Xây Dựng Phương Pháp Điều Chế Cao Khô Và Phân Lập Puerarin Từ Sắn Dây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC C

Y

G À

C

G G

D

C

BÀO C Ế THUỐC

Ố: 60720402

gười hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, là người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô giáo trường Đại học Dược

à

ội lòng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ

trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua. à ội, tháng 07 năm 2014 ọc viên

Phạm Thị Phương Dung

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HI U, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤ ĐỀ.............................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2 1.1.

Vài nét về cây sắn dây .................................................................................2

1.1.1.

Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây .....................................2

1.1.2.

Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây ..................................................2

1.1.3.

Tác dụng dược lý ....................................................................................4

1.1.4.

Công dụng ...............................................................................................6

1.1.5.

Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây ................................6

1.2.

Puerarin ......................................................................................................12

1.2.1.

Công thức hóa học ................................................................................12

1.2.2.

Tính chất lý hóa ....................................................................................12

1.2.3.

Kỹ thuật phân tích .................................................................................13

1.2.4.

Tác dụng sinh học của puerarin ...........................................................15

1.2.5.

Các nghiên cứu tinh chế puerarin hiện nay..........................................19

1.3.

Cao thuốc ....................................................................................................20

1.3.1.

Khái niệm ..............................................................................................20

1.3.2.

Phân loại ...............................................................................................20

1.3.3.

Kỹ thuật điều chế ..................................................................................21

1.3.4.

Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc .................................................22

Chương 2. NGUYÊN VẬT LI U, TRANG THIẾT BỊ VÀ

Ơ G

Á

NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................23 2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................23

2.1.1.

Nguyên liệu ...........................................................................................23

2.1.2.

Dụng cụ .................................................................................................23

2.1.3.

Phương tiện và máy móc.......................................................................23

2.2.

Nội dung nghiên cứu..................................................................................24

2.2.1.

Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô ..........................................24

2.2.2.

Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi..........................................24

2.2.3.

Điều chế cao khô...................................................................................25

2.2.4.

Phân lập puerarin và daidzin ...............................................................25

2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................25

2.3.1.

Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin ............25

2.3.2.

Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng ..........29

2.3.3.

Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô ...........................30

2.3.4.

Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ..................................30

2.3.5.

Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn dây tươi .....................................31

2.3.6.

Phương pháp điều chế cao khô.............................................................32

2.3.7.

Phương pháp phân lập puerarin và daidzin .........................................35

2.3.8.

Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidzin ...........................35

2.3.9.

Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết ......................35

2.3.10. Phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô ..............................36 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................37 3.1.

Định lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu ...........................37

3.1.1.

Đường chuẩn isoflavonoid ..................................................................37

3.1.2.

Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu .......................................38

3.2.

Định lượng puerarin trong nguyên liệu...................................................39

3.3.

Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô ...................................................40

3.3.1.

Khảo sát các dung môi chiết .................................................................40

3.3.2.

Tinh chế dịch chiết sắn dây khô ............................................................44

3.4.

Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi ...................................................45

3.4.1.

Chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ........................................................45

3.4.2.

Tinh chế dịch chiết sắn dây tươi ...........................................................46

3.5.

Điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây tươi ............................................47

3.6.

Phân lập puerarin và daidzin ...................................................................49

3.6.1.

Phân lập daidzin ...................................................................................49

3.6.2.

Phân lập puerarin .................................................................................53

3.6.2.1. Tiến hành ..............................................................................................53 Chương 4. BÀ L ẬN ............................................................................................57 4.1.

Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoid ....................................................57

4.2.

Về phương pháp bào chế cao khô ............................................................57

4.3.

Về phương pháp phân lập puerarin và daidzin ......................................58

KẾT LUẬ VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................60 KẾT LUẬN ...........................................................................................................60 ĐỀ XUẤT..............................................................................................................61 TÀI LI Ụ LỤC

T A

K ẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AMPK

:

5'-adenosine monophosphat-activated protein kinase

ATP

:

Adenosine triphosphat

CV

:

Coefficient of variation ( ệ số phân tán)

DEPT

:

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DĐV

:

Dược điển Việt am

ESI – MS

:

ElectroSpray Ionization - Mass spectrometry (Khối phổ - Ion hóa bằng phương pháp phun mù điện tử)

GOT

:

Glutamic oxaloacetic transaminase

HDL

:

High-density lipoprotein

HPLC

:

High Performance Liquid Chromatography ( ắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSCCC

:

High Speed Counter Current Chromatography ( ắc ký ngược dòng tốc độ cao)

IL

:

Interleukin

IR

:

Infrared ( ồng ngoại)

LDL

:

Low-density lipoprotein

LPS

:

Lipopolysaccharid

mTOR

:

mammalian Target of Rapamycin (Đích tác dụng trên động vật có vú của Rapamycin)

MAPK

:

Mitogen-activated-protein-kinase

NMR

:

Nuclear magnetic resonanc (Cộng hưởng từ hạt nhân)

1

H-NMR

13

C-NMR

:

hổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

:

hổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

PG

:

Pueraria glycosid

RSD

:

Relative standard deviation

(Độ lệch chuẩn) TLC

:

Thin Layer Chromatography ( ắc ký bản mỏng)

TNF

:

Tumor necrosis factors (Yếu tố hoại tử khối u)

UV

:

Ultraviolet (Tử ngoại)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sắn dây ......3 Bảng 1.2. o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng..........................9 Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng ......................................................................................23 Bảng 3.1. Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm. .37 Bảng 3.2. Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu .................................39 Bảng 3.3. Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn ..........................................39 Bảng 3.4. àm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở Phú Thọ.....................40 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau ................41 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước ...................................................................................................................................43 Bảng 3.7. Kết quả tinh chế dịch chiết sắn dây khô ...................................................44 Bảng 3.8. Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ...............................................45 Bảng 3.9. Hiệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch chiết, tương ứng khoảng 150 g dược liệu) ................................................................46 Bảng 3.10. Dịch tinh chế đem vào phun sấy .............................................................47 Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy...................................48 Bảng 3.12. Kết quả đo phổ hồng ngoại của daidzin .................................................51 Bảng 3.13. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của daidzin .................................52 Bảng 3.14. Kết quả đo phổ NMR của daidzin ..........................................................52 Bảng 3.15. Kết quả đo phổ hồng ngoại của puerarin ................................................54 Bảng 3.16. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của puerarin ...............................54 Bảng 3.17. Kết quả đo phổ NMR của puerarin .........................................................55

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ình 1.1. Sắn dây ........................................................................................................2 ình 2.1. ơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ...................................................31 ình 2.2. Quy trình điều chế cao khô .......................................................................34 Hình 3.1. Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu ...............................................37 ình 3.2. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ quang .........................................................................................................................38 ình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic sắc ký .........................................................................................................................40 ình 3.4. Biểu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau. ...............................................................................................42 ình 3.5. Bột cao khô phun sấy ................................................................................48 ình 3.6. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết .......49 ình 3.7. Quy trình phân lập daidzin và puerarin .....................................................50 Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của daidzin ...........51 ình 3.9. Công thức cấu tạo của daidzin ..................................................................52 Hình 3.10. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin ........53 ình 3.11. Công thức cấu tạo của puerarin ...............................................................55

ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây từ lâu đã được sử dụng trong dân gian. Theo y học cổ truyền, rễ sắn dây là một vị thuốc mát, có tác dụng giải nhiệt, sinh tân, chống khát, làm ra mồ hôi, dễ tiêu, chỉ tả, chữa các chứng sốt nóng, nhức đầu, mẩn ngứa, rôm sảy, viêm ruột, đau dạ dày... Gần đây trên thế giới đã có khá nhiều công trình khoa học chứng minh tác dụng của dịch chiết rễ sắn dây: chữa đau đầu [34], chống oxy hóa [9], [13], giải rượu [23]. Thành phần isoflavonoid trong rễ được cho là chất có tác dụng. Trong số các isoflavonoid sắn dây, puerarin là chất có hàm lượng lớn và được cho là thành phần có tác dụng chủ đạo. Hiện nay ở Trung Quốc puerarin đã được chiết xuất và phân lập thành công từ rễ sắn dây phục vụ cho cho việc bào chế các dạng thuốc quy ước (viên nén, viên nang, thuốc tiêm) để chữa bệnh. Tại Việt Nam, sắn dây được trồng khá phổ biến nhưng chủ yếu nhằm chế tinh bột. Vai trò của sắn dây trong chiết xuất isoflavonoid chưa được quan tâm đầy đủ. Hiện nay, isoflavonoid nguyên liệu và puerarin vẫn phải nhập chủ yếu từ Trung Quốc với giá thành cao. Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sắn dây song song với việc chế tinh bột có thể giúp chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng như puerarin trong sản xuất và tận dụng được phế phẩm của quá trình sản xuất tinh bột sắn. Nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ sắn dây phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây” với hai mục tiêu chính sau: 1.

Xây dựng quy trình điều chế cao khô phun sấy từ rễ củ sắn dây.

2.

Phân lập được puerarin từ rễ củ sắn dây.

1

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về cây sắn dây 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây Sắn dây có tên khoa học là Pueraria thomsonii Benth., họ Đậu – Fabaceae. Một số tài liệu Trung Quốc ghi loài Pueraria lobata (Willd.) Ohwi hoặc P. pseudohirsuta Tang et Wang [3]. Dược điển Trung Quốc ghi nhận cả hai loài Pueraria lobata và Pueraria thomsonii [32]. Sắn dây là một loại dây leo, dài có thể đến 10m, lá kép gồm ba lá chét. Cuống lá chét giữa dài, cuống lá chét

ình 1.1. ắn dây

hai bên ngắn. Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy. Về mùa hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá. Quả loại đậu có nhiều lông. Củ dài to nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ. Muốn trồng người ta đào các hố sâu 50cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại. Đến tháng 1-2 giâm cành vào các hố đó.

hiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm

giàn lấy bóng mát. Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn tinh bột [3]. Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau. Ở Trung Quốc, người ta thường thu hoạch sắn dây vào mùa thu và mùa đông [32]. Để chế vị Cát Căn thì rửa sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm. Nếu củ to thì bổ dọc để có những thanh dày khoảng 1cm, sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy khô. Loại trắng ít xơ là loại tốt. Muốn chế tinh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ hoặc mài trên tấm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn lấy tinh bột rồi đem phơi hoặc sấy khô [3]. 1.1.2. Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây Rễ củ các loài ueraria đều chứa tinh bột, tỷ lệ khoảng 12-15% theo tươi [3] đến 40% theo khô [4]. Ngoài ra còn có saponin [4], [20] và các flavonoid thuộc 2

nhóm isoflavonoid. Từ loài Pueraria lobata người ta đã phân lập được các isoflavonoid sau puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3), formonetin (4).

ăm 1987

các nhà nghiên cứu Nhật đã phát hiện thêm 13 chất mới, trong đó có genistein và các glycosid của daidzein, genistein [20]. Các nghiên cứu sau này đều chỉ ra rằng puerarin, daidzin, daidzein, genistein và genistin là các isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn trong rễ củ các loài sắn dây, và cho các tác dụng sinh học đáng chú ý [46], [11], [37]. R3 R2O

O

R1

O

R4

R1

R2

R3

R4

Puerarin

H

H

Glu

OH

Daidzin

H

Glu

H

OH

Daidzein

H

H

H

OH

Genistein

OH

H

H

OH

Genistin

OH

Glu

H

OH

Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sắn dây Tính đến thời điểm hiện tại, người ta đã tìm ra khoảng 52 flavone từ các loài Pueraria [44]. Trong đó Pueraria lobata là loài có hàm lượng flavones cao nhất và có nhiều flavones được phân lập nhất (36 chất) [44]. àm lượng isoflavone trong rễ củ sắn dây phụ thuộc nhiều vào loài, vùng trồng trọt [44] và thời gian thu hái [11].

àm lượng flavone trung bình ở loài

Pueraria lobata là 7,42% trong khi hàm lượng flavone trung bình ở loài Pueraria thomsonii chỉ có 0,93% [44].

àm lượng flavone ở loài Pueraria lobata trồng tại

Shanxi lên tới 10,4% trong khi hàm lượng này khi trồng tại Jiangxi chỉ đạt 3,3% [44]. Tuổi và thời gian thu hái cũng là yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hàm lượng isoflavone của loài Pueraria lobata trồng tại Huoshan. Rễ củ 3 năm tuổi thu hái vào khoảng tháng Giêng sẽ cho nồng độ isoflavone cao nhất, đạt 7,26%. Tuổi cao hơn

3

hoặc thời gian thu hái trước tháng Giêng đều làm giảm nồng độ isoflavone của sắn dây [11]. 1.1.3. Tác dụng dược lý 1.1.3.1. Tác dụng trên tim mạch Thử nghiệm tác dụng trên chó bằng cách tiêm flavon toàn phần của sắn dây cho thấy có tác dụng giãn động mạch vành đồng thời giảm lượng tiêu thụ oxy của cơ tim và giảm sức kháng mạch vành. Trên chó đã dùng reserpin trước đó để làm tiêu kiệt hết lượng catecholamin trong mô tim, dạng isoflavon toàn phần với liều 30 mg/kg và puerain với liều 20 mg/kg có tác dụng làm tăng lưu lượng mạch vành và giảm sức kháng mạch vành. Những kết quả này giống với kết quả thí nghiệm trên chó không dùng reserpin. Điều này chứng tỏ hiện tượng làm giãn mạch vành của sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn cơ trực tiếp [8]. 1.1.3.2. Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp. Cao sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp [8]. 1.1.3.3. Tác dụng chống loạn nhịp tim So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt. Dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống loạn nhịp tim. Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim, tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [8]. 1.1.3.4. Tác dụng đối với tuần hoàn não Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm động mạch cảnh với liều 0,1-5,0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng 87,7134%, nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30 mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20%. Trên bệnh nhân cao huyết áp,

4

flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg giúp cái thiện tuần hoàn não cho 53% bệnh nhân, làm giảm trợ lực mạch máu não [8]. 1.1.3.5. Tác dụng đối với hệ thần kinh Dịch chiết sắn dây với liều 2 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên thỏ gây sốt bằng vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự. ước sắn dây với liều 6 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng cải thiện hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây nên [8]. 1.1.3.6. Tác dụng đối với cơ trơn Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sắn dây thì dạng PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cô lập chuột lang kiểu papaverin, dạng PM1, PM3 lại có tác dụng gây co thắt. Daidzein có tác dụng giải co thắt đối với ruột non đã cô lập của chuột nhắt trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác dụng của papaverin [8]. 1.1.3.7. Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết ước sắc sắn dây với liều 6-8 g/kg cho thẳng vào dạ dày thỏ bình thường có tác dụng hạ đường huyết nhưng không thể đối kháng với hiện tượng đường huyết tăng cao do adrenalin gây nên. Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhắt trắng đã được gây tăng cholesterol bằng alloxan. Aspirin dùng đơn độc không có tác dụng hạ đường huyết hay lipid huyết [8]. 1.1.3.8. Tác dụng chống ung thư Dịch chiết cồn từ sắn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào ung thư phổi Lewis. Daidzein với nồng độ 14µg/ml có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư máu HL-60 (promyelocytic leukemia) [8]. 1.1.3.9. Tác dụng chống oxy hóa Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc streptozotocin. Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và một vài chất liên quan, với liều 500 mg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả 5

cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh, và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat với liều 50 mg/kg [8],[9]. 1.1.3.10. Các tác dụng khác: Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ. Thí nghiệm trên chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột cống trắng, daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do rượu gây nên. Đối với gan của chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng CCl4, isoflavonoid chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7% hoạt độ men GOT [8]. Nghiên cứu của Đỗ Thị oa Viên đã chứng minh rằng cao chiết isoflavonoid từ củ sắn dây Pueraria thomsonii Benth. có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen trên 51,5% chuột nhắt trắng cái với liều uống 150 mg/con/ngày. Điều này cho thấy hoạt tính estrogen của hỗn hợp isoflavonoid chiết xuất từ củ sắn dây là khá rõ rệt [7]. 1.1.4. Công dụng Theo y học cổ truyền, cát căn là một vị thuốc chữa sốt nhức đầu, khát nước, kiết lỵ, ban sởi. Cát căn đã được ghi vào dược điển Việt Nam. Tinh bột sắn dây pha với nước thêm đường uống để giải khát [3]. Ngoài ra trong y học cổ truyền còn dùng hoa của dây sắn dây với tên “Cát hoa” để làm thuốc giã rượu [3]. Theo Dược điển Trung Quốc, sắn dây có tác dụng hạ sốt, kích thích tiết dịch cơ thể, cầm ỉa chảy. Do vậy, sắn dây được sử dụng để điều trị sốt, đau đầu, khát nước, tiểu đường, ban sởi, kiết lỵ hoặc ỉa chảy cấp, cứng gáy và đau trong tăng huyết áp [32]. 1.1.5. Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây 1.1.5.1. Chiết kiểu truyền thống Mặc dù với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại đã có rất nhiều phương pháp chiết hiệu quả được đưa vào ứng dụng nhưng chiết xuất theo kiểu

