Una potente cepa bacteriana productora de biofracturante para la aplicación en las solicitudes de recuperación mejorada de petróleo Abstracto Se investigó la capacidad capacidad de los hidrocarburos hidrocarburos que que utilizan las bacterias para producir biofracturantes. Fuera de 38 esporas esporas formadoras de alcano alcano utilizando bacterias aisladas de las instalaciones de la rener!a "eddah# se aisló una bacteria que produce una potente surfactina# mediante la t$cnica de enriquecimiento. %l aislado fue puricado & caracterizado parcialmente parcialmente como miembros del g$nero 'acillus & se designó como '())*+USA*3. '())*+USA*3. Fue capaz de biodegradarse ,,#- g de n*headecano & consumen m/s del 801 en 22 h# pero no se detectó surfactina. )uando se cultiva en alde*,2# un subproducto barato recuperado durante la fabricación de jarabe de alta fructosa a partir de almidón de ma!z# hasta 452- mg.l*, de surfactina se produjo en 4- h. Se determinó la caracterización cin$tica# para el crecimiento celular & la producción de surfactina de alde*,2. se consigue una tasa de crecimiento espec!co m/ima de -#450 h*,# la eciencia de conversión de 68#81 & la productividad productividad volum$trica del reactor de ,22 gsurfactin.l*,.h*,. 7os resultados obtenidos sugieren que '())*+USA*3 '())*+USA*3 cepa puede ser de gran importancia como agente eor factible en casi todo campos de petróleo agotados. ntroducción 9ecientemente# se ha prestado atención a los procesos de potenciador microbiano para la recuperación de petróleo petróleo :eor;. 'iosurfactantes producidos por ciertos microorganismos microorganismos son algunos de los agentes m/s prometedores prometedores eor <,=. ejoran la recuperación de petróleo mediante la reducción de la tensión interfacial :F+; entre las interfaces de aceite & agua# o por mediación de los cambios en el !ndice de humectabilidad del sistema.7os sistemas tensioactivos microbianos tienen varias ventajas sobre los tensioactivos qu!micos# tales como menor toicidad# una ma&or biodegradabilidad & la ecacia a temperaturas etremas o valores de p> <0=. ?umerosos comentarios est/n disponibles en la producción & aplicación de biosurfactantes <,#3#4=. uchas de las aplicaciones potenciales que se han considerado para biosurfactantes dependen de la naturaleza del biotensioactivo & si puede ser rentable producido. Surfactina es uno de los m/s poderosos biosurfactantes producidos producidos por varias cepas de 'acillus subtilis# una bacteria @ram*positivas# móviles# bacterias formadoras de esporas <2#5#=. Se compone de una estructura de anillo de siete amino/cidos acoplado a una cadena de /cidos grasos a trav$s de la vinculación de lactona. 7a surfactina disminu&e la tensión supercial de 0 a 0#6 m? B m a concentraciones tan bajas como -#--21 & la tensión interfacial del agua B headecano a C, m? B m <8=. %l presente estudio est/ dirigido a la bDsqueda de una cepa bacteriana que podr!a producir surfactina efectiva a partir de sustrato de residuos de bajo
costo & podr!a sobrevivir de forma simult/nea en las duras condiciones encontradas en la tuber!a del pozo petrolero.
