GENÉTICA BACTERIANA 2014 TRABAJO PRÁCTICO Nº2: TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA Introducción: La transducción es la transferencia, de una célula a otra, de material genético no vira virall dent dentro ro de la cobe cobert rtur uraa vira viral. l. La tran transd sduc ucció ción n fue fue descu descubi biert ertaa por por Zind Zinder er and and Ledenberg en 1952 cuando intentaban obtener recombinantes genética en Salmonella luego Salmonella luego de la transferencia transferencia de marcadores por conjugación. conjugación. En el transcurso de estos estudios, estudios, los investi investigad gadore oress observ observaro aron n ue alguna algunass recomb recombina inante ntess pod!an pod!an ser recuper recuperada adass a"n sin mediar contacto directo entre las células dadoras # aceptoras. El agente ue mediaba esta trans transfer feren encia cia de gene geness resu result ltó ó ser resist resisten ente te a $%&a $%&asa sa # filt filtrab rable le,, demo demost str'n r'ndo dose se posteriormente ue se trataba del bacteriófago (22 de Salmonella. Salmonella. Los fagos fagos (22 (22 # (1, entre otros, otros, son capaces capaces de transfer transferir ir cualu cualuier ier parte parte del geno genoma ma del del )osp )osped edad ador or,, por por lo ue ue el proc proces eso o ue ue medi median an reci recibe be el nom nombre bre de transducción transducción generali*ada. generali*ada. Los lisados lisados ue se usan para reali*ar reali*ar transducció transducción, n, aunue aunue principalmente compuestos por fagos infecciosos, contienen una peue+a porción de part!culas transductantes. Estas "ltimas se forman cuando fragmentos de &$% del dador son son empa empaca cado doss en las las cabe cabe*a *ass de los los fagos fagos en luga lugarr del del &$% viral viral.. Las Las part! part!cu cula lass transductantes, ue carecen completamente de &$% viral, son las encargadas de transmitir, infección mediante, un fragmento de &$% del dador a una minor!a de células aceptoras. na ve* produc producida ida la transfe transferen rencia cia,, se recuper recuperan an transdu transducta ctante ntess establ estables es si el &$% &$% trans transfer ferid ido o logr lograa inco incorp rpor orars arsee al geno genoma ma de la célu célula la recep recepto tora ra.. Esto Esto es, si logr lograa recomb recombina inarse rse median mediante te -ec&, -ec&, replica replicarse rse indepe independi ndient enteme emente nte por por ejempl ejemplo o si es un pl'smido/ o transponer por ejemplo si contiene un transposón/. El bact bacter erió iófa fago go (22 (22 de Salmonella Salmonella enterica enterica serovar 0#p)imu 0#p)imurium rium posee una c'psid c'psidee capa* capa* de trans transpo port rtar ar 3b de $%&, $%&, un poco poco meno menoss ue ue el 14 del del &$% cromosomal de su )ospedador por lo ue es mu# poco probable p 6,661/ ue se trans transfi firie riera ran n 2 marca marcado dore ress a la ve*, ve*, si los los marc marcad ador ores es selec selecci cion onad ados os no est'n est'n lo suficientemente cerca como para ser llevados dentro de un mismo fragmento de &$%. (or otro lado, # dado ue el fago (22 sólo empaueta &$% del dador en una frecuencia mu# baja 716 8/, se suele emplear en los e:perimentos de transducción al fago mutante (22;0 por < High Transducing =/ =/ el ue no recono reconoce ce los sitios pac # empaueta &$% al a*ar generando un 7564 de part!culas transductantes. Es de remarcar ue la cotranducción )a sido un método poderoso para mapear genes # contin"a siendo de gran utilidad para la construcción de cepas. Objetivo: >bservar transferencia de marcadores conocidos en Salmonella enterica serovar enterica serovar 0)#p)imurium mediante transducción generali*ada, usando como )erramienta genética el bacteriófago (22;0. (22;0. (ara ello se utili*ar'n un lisado provenientes una cepa de Salmonella ue Salmonella ue transporta - marcadores conocidos? la cepa ;@6 golS ??Am ??Am , golB?? golB??lacZ lacZ 8Bm 8Bm- / # la ;@65 cueR cueR?? ?? Am- , copA+??lacZ ??lacZ 8Bm 8Bm- /. $ura $urant ntee el trab trabajo ajo pr'ct pr'ctic ico o se obte obtend ndr' r' # titu titula lar' r' un lisad lisado o transductor proveniente de esta cepa # se utili*ar' el mismo para transducir marcadores a una una cepa cepa salv salvaje aje de S. enteric enterica a 162s la cual es Bm C AmC/. El alumno aprender' a
interpretar como afecta la D> a la eficiencia de transformación # la distancia de los marcadores en el genoma de la bacteria con su frecuencia de co8transducción. Desarrollo del Trabajo Práctico
Día 1: Obt!"#$! %& &#'a%( P22)T t*a!'%+"ta!t ,Pa*t 1-. (ara obtener un lisado de fagos en placas se procede de la siguiente manera?
