan) an)
: variasi variasi dalam independ independent ent test test
terha erhada dap p samp sampel el yang ang sam sama a namu namun n dila dilak kukan ukan oleh oleh anal analis is dan dan laborato laboratorium rium yang yang berbeda. berbeda.
Intermediate Intermediate precision precision (kesek (keseksamaan samaan antara antara)) : variasi variasi hasil
labor laborat atori orium um pada pada hari hari yang yang berbed berbeda, a, at atau au analis analis yang yang berbed berbeda, a, atau at au alat alat yang ang berbe berbeda da di dal dalam am labo laborrat ator oriu ium m yang ang sama. sama.
Dilakuk Dilakukan an 15 kali kali pada pada 3 level level konse konsentr ntrasi asi (rendah (rendah,, sedang, sedang, tinggi). tinggi). Singapore Acreditation Council, July 2002.
22
3. SENSITIFITAS & SPESIFISITAS 1. Sen Sensi siti tifi fity ty : kem kemam ampu puan an meto metoda da dala dalam m memb member erik ikan an hasi hasill posi positi tif f terha terhadap dap sampel sampel presu presumti mtiff posit positif if.. 2. Spe Spesi sifi fici city ty : kem kemam ampu puan an meto metoda da dala dalam m memb member erik ikan an hasi hasill neg negat atif if terha terhadap dap sampel sampel presu presumti mtiff nega negatif tif.. 3. False positive rate : pengamatan hasil positif yang salah. 4. False negative rate : pengamatan hasil negatif yang salah. Karakteristik kinerja ini berlaku untuk metode selektif dan dilakukan
verifikasi dugaan koloni positif dan negatif pada cawan atau pertumbuhan positif dan negatif pada tabung (MPN). Singapore Acreditation Council, July 2002.
23
Validasi : setidaknya gunakan tiga strain mikroorganisme
dalam proses spiking. Verifikasi : gunakan satu atau lebih mikroorganisme
dalam proses spiking. Validasi : semua presumtif positif dan negatif harus
dikonfirmasi. Verifikasi : hanya presumtif positif yang dikonfirmasi.
24
4. SELEKTIFITAS
1. Selektifitas nyat nyata a : fraksi fraksi jumlah koloni koloni (logaritma) yang diverifikasi dari target yang benar. 2. Selektifitas semu : fraksi fraksi dari koloni koloni terduga terduga (dugaan positif) dalam logaritma diantara diantara jumlah koloni.
25
5. Relatif recovery rate rate Relatif if recov recovery ery rate rate : memba membandi ndingk ngkan an recov recovery ery antar antara a metod metode e yang yang diuji diuji dengan dengan Relat metode metode standar standar.. Dilakuka kan n setida setidakn knya ya 5 kali pada pada konsen onsentr trasi asi mikro mikroba ba uji, uji, dan dilaku dilakuka kan n triplo triplo dari Dilaku masing-masing dilusi. Parameter : Recovery (Perolehan Kembali) Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh. Sebaiknyan gunakan contoh yang tidak mengandung sample yang tidak tercemar
(jika diperlukan lakukan sterilisasi). rata-rata dari masing-masing metode dan hitung persentasi Laporakan hasil rata-rata antara metode uji dan metode standar.
Singapore Acreditation Council, July 2002.
26
Cont Contoh oh perh perhit itun ung gan akur akuras asii & Rela Relati tiff Recov ecover ery y Rat Rate
Singapore Acreditation Council, July 2002.