6

truyền thống vẫn được nghĩ đến đầu tiên khi nghiên cứu về các dược liệu mới. Chỉ có hiểu rõ đặc điểm chiết các dược liệu này theo phương pháp hồi lưu đơn giản mới có thể áp dụng các biện pháp cải tiến để nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng sản phẩm chiết. Cũng vì thế, trong rất nhiều nghiên cứu chiết sắn dây đã được thực hiện trên thế giới, phương pháp chiết hồi lưu vẫn được các nhà khoa học quan tâm thực hiện. Mục tiêu của các nghiên cứu này hầu hết là để tìm ra được loại dung môi, nhiệt độ, thời gian… tối ưu cho việc chiết isoflavonoid từ sắn dây. Ngay từ năm 1998, Li Wehong và cộng sự đã xác định được giữa hai dung môi nước và cồn, dung môi cồn cho hiệu suất chiết cao hơn và dễ tinh chế sản phẩm hơn. Cũng từ đó, nhóm nguyên cứu đã tìm ra được điều kiện chiết xuất tối ưu cho sắn dây là chiết bằng ethanol 60% trong 6 giờ ở 60C [25]. Đến năm 2007,

an Jian và cộng sự vẫn tiếp tục nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ sắn dây bằng phương pháp truyền thống nhưng sử dụng dung môi chiết là nước. Mặc dù không phải là một dung môi được đánh giá cao trong nhiều nghiên cứu song nếu tiến hành theo phương pháp của Han Jian vẫn có thể chiết được lượng lớn puerarin từ sắn dây. Chiết nước ở điều kiện tối ưu là chiết 2 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước, thời gian chiết lần lượt là 1,5 giờ và 1 giờ [14]. Để nâng cao hiệu suất chiết người ta đã tiến hành thay đổi dung môi chiết, sử dụng hệ dung môi thay vì các dung môi đơn thông thường. Đáng kể đến là chuỗi nghiên cứu của Hua-Neng Xu và cộng sự. Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã tìm ra hệ dung môi hai pha n-butanol/nước tỷ lệ 1:1 (v/v) không những dùng được cho quá trình chiết rắn – lỏng và tinh chế lỏng-lỏng mà còn giúp chiết được daidzein và isoflavonoid toàn phần với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi chiết một pha thông thường [15]. Với hệ dung môi hai pha như trên, daidzein dễ dàng được tách và tinh chế từ pha n-butanol [15]. uerarin được tinh chế từ phần pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol. Quá trình tinh chế tương đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phẩm tinh chế sạch khi phân tích sắc ký [16]. Với những kết quả thu được, các tác giả đã tiến hành tiếp những đánh giá toàn diện hơn về các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết isoflavonoid từ sắn 7

dây bằng hệ dung môi hai pha n-butanol/nước. Cuối cùng, rút ra những kết luận như sau thành phần của hệ dung môi hai pha và nhiệt độ chiết là những yếu tố chính ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần; hệ dung môi n-butanol/nước với tỷ lệ 1:1 là có hiệu quả hơn cả; hiệu suất chiết và hệ số phân bố tăng lên ở tất cả các hệ dung môi đã khảo sát khi tăng nhiệt độ; những kết quả tính toán được từ mô hình là hoàn toàn phù hợp với dữ liệu thực nghiệm [17]. Tại Việt

am, năm 2009 Dược sĩ Lê Thùy Linh đã nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ sắn dây bằng dung môi phân cực theo phương pháp chiết hồi lưu. Khảo sát ba dung môi chiết là ethanol 90o, methanol và ethyl acetat. Dựa vào tỷ lệ phần trăm hàm lượng cắn thu được và kết quả định tính isoflavonoid trong dịch chiết tác giả chọn ethanol 90o là dung môi sử dụng để chiết isoflavonoid từ sắn dây [5]. 1.1.5.2. Chiết dưới áp suất cao So với phương pháp chiết hồi lưu, chiết dưới áp suất cao cho hiệu suất chiết cao hơn hẳn. Khi sử dụng cùng dung môi chiết là ethanol 95%, chiết dưới áp suất cao giúp chiết được lượng puerarin cao gấp 1,8 – 2,4 lần, lượng daidzin cao gấp 1,4 – 1,8 lần và lượng daidzein cao gấp 2,6 – 3,7 lần so với phương pháp hồi lưu [31]. gười ta cũng nhận thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavonoid phụ thuộc vào nhiệt độ chiết khi chiết dưới áp suất cao. Hiệu suất chiết tăng khi tăng nhiệt độ [31]. 1.1.5.3. Chiết bằng siêu âm Khi so sánh phương pháp chiết bằng siêu âm với phương pháp chiết truyền thống, Yang Hu và cộng sự nhận thấy rằng sử dụng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết xuống 20 lần so với phương pháp chiết hồi lưu.

iệu suất

chiết của phương pháp chiết bằng siêu âm đạt 19% sau 20 phút, trong khi hiệu suất chiết của phương pháp chiết hồi lưu chỉ đạt được 14,3% và 16,5% sau 1 và 2 giờ. Chiết bằng siêu âm đạt được hiệu suất này sau 5 phút. Mặt khác, siêu âm không làm phân hủy tới các thành phần hoạt chất có trong dịch chiết [45]. 8

Cũng trong nghiên cứu này, Yang Hu và cộng sự đã chứng minh rằng, hiệu suất chiết khi sử dụng siêu âm bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết [45], tỷ lệ dung môi và năng lượng siêu âm [31]. Trong các dung môi chiết nước, methanol, ethanol và ethyl acetat người ta nhận thấy dung môi chiết tối ưu là ethanol nước tỷ lệ 7:3. Mặc dù nước là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhưng lại hòa tan nhiều tinh bột trong dịch chiết gây khó khăn cho quá trình lọc, dịch chiết thu được không trong và cao dẻo dính khó thu hồi [45]. Không chỉ có hiệu quả hơn phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, MeiHwa và cộng sự còn chứng minh được rằng, chiết bằng siêu âm còn cho hiệu suất chiết cao hơn phương pháp chiết dưới áp suất cao [31]. Dưới đây là bảng so sánh ba phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, áp suất cao và siêu âm: Bảng 1.2. o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng Yếu tố

Truyền thống

Dưới áp suất cao

Siêu âm

Thời gian chiết

Tốn thời gian

Ngắn (≤ 1 giờ)

Trung bình (1-2h)

Hiệu suất chiết

Thấp

Trung bình hoặc cao

Cao

Dung môi

Tốn kém

Nhiệt độ

Cao hoặc nhiệt độ phòng

Tốn nhiều để duy trì áp suất cao Nhiệt độ cao áp suất cao

Chi phí

Thấp

Cao

ăm 2007, Xu

Trung bình Nhiệt độ phòng Trung bình

uaneng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ rễ Pueraria lobata bằng siêu âm (20k z, điện năng đầu vào thay đổi từ 0-650W). Tác giả nhận thấy điện năng đầu vào và thời gian chiết là các yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khi sử dụng dung môi chiết là nước, nbutanol, ethanol 96% và ethanol 50%. Dung môi chiết là ethanol 50% và nước cho hiệu suất chiết cao ethanol 95% và n-butanol. Tốc độ chiết và hiệu suất chiết tăng lên rõ rệt khi phối hợp thêm siêu âm với tất cả các dung môi chiết kể trên. ăng lượng điện đầu vào càng lớn trong khoảng 0-650W thì hiệu suất chiết đạt

9

được càng cao. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần cao hơn khi sử dụng siêu âm [41]. 1.1.5.4. Chiết bằng vi sóng ăm 2001, Zhenku Guo và cộng sự đã tiến hành chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng vi sóng. Kết quả gây bất ngờ khi thời gian chiết của phương pháp chỉ kéo dài 1 phút, ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp chiết truyền thống. Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy rằng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ và áp suất chiết là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hiệu suất chiết của phương pháp. Trong số các dung môi thử nghiệm, ethanol 70% cho là dung môi hiệu suất chiết isoflavonoid cao nhất, song để chiết puerarin thì nước lại là dung môi tốt hơn [47]. Vi sóng không chỉ giúp rút ngắn thời gian chiết mà còn làm cho quá trình cô cao trở nên nhanh chóng hơn rất nhiều. Yang Hu và cộng sự đã chứng minh được rằng, sử dụng vi sóng có thể rút ngắn thời gian sấy khô dịch chiết xuống 10 lần so với phương pháp cất thu hồi dung môi thông thường [45]. ơn nữa, sóng viba không gây ra những tác động nào làm ảnh hưởng tới cấu trúc và thành phần các chất trong dịch chiết sắn dây thu được [45]. 1.1.5.5. Chiết bằng dung môi siêu tới hạn Trong những năm gần đây chiết xuất bằng dung môi tới hạn đã được áp dụng rộng rãi trong thực phẩm và y học. CO2 siêu tới hạn là dung môi chủ yếu được sử dụng trong phương pháp này.

u điểm của CO2 siêu tới hạn là không độc, không

gây cháy nổ, giá thành rẻ và dễ loại khỏi sản phẩm cuối. Nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Pueraria lobata, Lingzhao Wang và cộng sự nhận thấy bốn yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin từ rễ củ Pueraria lobata là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích đồng dung môi. Ở áp suất 20 Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 ± 0,3 mg/g, áp suất cao hơn và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin. Tương tự như vậy, chiết ở nhiệt độ 50C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều làm giảm hiệu suất. Thời gian chiết càng lớn, khả năng chiết kiệt puerarin càng cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới 100 phút. Hiệu suất chiết puerarin 10

tăng lên không rõ rệt khi kéo dài thời gian hơn 100 phút. Điều này có thể giải thích do độ tan của puerarin trong dung môi tới hạn và tốc độ chuyển khối đều là các yếu tốt phụ thuộc vào thời gian. Do vậy, thời gian chiết xuất càng lớn sẽ giúp hòa tan được nhiều dược chất vào dung môi chiết hơn, và do đó tăng hiệu suất chiết lên. Đồng dung môi được sử dụng là ethanol tuyệt đối.

gười ta thấy rằng

hiệu suất chiết puerarin sẽ đạt giá trị tối đa khi thêm một lượng xác định ethanol (120 g) [26]. Từ những kết quả kể trên, các tác giả đã thực hiện tối ưu hóa và tìm được điều kiện chiết puerarin tối ưu từ rễ củ Pueraria lobata bằng dung môi siêu tới hạn ở 20,04 Mpa, 50,24C và thể tích đồng dung môi sử dụng là 181,24 ml ethanol trong tổng khoảng thời gian chiết là 90 phút [27]. 1.1.5.6. Chiết bằng dung môi ion Dung môi ion lỏng là dạng muối nóng chảy do trong thành của nó có cả cation và anion ở dạng không phân ly. Phần cation thường là các cation hữu cơ [38]. Dung môi ion lỏng có nhiệt độ nóng chảy khá thấp, thường là dưới 100°C và thường ở dạng lỏng ở nhiệt độ phòng [38]. Trong chiết xuất hiện đại, dung môi ion lỏng được sử dụng thay thế cho các dung môi hữu cơ thông thường nhờ tính chọn lọc cao hơn các dung môi phân cực như nước, methanol; chiết được các phân tử hữu cơ phức tạp như cyclodextrins, glycolipid, kháng sinh, artermisinin và alkaloid …; dễ dàng rửa sạch hoặc loại đi khỏi sản phẩm chiết cuối [38]. Tuy nhiên, dung môi ion lỏng có nhược điểm là trong quá trình chiết xuất, một lượng lớn dung môi ion lỏng kỵ nước có thể bị lẫn nước tạo thành hệ hai pha dung môi ion/nước làm thay đổi độ nhớt, tỷ trọng, giảm dung lượng chiết và tính chọn lọc của dung môi trong quá trình chiết [18], [ 38]. Để hạn chế nhược điểm này, Jie-Ping Pan và cộng sự đã tạo ra các hệ dung môi hai pha thân nước để chiết puerarin từ rễ Pueraria lobatae từ các dung môi ion 1-carboxymethyl-3methylimidazolium tertrafluoroborat ([COOHMIM]BF4), 1-hydroxyethyl-3methylimidaziolium

tertrafluoroborat 11

([C2OHMIM]

BF4),

1-butyl-3-

methylimidazolium hydroxid ([BMIM]OH) và 1-butyl-3-methylimidazolium bromua ([BMIM]Br) với các muối vô cơ K2CO3, Na2CO3, K2HPO4, (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, NaH2PO4. Trong các hệ hai pha dung môi ion khảo sát, hệ K2HPO4 0,30-0,42 g/mL, [BMIM]Br 0,30-0,36 g/ml và 1,0 ml dung dịch gốc puerarin, cho hiệu suất chiết puerarin cao nhất đạt trên hơn 99% với một lần chiết duy nhất [18]. Lợi dụng ưu điểm của phương pháp chiết bằng siêu âm và phương pháp chiết bằng dung môi ion, Jie-Ping Pan và cộng sự tiếp tục nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sấy khô Pueraria lobata với các dung môi ion [BMIM]Br, [BMIM]BF4, [C2OHMIM]Cl, [C2OHMIM]BF4, [COOHMIM]BF4 kèm siêu âm. Sử dụng phương pháp phân tích mặt đáp để đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất. Kết quả chiết xuất tối ưu thu được với 0,43g dược liệu trong 10ml dung môi ion [BMIM]Br 1,06 mol/L, siêu âm trong 27,43 phút ở 480W [19]. 1.2. Puerarin 1.2.1. Công thức hóa học



Công thức phân tử [33]: C21H20O9



Tên khoa học: 7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4, 5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]chromen-4-one [33]



Tên khác: Kakonein, 3681-99-0, 8-(beta-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one,AC1NQZ4N, SureCN8581666, MLS002473178 [33].

1.2.2. Tính chất lý hóa

12

1.2.2.1. Lý tính: Puerarin là một isoflavonoid tự nhiên, được tìm thấy trong rễ sắn dây Pueraria lobata và Pueraria thomsonii. Về độ tan, puerarin: 

Ít tan trong nước, aceton, độ tan trong nước tăng lên khi tăng nhiệt độ [39].