♦ -eali*ar diluciones seriadas del lisado (22;0 dil. 1682, 168/ en tubos eppendorf estériles. Bolocar apro:imadamente ml de L@ soft en un tubo de )emólisis # llevar a ba+o a 7 F6GB para ue no solidifiue.
♦ De*clar en un tubo de )emólisis estéril 166 Hl de una dilución 16 8 del fago (22;0 con 166 Hl de un cultivo saturado de la cepa de S. enterica de la cual se desea obtener el lisado. El grupo 1 # 2 de la comisión usar'n la cepa ;@6 golS ??Am- , golB??lacZ 8 Bm- /, mientras ue los grupos # la cepa ;@65 cueR?? Am- , copA+??lacZ 8Bm- /. (unto Br!tico? La infección )a comen*ado por lo ue no debe dejarse muc)o tiempo la me*cla en el tubo. Es por esto, ue el L@ soft debe estar li sto en este punto.
♦ &gregar a la me*cla el L@ soft previamente enfriado a una temperatura de 756IB es recomendable usar un vorte: para bajar la temperatura # c)euear la ausencia de
♦ ncubar en estufa JIB )asta la aparición de las placas de lisis K de 5 )s/.
Dt*/#!a"#$! %& tít+&( %& &#'a%( P22)T t*a!'%+"ta!t ,Pa*t 1-. ♦ -eali*ar diluciones seriadas del lisado dil. 1682, 168, 168F # 168J/ en tubos eppendorf estériles. El grupo 1 # 2 de la comisión usar'n el lisado transductante obtenido a partir de la cepa ;@6 (golS ??Am- , golB?:lacZ 8Bm- /, mientras ue los grupos # el lisado obtenido a partir de la cepa ;@65 (cueR?? Am- , copA+?:lacZ 8Bm- /. Estos lisados ser'n dados por el docente.
♦ Bolocar apro:imadamente ml de L@ soft en dos tubos de )emólisis # llevar a ba+o a 7 F6GB para ue no solidifiue.
♦ De*clar 166 Hl de las 2 "ltimas diluciones con 166 Hl de un cultivo saturado de S. enterica 162s en un tubo de )emólisis estériles. (unto Br!tico? La infección )a comen*ado por lo ue no debe dejarse muc)o tiempo la me*cla en el tubo. Es por esto, ue el L@ soft debe estar li sto en este punto.
♦ &gregar a la me*cla el L@ soft previamente enfriado a una temperatura de 756IB es recomendable usar un vórte: para bajar la temperatura # c)euear la ausencia de
♦ ncubar en estufa a JIB )asta la aparición de las placas de lisis K de 5 )s/.
Día 2: Obt!"#$! %& &#'a%( P22)T t*a!'%+"ta!t ,Pa*t 2-. ♦ Luego de la incubación, agregar 5 ml de L@ sobre la placa conteniendo el lisado de fagos # romper la capa de L@ soft con una esp'tula de $r#gals3i )asta )omogenei*ar.