27
6. Rentang Hasil Pengujian Rent entang ang hasi hasill peng penguj ujia ian n menu menunj njuk ukk kan nila nilaii tere terend ndah ah dan dan nila nilaii
tert tertin ingg ggii dari dari peng penguj ujia ian n yang ang dapa dapatt dite ditent ntuk ukan an deng dengan an cerm cermat at dan dan seks seksam ama. a. Batas rendah rendah (Lower (Lower limit) limit) Batas Hasi Ha sill peng penguj ujia ian n tere terend ndah ah yang yang dita ditand ndai ai deng dengan an gala alat anal analis isis is yang ang dipe diperb rbol oleh ehka kan n tida tidak k lebi lebih h dari dari 20%. 20%. Batas tertinggi tertinggi (Upper (Upper limit) limit) Batas Hasi Ha sill peng penguj ujia ian n kolon olonii tert tertin ingg ggii yang yang masih masih dapa dapatt dihi dihitu tung ng deng dengan an cerm cermat at dan dan seks seksam ama, a, gala alat anal analis isis is 15%. 15%. Singapore Acreditation
28
Rentan ang g hasil hasil peng penguj ujia ian n (lem (lempe peng ng agar agar)) : Rent Makana Makanan n & farmas farmasii : 25-250 25-250 kolo koloni ni Sampel Sampel air : 30-300 30-300 koloni koloni Kapan apang g ( A.brasilliensi s) : 8-80 koloni A.brasilliensi s)
Singapore Acreditation Council, July 2002.
29
7. Ketangguhan (Robustness) Robustness adalah kemampuan metode untuk tetap tidak
berpengaruh oleh variasi/keragaman parameter metode (misal : waktu inkubasi, suhu inkubasi) dan menunjukkan hasil yang reliable selama metode tersebut digunakan. Efek waktu inkubasi pada koloni hitungan bisa ditentukan dengan
cara menghitung sama cawan sampel dua kali pada dua waktu inkubasi ekstrem yang ditentukan oleh metode. suhu inkubasi inkubasi pada koloni hitunga hitungan n bisa ditentuk ditentukan an dengan Efek suhu menginkubasi piring duplikat dari sampel yang sama pada kedua suhu inkubasi ekstrim ditentukan oleh metode. statistik seperti Student t-test dapat digunakan untuk Analisis statistik melihat perbandingan cawan paralel diperoleh dari dua inkubasi ekstrem waktu atau suhu inkubasi. Singapore Acreditation
30
Tahapan Validasi/Verifikasi Memili lih h Org Organis anisme me Uji Uji Memi Memili lih h matr matrik ikss samp sample le Memi Melak kukan ukan peng penguj ujia ian n sesu sesuai ai pros prosed edur ur Mela Interpr pret etasi asi hasil hasil Inter
31
Syarat,,,,
Mengg Menggun unak akan an per peralat alatan an yang ang terk terkal alib ibrrasi asi
Dila Dilak kukan ukan oleh oleh per personi sonill yang ang kompe ompetten
Media/Reagent
yang
digunakan
sesuai
spesifikasinya.
Kondi ondisi si ling lingk kung ungan mema memada daii
32
Memilih Organisme Uji Sesu Sesuai ai KANKAN-TN TN--LP 02 MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
Menjamin ketertelus etertelusur uran an Menjamin Dipeli liha harra oleh oleh Penan enangg ggun ungj gja awab wab MO acua acuan n Dipe
emelih ihar araa aan n seb sebagai agai beri berik kut : Pemel
33
Strain (ATCC, NTCC, dll)
Subkultur sekali *
Persediaan Persediaan acuan (Liofilisasi)
Dicairkan
Kultur kerja *
(Penggunaan rutin) * : uji kemurnian
34
Memilih Organisme Uji dinyatakan sebagai kontrol positif harus Kultur acuan yang dinyatakan merupakan salah satu dari strain tersebut. Strain yang lain dipilih dari hal berikut : •
Strain dari organisme organisme target yang diisolasi diisolasi oleh laboratorium laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik yang diperiksa.
•
Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh kultur collection. 35
Memilih Matrik Sampel Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang
mewakil kili lingkup variasi yang akan ditemui dalam lam matriks yang telah telah diten ditentu tuka kan. n. Dapat menggu ggunakan sample yang tercemari secara alami ami atau
dapa dapatt meng menggu guna nak kan samp sample le yang ang dice dicema mari ri (spi (spik ke samp sample le). ). Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi jumlah dan
homogen homogenitas itas kontamin ontaminan. an.