ateriales & m$todos sitio de muestreo Se recogieron muestras de sedimentos# en el h orario de verano# m/. temperatura 42 E )# de una tuber!a de transporte de petróleo en un sitio de reparación & mantenimiento# "eddah rener!a de petróleo# Sur de "eddah# al oeste de Arabia Saudita. procedimiento de enriquecimiento )on el n de enriquecer selectivamente cepas microbianas termólos que podr!an degradar los hidrocarburos & es de esperar producir biofracturante una cultura quimiostato se puso en un recipiente de vidrio de 0 l con un volumen de trabajo de , l. se aadió medio m!nimo de sal :S; en la siguiente composiciónG ?a)l :-#--,1;# gSH4 :-#-51;# )a)l0 :-#--41;# FeSH4 :-#--01; & -#, ml de solución de elementos traza contiene :gl*,; 0#30 InSH4.>0H# ,#8 nSH4.4>0H# -#25 >3'H3# ,#- )uSH4.2>0H# -#36 ?aoH4.0>0H# -#40 )o)l0.5>0H# ,.- %(+A# -#--4 ?i)l0.5>0H & -#55 Jl. %l S se suministró adicionalmente con n*headecano como la Dnica fuente de carbono & energ!a a ,,#- g.l*, & se inoculó con la muestra de sedimento en 21 :K B v;. 7a temperatura & p> se controlaron a 22 E ) & #0# respectivamente# & la velocidad de agitación se mantuvo a 0-- rpm & el cultivo continuó durante 2 d!as. %sto se repitió 8 veces despu$s de lo cual se prepararon & se sembraron en placas de agar de S con n*headecano en ,,#- g.,*, como fuente de carbono & energ!a diluciones en serie del cultivo obtenido <6=. As!# las colonias microbianas desarrollaron se ensa&aron adicionalmente# puricado & sub* cultivaron en el mismo medio. A los cultivos madre congelados se almacenaron en glicerol al 3-1 a *- E ). 7a biomasa :peso seco;G biomasa bacteriana se determinó por centrifugación un volumen conocido de caldo de fermentación a ,--- g durante ,2 min. 7a biomasa se lavó dos veces con agua destilada & se secó durante la noche a 6E ) hasta peso constante. características de crecimiento de aislados bacterianos: observaciones de la morfolog!a de c$lulas vegetativas se realizaron en cultivos cultivados durante 04 horas# en agar nutritivo :?A; medio# a 3- E ). 7os microorganismos fueron eaminados en ,--- aumentos# usando microscop!a de contraste de fase# para la forma de las c$lulas# la presencia de cadenas# & para la reacción con la tinción de @ram <,-=. Lara determinar la motilidad# las cepas se cultivaron en pendientes de ?A & despu$s de 5 h# o tan pronto como el crecimiento apareció despu$s# un asa de siembra del l!quido en la base de la
pendiente se eaminó a ,.--- ampliación por microscop!a de contraste de fase. 7a actividad de la catalasa de aislados bacterianos se detectó mediante la resuspensión de una colonia en una solución de 31 de peróido de hidrógeno :Sigma;. 7a capacidad de crecer en diferentes fuentes de carbono se determinó mediante el control de la densidad óptica a 5-- nm de cultivos crecidos en caldo nutriente suministrado con glucosa# ilosa# maltosa# sacarosa# celobiosa# galactosa# almidón# manitol o +Keen 8- como fuente de carbono. la producción de biosurfactanteG )on el n de probar para la producción biofracturante agitación de 2-- ml frascos cada cargó con 02- ml de S que contienen se utilizaron 0- g.l*, de alde*,2 como fuente de carbono. alde* ,2 es una detrina M*amilasa producida durante la producción comercial de jarabe de fructosa a partir de almidón de ma!z. )ontiene ,1 de glucosa# 31 de maltosa# maltotriosa 21 & 6,1 de oligo* & megalosaccharides <,,=. 