♦ 0ransferir 1 ml de la me*cla a un tubo eppendorf, agregar 266 Hl de cloroformo # me*clar con vórte:.
♦ Bentrifugar 5 min a 12666 rpm # trasvasar el sobrenadante a un tubo eppendorf no flamear los tubos ue contienen cloroformo a la llama del mec)ero/. &gregar cloroformo. Este lisado lo usar' otra comisión.
Dt*/#!a"#$! %& tít+&( %& & &#'a%( P22)T t*a!'%+"ta!t ,Pa*t 2-. ♦ Bontar las unidades formadoras de placas M(/ presentes en cada placa # estimar el n"mero de ufpNml en el lisado original.
T*a!'%+""#$! !*a&#a%a ,Pa*t 1-. ♦ -eali*ar diluciones seriadas del lisado transductante dil. 1681 # 1682/. Bada grupo usar' el lisado cu#o t!tulo determinó.
♦ En tubos eppendorf estériles reali*ar las siguientes me*clas. 0@> 1 2 5
>% Salmonella 5 : 169 ufcNml/ 56 Pl 56 Pl 56 Pl 56 Pl 56 Pl
Lisado (22 (laca transductor L@&EO0&/ 56 Pl puro/ BmNAm 81 56 Pl dil. 16 / BmNAm 82 56 Pl dil. 16 / BmNAm 81 56 Pl dil. 16 / Bm 8/ Bm
♦ ncubar en estufa a JIB 16 min. (unto Br!tico? La infección )a comen*ado por lo ue no debe dejarse muc)o tiempo la me*cla en el tubo. Es por esto, ue es recomendable largar las infecciones de manera escalonada en el tiempo.
♦ Cembrar las transductantes usando esp'tula de $r#gals3i. ♦ ncubar a JIB )asta el d!a siguiente. Bomentario mportante? (ara evitar la reinfección de la bacteria dadora las placas de L@& son suplementadas con 1mD EO0& Et)#lene gl#col8bisbeta8aminoet)#l et)er/8%,%,%Q,%Q8t etraacetic acid/. El EO0& uela los iones Ba 2R de manera ue estos no est'n disponibles para la adsorción del fago. & diferencia del E$0&, el EO0& se une preferentemente a este metal respecto a otros metales esenciales como Dg 2R o Zn2R.
Día : T*a!'%+""#$! !*a&#a%a ,Pa*t 2-. ♦ ;acer recuento de las colonias obtenidas. Bompletar la tabla usando la información de los otros grupos # sacar conclusiones. (uede concluir cu'l fue la mejor D> para el ensa#o de transducción. (uede justificar las diferencias encontradas entre las cepas. 0ubo
Darcador de Celección
1
BmNAm
2
BmNAm
BmNAm
Bm
5
Bm
D>
%G Bolonias para lisados de cepa ;@6
%G Bolonias para lisados de cepa ;@65
6
&dem's, S Tué controlNes )ar!a para descartar ue las transductantes obtenidas no provienen del lisado transductantes como resultado de una acción inefica* del cloroformoU
G+ía R3#%a: P*3"t#"( T*a!'%+""#$! G!*a&#a%a T*a!'%+""#$! !*a&#a%a
Día 2 ,Pa*t 1-
Día ,Pa*t 2-
El grupo 1 # 2 usar'n el lisado transductante (22;0 ;@6/.
-eali*ar diluciones seriadas del lisado transductante dil. 1681 # 1682/. Bada grupo usar' el lisado cu#o t!tulo determinó.
Hacer recuento de las colonias obtenidas. Completar la tabla usando la información propia y de los otros grupos .
El grupo # usar'n el lisado
En tubos eppendorf estériles reali*ar las siguientes me*clas .
0odos usar'n la cepa 162s.
ncubar en estufa a JIB 16 min. # sembrar todo el volumen en las placas usando esp'tula de $r#gals3i.
ncubar a JIB )asta el d!a siguiente.
