TRABAJO PRÁCTICO PRÁCTICO N° 7 M3- BIOLOGÍA CINÉTICA ENZIMÁTICA TRABAJO PRÁCTICO N° 6 ESTUDIO CINETICO DE LA ENZIMA ALFA-AMILASA.
INTRODUCCION. La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir: - por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo - por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S) y de la enzima (E) en la cinética del alfa-amilasa en su acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol). Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol: AMILOSA AMILOPECTINA AMILOPECTINA + Amilasa -------------- AMILODEXTRINAS +IODO = resultado Color azul violeta
MALTOSA + GLUCOSA -----------------------+IODO -------------- ---------+IODO No dan coloración
Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. En Esta práctica no estudiaremos el efecto del pH y la temperatura. La influencia de la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacción de la forma ya descrita pero utilizando diferentes c(E), manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). FORMULE LA PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN: -------
TRABAJO PRÁCTICO N° 7 M3- BIOLOGÍA CINÉTICA ENZIMÁTICA
FORMULE UNA HIPÓTESIS: -----FORMULE UN APREDICCIÓN: ---------
IDENTIFIQUE VARIABLE INDEPENDIENTE:---INDENTIFIQUE VARIABLE DEPENDIENTE:----IDENTIFIQUE VARIABLES DE CONTROL:……. Debido a que utilizaremos amilasa comercial extraída de hongos Aspergillus sp debe considerar que la temperatura óptima en este caso es de 50° y su pH óptimo es 7. ¿Cuál es la temperatura y pH óptimos de la alfa amilasa salival (ptialina)? Responda las siguientes preguntas (si es necesario consulte y busque en la bibliografía): 1. ¿Cuáles son las características estructurales del almidón? 2. ¿Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival? 3. ¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón? 4. ¿Cuál es el efecto del co-factor ClNa? 5. ¿Qué función cumple el ácido clorhídrico en este experimento? 6. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura. MATERIALES • •
•
•
•
•
•
•
Solución del enzima amilasa al 1% M/V + ClNa % M/V Disolución de almidón al 0,25 %. Lugol Tubos de ensayo. placa de porcelana, vasos de precipitado, baño de agua termostatado a 50° C, cronómetro,
TRABAJO PRÁCTICO N° 7 M3- BIOLOGÍA CINÉTICA ENZIMÁTICA •
Mechero
•
Gradilla
•
Termómetro
•
PIPETAS
•
Gotero de HCl puro (ácido clorhídrico)
EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA de la CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA PROCEDIMIENTO:
1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml de disolución de almidón al 0,25 %. 2. Agregue en cada tubo 3 ml de agua 3. Añada a cada tubo 1; 2; 3 y 4 ml de disolución del enzima respectivamente, Añada
primero el agua y luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima en cada tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento. 4. En cada intervalo de 5 minuto ensaye en la placa de cerámica la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que extraer 0.5 ml del tubo con la enzima y el almidón colocarlo en la placa y luego adicionar una gota de HCl puro (ácido clorhídrico) y dos gotas del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. 5. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control. Construya una tabla de datos brutos que contemple el número de cada tubo, el volumen de la enzima (ml±….), Tiempo total de reacción (min), Velocidad de la reacción (1/t)
6. Con estos datos construya un gráfico de c(E) en el eje ordenado contra velocidad de reacción (vol/t) en el eje de abscisas.
TRABAJO PRÁCTICO N° 7 M3- BIOLOGÍA CINÉTICA ENZIMÁTICA
EXPERIMENTO # 2 ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO PROCEDIMIENTO:
1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada 2 ml de solución de almidón al 0,1%, 0,20%, 0,25 y 0,30% respectivamente. 2. Complete el volumen de cada tubo con 3 ml de agua destilada. 3. Adicione a cada tubo 4 ml de disolución del enzima Alfa amilasa e incúbelos a 50 grados Celsius. 4. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidón mediante la reacción con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental # 1. 5. Con los datos obtenidos construya una de tabla de datos brutos. 6. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción (1 / tiempo) en el eje ordenado contra concentración de sustrato en el eje de abscisas.
REPORTE DE LABORATORIO.
Experimento # 1: Estudio de la influencia de la concentración del enzima. 1. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón (esto será la Introducción de su informe). Describa en este aparatado la pregunta de investigación puesta a prueba, la hipótesis y las predicciones, señale las variables involucrados así como el método que utilizó para controlar al menos una de las variables control. 2: Materiales y Método: explique con SUS PALABRA LOS MÉTODOS UTILIZADOS. 3. RESULTADOS: Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de reacción contra c(E), tomando como concentración del enzima el volumen de la solución utilizado en cada tubo. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de reacción el inverso del tiempo?. DESCRIBA LOS RESULTADOS 3. CONCLUSIONES Y EVALUACIÓN: Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados del experimento. EXPLIQUE LOS RESULTADOS ENCONTRADOS 4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo DEBIDO A LOS ERRORES DE DISEÑO EXPERIMENTAL
TRABAJO PRÁCTICO N° 7 M3- BIOLOGÍA CINÉTICA ENZIMÁTICA
Experimento # 2: Estudio de la influencia de la concentración del sustrato. 1. Describa en este aparatado la pregunta de investigación puesta a prueba, la hipótesis y las predicciones, señale las variables involucradas así como el método que utilizó para controlar al menos una de las variables control. 2. 2: Materiales y Método: explique con SUS PALABRA LOS MÉTODOS UTILIZADOS.
3. RESULTADOS: Anexe la tabla y el gráfico elaborados según las indicaciones del trabajo práctico, tomando como valor de c(S) la concentración de sustrato en cada caso. ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo? DESCRIBA LOS RESULTADOS 4. CONCLUSIÓN Y EVALUACIÓN: Analice el gráfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso. EXPLIQUE LOS RESULTADOS 5. Describa las dificultades presentadas en este ensayo PUNTUALIZANDO EN LOS ERRORES DEL DISEÑO.