36
Persiapan matriks contoh Validasi & Verifikasi
1. Disia Disiapk pkan an samp sampel el 2. Dilakuka Dilakukan n spiking spiking kultur kultur 3. Dilarutk Dilarutkan an dengan dengan 9 bagian pelarut pelarut 4. Diho Dihomo moge geni nisas sasii
37
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 1
1 loop
Biakan murni dalam agar miring
Inkubasi selama 18-24jam pada suhu 35-37 0C BHIBroth/media lainn lainnya ya 10 ml ml
38
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 2 10-1
1 ml BHI-Broth 10 ml Hit. Jumlah koloni/ml
10-2
1 ml BPW 9 ml
10-3
1 ml
1 ml BPW 9 ml
Dst. 10-7
BPW 9 ml
10-8
1 ml BPW 9 ml
10-9
1 ml BPW 9 ml
BPW 9 ml
1 ml Inkubasi selama 48 jam pada suhu 36±1 0C 39
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 4 Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri Ulangan
10-7
10-8
10-9
1
241
24
3
Hasil
2,4 x 109 kol/ml 2
238
22
2
40
Pembuatan Spike Spike Populasi Rendah
-1
-2
10
1 ml BHI-Broth 10 ml
10
Dst 10-8 .
1 ml BPW 9 ml
10 ml
1 ml BPW 9 ml
BPW 9 ml
90 ml sample Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi rendah (2 kol/ml atau/gr)
41
Pembuatan Spike Spike Populasi Sedang Sedang Dst. -1
-2
10
1 ml BHI-Broth 10 ml
10-7
10
1 ml BPW 9 ml
10 ml
1 ml BPW 9 ml
90 ml sample
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi sedang (2,0 x 101 kol/ml atau/gr)
42
Pembuatan Spike Populasi Tinggi 10-1
10-2
1 ml BHI-Broth 10 ml
10-6
1 ml BPW 9 ml
BPW 9 ml
1 ml
10 ml
90 ml sample
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi tinggi (2,0 x102 kol/ml atau /gr)
43
1. Akurasi Kuantitatif Kuantitatif (Hitungan Cawan) 1. Siapkan sampel yang sudah di spike spike dengan mikroorganisme, mikroorganisme, lalu lalu lakuk lakukan an penguj pengujian ian secar secara a duplo duplo,, lakuk lakukan an minima minimall 6x ulangan. Perhitungan H x 100 % A H = Hasil pengujian dengan dengan metode (sample (sample + spike) spike) sample A = Hasil sebenarnya sebenarnya dari MO target target (spike)
Catatan : Gunakan sample yang tid tidak mengandung MO Singapore Acreditation Council, July 2002.
44
2. Presisi Kuantitatif Kuantitatif (Hitungan Cawan) Siapkan sampel yang sudah di spike dengan mikroorganisme
seban sebanyak yak minima minimall 15 sampel sampel (perkir (perkiraan aan populas populasii pada pada contoh contoh : rendah, sedang, tinggi). Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan
metode spike sample) atau tidak t idak mengandung organisme target. Hitung RSD RSD dari dari masing masing-ma -masin sing g popula populasi si dan gabun gabunga gan n semua semua Hitung populasi. Catatan : Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi dari dari masi masing ng-m -mas asin ing g anal analis is untu untuk k meng menget etah ahui ui kine kinerj rja a anal analis is Singapore Acreditation Council, July 2002.
45
Hitung presisi dari masing-masing level dan gabungan,
dengan menggunakan rumus :
RSD =
((Log a – log b) / x1)2
2n
CV (coefisien (coefisien of variation) variation) = RSD x 100% Keberterimaan :
RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02) CV = max. 10 %
Singapore Acreditation Council, July 2002.