P+!t( C*ít#"(
Determine MOI optima y frecuencia de cotransducción de los marcadores. Puede justicar las diferencias encontradas entre las cepas.
G+ía R3#%a: P*3"t#"( T*a!'%+""#$! G!*a&#a%a T*a!'%+""#$! !*a&#a%a
Día 2 ,Pa*t 1-
Día ,Pa*t 2-
El grupo 1 # 2 usar'n el lisado transductante (22;0 ;@6/.
-eali*ar diluciones seriadas del lisado transductante dil. 1681 # 1682/. Bada grupo usar' el lisado cu#o t!tulo determinó.
Hacer recuento de las colonias obtenidas. Completar la tabla usando la información propia y de los otros grupos .
El grupo # usar'n el lisado
En tubos eppendorf estériles reali*ar las siguientes me*clas .
0odos usar'n la cepa 162s.
ncubar en estufa a JIB 16 min. # sembrar todo el volumen en las placas usando esp'tula de $r#gals3i.
P+!t( C*ít#"(
Determine MOI optima y frecuencia de cotransducción de los marcadores. Puede justicar las diferencias encontradas entre las cepas.
ncubar a JIB )asta el d!a siguiente.
PREGUNTAS 5 PROBLE6AS 1. SBómo se determina el t!tulo de un fagoU SEn ué unidades se e:presaU 2. STué tipos de transducción conoceU Dencione las diferencias entre ellas. . SBu'l es la diferencia entre los mecanismos de transducción generali*ada mediada por los fagos (1 # (22U . STué tipo de part!culas se pueden distinguir en un lisado de un bacteriofago ue )ace transducción generali*ada (22/U S# en un lisado ue )ace transducción especiali*ada λ) U 5. SEs posible transferir pl'smidos por transducciónU F. S& ué se llama multiplicidad de infección o D>U STué D> se debe usar al reali*ar una transducciónU J. S& ué distancia m':ima deben encontrarse dos marcadores para ue los mismos se transdu*can juntos en un e:perimento de cotransducciónU SBómo var!a la frecuencia de cotransducción con la distancia a la ue se encuentran dos marcadoresU . S$e ué factores depende la frecuencia de transducción mediada por un fagoU SBu'les
PREGUNTAS 5 PROBLE6AS 1. SBómo se determina el t!tulo de un fagoU SEn ué unidades se e:presaU 2. STué tipos de transducción conoceU Dencione las diferencias entre ellas. . SBu'l es la diferencia entre los mecanismos de transducción generali*ada mediada por los fagos (1 # (22U . STué tipo de part!culas se pueden distinguir en un lisado de un bacteriofago ue )ace transducción generali*ada (22/U S# en un lisado ue )ace transducción especiali*ada λ) U 5. SEs posible transferir pl'smidos por transducciónU F. S& ué se llama multiplicidad de infección o D>U STué D> se debe usar al reali*ar una transducciónU J. S& ué distancia m':ima deben encontrarse dos marcadores para ue los mismos se transdu*can juntos en un e:perimento de cotransducciónU SBómo var!a la frecuencia de cotransducción con la distancia a la ue se encuentran dos marcadoresU . S$e ué factores depende la frecuencia de transducción mediada por un fagoU SBu'les de ellos pueden ser mejoradosU 9. n investigador aisló recientemente un fago ue crece en E. coli. Este fago reali*a transducción generali*ada en algunas cepas de E. coli # transducción especiali*ada en otras. a/ SBómo podr!a distinguir entre transducción generali*ada # especiali*ada usando un test genético simpleU b/ Cugiera una e:plicación para estos resultados. 