Tan được trong ethanol, độ tan giảm khi tăng nhiệt độ [39]. Khi thêm một lượng nhỏ dung dịch CO2 siêu tới hạn vào dung dịch ethanol sẽ làm tăng độ tan của puerarin. ong khi vượt qua giới hạn này, việc thêm CO2 siêu tới hạn lại làm độ tan của puerarin giảm mạnh [28]. Độ tan của puerarin trong hỗn hợp ethanol + CO2 siêu tới hạn tăng lên khi tăng nhiệt độ [28]



Tan được trong hỗn hợp methanol – acid acetic, độ tan phụ thuộc vào nhiệt độ và tỷ lệ của acid acetic trong hỗn hợp. Tăng nhiệt độ làm tăng độ tan, ngược lại tăng thể tích acid acetic trong hỗn hợp làm giảm độ tan của puerarin trong hỗn hợp dung môi [12].

1.2.2.2. Hóa tính: Do cấu trúc phân tử của puerarin có một nhóm carbonyl (>C=O) và 6 nhóm hydroxyl (−O ) trong đó có 2 nhóm hydroxyl phenol nên puerarin có thể  Tạo liên kết hydro với các hợp chất có nhóm carbonyl và hydroxyl khác  Thể hiện tính acid của 2 nhóm −O phenol Vì vậy, puerarin có thể tan trong các dung dịch kiềm và acid mạnh [18]. 1.2.3. Kỹ thuật phân tích ăm 2007, để xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong rễ củ sắn dây nhanh chóng, chính xác Chen Sibao và cộng sự đã tiến hành đánh giá và so sánh độ chính xác của phương pháp đo V với phương pháp

LC. Quét phổ dung

dịch chuẩn của 7 loại isoflavonoid thường gặp và chiếm hàm lượng lớn trong rễ sắn dây, các tác giả nhận thấy rằng chỉ trừ genistin có cực đại hấp thụ ở 260nm còn 6 isoflavonoid còn lại đều có cực đại hấp thụ tại 250nm. Nồng độ isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ củ sắn dây tươi được định lượng theo phương pháp đo

V

bằng cách so sánh với mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn puerarin có nồng độ từ 4,77 – 12,72µg/ml. Kết quả cho thấy, hệ số tương quan khi định lượng 13

isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang với khi định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao là 0,975. Điều này chứng tỏ, kết quả định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang ở 250nm là tương quan với kết quả khi định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [11]. Cùng thời gian này, Xu Huaneng và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ củ sắn dây nhờ tác dụng của siêu âm.

àm lượng isoflavonoid trong mẫu thử được

ngoại suy từ đường chuẩn của dung dịch puerarin [41]. ăm 2008, trong nghiên cứu so sánh khả năng chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng cách sử dụng siêu âm và bằng cách dùng vi sóng Yang Hu và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng isoflavonoid trong các dịch chiết thu được. Dịch chiết isoflavonoid toàn phần được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi đo quang ở 250nm. Nồng độ isoflavonoid trong mẫu thử được tính toán từ đường chuẩn puerarin [45]. hư vậy, để định lượng isoflavonoid toàn phần từ dịch chiết hoặc trong nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm, so sánh với đường chuẩn của dung dịch puerarin. Kết quả định lượng bằng phương pháp này có độ chính xác cao, phương pháp tiến hành nhanh chóng, đơn giản. Để định lượng riêng từng hoạt chất hoặc đánh giá kết quả của quá trình tinh chế, phương pháp

V không còn có thể sử dụng được, lúc này

LC là phương

pháp thích hợp hơn cả. ăm 2001 Chen Bin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xây dựng hương pháp

LC đơn giản, nhanh chóng và có độ nhạy cao dùng để định lượng puerarin

và daidzin trong Pueraria lobata. Isoflavonoid toàn phần chiết được từ P.lobata bằng ethanol 70%, vi sóng trong 2 phút. Phân lập bằng cột Symmetry 18. Thời gian lưu của puerarin và daidzin là 4,38 phút và 8,15 phút. Đường chuẩn trong khoảng 0,115 ~ 1,38µg/ml có R=0,9991 đối với puerarin và trong khoảng 0,12 ~ 1,44 µg/ml

14

có R=0,9998 đối với daidzin. Phần trăm tìm lại trung bình khoảng 103,31% với hệ số phân tán CV=1,37% puerarin và 98,73% với CV=2,43% daidzin [10]. Để tách và định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii, Zhou Hong-Ying và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký pha đảo RP-HPLC với cột Diamosil TM C18 (4,6 mm x 150 mm, 5µm) và gradient rửa giải, pha động là methanol – 1% dung dịch acid acetic băng. Tốc độ dòng 1ml/phút. Bước sóng phát hiện ở 250nm, nhiệt độ cột 25C. Các tác giả nhận thấy rằng cả ba hợp chất đều có đường chuẩn với hệ số tương quan tốt (r > 0,9995) và phần trăm tìm lại trong khoảng 99,0% - 101,6%. Hàm lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân cao hơn trong lá. Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương pháp sắc ký pha đảo xây dựng được có độ nhạy cao và có thể sử dụng để sử dụng để định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii [48]. ăm 2008,

an Chen và cộng sự đã xây dựng được phương pháp

LC khá

đơn giản và chính xác để xác định hàm lượng puerarin trong rễ Pueraria lobata. Sử dụng cột sắc ký C18, pha động là methanol/nước (25:75), detector UV ở bước sóng 250nm. Kết quả cho thấy mối quan hệ tương quan chặt chẽ giữa nồng độ puerarin và mật độ quang trong khoảng 20 ~ 140µg/ml (r=0,9999). Phần trăm tìm lại là 97,40%, RSD = 3,0% [29]. 1.2.4. Tác dụng sinh học của puerarin 1.2.4.1.

Tác dụng trên tim mạch

Gần đây có rất nhiều báo cáo đã xác minh tác dụng giãn mạch của puerarin trên chuột. Tác dụng giãn mạch của puerarin trên động mạch chủ ngực của chuột do hoạt hóa điện áp dẫn lớn và kênh kali canxi kích hoạt đóng vai trò quan trọng trong điều hòa nhịp tim. Hoạt động của kênh kali canxi kích hoạt gây ra hiện tượng ưu phân cực trên màng tế bào. Tác dụng thư giãn nội mạc nguyên vẹn của vòng động mạch chủ ở chuột đã bị làm hẹp trước đó bởi phenylephrine (10-9 – 10-6) hoặc KCl (10 – 100 mM) của

15

puerarin (50, 150 và 450µM) không phụ thuộc vào nồng độ. Tuy nhiên, tác dụng thư giãn này không quan sát thấy ở vòng động mạch chủ của chuột đã bị loại bỏ lớp nội mạc, điều này chỉ ra rằng tác dụng giãn mạch của puerarin phụ thuộc vào hoạt động của lớp nội mạc. Ngoài ra, tác dụng chống co mạch của puerarin đối với phenylephrine hoàn toàn bị vô hiệu hóa bởi dung dịch Ca2+ tự do. Điều này có nghĩa là tác dụng chống co mạch của puerarin liên quan đến việc kích hoạt dòng Ca2+ từ ngoại bào đi vào nội mô [43]. Puerarin bảo vệ tim mạch qua kênh natri và calci dạng L ở chuột lang và tế bào cơ tâm thất ở chuột. Tác dụng bảo vệ tim mạch của puerarin chống lại các tổn thương do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu ở tế bào cơ tâm thất ,.;m/thông qua việc hoạt hóa các kênh kali nhạy cảm ATP ở ti thể và ức chế việc mở kênh vận chuyển trên màng ti thể. Ở tim chuột cô lập đã được sử dụng puerarin (0,24 mmol/L) trước khi gây thiếu máu cục bộ, việc sản xuất formazan được tăng cường và giảm giải phóng lactat dehydrogenase. Tuy nhiên tác dụng này bị mất khi điều trị paxilline 1µmol/L (tác nhân block kênh kali canxi hoạt hóa) [43]. Puerarin có thể làm phục hồi sự biểu hiện mRNA của yếu tố tăng trưởng biến đổi tim 1 và

AD3 đồng thời giảm sự biểu hiện mRNA ở SMAD7 tim trên

chuột tăng huyết áp tự phát. Các SMAD là các protein nội bào vận chuyển tín hiệu từ yếu tố tăng trưởng biến đổi  trong tế bào, SMAD3 là loại SMAD kiểu receptor còn

AD7 là

AD đối kháng. Các thay đổi biểu hiện gen này sẽ giúp cải thiện

phì đại và xơ hóa cơ tim, đó có thể là cơ chế bảo vệ cơ tim của puerarin [43]. 1.2.4.2.

Giảm đau, hạ sốt

Tiêm màng bụng cho chuột dung dịch puerarin (25-200µM) làm giảm nhiệt độ cơ thể và nồng độ IL-1, TNF-. IL-6, prostaglandin E2 và NO, và chặn sự hoạt hóa NF-B và sự phosphoryl hóa MAPKs gây ra bởi LPS 100 µg/kg) ở chuột, chứng tỏ rằng tác dụng hạ sốt của puerarin liên quan tới việc điều chỉnh hoạt động tổng hợp và giải phóng các chất gây sốt nội sinh thông qua ức chế hoạt động của NF-B và con đường MAPK [43]. 1.2.4.3.

Chống viêm

16

Đặc tính chống viêm của puerarin đã được xác minh trên mô hình tai chuột phù và một vài mô hình tế bào viêm. Puerarin tác dụng không phụ thuộc liều ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa và giáng hóa của inhibitor-B và chuyển vị của hạt nhân NF-B p65 subunit, làm ngăn cản quá trình biểu hiện protein và mRNA của protein phản ứng C với LPS kích thích tế bào máu đơn nhân ngoại biên. uerarin ngăn chặn sự biểu hiện của protein phản ứng C, iNOS, và cyclooxygenase-2, ức chế đường tín hiệu NF-B ở tế bào RAW264,7 có LPS hoạt động và ngăn chặn rõ rệt sự biến đổi hình thái của lipopolysaccharid ở tế bào RAW264,7. Ngoài ra, sự biểu hiện mRNA ở NF-B p65 trong tế bào và nồng độ đại thực bào protein viêm 2 và TNF- trong tế bào nổi đã bị ức chế bởi việc sử dụng puerarin trước đó [43]. 1.2.4.4.

Chống oxy hóa

Puerarin thu dọn cả các anion superoxid tạo ra bởi ánh sánh riboflavin và gốc hydroxyl sinh ra từ phản ứng Fenton, làm giảm phản ứng oxi hóa tán huyết hồng cầu và nồng độ malondialdehyd tạo ra từ H2O2 trong tế bào hồng cầu, sửa chữa những biến đổi trên LDL gây ra bởi tia cực tím và đồng II sulfat, cho thấy tác dụng chống peroxy hóa và tiềm năng sử dụng để phòng ngừa vữa xơ động mạch của puerarin. uerarin ngăn cản quá trình oxi hóa LDL gây ra bởi ion Cu2+ trên invitro, tăng sản xuất prostacyclin huyết tương và DL, ức chế kết tụ và bám dính tiểu cầu, ngăn chặn quá trình hình thành cục nghẽn. Ngoài ra puerarin còn có tác dụng làm giảm sản xuất LDL và cholesterol toàn phần, do đó làm tăng sản xuất HDL trên mô hình thỏ tăng lipid. 1.2.4.5.

Tác dụng kiểu estrogen

Puerarin vẫn thường được biết đến như là một phytoestrogen bởi tác dụng kiểu estrogen của nó trên nhiều mô hình động vật. Tiêm ngắn hạn puerarin (0,7 mg/kg) làm tăng số lượng các tuyến tử cung ở chuột chưa trưởng thành và tiêm kéo dài puerarin (7 mg/kg) làm tăng rõ rệt tỷ lệ phần trăm các tế bào sừng hóa ở chuột cái trưởng thành, điều này chứng tỏ puerarin có tác dụng kiểu estrogen. Sử dụng puerarin đường uống trong 3 tháng làm tăng cả áp lực bàng quang và niệu đạo, giảm béo phì và tăng cường trọng lượng tử cung ở chuột. Các tác dụng này của puerarin 17

đều tương đương hoặc yếu hơn 17-estradiol (E2). Những kết quả này chứng tỏ rằng puerarin có thể giúp cải thiện tình trạng bế niệu, mang lại những lợi ích đáng kể trong điều trị các rối loạn do mãn kinh. uerarin làm tăng rõ rệt cân nặng, IGF-1 và biểu hiện C3 và nồng độ chất chống oxy hóa trong huyết thanh, đồng thời làm giảm nồng độ melondialdehyd và tổn thương D A ở tế bào lympho trên chuột, chứng tỏ rằng puerarin có tác dụng trên tử cung và có thể là một tác nhân trị liệu có hiệu quả trong việc chống tăng sản nội mạc tử cung và hội chứng tiền kinh nguyệt. 1.2.4.6.

Ức chế các rối loạn do rượu

Khả năng sống của tế bào, sự tích lũy lipid bên trong tế bào ở các tế bào gan ủ ethanol đã được khôi phục về bình thường sau khi điều trị bằng puerarin. Ngoài ra, puerarin còn kích thích quá trình phosphoryl hóa AMPK, và block các protein ribosome S6 và protein 4E-binding là những protein mục tiêu ở động vật có vú của rapamycin (mammalia targets of rapamycin - mTOR), phục hồi cơ chế tự tiêu hủy ở các tế bào sản xuất ethanol. Những kết quả này chỉ ra rằng cơ chế bảo vệ của puerarin có liên quan đến con đường AMPK/mTOR. Trong tế bào mô đệm tủy xương gây ngộ độc bằng rượu, puerarin ức chế tăng sinh số lượng tế bào mỡ, ức chế sản xuất triglycerid và tăng cường hoạt động của phosphatase kiềm, osteocalcin và biểu hiện mRNA của osteocalcin. Điều đó cho thấy puerarin có tác dụng phòng ngừa các rối loạn liên quan tới nghiện rượu [43]. 1.2.4.7.

Chống tiểu đường và ức chế các biến chứng tiểu đường

uerarin đã được sử dụng để điều trị đái tháo đường ở Trung Quốc từ những năm 1990. Tiêm tĩnh mạch puerarin giúp làm hạ đường huyết, tăng mR A và tăng biểu hiện protein vận chuyển glucose trong cơ, kích thích tuyến thượng thận tăng tiết -endorphin, làm giảm đường huyết ở chuột bị gây tiểu đường bởi streptozotocin. Ở chuột đực Sparague-Dawley được cho ăn với chế độ ăn giàu chất béo, các dấu hiệu như tăng trọng lượng cơ thể và giảm glucose dung nạp/tăng đề kháng insulin đã giảm, sự tăng nồng độ resistin và leptin huyết tương cũng được ngăn chặn khi điều trị bằng puerarin (100 và 20 mg/kg) [43].

18

uerarin giúp tăng cường đáng kể sự hấp thu glucose vào các tế bào nhạy cảm insulin, giảm lượng đường trong máu, triglycerid, insulin, cholesterol toàn phần và trọng lượng cơ thể ở chuột Zucker béo phì và chuột mắc tiểu đường type 2 theo di truyền. Sự chuyển hóa glucose và insulin được cải thiện đáng kể ở nhóm chuột được thêm puerarin sắn dây vào chế độ ăn hằng ngày [43]. 1.2.5. Các nghiên cứu tinh chế puerarin hiện nay 1.2.5.1.