46
3. Sensitifitas, Spesifisitas, Selektifitas Kuantitatif (Hitungan Cawan) & Tabung MPN Siapkan sampel yang sudah di spike dengan setidaknya 3 strain
(validasi) atau 1 strain (verifikasi) mikroorganisme. mikroorganisme. Buat pengenceran dua kali lipat atau sepuluh kali lipat dari
sampel alami. Lakukan pengujian sampel sesuai dengan metode uji.
juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan Lakukan juga metode spike sample) atau tidak mengandung organisme organisme target. atau Hitung jumlah koloni khas dan tidak khas pada cawan atau hitung jumlah tabung positif (MPN). Singapore Acreditation Council, July 2002.
47
Konfirmasi
Validasi
Semua presumpti presumptive ve positive positive dan negativ negative e harus dikonfirmasi. Verifikasi
Semua presumptive positive yang dikonfirmasi. dikonfirmasi. Sensitifity, Spesificity, Spesificity, False False Positif, Positif, False Negatif, Negatif, dan Hitung Sensitifity, Efficiency
Singapore Acreditation Council, July 2002.
48
Perhitungan Confirmed
Presumtive Positif
Negatif
Positif
A (positive)
B (false negative)
Negatif
C (false positive)
D (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100 False positive rate = c/(a c/(a+c) +c) x 100 100 False False negatif negatif rate rate = b/(b+ b/(b+d) d) x 100 100 Jumlah Jumlah tabung tabung : a + b + c + d = n Efficiency = (a+d)/n x 100
Singapore Acreditation Council, July 2002.
49
4. Relatif recovery rate rate Kuantitatif (Hitungan Cawan) 1. Siapkan sampel yang yang sudah di spike dengan dengan masing-masing 5 strain dan dikondisikan merusak mikroorganisme sebanyak 10 sampel, dan sampel yang sudah di spike spike tanpa dikondisikan dikondisikan merusak mikroorganisme sebanyak 10 sampel. 2. Lakukan Lakukan penguj pengujian ian : •
10 stressed stressed sampel : masing-masing 5 sampel diuji menggunak menggunakan an metode metode yang diuji dan menggunak menggunakan an metode metode standar.
•
10 non-stressed non-stressed sample : masing-masing 5 sampel diuji menggunak menggunakan an metode metode yang diuji dan menggunak menggunakan an metode metode standar. Singapore Acreditation Council, July 2002.
50
Hitung Relative Recovery Rate masing-masing kondisi
sampel : Relative Recovery Rate = Test Method
x 100
Reference Reference Method Metho d Keberterimaan : Hasil metode uji sama dengan metode
standar atau lebih lebi h baik dari metode metode standar. standar.
Singapore Acreditation Council, July 2002.
51
Contoh perhitungan perhit ungan Relatif Recovery Rate
Singapore Acreditation Council, July 2002.
52
5. Robusstness Kuantitatif Kuantitatif (Hitungan Cawan) Siapkan sampel yang tercemar secara alami atau sampel yang
sudah di spike dengan mikroorganisme mikroorganisme sebanyak 8 sampel. Lakukan pengujian sampel menggunakan metode uji dan
metode reference. Untuk melihat efek waktu : inkubasi 2 sampel (duplo) pada
waktu batas atas dan 2 sampel (duplo) pada waktu batas bawah. efek suhu : inkubasi 2 sampel (duplo) pada suhu Untuk melihat efek batas atas dan 2 sampel (duplo) pada suhu batas bawah. nyata (uji t). Hitung statistik untuk melihat beda nyata Singapore Acreditation Council, July 2002.
