Tricrómico de Masson Las tinciones tricrómica son usadas frecuentemente para diferenciar entre colágeno y músculo liso en tumores e identificar incrementos en tejidos colagenosos en enfermedades como cirrosis hepática. Tinción tricrómica más simple ya que ocupa solo dos colorantes aniónicos después de la tinción nuclear con hematoxilina férrica. Se pueden hacer variación utilizando distintos colorantes o soluciones con distintos heteropoliácidos. Fundamento
El rol jugado por el ácido fosfomolíbdico en la tinción selectiva de fibras del tejido conectivo, fue investigado probando la hipótesis: el ácido se une al tejido y de este modo conserva la capacidad de unir colorantes, por la formación de enlaces salinos con sus grupos básicos (del ácido). La reacción del azul de molibdeno demuestra que el ácido fosfomolíbdico se une a muchas estructuras las cuales son teñidas selectivamente por métodos tricromicos o por la combinación de tinción acido-base del ácido fosfomolíbdico, particularmente tejido conectivo. Así las propiedades adquiridas de la tinción por las fibras del tejido conectivo, después del tratamiento con ácido fosfomolíbdico están probablemente debido a la presencia de este acido sobre las fibras. El ácido fosfomolíbdico no fue desplazado por el colorante, como sugirió Zeiger, desde una reacción de azul de molibdeno de intensidad regular podría ser aun obtenida después de la tinción con verde claro. A cualquier velocidad el ácido fosfomolíbdico es intercambiado, probablemente por un anión. Esto, obviamente, no ocurre desde un colorante aniónico puro que no tiñe fibra del tejido conectivo después del ácido fosfomolíbdico. Se concluye que el ácido fosfomolíbdico es retenido por el tejido y por enlaces moleculares de colorantes. Hay varias evidencias de que el enlace entre el ácido fosfomolíbdico y el colorante es de naturaleza salina: 1-. La presencia de grupos cationicos en el colorante era indispensable para teñir después del ácido fosfomolíbdico. 2-. Grupos básicos fuertes producen tinción mas intensa 3-. Con colorantes débilmente básicos bajando el pH, y por lo tanto
aumentando la disociación de grupos básicos, también aumenta la intensidad de colorantes. 4-. Otros enlaces tales como valencias residuales o puentes de hidrogeno no juegan, probablemente, un rol esencial ya que un numero de colorantes muestra distribución asimétrica de cargas eléctricas y H (labiles) no fueron, o sólo escasamente, establecidos después del tratamiento con ácido fosfomolíbdico. Se concluyó que el colorante y el acido fosfomolíbdico forman una sal en la cual el colorante es el cation. El hecho de que las fibras de tejido conectivo se unen a sustancias con propiedades acidas (ácido fosfomolíbdico o colorantes con grupo ácido) sugiere que estas fibras contienen grupos básicos, los que forman sales con el ácido fosfomolíbdico. Así el ácido fosfomolíbdico polivalente aparece para formar un puente entre los grupos básicos del sustrato y los grupos básicos del colorante. En otras palabras la adición del ácido fosfomolíbdico en tejido conectivo cambia su acidofilia por basofilia. El ácido fosfomolíbdico no solamente produce una tinción intensa de las fibras de tejido conectivo por colorantes de grupos básicos (colorantes básicos o anfotéricos), pero también reduce la tinción del citoplasma, así produce una tinción específica de fibras del tejido conectivo. La explicación de este segundo efecto se encuentra en el hecho de que en el citoplasma, el cual es conocido por teñirse con colorantes de grupos ácidos (colorante acido o anfotérico), se producen algunos enlaces de ácido fosfomolíbdico, aunque menos que en el tejido conectivo. Las cantidades pequeñas de ácido fosfomolíbdico en el citoplasma previene la salida del colorante acido, y ocurre para tinciones escasas obtenidas con colorantes anfoteritos y para tinciones moderadas obtenidas con colorantes ácidos. Los procedimientos tricrómicos son nombrados así porque se usan tres tipos de tinciones, que pueden incluir o no la tinción nuclear. Las secciones se tiñen primero con un colorante ácido como el escarlata biebrich, todos los elementos acidofilicos del tejido como citoplasma, músculo y colágeno se unirán a los colorantes ácidos.