Tinh chế bằng sắc ký

Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Các kỹ thuật sắc ký thường dùng là sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, sắc ký cột… u điểm của phương pháp sắc ký là tách được nhiều hoạt chất với độ tinh khiết cao. ăm 1999, Xueli Cao và cộng sự đã sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao với hệ dung môi ethyl acetat – n-butanol – nước theo tỷ lệ 2:1:3 (v/v/v) tách được ngay 6 hợp chất tinh khiết từ 80 mg dịch chiết trong lần chạy sắc ký đầu tiên. Các hợp chất tinh chế được gồm 3’-hydroxyl-puerarin, puerarin, 3’methoxy-puerarin, puerarin-xylosid, puerarin-xylosid, daidzin. Các chất tinh chế được có độ tinh khiết cao trên 90%, đáng kể nhất là puerarin có độ tinh khiết trên 98% [42]. ăm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên epichlorohydrin gắn ligand -cyclodextrin.

ha động là dung dịch acid acetic

10%. Dung lượng phân tích khoảng 1,2 mg dịch chiết. uerarin thu được có độ tinh khiết khoảng 98% [40]. Có thể thấy, phương pháp sắc ký tách hoạt chất với độ tinh khiết cao (>90%) từ một lượng rất nhỏ dịch chiết (<100mg). hương pháp này thích hợp để tinh chế ra chất chuẩn cho định lượng nhưng với lượng mẫu nhỏ khó triển khai trên quy mô lớn. 1.2.5.2.

Tinh chế bằng biện pháp thay đổi dung môi

19

Mặc dù phương pháp tinh chế bằng sắc ký cho ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao song chỉ thực hiện với cỡ mẫu nhỏ, chi phí tốn kém chủ yếu dùng nghiên cứu thành phần của dược chất hơn là tinh chế sản xuất trên quy mô công nghiệp. Và do vậy, bên cạnh phương pháp sắc ký người ta luôn phải nghiên cứu tìm ra các phương pháp tinh chế hoạt chất khác rẻ tiền, dễ triển khai trên quy mô lớn với mức độ tinh khiết chấp nhận được. hương pháp đơn giản nhất có thể kể đến đó là phương pháp của HuaNeng Xu và cộng sự. Chiết rễ củ sắn dây Pueraria lobata bằng hỗn hợp dung môi n-butanol/nước (1:1) ở 25C trong 6 giờ. Dịch chiết thu được để lắng cho tách pha thu lấy phần nước để tinh chế puerarin (daidzein phân bố chủ yếu ở pha n-butanol). Phần dịch này được lắc với n-butanol trong 1 giờ, sau đó điều chỉnh pH của pha nước bằng acid HCl về 4,0, lúc này puerarin sẽ chuyển sang pha nbutanol. Thu lấy pha n-butanol, tiếp tục lắc với đồng thể tích nước trong 1 giờ, pH của pha nước được điều chỉnh về giá trị 8,0. Lúc này puerarin lại chuyển sang pha nước. Thu lấy phần chiết nước. Phân tích HPLC cho thấy sau 2 lần chuyển pha puerarin thu được tương đối tinh khiết [16]. Tại Việt Nam, tinh chế puerarin từ dịch chiết sắn dây chưa được quan tâm nghiên cứu mặc dù đây là thành phần chiếm hàm lượng lớn và cho tác dụng sinh học chủ đạo của sắn dây. Hiện tại chỉ có duy nhất nghiên cứu của Dược sĩ Lê Thùy Linh đã tiến hành tinh chế được daidzein bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi CCl3 : Methanol (98:2) [5]. 1.3. Cao thuốc 1.3.1. Khái niệm Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp[2]. 1.3.2. Phân loại Theo thể chất, cao thuốc được chia làm 3 loại:

20

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc. Cao đặc: Là khối đặc quánh.

àm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao

không quá 20%. Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5% [2]. 1.3.3. Kỹ thuật điều chế Quy trình điều chế cao khô gồm những giai đoạn sau: 1.3.3.1. Chuẩn bị dung môi, dược liệu

Dược liệu thường được sấy khô, chia nhỏ đến kích thước thích hợp. Một số dược liệu đặc biệt cần diệt enzym hoặc loại chất béo. Dung môi điều chế cao thường là nước, ethanol, ete ethylic. Để làm tăng độ tan của hoạt chất có thể acid hóa hoặc kiềm hóa dùn môi bằng acid hydrochloric, acid acetic, amoniac, natri hydroxyd. 1.3.3.2. Chiết xuất hoạt chất

Tùy theo bản chất dược liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm cũng như điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất, có thể sử dụng các phương pháp: Ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng hay các phương pháp thích hợp khác. 1.3.3.3. Loại bớt tạp chất Cần phải loại tạp chất vì chúng thường dễ phân hủy ảnh hưởng đến chất lượng cao thuốc. Trường hợp điều chế cao đặc, cao khô, nếu hàm lượng hoạt chất chưa đủ quy định cũng có thể cũng có thể tiến hành loại bớt tạp chất. 1.3.3.4. Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao thuốc thường phải tiến hành loại dung môi. Dịch chiết được cô đặc đến tỷ lệ dung môi quy định, với cao đặc và cao khô thì sau khi cô đặc,

21

sấy đến độ ẩm không quá 20% đối với cao đặc và không quá 5% đối với cao khô. 1.3.3.5. Xác định và điều chỉnh tỷ lệ hoạt chất.

Đối với cao thuốc có quy định hàm lượng, sau khi điều chế phải định lượng hoạt chất, nếu chưa đạt phải điều chỉnh để cao có tỷ lệ hoạt chất đúng quy định. 1.3.3.6. Hoàn chỉnh chế phẩm

Thêm các chất bảo quản chống nấm mốc như acid boric, natri benzoat, nipagin, nipasol. Việc thêm chất bảo quản vào cao thường được thực hiện ở cuối giai đoạn cô đặc [1]. 1.3.4. Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc Cảm quan: Cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định. Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao. Mất khối lượng do làm khô: Thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%. Các chỉ tiêu khác: Độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng… [2].

22

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu a. Củ sắn dây tươi và khô thu ở Phú Thọ, Hải Dương, inh Bình. Dược liệu tươi đem rửa sạch, thái lát rồi xay thô trước khi đem vào chiết xuất. b. Chất đối chiếu: Puerarin 82,31% (Trung Quốc).

c. Hóa chất: Bảng 2.1. óa chất sử dụng STT Hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Ethanol 96% Việt Nam

DĐV IV

2

Cloroform

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

3

Ethyl acetat

Trung Quốc

Công nghiệp

4

Methanol

5

ước cất

erck (Đức) Phân tích; HPLC ước tự cất

2.1.2. Dụng cụ  Bình cầu 100 ml, 500 ml, 1000 ml.  Cốc thủy tinh loại 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.  Bình định mức 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml.  Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.  Ống đong 10 ml, 300 ml, 500 ml.  Màng lọc cellulose acetat 0,45 μm ( atorius).  Bản mỏng silicagen GF254.  Bình hút ẩm. 2.1.3. Phương tiện và máy móc 

áy siêu âm ltrasonic LC 60 (Đức).

 Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).

23

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).  Cân kỹ thuật artorius B 2001 (Đức). 

áy đo quang ITACHI U-1900.

 Đèn tử ngoại.  Tủ sấy

E

ERT (Đức).

 Máy xay búa.  Máy xay sinh tố.  Hệ thống lọc hút Buchner.  Cân xác định hàm ẩm nhanh Precisa XM 60 (Thụy ĩ). 

áy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA V

(Đức).

 Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou Jinqiao, Trung Quốc) công suất 5 L/giờ.  Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao himadzu ( hật Bản), gồm: + Bộ phân loại khí DGU – 14A + Bơm cao áp LC – 10ADVP + Buồng chứa cột CTO – 10AVP + Bộ điều khiển SCL – 10AVP + Detector dãy diod quang SPD – M10AVP + Phần mềm Class vp 6.14. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô  Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin trong sắn dây khô  Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô  Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp 2.2.2. Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi  Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin trong sắn dây tươi  Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi  Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp: sử dụng nhiệt độ, sử dụng ethanol, kết hợp cả ethanol và nhiệt độ.

24

2.2.3. Điều chế cao khô  Điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy  Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao khô 2.2.4. Phân lập puerarin và daidzin  Phân lập daidzin và chứng minh cấu trúc sản phẩm  Phân lập puerarin và chứng minh cấu trúc sản phẩm 2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin 2.3.1.1. Định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang Qua tham khảo các tài liệu [11], [41], [45] chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần trong dược liệu và trong dịch chiết bằng quang phổ hấp thụ V như sau. Cân chính xác khoảng 12,1 mg chất đối chiếu (chứa 82,31% puerarin) tương đương với khoảng 10,0 mg puerarin hòa tan trong khoảng 20ml ethanol 96%, sau đó chuyển vào bình định mức 50ml. Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch A. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 25 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều được dung dịch chất đối chiếu có hàm lượng puerarin khoảng 8µg/ml. Lọc qua màng 0,45µm, quét phổ để chọn ra bước sóng thích hợp cho định lượng. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 20,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch B. Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 µg/ml theo như bảng sau: Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml) Vdung dịch B (ml)

1,6

3,2

4,8

6,4

8,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

Vethanol 96% (ml)

8,0

6,0

4,0

2,0

0

Vnước cất (vđ)

50,0

50,0

50,0

50,0

50,0

25

Mẫu trắng là dung dịch ethanol 19,2% (10ml dung dịch ethanol 96% pha loãng với nước cất vừa đủ 50ml). Mẫu trắng và mẫu chuẩn sau khi pha được lọc qua màng 0,45µm, đo độ hấp thụ tại bước sóng đã chọn, đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đường chuẩn. Với mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 100 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 500 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 100 ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử. Với mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 0,4 g dược liệu, thêm 40 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 50 ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử. Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao xác định hàm lượng, hòa tan bằng ethanol 96%, chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm 9,0 ml ethanol 96% và bổ sung nước cất vừa đủ, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45µm trước khi đo quang. Hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:

Trong đó

26

At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc

: Nồng độ dung dịch chuẩn

Vchiết : Thể tích dịch chiết K

: Tích các hệ số pha loãng

mt

: Khối lượng dược liệu đem vào chiết xuất.

àm lượng isoflavonoid trong cao được tính theo công thức

Trong đó At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc

: Nồng độ dung dịch chuẩn

mcao

: Khối lượng cao.

2.3.1.2. Định lượng puerarin bằng HPLC Để định lượng puerarin trong nguyên liệu, cao khô toàn phần và sản phẩm tinh chế, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Qua tham khảo các tài liệu [29], [45], [16] và quá trình khảo sát ban đầu, chúng tôi lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau:  Thông số máy sắc ký:  Bộ phân loại khí DGU – 14A  Bơm cao áp LC – 10ADVP  Buồng chứa cột CTO – 10AVP  Bộ điều khiển SCL – 10AVP  Detector dãy diod quang SPD – M10AVP  Phần mềm Class vp 6.14.  Cột sắc ký Alltech C18 với kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm 

ha động: methanol nước = 30:70, pha động được lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm trong 15 phút.

27

 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.  Thể tích tiêm mẫu: 5 µl  Detector UV phát hiện ở bước sóng 250 nm. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,125 g chất đối chiếu puerarin 82,31%. Hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch được dung dịch A. Lấy chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nước cất được dung dịch B. Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,01 mg/ml đến 0,2 mg/ml theo bảng sau: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) Vdd A (ml)

0,01

0,02

0,05

0,10

0,15

0,20

-

-

-

1

1

2

Vdd B (ml)

1

2

5

-

5

-

Vpha động vđ (ml)

10

10

10

10

10

10

Các dung dịch chuẩn này đều được lọc qua màng 0,45 µm trước khi phân tích sắc ký. Mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký. Mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký. Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,115g cao. Hòa tan trong khoảng 20ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm 28

ethanol 96% vừa đủ đến vạch. Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động, sau đó lọc qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký. àm lượng puerarin trong nguyên liệu, trong cao đặc và cao khô được tính theo công thức:

Trong đó St, Sc : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Cc

: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

V

: Thể tích chiết hoặc thể tích dung dịch ban đầu pha mẫu thử.

K

: Hệ số pha loãng

mcân : Khối lượng dược liệu, khối lượng cắn hoặc cao khô cân thực tế. 2.3.2. Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng Để tiết kiệm thời gian và chi phí trong quá trình khảo sát cũng như tinh chế, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính các thành phần có trong dịch chiết, dịch tinh chế. Tham khảo các tài liệu [2], [32] chúng tôi xây dựng phương pháp sắc ký lớp mỏng như sau  Bản mỏng: Silicagel 60F254, hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ.  Dung môi khai triển: Hệ 1: Cloroform-methanol-nước (7:2,5:0,25). Hệ 2: Cloroform-methanol (7:3).  Dung dịch thử: + Mẫu thử là dịch chiết: Lấy một thể tích dịch chiết tương đương với 1 mg isoflavonoid toàn phần, cô cách thủy đến cắn. Hoà cắn trong 1 ml ethanol. + Mẫu thử là chất chưa biết: Hòa tan trong ethanol 96% để được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml.  Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu trong methanol để có nồng độ puerarin khoảng 1 mg/ml. 29

Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. 2.3.3. Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô Hầu hết các isoflavonoid trong sắn dây đều ở dạng glycosid, chỉ có một vài chất là aglycon như daidzein, genistein. Vì vậy có thể lựa chọn dung môi phân cực để chiết isoflavonoid từ sắn dây.

u tiên chọn dung môi rẻ tiền, không độc, dễ

kiếm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau và nước. Cân xác định khối lượng cao thu được với mỗi dung môi, định lượng hàm lượng isoflavonoid và puerarin trong dịch chiết và cao thu được. Tính hiệu suất của quá trình chiết dựa vào hàm lượng isoflavonoid chiết được. Hiệu suất của quá trình chiết được tính theo công thức:

Trong đó

misoflavonoid/dl là lượng isoflavonoid có trong dược liệu đưa vào chiết misoflavonoid/cao là lượng isoflavonoid có trong cao thu được

2.3.4. Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi Nhằm tận dụng quy trình chế tinh bột từ sắn dây tươi, chúng tôi kết hợp quá trình chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi với quá trình thu tinh bột. Quy trình chiết xuất được tóm tắt theo sơ đồ trong hình 2.1. ô tả các bước tiến hành Bước 1.

Chuẩn bị nguyên liệu: Sắn dây tươi mua về được xử lý trong vòng 3

ngày, củ được rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng. Để ráo nước và cân xác định khối lượng. au đó xay mịn thành bột nhão, trước đó có thể thái thành lát để xay dễ dàng hơn. Bước 2.

Tiến hành chiết xuất: Bột nhão được hòa vào nước với tỷ lệ 1:2 (w/w)

rồi vắt loại bã bằng túi vải. Bã sắn được rửa lại một lần với lượng nước như lần một. Gộp các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn, lọc qua vải lấy phần dịch trong; đây là dịch chiết chứa isoflavonoid. Lấy 100ml dịch chiết này

30

đem cô giảm áp đến cao được được khối lượng m. Định lượng isoflavonoid toàn phần trong cao theo mục 2.3.1.1. Bước 3.

Thu tinh bột sắn: Phần tinh bột lắng xuống được rửa bằng cách thêm

nước, khuấy đều rồi lại để lắng; rửa đến khi trắng (3-5 lần) thì thu được tinh bột sắn dây. Thực hiện 3 mẫu, lấy kết quả trung bình. Củ tươi - Rửa sạch đất, vỏ đen bên ngoài - Để ráo nước Củ tươi sau rửa

Bã khô

Cân xác định khối lượng

o

Sấy ở 60 C đến khô

Xay nhỏ Bột nhão - òa vào nước - Vắt loại bã xơ

Bã ướt

Dịch sau vắt Để lắng qua đêm, gạn, lọc.