53
Validasi Metode Kualitatif ISO 16140:2003 Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs Protocol for The Validation of Alternative Methods –
54
Metode pengujia jian dalam acuan validasi Umumnya adalah metode cepat Umumnya Diajukan untuk mendapatkan pengakuan secara
internasional melakukan pengujian dalam Dapat digunakan untuk melakukan rangka rangka pengendalian mutu ( Official control)
ISO 16140:2003
55
Lingkup ISO 16140 16140:2 :2003 003 men menet etapk apkan an prinsi prinsip-p p-prin rinsip sip umum umum dan
prot protok okol ol tekni ekniss untu untuk k valid alidas asii met metode ode alte altern rna atif tif di bida bidang ng anali analisis sis mikro mikrobio biolog logii sampe sampell panga pangan, n, pakan pakan hewa hewan, n,li ling ngk kung ungan dan dan samp sampel el tern ternak ak.. Penet enetap apan an prin prinsi sipp-pr prin insi sip p umum umum dari dari sert sertif ifik ikas asii meto metode de alte altern rna atif tif ber berdasa dasark rkan an prot protok okol ol valid alidas asii ini. ini. Met Metode ode alt alterna ernati tiff digu diguna nak kan seba sebag gai met metode ode ruti rutin n di lab lab
inte intern rnal al tanpa anpa haru haruss meru meruju juk k ke per persyarat aratan an ekte ektern rnal al yang ang lebih tinggi ggi dari QA.
ISO 16140:2003
PrinsipPrinsip-prinsip Umum Validasi dan Sertifikasi Metode Alternatif 1.Protok 1.Protokol ol Validasi alidasi Terdi erdiri ri dar dari 2 fas fase e: a.Stu a.Studi di perb perban andi ding ngan an meto metode de anta antarra meto metode de alte altern rnat atif if deng dengan an meto metode de acua acuan n yang yang dila dilaku kuka kan n oleh oleh lab yang ang mapa mapan. n. b.Stud b.Studii inter interlab labor orat atori orium um denga dengan n 2 metod metode e terseb tersebut. ut. 2. Prinsip Prinsip Sertifika Sertifikasi si a.Bila a.Bila meto metode de alte altern rnat atif if dipe diperl rluk ukan an sert sertif ifik ikas asi, i, prot protok okol ol vali valida dasi si haru haruss dipenuhi. b.P b.Pabrik abrikan an haru haruss mene menerrapka apkan n quali quality ty sytem ytem untu untuk k line line prod produk uksi si berdas berdasark arkan an Europe European an Stand Standar ar at atau au yang yang setar setara a (con (contoh tohny nya a ISO 9001) c.V c. Verif erifik ikas asii regul eguler er dari dari kuali kualita tass meto metode de alter alterna natif tif yang ang suda sudah h dise disert rtifi ifik kasi asi dapa dapatt dila dilaku kuk kan sete setela lah h sert sertif ifik ikas asii diak diakui ui.. Audi Auditt dila dilaku kuka kan n seca secarra ter terat atur ur untu untuk k mem memveri verifi fik kasi asi per persyarat aratan an QA dan dan products production control. ISO 16140:2003
57
Parameter/Kar Parameter/Karakteristik akteristik Umum Kinerja Validasi Metode Quantitative
Qualitative
Linearity
Relative Relative accuracy
Relative accuracy
Relative specificity
Accuracy
Relative sensitivity
Detection limit (LOD)
False positive (positive deviation)
Quantification limit (LOQ)
False negative (negative deviation)
Relative sensitivity
Relative detection level
Specificity
Inclusivity
Inclusivity
Exclusivity
Exclusivity 58
Istilah dan definisi Relative accuracy