16. Vanofs3# aisló dos mutantes trpA trpA8 # trpA1 /. (ara determinar el orden de las dos mutaciones trpA respecto al gen trpE , reali*ó el e:perimento de transducción con (1 descrito a continuación? $onor? trpA1 trpE R &ceptor? trpA8 trpE 8 Darcador seleccionado? trpA+ 166 colonias Darcadores encontrados? trpAR trpE R 16 coloniasW trpAR trpE 8 96 colonias En base a estos resultados, cual ser!a el orden m's adecuado de estos genesU $etermine si el orden es trpE trpA8 trpA1 o trpE trpA1 trpA8/ 11. Ce lleva a cabo un e:perimento de transducción con (1 para determinar el orden de sitios de mutación en el gen trpA de E. coli, utili*ando una mutación ligada estrec)amente,
llamada ant , como un marcador no seleccionable. En cada una de las cru*as listadas debajo, son seleccionados recombinantes T*7 # luego testeadas para el alelo ant + o ant -. El genotipo de la donante es dado en primer término # el porcentaje de recombinantes T*7 ue es ant + es dado entre paréntesis. Bru*a 1? ant + trpA34 : Bru*a 2 ant + trpA4 : Bru*a ? ant + trpA223 : Bru*a ? ant + trpA223 :
ant - trpA223 ant - trpA223 ant ! trpA34 ant ! trpA4
14 ant +/ 524 ant +/ 564 ant +/ 264 ant +/
SBu'l es el orden de los marcadores trpA con respecto al gen ant U 12. En un e:perimento de transducción generali*ada, la cepa donora de E. coli tiene el genotipo XR VR &8 ZR # la cepa aceptora tiene el genotipo X 8 V8 &R Z8 . Ce seleccionaron transductantes mediados por el fago (1 para X R o VR # se determinó el fenotipo con los siguientes resultados?
$etermine el orden del gen & respecto a los genes X, V, Z. $etermine la frecuencia de co8transducción para X # &W X e V, # para V # Z e V # &. 1. SBu'l es el fenotipo de un fago λ mutante en el gen int U V en el gen !isU 15. SBu'l de los siguientes genes es reuerido para una lisogeni*ación eficiente luego de la infección de un )ospedador sensible por un fago λ? int , !is, %, c, TU 1F. SBuando una ;fr ue lleva un profago λ transfiere su cromosoma a una célula M8 no lisógena para λ, ésta célula muere. (or uéU 1J. na ;fr transfiere genes en orden alfabético a, b, c, d, e, f, g, ), etc/ por conjugación con una cepa C12 M 8/. na variante de la misma ;fr, denominada Y1, posee un profago
X(1 insertado en su cromosoma. Buando se reali*a una conjugación con la cepa Y1 como donadora, se observa ue solamente se transfieren los genes )asta el gen e. Es decir ue los genes m's all' del e nunca son transferidos. Cugiera una e:plicación para este fenómeno. 1. El represor termosensible c"8# es desnaturali*ado reversiblemente, cuando las células son calentadas a 6IB. Ci luego del calentamiento, las células se vuelven a IB o menos, el represor se renaturali*a, # se vuelve nuevamente activo. a. Ce est' transcribiendo el gen c" de un lisógeno a 6 IBU b. Tué pasa si la temperatura se vuelve a IBU c.