Tinh bột

Dịch chiết

ình 2.1. ơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 2.3.5. Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn dây tươi Nhằm nâng cao hàm lượng isoflavonoid trong dịch chiết và loại bớt một số tạp chất, chúng tôi tiến hành khảo sát ba phương pháp tinh chế dịch chiết: kết tủa bằng nhiệt, kết tủa bằng ethanol và sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Từ dịch gạn thu được như ở mục 2.3.4. Lấy 3 mẫu, mỗi mẫu 500 ml. Tiến hành tinh chế theo 3 phương pháp sau

31

 Phương pháp 1 (kết tủa tạp chất bằng nhiệt): Lấy 500 ml dịch chiết vào cốc 1000 ml, đun cách thủy 30 phút, để nguội qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 20 ml nước.  Phương pháp 2 (kết tủa tạp chất bằng ethanol): Cô ở áp suất giảm đến thể cao mềm, thêm 500 ml ethanol 96%, để qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 20 ml ethanol 96%.  Phương pháp 3 (kết hợp phương pháp 1 và 2) Đun cách thủy 30 phút, để qua đêm, lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 20 ml nước. Dịch lọc và dịch rửa được gộp lại, cô ở áp suất giảm đến cao mềm, thêm 500 ml ethanol 96%, để qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 20 ml ethanol 96%. Dịch chiết sau tinh chế được cô dưới áp suất giảm, ở 80oC đến thể chất cao đặc. Xác định khối lượng cao và hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong cao thu được. 2.3.6. Phương pháp điều chế cao khô Cao khô điều chế theo phương pháp cô đặc, sấy khô thường có thể chất dẻo dính, khó thu hồi, khó bảo quản, quá trình điều chế tốn nhiều thời gian. Để hạn chế những nhược điểm trên và nâng cao chất lượng cao khô bào chế được có thể sử dụng cho bào chế các dạng thuốc hiện đại, chúng tôi tiến hành điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy. Quá trình phun sấy được tiến hành tại công ty cổ phần hóa dược phẩm Việt Nam (khu công nghiệp Tiên ơn, Bắc Ninh). Quy trình điều chế cao khô gồm 2 giai đoạn được tóm tắt như hình 2.2. Giai đoạn 1: Thực hiện tại bộ môn Công nghiệp Dược Đại học Dược Hà Nội. Sắn dây tươi được rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng. Để ráo nước và cân xác định khối lượng được 11 kg. au đó xay mịn thành bột nhão, bột nhão được hòa vào 22 l nước, rồi vắt loại bã bằng túi vải. Bã sắn được rửa lại một lần với 22 l nước. Gộp dịch các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn lấy phần dịch trong; thu được 42 l dịch chiết. Dịch chiết được tinh chế bằng đun nóng ở

32

90oC trong 30 phút, để nguội qua đêm, gạn lấy dịch trong phía trên. Phần dịch lẫn tủa được lọc hút qua giấy lọc bằng hệ thống lọc Buchner. Tủa được rửa 3 lần, mỗi lần 2 l nước. Dịch chiết sau tinh chế có thể tích là 46 l. Xác định nồng độ isoflavonoid trong dịch tinh chế theo mục 2.3.1.1 và xác định khối lượng cắn theo mục 2.3.9. Giai đoạn 2: Thực hiện tại công ty cổ phần hóa dược phẩm Việt Nam (khu công nghiệp Tiên ơn, Bắc Ninh). Dịch chiết sau khi tinh chế được cô đặc bằng hệ thống cô tuần hoàn đến tỷ trọng 1,1 g/ml. Dịch chiết sau khi cô đặc đem lọc qua giấy lọc rồi tiến hành phun sấy. Điều kiện phun sấy như sau  Thiết bị: Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou Jinqiao, Trung Quốc), công suất max 5 L/giờ.  Nhiệt độ gió vào: 180°C.  Nhiệt độ gió ra: 85 - 90°C.  Tốc độ phun dịch: 4 lít/giờ. Cao khô thu được được đánh giá về một số chỉ tiêu chất lượng sau : 2.3.6.1. Thể chất của bột: Quan sát bằng mắt thường bột phun sấy thu được và nhận xét về thể chất, màu sắc, mùi và vị. 2.3.6.2. Khối lượng và hiệu suất phun sấy: Cân xác định khối lượng cao thu được và tính hiệu suất của quá trình phun sấy theo công thức sau:

Trong đó

H:hiệu suất của quá trình phun sấy (%) mcao: khối lượng cao thu được mdl: khối lượng dược liệu ban đầu

2.3.6.3. Mất khối lượng do làm khô: Tiến hành theo phương pháp ghi ở mục 2.3.10 2.3.6.4. Định lượng isoflavonoid trong cao khô: Tiến hành theo phương pháp ghi ở mục 2.3.1.1

33

Sắn dây tươi

ước

Rửa sạch, cắt bỏ phần hỏng Cân xác định khối lượng Xay thành bột nhão ước

Bột nhão ước Bã

Vắt

Bã Vắt

Dịch chiết nước

Dịch chiết

Dịch gộp Để lắng qua đêm Gạn

Tinh bột

Dịch trong Tủa

Tinh chế Dịch tinh chế Cô Dung dịch đặc (d = 1,1 g/ml) Lọc Phun sấy Cao khô ình 2.2. Quy trình điều chế cao khô

34

2.3.7. Phương pháp phân lập puerarin và daidzin uerarin và daidzin được phân lập từ dịch chiết bằng phương pháp thay đổi dung môi. Sản phẩm tinh chế được đo nhiệt độ nóng chảy, giá trị Rf và khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ như mục 2.3.8. 2.3.8. Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidzin Khẳng định cấu trúc của hoạt chất phân lập được bằng các kết hợp các phương pháp phổ: 2.3.8.1. Phổ hồng ngoại (IR)

Mẫu được nghiền với KBr và phổ hồng ngoại (IR) của sản phẩm được xác định trên máy erkin Elmer đo trong vùng bước sóng 4000 – 400 cm-1 tại Viện Hóa học – Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.8.2. Phổ khối lượng (ESI-MS)

Sử dụng máy Varian 320 Ms (Mỹ), nguồn ion hóa ESI tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam để xác định phổ khối lượng va chạm điện tử của các mẫu tinh chế được, đọc và biện giải phổ chứng minh cấu trúc. 2.3.8.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ carbon 13 (13C-NMR)

Sử dụng máy cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao 500MHz, BRUKER AVANCE 500 tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam để đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ carbon 13 (13C-NMR) của các mẫu tinh chế được. Đọc và biện giải phổ chứng minh cấu trúc hợp chất tinh chế được. 2.3.9. Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết

Lấy chính xác 100 ml dịch chiết, cất quay 95oC đến thể chất cao mềm, cân xác định khối lượng cao được a g. Lấy một phần cao để xác định mất khối lượng do làm khô được kết quả h%, từ đó tính ra khối lượng cắn chiết được theo công thức:

35

Trong đó W: là khối lượng cắn chiết được (g). a: là khối lượng cao mềm tương ứng với 100 ml dịch chiết (g). h: mất khối lượng do làm khô của cao mềm (%). V: thể tích dịch chiết thu được (ml). 2.3.10. Phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô

Cho cốc cân đã rửa sạch vào trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050C ± 20C trong 1 giờ. Sau đó chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phòng, cân xác định được khối lượng cốc mc. Chuyển mẫu thử vào cốc cân, cân được khối lượng mbđ. Cho cốc đựng mẫu vào trong tủ sấy, sấy tại nhiệt độ 1050C ± 20C. Sau đó chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội đến nhiệt độ phòng, cân xác định khối lượng. Cho lại mẫu thử vào tủ sấy và tiến hành như trên cho tới khi mẫu thử đạt khối lượng không đổi a.

ẫu thử được coi là đạt khối lượng không đổi, khi chênh lệch giữa 2 lần cân

liên tiếp không lớn hơn 0,1% so với khối lượng mẫu thử cân ban đầu đối với mẫu thử có khối lượng cân ban đầu là 50g và không được lớn hơn 0,05% đối với mẫu thử có khối lượng cân ban đầu là 2g. Thời gian giữa hai lần sấy liên tiếp không được nhỏ hơn ½ thời gian sấy lần đầu. Độ ẩm của mẫu thử được tính theo công thức:

Trong đó mbđ : khối lượng mẫu ban đầu và cốc mc : khối lượng cốc đã làm khô a : khối lượng mẫu và cốc sau khi sấy tới khối lượng không đổi

36

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Định lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu 3.1.1. Đường chuẩn isoflavonoid Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch puerarin nồng độ 8 µg/ml trong vùng bước sóng 200 đến 400 nm, thu được phổ hấp thụ như hình 3.1.

Hình 3.1. hổ V-VI của dung dịch chất đối chiếu Hình dạng phổ phù hợp với kết quả đã được công bố [35]. Hình ảnh phổ cho thấy có 2 cực đại hấp thụ tại bước sóng 250 nm và 307 nm. Từ kết quả trên và tham khảo các tài liệu [11], [41], [45] chúng tôi chọn bước sóng 250 nm là bước sóng đo quang trong các phép định lượng isoflavonoid toàn phần sau này. Pha dãy dung dịch puerarin có nồng độ 1,6; 3,2; 4,8; 6,4 và 8,0 µg/ml như mục 2.3.1.1 rồi tiến hành đo quang tại bước sóng 250 nm. Giá trị mật độ quang của dãy dung dịch đối chiếu được ghi trong bảng 3.1. Bảng 3.1.

ật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm.

Nồng độ puerarin (µg/ml)

1,6

3,2

4,8

6,4

8,0

Mật độ quang

0,133

0,289

0,427

0,566

0,715

37

Mật độ quang

0.9

y = 0,0901x - 0,0063 R² = 0,9996

0.7 0.5 0.3 0.1 0

2

4

6

8

10

Nồng độ (µg/l) ình 3.2. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ quang Hệ số tương quan R2 = 0,9996 ( 1) cho thấy nồng độ puerarin và mật độ quang có sự phụ thuộc tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 1,6 – 8,0 µg/ml tại bước sóng 250nm. Các isoflavonoid có trong rễ củ sắn dây trừ genistin đều có hấp thụ cực đại tại 250nm (dung môi ethanol 30%), trong đó puerarin là isoflavonoid chiếm chủ yếu trong thành phần rễ sắn dây. Do đó có thể sử dụng puerarin làm chất chuẩn so sánh trong định lượng isoflavonoid toàn phần bằng đo quang ở 250 nm 3.1.2. Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu àm lượng isoflavonoid trong sắn dây phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thời gian và địa điểm thu hoạch, sơ chế, bảo quản,…Vì vậy, xác định hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu khô trước nghiên cứu sẽ góp phần định hướng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu đưa vào nghiên cứu. àm lượng isoflavonoid trong sắn dây được xác định bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 250nm như mục 2.3.1.1. Mẫu đối chiếu có nồng độ 4µg/ml. Nguyên liệu được thu mua từ ba nơi khác nhau là Ninh Bình (NL1), Hải Dương (NL2) và Phú Thọ (NL3), định lượng isoflavonoid trong các nguyên liệu này thu được kết quả như bảng 3.2.

38

Bảng 3.2. Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu Mẫu thử NL 1

Mẫu thử NL2

Mẫu thử NL3

Khối lượng mẫu (g)

10,0

10,0

10,0

àm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu (%)

0,231

0,398

0,582

Khối lượng mẫu (g)

0,4

0,4

0,4

àm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu (%)

0,623

0,812

1,054

Mẫu Nguyên liệu tươi Nguyên liệu khô

Kết quả cho thấy hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu khác nhau nhiều giữa các địa phương. guyên liệu từ Phú Thọ cho hàm lượng isoflavonoid cao nhất, đạt 0,582% (theo tươi) và 1,054 (theo khô) gấp 2,5 lần so với hàm lượng isoflavonoid trong sắn dây tươi thu mua ở Ninh Bình (0,231 và 0,623), và gấp gần 1,5 lần so với hàm lượng isoflavonoid trong sắn dây ở Hải Dương (0,398 và 0,812). Từ kết quả trên, chúng tôi chọn nguyên liệu sắn tươi thu mua từ Phú Thọ là nguyên liệu đưa vào nghiên cứu. Đậu nành là nguyên liệu chiết xuất các isoflavonoid có tác dụng kiểu estrogen khá phổ biến hiện nay, tuy nhiên so với kết quả định lượng isoflavonoid từ sắn dây ở trên có thể thấy hàm lượng isoflavonoid trong đậu nành (0,1-0,3%) [36] thấp hơn rất nhiều. Do vậy, nếu có thể xây dựng được thành công phương pháp chiết xuất isoflavonoid và tinh chế puerarin từ sắn dây, sẽ góp phần gia tăng nguồn nguyên liệu và phương pháp chiết isoflavonoid trong nước. 3.2. Định lượng puerarin trong nguyên liệu Pha dãy dung dịch puerarin có nồng độ 0,01; 0,02; 0,1; 0,15; 0,20 mg/ml như mục 2.3.1.2 và phân tích HPLC ở 250nm thu được kết quả như sau Bảng 3.3. Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn Nồng độ (mg/ml)

0,0103

0,0206

0,0514

0,1029

0,1543

0,2058

Spic

151175

283710

763851

1451805

2138399

2968977

39

3000000

y = 14226x + 88.251 R² = 0.999 2000000

1000000

0

0

50

100

150

200

250

µg/ml

ình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic sắc ký Từ đồ thị thu được có thể thấy, diện tích pic sắc ký với nồng độ puerarin có mối quan hệ tuyến tính trong khoảng 0,01 – 0,2 mg/ml (hay 10 – 200 µg/ml). Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Man Chen và cộng sự [30]. Định lượng puerarin trong nguyên liệu khô và tươi thu mua từ Phú Thọ, chúng tôi thu được kết quả như sau. Bảng 3.4. àm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở hú Thọ Nguyên liệu àm lượng puerarin (%)

Khô

Tươi

0,5640

0,2130

Nhận xét: Puerarin chiếm khoảng 50% lượng isoflavonoid có trong nguyên liệu. hương pháp

LC là phù hợp để định lượng puerarin trong nguyên liệu, dịch

chiết và sản phẩm tinh chế. 3.3. Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô 3.3.1. Khảo sát các dung môi chiết Với dung môi ethanol, khảo sát các dung môi chiết là ethanol 40, ethanol 60, ethanol 80 và ethanol 96. Cân chính xác khoảng 50g bột nguyên liệu khô cho vào bình nón 250 ml. Thêm 100 ml dung môi (ethanol 40, 60, 80, 96), khuấy đều. au đó để 24h ở

40

nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc đều trong quá trình chiết. Lọc thu dịch được thể tích V1. Tiếp tục chiết bã còn lại 2 lần, mỗi lần với 100ml trong 24 giờ thu được các thể tích V2, V3. Cô giảm áp các dịch chiết thu được tới cao đặc. Xác định khối lượng cao và định lượng hàm lượng isoflavonoid và puerarin trong dịch chiết và cao theo phương pháp ghi ở mục 2.3.1. Kết quả thu được như bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau

Dược liệu

Dung môi chiết

Dịch chiết

Ethanol 80%

Ethanol 96%

Khối lượng dược liệu (g)