7os matraces se inocularon con un cultivo de 04 h de cada cepa bacteriana en 21 :v B v; & se incubaron en un agitador rotatorio a 2- E ) & 0-- rpm. Se tomaron muestras al nal de cada ejecución de cultivo# se centrifugaron a ,--- g durante ,2 min & se eaminaron para biosurfactantes. La detección de la actividad biofracturante: la actividad biofracturante de las bacterias aisladas se detectó mediante el uso de la t$cnica de propagación de aceite & la prueba de estabilidad de la emulsión en tres aceites diferentesG queroseno# petróleo crudo & aceite de motor. Aceite técnica de difusión: 7as capacidades de los aislados bacterianos se determinaron midiendo el di/metro de las zonas claras se produjo cuando una gota de una solución contiene biotensioactivo# se coloca sobre una supercie de aceite*agua <,0=. Se aadieron 2- ml de agua destilada a una placa de Letri# ,2 cm de di/metro# seguido de la adición de 0-Nl de aceite a la superficie del agua. (espu$s# se aadieron ,-Nl de sobrenadante de cultivo bacteriano. %l di/metro de las zonas claras desarrolladas se determinó por triplicado. estabilidad del emulsionamiento :%04; de la pruebaG %04 de muestras de cultivo se determinó mediante la adición de 0 ml de aceite a la misma cantidad del cultivo# mezclando con un vórtice durante 0 min & dejando reposar durante 04 horas. %l !ndice de %04 se da como porcentaje de la altura de la capa emulsionada :mm; dividido por la altura total de la columna de l!quido :mm; <,3=. Supercie mediciones de la tensión: %llos se hicieron con un Fisher Autotensiomat :Fisher Scientic )o.# Littsburgh# La.;. concentraciones de surfactina relativas se determinaron mediante la dilución del cultivo hasta que se alcanzó la concentración micelar cr!tica :)); <,4=. Aislamiento de surfactinaG %l m$todo descrito por )ooper et al. <,2= fue utilizado. surfactina bruto se aisló mediante la adición de /cido clorh!drico
concentrado a caldo de cultivo despu$s de la eliminación de la biomasa por centrifugación. Se formó un precipitado al disminuir el p> a 0# que podr!a ser recogida# se secó# & se etrajo con diclorometano. %l disolvente se eliminó a presión reducida para dar un sólido blanquecino. 7a puricación adicional se logró mediante recristalización. %l etracto de diclorometano se disolvió en agua destilada que contiene suciente ?aH> para dar p> . %sta solución se ltra a trav$s de Ohatman no. 4 de papel & reducido a p> 0 con >)l concentrado. %l sólido blanco se recogió en forma de gr/nulos despu$s de la centrifugación. caracterización cualitativa de la biofracturante producido: )romatograf!a de capa na se utilizó con el n de caracterizar biotensioactivo producido en caldo de cultivo de cepas bacterianas de acuerdo con el m$todo de Pin et al. )lG )>H>G >0H :-G ,-G -#2# v B v B v; como el desarrollo de sistema de disolventes con diferentes reactivos de desarrollo de color. 9eactivo de ninhidrina :-#2 g de ninhidrina en ,-- ml de acetona anhidra; se utilizó para detectar surfactina como puntos rojos. +iempo curso para el crecimiento celular & la producción de biosurfactanteG %n otra serie de eperimentos# una cultura quimiostato de 3*l cargado con ,-ml de S que contienen se llevó a cabo 4- g.l*, de alde*,2 para cada una de las cepas bacterianas seleccionadas. Se establecieron las condiciones de cultivo como se ha descrito anteriormente. Se tomaron muestras a intervalos regulares & se analizaron para la biomasa# surfactina & los hidratos de carbono residuales. An/lisis %l hidrato de carbono total en el caldo de cultivo se estimó por el m$todo de fenol*/cido sulfDrico usando manosa como un est/ndar <,=. 7a tasa de crecimiento espec!ca se determinó segDn L9+ <,8=. Se utilizó la siguiente ecuación
Q.loge.t R log 0* log ,
(onde N R tasa de crecimiento espec!fico# loge R logaritmo natural# , & 0 R concentraciones de dos valores para la biomasa :(O; en mitad de la fase logar!tmica de crecimiento celular & t R tiempo entre medidas de , & 0.