Tingk Ting kat kes eses esua uaian ian an anta tarra has hasil il yan ang g did didap apat atk kan ol oleh eh me meto tode de acu acuan an dan da n ha hasi sill yan ang g di dida dapa patk tkan an ol oleh eh me meto tode de al alte tern rnat ativ ive e pa pada da sa samp mpel el yang sama Relative e specitivity Relativ Kemamp Kema mpua uan n me meto tode de alt alter erna nati tive ve un untuk tuk ti tida dak k me mend ndet etek eksi si mikr mi kroo oorrgan anis isme me yan ang g ti tida dak k di dide dete teks ksii ol oleh eh me meto tode de acu acuan an Relative e sensitivity Relativ Kemampua Kemam puan n me metod tode e alt altern ernati ative ve untuk untuk men mendet detek eksi si mik mikro roor org gani anisme sme yang ya ng di dide dete teks ksii ol oleh eh me meto tode de acu acuan an False positive (Positive deviation)
Meto Metode de alte altern rnat ativ ive e memb member erik ikan an hasi hasill posi positi tiff seme sement ntar ara a meto metode de acuan acuan memb member erik ikan an hasi hasill neg negat atif if ISO 16140:2003
59
Istilah dan definisi False negative (Negative deviation)
Meto Metode de alte altern rnat ativ ive e memb member erik ikan an hasi hasill neg negat atif if seme sement ntar ara a meto metode de acua acuan n memb member erik ikan an hasi hasill posi positi tiff. Relative detection level Relative Juml Jumlah ah kult kultur ur mikr mikroo oorrganis anisma ma tere terend ndah ah yang ang dapa dapatt dide didete teks ksii seba seban nyak 50 % ole oleh h meto metode de alte altern rnat ativ ive e dan dan meto metode de acua acuan. n. Inclusivity
Kemam Kemampua puan n metod metode e altern alternati ative ve untuk untuk mendet mendetek eksi si mikro mikroor orga ganis nisme me tarrget ta get dari dari seju sejuml mlah ah besa besarr str strains ains.. Exclusivity
Kur Kurangny angnya a ganggu gangguan an dari dari berbag berbagai ai strain strain non-ta non-targ rget et dari dari metod metode e alternative. ISO 16140:2003
60
Protokol Validasi Metode Kualitatif (Studi (Studi Bandin Banding g Meto Metode de)) 1. Relative Relative accuracy accuracy,, relative relative specificity & relative relative sensitivity Diutamakan mencari sampel yang terkontaminasi secara natural.
melakukan validasi terhadap seluruh pangan, uji pada 5 Jika akan melakukan kate kategor gorii pang pangan/ter an/terga gant ntung ung pada pada kate kategor gorii panga pangan n yang yang ditentukan. Jumlah ah samp ampel 60 samp ampel untuk tuk seti setiap ap kategor egorii pang pangan an (pil (pilih ih 3 Juml jenis pangan yang mewakili). mewakili). nalissa 20 por porsi uji uji untu untuk k setiap tiap jenis enis pang pangan an dan dan lak lakukan ukan Anali peng penguj ujia ian n meng menggu guna nak kan met metode ode acua acuan n dan dan met metode ode alte altern rnat ativ ive e Untuk spik spike sampel sampel,, gunak gunakan an tingk tingkat at kontam ontaminas inasii untuk untuk Untuk meng mengha hasi silk lkan an hasi hasill uji uji yang ang posi positi tiff (L0= kontr ontrol ol neg negat atif if;; L1 = 1 sel per 25 g sam sampe pell dan dan L2 = 10 100 sel per 25 25 g sampel sampel)* )*
–
10
–
61
Food categories relevant to major foodborne pathogen
ISO 16140:2003
62
ISO 16140:2003
63
ISO 16140:2003
64
Food categories relevant to major non-pathogenic microorganisms
ISO 16140:2003
65
Peraturan Kepala BPOM RI No 16 tahun 2016 No 1 2 3 4