50,0

50,0

50,0

50,0

àm lượng isoflavonoid trong dược liệu (%)

1,054

1,054

1,054

1,054

àm lượng puerarin trong dược liệu (%)

0,564

0,564

0,564

0,564

Lần 1

232,6

270,7

185,7

149,1

Lần 2

134,9

144,8

115,2

70,2

Lần 3

55,2

62,0

49,3

28,6

Tổng

422,7

477,5

350,2

247,9

Phần trăm isoflavonoid chiết được (%)

80,21

90,61

66,45

47,02

Tổng lượng puerarin trong dịch chiết (mg)

215,0

250,1

230,1

143,0

Phần trăm puerarin chiết được (%)

76,24

88,69

81,61

50,70

7,1

6,3

4,3

1,6

420,0

473,7

347,0

246,5

Lượng isoflavonoid chiết được (mg)

Cao chiết

Ethanol Ethanol 40% 60%

Khối lượng cao (g) Lượng isoflavonoid/cao (mg)

41

àm lượng isoflavonoid/cao (%)

5,92

7,52

8,07

15,41

Lượng puerarin trong cao (mg)

213,4

248,6

228,3

142,5

àm lượng puerarin/cao (%)

3,01

3,95

5,31

8,91

Lượng isoflavonoid chiết được (mg)

Ethanol 40%

Ethanol 60%

Ethanol 80%

Ethanol 96%

600 500 400 300 200 100 0 Lần 1

Lần 2

Lần 3

Tổng

ình 3.4. Biểu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau. Nhận xét: Ethanol 60% cho hiệu suất isoflavonoid và puerarin cao hơn so với các dung môi ethanol khác. Lần chiết đầu đóng vai trò quan trọng, chiết được tới hơn 50% hàm lượng isoflavonoid chiết được. Với ethanol 60%, sau ba lần chiết isoflavonoid trong dược liệu đã được chiết gần như kiệt hoàn toàn. Việc cô giảm áp suất trong điều chế cao đặc từ dịch chiết làm thay đổi không đáng kể hàm lượng isoflavonoid và puerarin. Với dung môi chiết là nước, tham khảo quy trình chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi và quy trình chiết isoflavonoid từ sắn dây khô theo tài liệu [14], chúng tôi khảo sát hiệu suất chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi theo hai phương pháp sau

42

Phương pháp A: Cân chính xác khoảng 50g dược liệu khô, đem nghiền với nước theo tỷ lệ 1:4 bằng máy xay sinh tố được hỗn hợp bột nhão. Chuyển khối bột nhão này vào bình nón 500 ml, rửa thiết bị nghiền và dụng cụ bằng 50 ml nước và gộp vào khối bột não này. Lọc hỗn hợp thu được qua vải và sau đó là qua màng lọc thu được thể tích V1. Thêm khoảng 250 ml nước vào bã lọc, khuấy đều. Tiếp tục lọc qua vải và qua màng lọc thu được thể tích V2. Gộp dịch chiết 1 và 2. Cô giảm áp đến cao đặc được khối lượng m1. Lấy mẫu cao này đem định lượng isoflavonoid theo phương pháp 2.3.1.1 và định lượng puerarin theo phương pháp 2.3.1.2 Phương pháp B: Cân chính xác khoảng 50g bột nguyên liệu khô cho vào bình nón 1l. Thêm 500ml nước cất, khuấy trong 1,5 giờ. Lọc thu dịch lọc 1 có thể tích V1. Thêm tiếp 500 ml nước cất vào bã, khuấy trong 1 giờ, sau đó lọc thu dịch lọc 2 có thể tích V2 . Gộp dịch lọc 1 và 2. Cô giảm áp đến cao đặc được khối lượng m2. Lấy mẫu cao này đem định lượng isoflavonoid theo phương pháp 2.3.1.1, định lượng puerarin theo phương pháp 2.3.1.2. Kết quả khảo sát thu được như sau. Bảng 3.6. Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước Phương pháp

A

B

Khối lượng dược liệu (g)

50,15

50,05

Khối lượng cao (g)

7,08

5,99

Tổng lượng isoflavonoid trong cao (mg)

250,48

269,06

Phần trăm isoflavonoid chiết được (%)

47,39

51,00

Tổng lượng puerarin trong cao (mg)

125,87

146,44

Phần trăm puerarin chiết được (%)

44,50

51,88

Nhận xét: Cả hai phương pháp chiết isoflavonoid bằng dung môi nước đều cho hiệu suất chiết tương isoflavonoid tương đối thấp, chỉ đạt khoảng 50%. hương

43

pháp A được hình thành dựa trên quy trình chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi. hương pháp B được xây dựng dựa vào nguyên cứu của Han Jian và cộng sự [14]. Hiệu suất chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng ethanol cao hơn, nhưng quá trình chiết tốn nhiều thời gian. hương pháp chiết bằng dung môi nước khó lọc do có nhiều tinh bột trong dịch chiết, không thu hồi được tinh bột như phương pháp chiết nước đối với sắn dây tươi, không chiết kiệt được hoạt chất như ethanol 60%. Do vậy chúng tôi chọn ethanol 60% là dung môi chiết isoflavonoid từ sắn dây khô. 3.3.2. Tinh chế dịch chiết sắn dây khô Qua quá trình khảo sát, chúng tôi xây dựng phương pháp tinh chế isoflavonoid từ dịch chiết sắn dây khô với dung môi chiết ethanol như sau:  Với mỗi dung môi chiết, gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại. Cô loại hết ethanol sau đó thêm nước cất vào phần dịch còn lại cho đủ 120ml (với 50 bột nguyên liệu khô đưa vào chiết).  Để lắng qua đêm, các tạp chất tan trong ethanol sẽ bị tủa và loại đi trong quá trình lọc sau đó. Lấy mẫu dịch lọc đem định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin. Kết quả thu được như bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả tinh chế dịch chiết sắn dây khô Ethanol 40%

Ethanol 60%

Ethanol 80%

Ethanol 96%

Khối lượng cao tinh chế (g)

4,81

4,28

2,99

1,30

Lượng isoflavonoid còn lại trong cao tinh chế (mg)

389,20

445,71

285,21

187,39

8,09

10,41

9,53

14,359

180,86

240,54

166,5

119,60

3,76

5,62

5,57

9,20

Dung môi chiết

àm lượng isoflavonoid trong cao tinh chế (%) Lượng puerarin còn lại trong cao tinh chế (mg) àm lượng puerarin trong cao tinh chế (%)

hư vậy, sau khi tinh chế, hàm lượng puerarin và isoflavonoid toàn phần trong cao đều tăng lên. Trong số các dung môi khảo sát, cao thu được sau khi tinh 44

chế dịch chiết của dung môi ethanol 60% có hàm lượng đạt 10,410.

àm lượng

puerarin trong cao đạt khoảng 5,62%. Mặc dù hàm lượng puerarin đạt cao nhất ở cao thu được từ dịch chiết ethanol 96%, tuy nhiên khối lượng cao thu được rất thấp, khả năng chiết isoflavonoid và puerarin từ dược liệu không cao, dung môi dễ cháy và đắt tiền hơn ethanol 60%, khó triển khai trên quy mô lớn. Do vậy chúng tôi chọn ethanol 60% là dung môi chiết isoflavonoid từ sắn dây khô. 3.4. Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi 3.4.1. Chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi Tiến hành chiết isoflvonoid từ sắn dây tươi theo phương pháp ghi ở mục 2.3.4. Định lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết theo mục 2.3.1 và xác định khối lượng cắn trong dịch chiết theo mục 2.3.9. Thực hiện 3 mẫu, kết quả như bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi Mẫu

1

2

3

Trung bình

Khối lượng dược liệu (kg)

2,35

2,15

5,3

-

Khối lượng tinh bột (kg)

0,55

0,46

1,25

-

Thể tích dịch chiết (l)

9,8

8,9

22,5

-

Khối lượng cắn chiết (g)

126,29 121,17 291,82

-

àm lượng isoflavonoid trong cắn (%)

9,32

8,92

9,10

9,12

Hiệu suất chiết (tính theo hàm lượng isoflavonoid) (%)

86,06

86,38

86,09

86,18

Nhận xét: àm lượng tinh bột thu được trung bình là 22,8% cao gần gấp đôi so với công bố trong các tài liệu tham khảo [2], [ 6]. Hiệu suất chiết isoflavonoid trung bình đạt 86,18%. Mặc dù chỉ chiết 2 lần nhưng hiệu suất tương đối cao, lượng isoflavonoid còn lại trong bã thấp (< 15%).

45

hương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi bằng dung môi nước không chỉ giúp chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu mà còn có thể tận dụng thu được lượng lớn tinh bột. So với chiết từ dược liệu khô, phương pháp chiết với dược liệu tươi tỏ ra có nhiều ưu điểm, giá thành rẻ, ngoài sản phẩm chính là isoflavonoid còn thu thêm sản phẩm phụ là tinh bột. 3.4.2. Tinh chế dịch chiết sắn dây tươi àm lượng isoflavonoid toàn phần trong cắn chiết trung bình đạt 9,12%. Để tăng hàm lượng hoạt chất trong cao. Tiến hành tinh chế dịch chiết như phương pháp ghi ở mục 2.3.5. Kết quả thu được như bảng 3.9. Bảng 3.9. iệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch chiết, tương ứng khoảng 150 g dược liệu)

Phương pháp tinh chế

Tủa tạp chất bằng nhiệt (1)

Khối lượng cao đặc (g)

7,97

7,35

6,09

Mất khối lượng do làm khô (%)

18,24

14,55

14,1

9,19

10,61

11,5

86,67

92,30

82,88

àm lượng isoflavonoid trong cao đặc (%) Hiệu suất giai đoạn tinh chế tính theo hàm lượng isoflavonoid (%)

Tủa tạp chất Phối hợp cả hai bằng ethanol phương pháp (2) (3)

Nhận xét: àm lượng isoflavonoid trong cao đặc tinh chế của phương pháp 2 (10,61%) cao hơn phương pháp 1 (9,19%); phương pháp 3 (kết hợp phương pháp 1 và 2) cho hàm lượng cao nhất (11,5). Hiệu suất tinh chế cao nhất là phương pháp 2 (sử dụng ethanol), thấp nhất là phương pháp 3 (2 giai đoạn).

hư vậy, mặc dù sản

phẩm thu được từ phương pháp 3 có hàm lượng isoflavonoid toàn phần cao hơn các phương pháp khác, song tính về hiệu suất thì quá trình tinh chế theo phương pháp 3 cũng loại đi khá nhiều isoflavonoid cùng với các tạp chất khác. hương pháp 2 (kết tủa tạp chất bằng ethanol) cho sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid cao (10,61% tương đương với 12,41% tính theo cao tinh chế đã làm

46

khô) với hiệu suất tinh chế cao, đạt 92,30%. Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm là việc cất thu hồi ethanol tốn thời gian. àm lượng isoflavonoid toàn phần trong cao tinh chế thu được từ phương pháp 1 (kết tủa tạp chất bằng nhiệt) là 9,19% tương đương với 11,23% tính theo cao tinh chế đã làm khô. hương pháp tinh chế đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, có thể triển khai trên quy mô lớn. 3.5. Điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây tươi Với hai loại nguyên liệu khô và tươi, qua quá trình khảo sát đánh giá ở trên đã chọn được các dung môi chiết phù hợp, cho hiệu suất chiết cao, đảm bảo chiết kiệt hoạt chất từ nguyên liệu. Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu hạn chế, quá trình phun sấy thực hiện tại công ty cổ phần hóa dược phẩm Việt Nam khó chủ động về thời gian và cỡ mẻ thực hiện chưa đủ lớn nên chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu điều chế cao khô phun sấy từ dịch chiết sắn dây tươi theo phương pháp ghi ở mục 2.3.6., sử dụng phương pháp tinh chế kết tủa tạp chất bằng nhiệt. Dịch tinh chế thu được sau giai đoạn 1 có nồng độ isoflavonoid và tỷ lệ cắn khô như bảng 3.10. Bảng 3.10. Dịch tinh chế đem vào phun sấy Thông số

Giá trị

Khối lượng sắn dây tươi

11 kg

Thể tích dịch tinh chế

46 lít

Nồng độ isoflavonoid trong dịch tinh chế 1,24 mg/ml Tỷ lệ cắn khô của dịch tinh chế

11 mg/ml

Tiến hành phun sấy với các điều kiện như ở mục 2.3.6, thu được 450g cao khô. Thể chất cao thu được như hình 3.5.

47

ình 3.5. Bột cao khô phun sấy Cao khô thu được được đánh giá về một số chỉ tiêu chất lượng như mục 2.3.6.a, 2.3.6.b, 2.3.6.c và 2.3.6.d. Kết quả thu được như bảng 3.11. Bảng 3.11. STT

ột số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy.

Chỉ tiêu

Giá trị Dạng bột, thể chất tơi xốp, đồng nhất, có màu vàng kem, mùi thơm, vị đắng và hơi ngọt.

1

Hình thức cảm quan

2

Khối lượng cao phun sấy

3

Khối lượng riêng biểu kiến

4

Kích thước tiểu phân

5

Mất khối lượng do làm khô

2,7 %

6

àm lượng isoflavonoid toàn phần trong cao

10,78 %

7

Hiệu suất phun sấy

4,09 %

450 g 0,52 g/cm3 100% bột qua rây 250 µm

Nhận xét: Cao khô thu được có hàm lượng isoflavonoid đạt 10,78% tương đương với 11,08% tính theo cao đã làm khô kiệt.

àm lượng này thấp hơn không

đáng kể so với hàm lượng trong cắn khô tinh chế. Cao khô thu được có thể chất tơi,

48

xốp, dễ đóng gói và bảo quản hơn rất nhiều so với cao khô bào chế theo phương pháp cô đặc sấy khô. Cao khô phun sấy không chỉ có nhiều ưu điểm hơn so với cao khô cô đặc sấy khô mà phương pháp còn giúp tiết kiệm nhiều thời gian và chi phi, có thể triển khai trên quy mô công nghiệp. 3.6. Phân lập puerarin và daidzin Tiến hành sắc ký bản mỏng dịch chiết sau tinh chế, thu được kết quả như sau hình 3.6. Ghi chú: T – dung dịch thử; C – dung dịch chuẩn. Trên bản mỏng sắc ký thấy có 4 vết đậm, chứng tỏ trong dịch tinh chế có 4 isoflavonoid chính:  Vết 1 tương ứng với puerarin  Vết 2 dự kiến là daidzin  Vết 3 chưa rõ  Vết 4 dự kiến là daidzein

ình 3.6. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết

Tham khảo tài liệu [16] và rất nhiều quá trình khảo sát trước đó chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân lập puerarin và daidzin được tóm tắt như sơ đồ ở hình 3.7. 3.6.1. Phân lập daidzin 3.6.1.1.

Tiến hành

Lấy 1L dịch tinh chế, cô giảm áp đến cao đặc.

òa cao đặc này vào 100 ml

ethyl acetat bão hòa nước, để lắng, gạn lấy phần dịch trong. Thêm tiếp 50 ml ethyl acetat bão hòa nước vào phần cắn còn lại, lắc đều. au đó để lắng và gạn lấy phần dịch trong. Tiếp tục chiết phần cắn còn lại với 50ml ethyl acetat bão hòa nước như trên, để lắng và lọc lấy dịch. Gộp các dịch lọc, cô giảm áp ở 50C đến 50ml. Chuyển phần dịch này vào bình gạn 250ml. Lắc 2 lần, mỗi lần với 100ml nước ấm, trong 15 phút, sau đó gạn lấy phần nước ở lớp dưới. Gộp các dịch chiết nước, cô giảm áp ở 70C đến thể tích khoảng 120 ml thấy xuất hiện tủa thì dừng lại, để qua đêm ở điều kiện phòng, lọc thu tủa. Phần dịch còn lại dùng để phân lập puerarin. Tủa thu được đem kết tinh lại trong 10ml ethanol 50% được daidzin tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng. Cân khối lượng daidzin thu được, thử độ tinh khiết bằng 49

sắc ký lớp mỏng theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2 và khẳng định cấu trúc theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.