resultados %l aislamiento & la identicación parcial de hidrocarburos utilizando & microorganismos productores de biotensioactivo
)uarenta & ocho cepas microbianas con la capacidad de crecer en n* headecano como Dnico fuente de carbono & energ!a & que representa las diferentes morfolog!as de colonias se obtuvieron :Figura ,;. %stos inclu&en 38 :6#01; cepas como las bacterias formadoras de esporas# 8 :,5#1; como no formadoras bacterias formadoras & 0 :4#01; como levaduras. ?o se utilizaron adem/s la formación de bacterias & levaduras no forma esporas. Lor tanto# este estudio se limita a la producción biofracturante por la formación de esporas de bacterias que utilizan alcanos. (e los 38 aislamientos bacterianos formadoras de esporas# 3 mostraron biodegradación efectiva de hidrocarburos con una eciencia de conversión de m/s del 561. 7as tres cepas bacterianas fueron nombrados despu$s de la )olección de )ultivos (epartamento de 'iotecnolog!a de la Universidad de +aif# Arabia Saudita como '())*+USA*,# '())*+USA*0 & '())*+USA*3 & Kereused para los eperimentos de producción biofracturante. )aracter!sticas morfológicas & bioqu!micas 7os aislados morfológicamente distintos fueron identicados por las propiedades morfológicas# siológicas# & quimio*taonómica de acuerdo con el anual de 'erg& de bacteriolog!a determinativa <,6=. 7os tres aislamientos seleccionados fueron formadores de esporas# aeróbica# móviles# gramo varillas positivos# catalasa positiva# indol n egativo# termólo :creciendo vigorosamente a 22 E ); & se puede utilizar la glucosa# ilosa# maltosa# sacarosa# celobiosa# galactosa# almidón & manitol como fuentes de carbono & energ!a# pero que no pueden utilizar +Keen 8-. %sta identicación parcial las caracteriza como miembros del g$nero 'acillus <0-=. %stos resultados est/n en buen acuerdo con los obtenidos por LoTethiti&ooT et al. <0,= & Sadeghazad & @haem! <00= que informó de que las especies de bacilos estaban entre los microorganismos m/s ecaces en la biodegradación de alcano & la prevención de precipitación de la cera & la deposición. %amen para la producción biofracturante Aceite de capacidad de desplazamiento & la actividad de emulsión est/n entre las caracter!sticas m/s importantes de la producción de biofracturante microorganismos <,#=. %stas caracter!sticas han demostrado aumentar la tasa de biodegradación de hidrocarburos# estimular el crecimiento microbiano# reducir la viscosidad del aceite crudo & mejorar la recuperación de aceite a aceite campos <03#04#02= %n el presente estudio# biosurfactantes ?unca se detectaron en caldo de cultivo de cepas bacterianas cultivadas en >S> en presencia de n*headecano como Dnica fuente de carbono. Lor el contrario# argaritis et al. <03= & %toumi <05= encontraron varios tipos de biosurfactantes con cepas bacterianas de las
especies de Lseudomonas & actinomicetos cuando se crece en n*headecano. %sta discrepancia se debe mu& probablemente a la naturaleza de los microorganismos fermentativos & sustratos utilizados. Lor lo tanto# se intentó probar posibilidades para la producción de biosurfactante por estas cepas en los suministros de >S> con alde*,2 como sustrato de fermentación. 7os tres bacteriana seleccionada a!sla con la tasa de utilización m/s alta de alcano :+abla ,; fueron probados para la producción de biosurfactante de una fuente de carbono alternativa como se describe en la sección de ateriales & $todos. )uando crece en S con alde*,2 como fuente de carbono# theisolates producido biotensioactivo con concentración variable como sobrenadantes de cultivo ehiben capacidades de desplazamiento variable :+abla 0; & las actividades de emulsicación :+abla 3;. )lear&# aislar '())*+USA*3 mostró un mejor rendimiento en comparación con los otros tKoisolates. Un /rea de desplazamiento de aceite# el !ndice de emulsicación :%04;# con el petróleo crudo# de 5#6 cm0 & 61 se registran para aislar '())*+USA*3 