Ci un lisógeno λ c"8# es calentado durante 16 min # luego enfriado, se
lleva a cabo el desarrollo del fago durante su incubación en el medio de cultivo. Ci en cambio el lisógeno es enfriado luego de 5 min, no )a# desarrollo del fago # las bacterias sobreviven. E:pliue. 19. na cepa & lisogénica de un fago b, el cual posee una prote!na represora r termosensible a 2IB se induce el ciclo l!tico/, es crecida en medio l!uido L@ a 6IB toda la noc)e. Ce reali*an diluciones 1682, 168, 168F # 168/ del cultivo # se siembran 166 µl de cada una en placas de medio sólido L@8agar # se incuban toda la noc)e a 6IB # a 2IB. Ce observa ue a 2IB crecen algunas colonias sólo en las placas ue se sembraron las diluciones ma#ores. a/ E:pliue ué )a ocurrido. b/ S(or ué sólo crecen a 2IB en las placas de ma#or diluciónU c/ SEstas colonias crecidas a 2IB siguen siendo lisogénicas o noU S(or uéU 26. Ce desea obtener una cepa de E. coli con el genetipo gal R leu8 trp8. $ise+e los e:perimentos genéticos ue reali*ar!a, disponiendo de las cepas bacterianas, bacteriófagos # pl'smidos ue se detallan m's abajo, para llegar a la construcción deseada. A$ B$ &$
M8 gal + leu+ trp+ str - %la+ recA+ ;fr gal $ leu$ trp+ str C M8 gal $ leu+ trp$ str - recA$
@acteriofago (1 @acteriofago λ p@-22??recA+ &mp- / El orden de los marcadores genéticos en el cromosoma de E. coli es gal leu trp str # la distancia entre gal # str es de 6 3b. ndiue en detalle los medios ue utili*ar!a en cada selección # fundamente cada uno de los e:perimentos ue reali*ar!a. 21. E:iste un sitio secundario de attac)ment para el fago lambda dentro del gen proB del operón proBA. a/ $ibujar un diagrama mostrando cómo un profago integrado en este sitio puede generar part!culas transductoras especiali*adas. b/ Bómo se podr!a usar este lisado transductor para obtener un lisado transductor de alta frecuencia ue lleve proARU
GU8A SE6INARIO 1: El art!culo de $atsen3o # anner de t!tulo <>ne8step inactivation of c)romosomal genes in Escherichia coli A812 using (B- products= describe una metodolog!a para )acer mutantes no polares. Es decir )acer una disrupción en uno o m's genes sin afectar los genes codificados corriente abajo de los genes mutados. Lo novedoso de esta metodolog!a es ue logran delecionar un gen introduciendo a la bacteria &$% lineal obtenido por (B-/ # ue se logra )acer la recombinación entre dos regiones )omologas entre s! pero de una longitud de tan sólo F pb. Esto es novedoso porue E. coli normalmente degradar!a el &$% lineal # adem's su mauinaria de recombinación reuiere regiones m's largas. Lo ue )acen los autores para evitar la degradación # ue ocurra la recombinación entre regiones mu# c)icas es usar el sistema -ed del fago lambda. &dem's, otra cosa novedosa ue introducen los autores es el uso de la recombinasa M-0. Bon ella logran curar el casete de resistencia introducido gracias al sistema -ed dado ue dic)o casete cuenta con secuencias M-0 ad#acentes. Estas secuencias son el blanco de acción de ML(. La figura 1 del paper resume la m's importante de toda la metodolog!a desarrollada por los autores. El objetivo de este seminario es evaluar las distintas )erramientas genéticas ue emplean los autores para desarrollar la metodolog!a antes descripta por eso no se le va a e:igir al alumno ue a)onde en los detalles de la construcción de todas las disrupciones ue los autores )icieron. Las 6 construcciones fueron )ec)as para probar la robuste* de la metodolog!a por lo ue la comprensión de la función de los genes, los fenotipos # genotipos de las cepas ue van a ser mutadas as! como los fenotipos resultantes escapan del objetivo del seminario. $ebajo se enumeran una serie de preguntas ue intentan orientar al alumno )acia los aspectos m's relevantes del trabajo de $atsen3o # anner. @reve cuestionario gu!a? 1. SBómo se dise+an los primers para )acer las mutacionesU S$ónde )ibridan estos para levantar el casete de resistenciaU STué región del primer va a ser necesario para ue el producto de (B- se recombine con el cromosoma de E. coliU '. S(or ué lo controlan la e:presión del sistema -ed de LambdaU SBómo lo )acenU S(ara ué constru#en el pl'smido pA$26 con un replicón sensible a la temperaturaU . SBómo c)euean ue el casete se introdujo en el locus indicado en el cromosoma de E. coli) *. STué es ML(U S&ct"a por recombinación )omóloga o sitio espec!ficaU S(ara ué curan el casete de resistenciaU #.
S(or ué dise+an el vector pB(26 de manera de ue no se repliue a altas temperaturas pero ue indu*ca la e:presión de ML( a altas temperaturasU