Las secciones después son tratadas con acido fosfotúngstico y/o ácido fosfomolíbdico. Dado que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, el ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico, causan que el colorante escarlata biebrich difunda hacia fuera del colágeno pero no del citoplasma. Acido fosfotúngstico y/o ácido fosfomolíbdico tienen numerosos grupos acídicos que muy probablemente actuaran como un enlace entre el colágeno descolorado y el azul de anilina, el colorante de colágeno. Probablemente el pH de la solución ácida fosfotúngstico/ácido fosfomolíbdico también incremente la coloración selectiva del colágeno y contribuye a la difusión o remoción del escarlata de biebrich.
Reactivos Solución de hematoxilina férrica de Weigert. Solución A: Solución B: -
Hematoxilina cristalizada Alcohol 95-100%
1 gr 100 ml
Dejar reposar unos 8 min antes de usar -
Cloruro Ferrico - Agua destilada - Acido Clorhídrico concentrado -
Solución Biebrich Scarlett- fucsina acida: -
Biebrich Scarlett 1% solución acuosa (C.I 26905)
45 ml
-
Fucsina Acida 1% solución acuosa (C.I 42685)
5 ml
-
Acido Acético glacial
1 ml
Solución PMA-PTA (Ac. Fosfomolibdico- fosfotungstico) -
Acido Fosfomolibdico
-
Acido Fosfotungstico
-
Agua estilada
1.25 gr 1.25 gr 50 ml
1.5 gr 95 ml 1 ml
Solución de Anilina -
Azul de Anilina (C.I 42755)
-
Acido Acético glacial
-
Agua estilada
1.25 gr 1 ml 50 ml
Solución acuosa de ácido acético glacial al 1%.
Reacción
a) Hematoxilina férrica de Weigert (I) *Colorante aniónico *Actúa como mordiente - Aplicación de alcohol acido para la diferenciación de la tinción nuclear. b) Solución de Biebrich scarlett-Fucsina ácida (II) *Colorante aniónico
c) Solución ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (PMA-PTA) *Actúa como mordiente y diferenciador *Solución muy aniónica y de moléculas grandes *Saca el exceso de colorante y se queda unido al tejido conectivo favoreciendo que el azul de anilina se una por medio del ácido.
d) Azul de anilina o azul de metileno (III) *Colorante catiónico
e) Solución de ácido acido acetico.
Procedimiento de Tinción Masson 1.
Desparafinar (Xilol I, II, III cada uno por 5 min)
2.
Hidratar (OH 100º I, II, III; OH 95º I, II y OH 70º I, cada uno 5 min)
3.
Agua destilada (5 min)
4.
En material fijado en soluciones de formaldehído o alcohólicas se recomienda hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 ºC o toda la noche a temperatura ambiente.
5. Enfriar y lavar con agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo 6. Lavar en agua destilada 7.
Teñir con Hematoxilina Ferrica de Weigert (10 min)
8.
Lavar con abundante agua corriente (hasta que los núcleos se vean nítidamente negros)
9. Lavar con agua destilada 10. Teñir
en solución Biebrich Scarlett- fucsina acida (2 min)
11.Lavar en agua destilada 12.
Colocar en solución PMA-PTA (10-15 min)
13.Lavar con agua destilada 14. Teñir
en azul de anilina (5 min)
15.Lavar con agua destilada 16.
Colocar en solución Acido Acético 1% (3-4 min)
Deshidratar (desde alcohol de 95º por 2 min, OH 100º I, II, III cada uno por 5 min)
17.
18.
Aclaramiento (Xilol I, II, III cada uno por 5 min)
19.Montar
Resultados Esperados Masson Estructura celular Fibras colágenas Musculatura Citoplasma Queratina Fibras Musculares Núcleos
color Azul o verde Rojo Rojo Rojo Rojo Azules