en comparación con sólo ,0#5 & 081 para aislar '())*+USA*0 & 30#0 & 861 para a!sla '())*+USA*,# respectivamente. %stos resultados son comparables con los reportados por %toumi <05= & argaritis et al. <03= el uso de especies de Lseudomonas. ientras los !ndices de emulsicación registrado para los tres hidrocarburos# queroseno# petróleo crudo & aceite de motor :+abla 3;# hab!a una diferencia en la actividad de emulsicación de aislado de '())*+USA*3 en los tres hidrocarburos. Un !ndice de emulsión de 61 se logró con el petróleo crudo# 6-1 para aceite de motor & 851 para el queroseno. Lor lo tanto# aislar '())*+USA*3 mostró una emulsión preferente en el orden del crudo aceite de motor queroseno. Aislamiento e identicación de biotensioactivo Se identicó el biotensioactivo producido como surfactina por la t$cnica de +7) como manchas de color rojo se desarrollaron despu$s de la aplicación de reactivo de ninhidrina. Una vez m/s# aislar '())*+USA*3 ehibió el ma&or valor 9f & demostró ser los mejores productores de surfactina entre las cepas analizadas :+abla 4;. +iempo curso para el crecimiento celular & la producción de biosurfactante Figura 0 & la +abla 2 muestra el patrón de crecimiento & la producción de surfactina de alde*,2 por las tres cepas bacterianas seleccionadas. )omo se evidencia a partir de :Figura 0;# ade*,2 apo&a el crecimiento & la producción de surfactina de todos los aislamientos# pero a diferentes velocidades & eciencias con aislamiento '())*+USA*3 es la mejor. )asi no se observó ninguna fase de latencia durante el crecimiento. Alrededor del 0-1 de hidratos de carbono se consume durante las primeras ,- h de cultivo# con -#8* ,#0 g.l*, de la biomasa bacteriana. ?o se detectó surfactina durante este per!odo.
)on aislado '())*+USA*3# la concentración de biomasa m/ima de 2#65 gl*, se logró despu$s de 0- h seguido de la m/ima producción de surfactina de 452mg.l*, a 3- h con un consumo casi completo de alde*,2 :68#1V ; :+abla 2;. %sto est/ de acuerdo con 'ala et al. <0= & ?o$ et al. <5=# pero en desacuerdo con Sheppard et al. <08= informó de que la m/ima producción de surfactina a mediados de la fase de registro & @ong et al. <= que encontró que la producción de surfactina fue un proceso de crecimiento asociado. %sta discrepancia podr!a atribuirse a la naturaleza de los microorganismos & los par/metros ambientales & culturales empleado en cada estudio. 7os aislados '())*+USA*, :Figura 0A; & '())*+USA*0 :Figura 0';# dio lugar a mucho m/s bajos alde*,2 eciencias de conversión :58#, & 25#61# respectivamente; con concentraciones de biomasa de tan sólo 0#80 & ,#4 g.l*,# respectivamente. Al mismo tiempo# el aislado bacteriano '())*+USA*, produce sólo 0#-2- mg.l* de surfactina incluso cuando su capacidad para degradar n*headecano fue el mejor :+abla ,;. 7a producción de surfactina m/s bajo de 25- mg.l*, se registró para aislar '())+USA* 0 :+abla 0;. )omo se ilustra en la :Figura 0;# se observó una disminución gradual de la tensión supercial para las tres cepas bacterianas. %ste fue coordinada con el inicio de la producción de surfactina. Se detectó la tensión supercial m!nima despu$s de aproimadamente ,2 h & se mantiene durante todo el per!odo de cultivo restante. %n contraste# la producción de surfactina siguió aumentando alcanzando su m/imo en casi 02 h# donde &a se ha alcanzado la fase estacionaria del crecimiento celular. )on respecto a los par/metros cin$ticos generales# aislar '())+USA* 3 mostró ventaja sobre los otros aislados :+abla 0;. +hisisolate alcanzado los valores m/s altosG tasa de crecimiento espec!co -#450 h*,# rendimiento -#,2, crecimiento gcells.galde*,2# surfactina producir ,,#6 gsurfactin B galde*,2# el rendimiento de surfactina por unidad de peso seco de 8-#0 mgsurfactin B gcells & la productividad volum$trica del reactor de alto ,22 gl*,.h*,. ?o$ et al. <5= desarrollado un proceso para la producción de surfactina