Dịch tinh chế Cô giảm áp Ethylacetate bão hòa nước

Cao đặc Chiết 2-3 lần Lọc

Tủa

ước ấm (70-80C)

Dịch chiết ethyl acetat Dung dịch ethylacetat

Lắc 2-3 lần, gạn. Dịch chiết nước ấm Để nguội

Dịch chiết nước

Tủa daidzin

Cô giảm thể tích Làm lạnh ước

Ethanol 50%

Kết tinh lại Daidzin

Tủa puerarin Kết tinh lại Puerarin

ình 3.7. Quy trình phân lập daidzin và puerarin 3.6.1.2. Kết quả

Khối lượng daidzin thu được: 262,5mg/mẻ. Thực hiện 5 mẻ, thu được tổng lượng daidzin là 1,31 g Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng thu được như hình 3.8. Trong đó A là mẫu thử daidzin, C là mẫu chuẩn puerarin 82,31%. Từ hình ảnh sắc ký lớp mỏng này có

50

thể thấy, daidzin thu được khá tinh khiết, trên hình ảnh sắc ký không thấy có xuất hiện vết lạ, vết sắc ký gọn, sạch.

Hình 3.8. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của daidzin Xác định các thông số vật lý của tủa daidzin thu được kết quả như sau  Cảm quan: Tủa daidzin thu được có dạng bột trắng, hơi vàng.  Nhiệt độ nóng chảy: 238,8°C (tài liệu [21]: 238-240°C) Khẳng định lại cấu trúc của daidzin bằng các phương pháp phổ thu được kết quả như sau.  Phổ hồng ngoại - IR Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.1 thu được kết quả như Phụ lục 13. Quan sát trên hình ảnh phổ thu được nhận thấy có các dải phổ hấp thụ đặc trưng như bảng sau : Bảng 3.12. Kết quả đo phổ hồng ngoại của daidzin Tên chất

Đỉnh hấp thụ đặc trưng 3425 cm-1 , pic rộng và tù

Daidzin

Nhóm chức tương ứng O─ phenol

1635 cm-1

C=O

1519 cm-1

C=C thơm

 Phổ khối lượng (ESI-MS)

51

Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.2 thu được kết quả như hụ lục 14-15. Bảng 3.13. Kết quả đo phổ khối lượng (E I-MS) của daidzin Tên chất Daidzin

Số khối của mảnh ion phân tử m/z Phổ positive xuất hiện pic 438,96 ứng với mảnh [M+Na]+ có số khối là 438,96, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19) Phổ negative xuất hiện pic 415,00 ứng với mảnh [M-H]- có số khối là 415,00 tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)

Nhận xét : Kết quả cho thấy các chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử tương ứng.  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.3 thu được kết quả như Phụ lục 16-19. OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

6 2'' OH

3''

3

OH

1'

4

5

4'

O

OH

ình 3.9. Công thức cấu tạo của daidzin Bảng 3.14. Kết quả đo phổ 13

R của daidzin 1

C NMR Thực nghiệm Tài liệu [22]

H NMR Thực nghiệm Tài liệu [22]

C

(500 MHz, DMSO, ppm)

(125 MHz, DMSO, ppm)

(500 MHz, DMSO, ppm)

(500 MHz, DMSO, ppm)

2

153,2

153,1

8,34 s

8,35 s

3

123,7

123,7

4

174,7

174,7

5

126,9

126,9

8,03 d (J 9,0)

6

115,5

115,4

7,13 dd (J 7,0; 2,0)

8,05 d (J 8,8) 7,14 dd (J 8,8; 2,4)

7

161,3

161,3

8

103,3

103,3

7,22 d (J 2,0)

52

7,22 (J 2,4)

9

157,2

157,2

10

118,4

118,5

1’

122,3

122,2

2’

130,0

129,9

7,40 d (J 8,5)

7,41 d (J 8,7)

3’

114,9

114,9

6,81 d (J 8,5)

6,82 d (J 8,7)

4’

157,0

157,0

5’

114,9

115,5

6,84 d (J 8,5)

6’

130,0

129,9

7,35 d (J 8,5)

1’’

100,0

100,1

5,09 d (J 7,0)

5,09 d (J 7,5)

2’’

73,1

73,1

3’’

76,4

76,4

4’’

69,6

69,6

5’’

77,2

77,2

3,27-3,33 m, 2H 3,44-3,48 m, 2H 3,70-3,74 m, 1H

3,20; 3,30-3,36 m 3,44-3,52 m 3,74 m; 3,46 m

6’’

60,6

60,6 4,59; 5,06-5,13; 5,42; 9,54 (OH-4’)

4,58; 5,04; 5,10; 5,39; 9,48

OH

3.6.2. Phân lập puerarin 3.6.2.1. Tiến hành Dịch lọc còn lại sau khi đã loại tủa daidzin như mục 3.6.1.1 đem cô bớt còn khoảng 40ml, sau đó làm lạnh trong tủ lạnh qua đêm, thu được tủa puerarin thô. Tủa này được kết tinh lại trong khoảng 10 ml nước để thu puerarin có độ tinh khiết cao. Cân khối lượng puerarin thu được, thử độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2 và khẳng định cấu trúc theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8. 3.6.2.2.

Kết quả

Khối lượng puerarin thu được: 432,5mg/mẻ. Thực hiện 5

Hình 3.10. ình ảnh sắc ký lớp mỏng Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng thu được như hình dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin 3.10. Trong đó B là mẫu thử puerarin, C là mẫu chuẩn puerarin mẻ, thu được tổng lượng puerarin là 2,16 g

53

82,31%. Từ hình ảnh sắc ký lớp mỏng này có thể thấy, puerarin thu được có độ tinh khiết cao, hình ảnh sắc ký không thấy có xuất hiện vết lạ, vết sắc ký gọn, sạch. Xác định các thông số vật lý của tủa daidzin thu được kết quả như sau  Cảm quan: dạng bột trắng, hơi vàng.  Nhiệt độ nóng chảy: 210°C (tài liệu [24]: 208,4-212,5°C)  Rf = 0,388 với pha động là Cloroform - methanol - nước (7:2,5:0,25).  Rf = 0,589 với pha động là Cloroform – methanol (7:3). Khẳng định lại cấu trúc của puerarin bằng các phương pháp phổ thu được kết quả như sau.  Phổ hồng ngoại - IR Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.1 thu được kết quả như Phụ lục 5. Quan sát trên hình ảnh phổ thu được nhận thấy có các dải phổ hấp thụ đặc trưng như bảng sau : Bảng 3.15. Kết quả đo phổ hồng ngoại của puerarin Tên chất Puerarin

Đỉnh hấp thụ đặc trưng

Nhóm chức tương ứng

3341 cm-1, pic rộng và tù

O─ phenol

1635 cm-1

C=O

1513 cm-1

C=C thơm

 Phổ khối lượng (ESI-MS)

Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.2 thu được kết quả như hụ lục 6-7.. Bảng 3.16. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của puerarin Tên chất Puerarin

Số khối của mảnh ion phân tử m/z Phổ negative xuất hiện pic 415,08 ứng với mảnh [M-H]- có số khối là 438,96, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19) Phổ positive xuất hiện pic 417,08 ứng với mảnh [M+H]+ có số khối là 417,08, tương ứng với khối lượng phân tử 416,38 (C21H20O19)

Nhận xét : Kết quả cho thấy chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử của puerarin. 54

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Tiến hành đo mẫu theo phương pháp ghi ở mục 2.3.8.3 thu được kết quả như hụ lục 8-12. OH

OH

4"

HO 3"

6" 5"

2"

O

HO

1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

ình 3.11. Công thức cấu tạo của puerarin Bảng 3.17. Kết quả đo phổ 13

C NMR và DEPT Thực nghiệm Tài liệu [22]

R của puerarin 1

H NMR Thực nghiệm Tài liệu [22]

C

(500 MHz, CD3OD, ppm)

(125 MHz, DMSO, ppm)

(500 MHz, CD3OD, ppm)

(500 MHz, DMSO, ppm)

2

154,4 (CH)

152,0

8,15 s

8,26 s

3

125,4 (C)

122,9

4

178,2 (C)

174,6

5

128,0 (CH)

125,9

8,03 d (J 9,0)

7,96 d (J 8,8)

6

116,2 (CH)

114,8

6,97 d (J 9,0)

6,99 dd (J 8,8)

7

162,9 (C)

160,6

8

113,0 (C)

113,2

9

158,5 (C)

155,7

10

118,4 (C)

116,8

1’

124,1 (C)

122,4

2’

131,3 (CH)

129,6

7,35 d (J 8,5)

7,42 d (J 8,8)

3’

116,2 (CH)

114,7

6,84 d (J 8,5)

6,82 d (J 8,8)

4’

158,5 (C)

156,9

5’

116,2 (CH)

114,7

6,84 d (J 8,5)

6’

131,3 (CH)

129,6

7,35 d (J 8,5)

1’’

75,6 (CH)

73,4

5,11 (J 9,5)

4,90 d (J 10,4)

2’’

72,99 (CH)

70,9

3,51-3,54 m, 1H

3,34m; 3,54m

55

3’’

79,9 (CH)

78,5

4’’

71,6 (CH)

70,2

5’’

82,6 (CH)

81,2

6’’

62,7 (CH2)

61,1

3,56-3,58 m, 2H 3,77 dd, 1H 3,89-3,93 m, 1H 4,14 br, 1H

OH

3,55br, d 3,74br, d 3,75m; 4,0m

4,68

Nhận xét : Các dữ liệu phổ và hằng số vật lý của mẫu puerarin chiết được là đồng nhất với dữ liệu phổ và hằng số vật lý từ các tài liệu tham khảo và phù hợp với cấu trúc của puerarin. Kết quả đo phổ cũng cho thấy puerarin và daidzin phân lập được là tinh khiết.

56

Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoid Đề tài đã thực hiện khảo sát chiết isoflavonoid từ cả hai nguyên liệu sắn dây khô và sắn dây tươi thu mua ở các tỉnh Hải Dương, inh Bình và hú Thọ. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy, sắn dây thu mua ở Phú Thọ cho hàm lượng isoflavonoid và puerarin cao nhất, được đưa vào nghiên cứu. Đề tài mới chỉ thực hiện những khảo sát và nghiên cứu bước đầu về chiết isoflavonoid và puerarin từ sắn dây, do vậy chưa chủ động được nguồn nguyên liệu. Kết quả nghiên cứu phụ thuộc nhiều vào chất lượng nguyên liệu đầu vào. Cần có thêm nghiên cứu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu về các tiêu chí như hàm lượng isoflavonoid, thời gian thu hái, độ tuổi của sắn dây khi thu hái, quy trình làm khô dược liệu… Với sắn khô, đã tiến hành khảo sát các dung môi chiết là các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau và nước. Dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao hơn dung môi nước và có thể chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Trong các nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 60% tỏ ra là dung môi chiết hiệu quả: hiệu suất chiết isoflavonoid đạt 90,61%, cao sau tinh chế có hàm lượng isoflavonoid đạt trên 10%. Kết quả phù hợp với nhiều kết quả đã được công bố trong nước [5] và nước ngoài [41], [45]. Tuy nhiên, theo phương pháp khảo sát, chiết isoflavonoid bằng ethanol thực hiện trong thời gian kéo dài, ngoài sản phẩm chính là isoflavonoid thì không thu thêm được tinh bột. Với sắn tươi chỉ cần sử dụng dung môi rẻ tiền, không độc là nước để chiết isoflavonoid cho hiệu quả chiết cao đạt 86,18%. Đặc biệt, quy trình chiết xây dựng được hoàn toàn có thể triển khai trên quy mô lớn, kết hợp với quy trình thu tinh bột thường sử dụng trong dân gian. Nguyên liệu được tận dụng tối đa để vừa thu tinh bột, vừa chiết isoflavonoid. Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình là chỉ sản xuất được theo thời vụ, vào mùa thu hoạch sắn dây. 4.2. Về phương pháp bào chế cao khô

57

Đề tài đã xây dựng được quy trình điều chế cao khô isoflavonoid bằng phương pháp phun sấy. hương pháp phun sấy có các ưu điểm:  Tiết kiệm thời gian, năng lượng (điện năng, nhiệt năng).  Tránh phân hủy hoạt chất do tiếp xúc với nhiệt lâu.  Cao khô thu được ở dạng bột tơi xốp, dễ thu hồi, bảo quản và chất lượng đồng đều giữa các lô mẻ.  Dễ triển khai trên quy mô lớn. Đề tài cũng đã đánh giá được một số đặc điểm cơ bản của cao khô phun sấy được. Trong khuôn khổ đề tài, việc phun sấy còn gặp một số khó khăn như  Mới chỉ thực hiện được trên dịch chiết nước của nguyên liệu tươi.  Cần một lượng lớn dịch chiết (42 lít), do điều kiện máy móc và thời gian hạn chế nên chỉ lựa chọn được phương pháp tinh chế đơn giản nhất để tiến hành tinh chế lượng dịch chế thu được mặc dù đó không phải là phương pháp cho hiệu quả tinh chế cao nhất.  Quá trình điều chế phải thực hiện qua hai giai đoạn ở hai nơi khác nhau, khó khăn trong việc vận chuyển, không chủ động được về máy móc, phụ thuộc nhiều vào nơi hợp tác (công ty cổ phần óa dược phẩm Việt Nam). Cần tiến hành thêm nghiên cứu điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây khô để đảm bảo có thể sản xuất cao khô isoflavonoid liên tục trong năm khi nguồn nguyên liệu tươi không còn sẵn có. 4.3. Về phương pháp phân lập puerarin và daidzin Hầu hết các phương pháp phân lập puerarin và daidzin đã được công bố [5], [42] đều sử dụng phương pháp sắc ký cột. hương pháp này cho sản phẩm có độ tinh khiết cao song chỉ tiến hành được với cỡ mẫu nhỏ, dung môi và hóa chất sử dụng đắt tiền, cho hiệu quả kinh tế không cao. Đề tài đã xây dựng được quy trình đơn giản phân lập được cả puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi. Quy trình thực hiện đơn giản, nhanh chóng, có thể tiến hành với các cỡ mẫu lớn.

58

Quá trình phân lập trải qua 4 giải đoạn.

ai giai đoạn đầu nhằm mục đích loại

các tạp bằng cách thay đổi dung môi. Do puerarin tan được trong nước, ít tan trong ethyl acetat còn daidzin tan tốt trong ethyl acetat nhưng lại tan kém hơn nhiều trong nước, sử dụng ethyl aceta bão hòa nước giúp cải thiện độ tan của puerarin do đó nâng cao hiệu suất phân lập so với khi chỉ sử dụng ethyl acetat. Qua hai lần thay đổi dung môi, kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng thấy tạp chất và các isoflavonoid không cần thiết đã được loại đi đáng kể. Việc phân lập được daidzin là thành công nằm ngoài mục tiêu mong đợi ban đầu của đề tài. Thực tế, đề tài mới thực hiện phân lập thành công puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi do điều kiện thời gian có hạn. Cần có thêm nghiên cứu hoàn thiện quy trình phân lập puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây khô để có thể chủ động trong việc sản xuất không phụ thuộc vào mùa thu hoạch sắn dây tươi.