Kategori Pangan Produ Produkk-pr prod oduk uk susu susu dan dan analo analogn gnya ya,, kecu kecuali ali yan yang g terma termasu suk k kate katego gori ri pang pangan an 02.0 02.0 Lemak, ak, minyak, dan emulsi lsi minyak Es unt untuk uk dim dimak akan an (ed (edib ible le ice ice,, ter terma masu suk k sher sherbe bett dan dan sorb sorbet et)) Buah dab sayuran (termasuk jamur, umbi, kacang termasuk kacang kedelai, dan lidah buaya), rumput laut,
5
biji-bijian Kembang gula gula//permen dan cokelat lat Serealia dan produk serealia yang merupakan produk turunan dari biji serealia, akar dan umbi, kacang dan
6
empulur (bagian dalam batang tanaman), ti dak termasuk produk bakeri dari kategori 07.0 dan tidak termasuk kacang dari kategori 04.2.1 dan 04.2.2
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Produk bakeri Dagin Daging g dan dan produ produk k dag dagin ing, g, ter terma masuk suk dagin daging g ungg unggas as dan dan dagi daging ng hew hewan an buru buruan an Ikan Ikan dan dan prod produk uk peri perikan kanan an term termasu asuk k molusk moluska, a, krus krustase tase,, dan dan ekinod ekinoderm ermata ata serta serta amfi amfibi bi dan dan rept reptil il Telur da dan pr produ oduk-produk te telur Pemanis, te termasuk ma madu Garram, Ga am, rem rempa pah, h, sup, sup, saus saus,, sala salad, d, prod produk uk prot protei ein n Prod Produk uk pang pangan an untu untuk k kep keper erlu luan an gizi gizi khus khusus us Min Minuman uman tida tidak k ter terma masu suk k prod produk uk susu susu Makanan ri ringan si siap sa santap Pangan campuran (kompos mposit it))
Penghitungan hasil validasi kualitatif Hasil uji metode acuan dan metode alternative
ISO 16140:2003
67
Pengh enghit itun ung gan hasi hasill valid alidas asii kuali ualittat atif if Penghitungan relative accuracy, relative sensitivity dan relative specificity
ISO 16140:2003
68
2. Relative detection level Tujuan ujuan : konse konsent ntra rasi si terk terkeci ecill mikro mikroor orga ganis nisme me yang yang dapat dapat didetek dideteksi si minimal minimal 50% oleh alterna alternativ tive e dan refe referen rence ce methods methods didalam didalam sampel sampel Pili Pilih h 1 prod produk uk pang pangan an dian dianta tara ra masi masing ng-m -mas asin ing g katego tegori ri
pangan. Gunaka Gunakan n 5 target target mikr mikroor oorga ganism nisme e yang yang berbeda. berbeda. Uji minim minimum um 3 level level kons konsen entr trasi asi (L0= kontr ontrol ol neg negat atif if;;
L1 = 1 10 sel sel per per 25 25 g sa sampel pel dan dan L2 = 10 25 g sampel) –
–
100 100 sel sel per per
Lak Lakukan ukan uji uji seba seban nyak yak 6x ulan ulang gan deng dengan an alte altern rnat ativ ive e
dan refe referen rence ce methods methods ISO 16140:2003
69
Pengh enghit itun ung gan hasi hasill valid alidas asii kuali ualittat atif if
ISO 16140:2003
70
3. Inclusivit Inclusivity y dan dan Exclusi Exclusivity vity Inclus Inclusivi ivity ty : pilih pilih 50 stra strain in murni murni dari dari bakte bakteri ri ta targ rget et
(untuk Salmonella pilih minimal 30 strain). strain). Inokulasikan Inokulasikan kedal edalam am samp sampel el 10 100 100 kal kalii lebi lebih h besa besarr dari dari bat batas deteksi. –
Exclu Exclusiv sivity ity : pilih pilih 30 stra strain in murni murni dari dari bakte bakteri ri non ta targ rget et..