continua utilizando un biorreactor de transporte a$reo utilizando 'acillus subtilis & el registro de una de las tasas m/s altas de crecimiento espec!cos# reportado en la literatura :-.44h*,; que es menor que la reportada en este estudio. %sto es m/s probablemente debido al aumento de las concentraciones de glucosa libre & de cadena corta maltodetrinas presente en alde*,2 que podr!a iniciar el crecimiento celular & la multiplicación activa. (urante los Dltimos 2- aos# un nDmero de resultados prometedores se han obtenido en la mejora del rendimiento de surfactina por fermentación. Arima et al. <06= producido en primer lugar surfactina# con una producción Dnica con 2-*
,-- mg 7*, en un cultivo de 04 *h. %ntonces# )ooper et al. <,2= desarrolló un proceso continuo con la eliminación de productos & catión met/lico adem/s que dio lugar a la mejora de rendimiento de surfactina de 8- mg.l*,. ulligan et al. <3-= utilizado el mutante ultravioleta del 'acillus subtilis A+)) 0,330 que produjeron m/s de tres veces m/s surfactina :,#,04 mg B 7;. /s recientemente# Sen & SKaminathan <3,= optimizan el medio de fermentación & obtener una producción m/ima de surfactina 5- mg.l*,. )lear&# los resultados obtenidos en el presente estudio VV %l uso de aislar '())+USA* 3 se comparan mu& favorablemente con los reportados en la literatura & demostrar su superioridad. )omo cultivador r/pido en alcanos# productor móviles & ecaz de surfactina# el aislado bacteriano '())*+USA*3 tiene un potencial de aplicaciones como agente de eor en &acimientos de petróleo casi agotados & B o aquellos con historia de deposición de cera de parana. )onclusión %l presente estudio proporciona una notable cepa de bacterias termólas con una potencialidad prometedor en el uso como agentes H%9. %l alde*,2# un subproducto recuperado durante la fabricación de jarabe de fructosa a partir de almidón de ma!z# fue demostrado ser un sustrato viable para fermentativa relativamente alta producción de surfactina. Al lado de la disponibilidad de potentes '())*+USA*3 cepa & el sustrato de fermentación baratas para el crecimiento celular & la producción de surfactina# proceso de producción de surfactina necesita ser totalmente optimizado# tanto a nivel biológico & de ingenier!a con el n de competir con $ito con surfactantes qu!micos. +rabajar isin progreso con el n de optimizar las condiciones culturales & ambientales necesarias para tasas m/s altas para la utilización del sustrato & producción de surfactina tambi$n. Figura ,
+ablas
+abla ,
+abla 0
(istribución de los diferentes tipos de microorganismos presentes en las muestras de aceite contaminado. )on respecto a los par/metros cin$ticos generales# aislar '())+USA* 3 mostró ventaja sobre los otros aislados :+abla 0;. %ste ,# los porcentajes de conversión de n* headecano de biomasa 0# g de biomasa :(O; producido a partir de g de headecano consumido. Lar/metros de crecimiento de las tres cepas bacterianas cultivadas en S con n*headecano como fuente de carbono & energ!a. zona de (esplazamiento de aceite por sobrenadante libre de c$lulas de
+abla 3
+abla 4
las tres cepas bacterianas. !ndice de emulsicación :%04; de sobrenadante libre de c$lulas de las tres aislado bacteriano con varios hidrocarburos de petróleo. 7os valores de 9f para biofracturante utilizando cromatograf!a en capa na.
,# los porcentajes de alde*,2 conversión a biomasa & surfactina 0# mg surfactina produce a partir de ,#g de alde*,2 3# la biomasa g de c$lulas :peso en seco; produce a partir de ,#- g de alde*,2 +abla 2.
Figura 0
)in$tica de crecimiento de las c$lulas & la producción de surfactina por las tres cepas bacterianas cultivadas en S con alde*,2 como Dnica fuente de carbono. odelo de crecimiento celular & la producción de surfactina por la aislamientos bacterianos '())*+USA* , :A;# '())*+USA*0 :'; & '())*+USA* 3 :); cultivadas en S suministra con alde*,2 como carbono fuente.