59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Mặc dù do thời gian thực hiện và điều kiện thực nghiệm còn hạn chế, nghiên cứu đã đạt được các mục tiêu đề ra: 1.

Xây dựng được quy trình điều chế cao khô phun sấy từ rễ củ sắn dây có hàm lượng isoflavonoid trong cao trên 10% Cụ thể, nghiên cứu đã

 Khảo sát và lựa chọn được dung môi chiết isoflavonoid thích hợp từ sắn dây khô là ethanol 60%, tinh chế dịch chiết bằng nhiệt, hàm lượng isoflavonoid trong cao tinh chế đạt 10,41%  Xây dựng được quy trình chiết isoflavonoid và thu tinh bột từ sắn dây tươi bằng dung môi rẻ tiền, không độc là nước. Hiệu suất chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi đạt 86,18% sau 2 lần chiết. Khảo sát 3 phương pháp tinh chế dịch chiết là sử dụng nhiệt, sử dụng ethanol và phối hợp cả nhiệt và ethanol. Lựa chọn phương pháp tinh chế đơn giản, thuận tiện là sử dụng nhiệt để tinh chế dịch chiết đem vào điều chế cao khô phun sấy.  Xây dựng được quy trình điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy như

hình 2.2. Cao khô điều chế được ở dạng bột, thể chất tơi xốp, đồng nhất, có màu vàng kem, mùi thơm, vị đắng hơi ngọt; khối lượng riêng biểu kiến là 0,52 g/cm3; kích thước tiểu phân nhỏ hơn 250µm; hàm ẩm 2,7%; hàm lượng isoflavonoid trong cao đạt 10,78%. 2.

Phân lập được puerarin và daidzin từ rễ củ sắn dây. Cụ thể, nghiên cứu đã

 Xây dựng được quy trình phân lập được puerarin và daidzin từ dịch chiết sắn dây tươi đơn giản, hiệu quả. Sản phẩm phân lập có độ tinh khiết cao trên phổ. Cấu trúc của puerarin và daidzin tinh chế được được khẳng định bằng các phương pháp có độ tin cậy cao: phổ IR, phổ ESI – MS, phổ NMR.

60

ĐỀ XUẤT Những kết quả đạt được của nghiên cứu chỉ là những thành quả khảo sát, thăm dò bước đầu trong việc đưa ra một quy trình chiết xuất isoflavonoid và phân lập puerarin, daidzin hoàn thiện từ sắn dây (khô và tươi).

hóm nghiên cứu xin đề

xuất cần có thêm những nghiên cứu cụ thể hơn như 1. Nghiên cứu chuẩn hóa nguyên liệu sắn dây đưa vào nghiên cứu 2. Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi và sắn dây khô 3. Nghiên cứu mở rộng quy trình chiết xuất isoflavonoid và phân lập puerarin, daidzin trên các quy mô lớn hơn.

61

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1.

Bộ Môn Công Nghiệp Dược (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập 1, tr. 199-206.

2.

Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr. 880-881, PL1-1.

3.

Bộ Y Tế (2006), Bài giảng dược liệu, NXB Y học, tr. 38-40, 259-289.

4.

Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1023-1024.

5.

Lê Thùy Linh (2009), "Chiết xuất và phân lập các Isoflavonoid từ cây sắn dây", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.

6.

gô Văn Thu (2004), Bài giảng Dược liệu, tập 1, Đ

Dược HN, tr. 38, 259,

273-281. 7.

Đỗ Thị Hoa Viên (2006), "Nghiên cứu in vivo tác dụng nội tiết kiểu estrogen của cao chiết isoflavone từ củ sắn dây Pueraria thomsonii Benth"", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 44, số 2, tr. 55-58.

8.

Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB Khoa học & Kỹ thuật, tập 2, tr. 680-686.

TIẾNG ANH 9.

Bebrevska L., et al. (2010), "Invivo antioxidative activity of a quantified Pueraria lobata root extract", Journal of Ethnopharmacology, 127, pp. 112117.

10.

Chen B., et al. (2001), "Study on HPLC Rapid Determination of Puerarin & Daidzin in Pueraria Lobata (Wild.)", Food Science, 04.

11.

Chen S., et al. (2007), "Seasonal Variations in the Isoflavonoids of Radix Puerariae", Phytochemiscal Analysis, 18, pp. 245-250.

12.

Dongwei W., Xiaorong Z. (2013), "Solubility of puerarin in the binary system of methanol and acetic acid solvent mixtures", Fluid Phase Equilibria, 339, pp. 67-71.

13.

Guerra M. C., et al. (2000), "Comparison between Chinese medical herb Pueraria lobata crude extract and its main isoflavone puerarin Antioxidant

properties and effects on rat liver CYP-catalysed drug metabolism", Life Sciences, 67, pp. 2997-3006. 14.

Han J., et al. (2007), "Study on extraction of puerarin from Radix Puerariae by orthogonal test", China Hospital Pharmacy Journal, 27, pp. 332-333.

15.

Hua-Neng X., Chao-Hong H. (2007), "Extraction of isoflavones from stem of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi using n-butanol/water two-phase solvent system and separation of daidzein", Separation and Purification Technology, 56, pp. 85-89.

16.

Hua-Neng X., Chao-Hong H. (2007), "Separation and purification of puerarin with solvent extraction", Separation and Purification Technology, 56, pp. 397–400.

17.

Hua-Neng X., et al. (2008), "Modeling for extraction of isoflavones from stem of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi using n-butanol/water two-phase solvent system", Separation and Purification Technology, 62, pp. 590-595.

18.

Jie-Ping F., et al. (2013), "Extraction of Puerarin using Ionic Liquid Based Aqueous Two-Phase Systems", Separation and Purification Technology, 47, pp. 1740-1747.

19.

Jie-Ping F., et al. (2012), "Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extration of puerarin from Radix Puerariae Lobatae by response surface methodology", Food Chemistry, 135, pp. 2299-2306.

20.

Jun-Ei K., et al. (1987), "Studies on the Constituents of Pueraria lobata. III. Isoflavonoids and Related Compounds in the Roots and the Voluble Stems", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 35(12), pp. 4846-4850.

21.

Jun-Ei K., et al. (1988), "Studies on the constituents of Pueraria Iobata. IV. Chemical constituents in the flowers and the leaves", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 36, pp. 1174-1179.

22.

Kazuhiro H., et al. (1997), "Phenolic glycosides from the root of Pueraria lobata", Phytochemistry, 45, pp. 921-928.

23.

Keung W. M., Vallee B. L. (1998), "Kudzu root: an ancient chinese source of mordern antidisotropic agents", Phytochemistry, 47, pp. 199-506.

24.

Li Liu F., inventor (2013), Puerarin hydrates, preparation methods and uses thereof, Patent No.: US20130331345 A1.

25.

Li W., et al. (1998), "A study on the Extractive Technology of Effective Composition-Pueraria Flavonoid from Pueraria Lobata Ohwi", Journal of Northwest University, 28, No.2, pp. 131-138.

26.

Lingzhao W., et al. (2009), "Investigation of supercritical fluid extraction of puerarin from Pureraia lobata", Journal of Food Process Engineering, 32, pp. 682-691.

27.

Lingzhao W., et al. (2008), "Optimisation of supercritical fluid extraction of flavonoids from Pueraria lobata", Food Chemistry, 108, pp. 737-741.

28.

Long-Hu W., Yi-Yu C. (2005), "Solubility of Puerarin in Ethanol + Supercritical Carbon Dioxide", Journal of Chemical & Engineering Data, 50, pp. 1747-1749.

29.

Man C., Gan X. (2008), "Determination of Puerarin in Radix Puerariae by HPLC", China Feed, 10.

30.

Man Chen, Gan Xiaoying (2008), "Determination of Puerarin in Radix Puerariae by HPLC".

31.

Mei-Hwa L., Chuan-Chuan L. (2007), "Comparison of techniques for extration of isoflavones from the root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized solvent extractions", Food Chemistry, 105, pp. 223-228.

32.

Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2005), "Chinese Materia Medica and Prepared Silces of Chinese Crude Drug", pp. 230-231.

33.

Pubchem Compound, Puerarin, database on the Internet, National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, available from: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.

34.

Sewell R. A. (2009), "Response of Cluster Headache to Kudzu", Headache: The Journal of Head and Face Pain, 49(1), pp. 98-105.

35.

Sibao C., et al. (2007), "Seasonal Variations in the Isoflavonoids of Radix Puerariae", Phytochemical Analysis, 18, pp. 245–250.

36.

Song T., et al. (1998), "Soy isoflavone analysis: quality control and a new internal standard", The American journal of clinical Nutrition, 68, pp. 1474S–1479S.

37.

Tong R. C., et al. (2010), "Evaluation of quality of Radix Puerariae herbal medicine by isoflavonoids", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 62, pp. 644-650.

38.

Volkmar J., Ulrich M. (2011), "Alternative Solvents in Plant Extraction", Inductrial Scale Natural Products Extraction, Hans-Jorg Bart, Pilz S., editors, Wiley - VCH, pp. 55-86.

39.

Wang L.-H., Cheng Y.-Y. (2005), "Solubility of Puerarin in Water, Ethanol, and Acetone from (288.2 to 328.2) K", Journal of Chemical & Engineering Data, 50, pp. 1375-1376.

40.

Xiangling H., et al. (2004), "Separation and purification of puerarin using cyclodextrin-coupled agarose gel media", Journal of Chromatography A, 1022, pp. 77-82.

41.

Xu H., et al. (2007), "Ultrasonically Assisted Extraction of Isoflavones from Stem of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi and Its Mathematical Model", Chinese Journal of Chemical Engineering, 15(6), pp. 861-867.

42.

Xueli C., et al. (1999), "Separation and purification of isoflavones from Pueraria lobata by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A, 855, pp. 709-713.

43.

Yan-Xi Z., et al. (2013), "Puerarin: A review of Pharmacological Effects", Phytotherapy Research.

44.

Yang D. (2006), Chinese Medicine Based on Radix Puerariae, The Hong Kong Polytechnic University.

45.

Yang H., et al. (2008), "Extraction of isoflavonoids from Pueraria by combining ultrasound with microwave vacuum", Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 47, pp. 2256–2261.

46.

Zang Z., et al. (1999), "Studies on isoflavonoid constituents of roots of Qin Mountain Taibai Pueraria lobata", Chinese Pharmaceutical Journal, 34(5), pp. 301-302.

47.

Zhenku G., et al. (2001), "Microwave-assisted extraction of effective constituents from a Chinese herbal medicine Radix puerariae", Analytica Chimica Acta, 436, pp. 41-47.

48.

Zhou H.-Y., et al. (2007), "Separation and determination of puerarin, daidzin and daidzein in stems and leaves of Pueraria thomsonii by RP-HPLC", China journal of Chinese materia medica, 32(10), pp. 937-939.

PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. PIC SẮC KÝ CỦA DUNG DỊC ERARI ĐỐI CHIẾU PHỤ LỤC 2. IC ẮC KÝ CỦA DỊC C IẾT Ắ DÂY K BẰ G ETHANOL 60% PHỤ LỤC 3. IC ẮC KÝ CỦA ERARI TI C Ế PHỤ LỤC 4. IC ẮC KÝ CỦA DAIDZI TI C Ế PHỤ LỤC 5. Ổ IR CỦA ERARI PHỤ LỤC 6. Ổ K ỐI L G ( EGATIVE) CỦA ERARIN PHỤ LỤC 7. Ổ K ỐI L G ( O ITIVE) CỦA ERARI 1 PHỤ LỤC 8. Ổ HR CỦA ERARI 1 PHỤ LỤC 9. Ổ HexR CỦA ERARI 13 PHỤ LỤC 10. Ổ CR CỦA ERARI PHỤ LỤC 11. Ổ DE T CỦA ERARI 13 PHỤ LỤC 12. Ổ CexR CỦA ERARI PHỤ LỤC 13. Ổ IR CỦA DAIDZI PHỤ LỤC 14. PHỔ KHỐI L NG (NEGATIVE) CỦA DAIDZIN PHỤ LỤC 15. Ổ K ỐI L G ( O ITIVE) CỦA DAIDZI 1 PHỤ LỤC 16. Ổ HR CỦA DAIDZI PHỤ LỤC 17. PHỔ 1Hex-NMR CỦA DAIDZIN PHỤ LỤC 18. Ổ 13CR CỦA DAIDZI 13 PHỤ LỤC 19. Ổ CexR CỦA DAIDZI

PHỤ LỤC 1. PIC SẮC KÝ CỦA DUNG DỊC

ERARI ĐỐI CHIẾU

PHỤ LỤC 2. IC ẮC KÝ CỦA DỊC C IẾT Ắ DÂY K

BẰ G ET A OL 60%

PHỤ LỤC 3. IC ẮC KÝ CỦA

ERARI TI

C Ế

PHỤ LỤC 4. IC ẮC KÝ CỦA DAIDZI TI

C Ế

PHỤ LỤC 5.

Ổ IR CỦA

ERARI

PHỤ LỤC 6.

Ổ K ỐI L

G ( EGATIVE) CỦA PUERARIN

OH

OH

4"

HO 3" 2"

HO

6" 5"

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

PHỤ LỤC 7.

Ổ K ỐI L

OH

OH

4"

HO 3"

6" 5"

2"

HO

G ( O ITIVE) CỦA

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

ERARI

PHỤ LỤC 8.

Ổ 1H-

R CỦA

OH

OH

4"

HO 3"

6" 5"

2"

HO

ERARI

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

PHỤ LỤC 9.

Ổ 1Hex-

R CỦA

OH

OH

4"

HO 3"

6" 5"

2"

HO

ERARI

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

Ổ 13C-

PHỤ LỤC 10.

OH

OH

4"

HO 3" 2"

HO

6" 5"

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

R CỦA

ERARI

PHỤ LỤC 11.

Ổ DE T CỦA

ERARI

OH

OH

4"

HO 3" 2"

HO

6" 5"

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

PHỤ LỤC 12.

OH

OH

4"

HO 3" 2"

HO

6" 5"

O 1" 8

HO

O

2

9

7

10

6

3

1'

4

5

O

4'

OH

Ổ 13Cex-

R CỦA

ERARI

PHỤ LỤC 13.

Ổ IR CỦA DAIDZI

PHỤ LỤC 14. PHỔ KHỐI L

NG (NEGATIVE) CỦA DAIDZIN

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3''

OH

6 2'' OH

3

1'

4

5

O

4'

OH

Ổ K ỐI L

PHỤ LỤC 15.

G ( O ITIVE) CỦA DAIDZI

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3''

OH

6 2'' OH

3

1'

4

5

O

4'

OH

PHỤ LỤC 16.

Ổ 1H-

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3

6 3''

OH

2'' OH

1'

4

5

O

4'

OH

R CỦA DAIDZI

PHỤ LỤC 17. PHỔ 1Hex-NMR CỦA DAIDZIN

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3''

OH

6 2'' OH

3

1'

4

5

O

4'

OH

Ổ 13C-

PHỤ LỤC 18.

R CỦA DAIDZI

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3''

OH

6 2'' OH

3

1'

4

5

O

4'

OH

PHỤ LỤC 19.

Ổ 13Cex-

R CỦA DAIDZI

OH 6''

5'' O

O 7

8

9 O

2

1'' 4''

HO

3

6 3''

OH

2'' OH

1'

4

5

O

4'

OH