Inok Inokul ulas asik ikan an kedal edalam am samp sampel el deng dengan an ting tingk kat konta ontami mina nasi si yang yang tin tinggi ggin nya dipe diperk rkir irak akan an seri sering ng ter terdapa dapatt pada pada samp sampel el
ISO 16140:2003
71
Pengh enghit itun ung gan hasi hasill valid alidas asii kuali ualittat atif if
ISO 16140:2003
72
Verifikasi Metode Kualitatif
73
Prosedur Sampel: l: sesuai kateg kategori ori pang pangan an ata atau u sampel yang yang biasa diuji diuji di Sampe laboratorium. Unt Untuk uk setia setiap p sampe sampel, l, siapk siapkan an sampe sampell tan tanpa pa spik spike e bakt bakteri eri (k (kont ontrol) rol),,
siapk siap kan sa samp mpel el sp spik ike e bakte bakteri ri ta targ rget et (dap (dapat at me meng nggu guna nak kan satu satu at atau au lebih leb ih bak bakte teri) ri),, dan sia siapk pkan an sam sampel pel spi spik ke bak bakte teri ri no non n ta targ rget et.. Spik ke sampel sampel deng dengan an tingk tingkat at kon onta tamin minasi asi re renda ndah h (1(1-10 10 sel sel per 25 g Spi samp sa mpel el da dan n kon onta tami mina nasi si ti ting nggi gi (1 (100-10 100 0 sel sel pe perr 25 g samp sampel el)* )* Lakukan enam kali ulangan masing-masing level. Uji sesuai prosedur yang tertera pada metode. Ko Konfi nfirma rmasi si sam sampel pel pre presum sumtif tif posi positif tif deng dengan an uji bio biokim kimia ia dan
serologi sero logi,, presumptive presumptive neg negativ ative e tida tidak k dik dikonfi onfirmasi rmasi.. * NordVal International International protocol for the validation of microbiological alternative (proprietary) methods
74
Penghitungan Konfirmasi
Presumptif positif
positif negatif
negatif
a
b
(positive)
(false negative)
c
d
(false positive)
(negative)
Sensit Sen sitifi ifitas tas (%) = a/( a/(a a + b) x 100 Spesif Spe sifisi isita tass (%) = d/(c d/(c + d) x 100 100 Fals alse e positi positive ve rat rate e (%) = c/(a c/(a + c) x 100 False negativ negative e rate rate (%) = b/(b+d) x 100 Jumlah con contoh: toh: a + b + c + d = n 75
Contoh Konfirmasi
Presumtif positif
positif
negatif a
b
(11)
(0)
c
d
(1)
(6)
negatif Sensitifitas = a/(a + b) x 100
= 11/11 x 100 = 100
Spesifisitas = d/(c + d) x 100
= 6/7 x 100
= 85.7
False positive rate = c/(a + c) x 100 = 1/11 x 100
= 9 .1
Fals alse neg negativ tive rate = b/(b b/(b+d +d)) x 100 100
= 0/6 0/6 x 100 100
=-
Jumlah contoh: a + b + c + d = n
= 11+0+1+6
= 18 76
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
77
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
78
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
79
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
80
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
81
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation techniques 19 – 22 August 2014
82
Laporan Laporan valida validasi/v si/verifi erifik kasi metode metode
83
Lapor Laporan an valida alidasi si/v /ver erif ifik ikas asii meto metode de Latar belakang/alasan melakukan validasi/verifikasi Acuan metode validasi Waktu dan analis yang melaksanakan Uraian tatacara pelaksanaan Metode uji yang digunakan Uraian sampel yang digunakan Uraian mikroba yang digunakan dan sumber/asalnya Tingkat kontaminasi (spike) 84
Lapo Laporran valid alidasi asi/v /ver erif ifik ikasi asi met metode Analisa data Kriteria yang digunakan dalam validasi/verifikasi Laporkan Laporkan semua hasil uji (lampirkan (lampirkan data data mentah) mentah) Bedakan hasil yang diperoleh dari sampel alami dan
kontaminasi kontaminasi (spike) Kesimpulan tentang kesesuaian metode tersebut
terhadap persyar persyarata atan n laboratorium laboratorium
85
86
