TD2 : Le transport
Rappel sur les différents types de transport :
1 - Deux souches d'E.coli MC4100 (sauvage) et MKH13 (mutant) sont cultivées dans le milieu de base M63 glucose 10 mM final (M63 0M), additionné de NaCL 0,5 M final (M63 0,5 M) et de Glycine Bétaine 1 mM final (M63 0,5 M + GB) ou de proline 1 mM final (M63 0,5 M + Pro). La glycine bétaine est un composé dérivé de l'acide aminé glycine. la croissance est suivie par mesure de densité optique à 600 nm pendant 6 heures. Interpréter les résultats obtenus.
1 sur 6
E.coli MC4100 • M63 0 M • M63 0,5 M
g = 0,7 h g = 2 h
(sans NaCl) (avec NaCl)
Avec NaCl, le temps de génération est plus élevé (3fois plus lent). (En TP : Chapman milieu avec beaucoup de NaCl -> E.Coli ne pousse pas) E.coli n'est pas halotolérante ou halophile. g = 0,7 h • M63 0,5 M + GB g = 0,9 h • M63 0,5 M + Pro Pour GB, on récupère une croissance normale. Pour Pro, on récupère une croissance presque normale. La GB est donc un osmo-protecteur. La pro est également un osmo-protecteur mais moins efficace.
E.Coli MKH13
g = 1h -> croissance un peu plus lente • M63 0 M
g = 3h • Les 3 autres -> après ajout de NaCl : pousse 3 fois plus lentement également. -> ajout de GB et Pro :aucun effet. La GB et la Pro ne jouent plus leur rôle de mutant. Hypothèse : le mutant n'arrive pas à faire entrer la GB et la Pro. Mutation au niveau des transporteurs.
2 - Aux bactéries MC4100 (1 mg de protéines correspond à un volume interne 2,2 microlitres), on ajoute de la GB marquée au carbone 14 à la concentration de 0?5 mM dans 5 ml de milieu M63 0,5 M. Aux temps indiqués dans le tableau qui suit un petit volume de bactéries est prélevé. Les cellules sont récupérées par filtration et la radioactivité incorporée est mesurée au compteur à scintillation. D'autres mesures non décrites ici ont permis de déterminer que 56,4 dpm correspondaient à 1 nmol de [GB] intracellulaire/mg de protéines. Trancher parmi diffusion passive, diffusion facilitée ou transport actif.
Min Dpm
0
1410
2190
3019
3843
4831
5820
6204
6204
0
1
2
4
8
2 sur 6
15
30
45
60
L'afflue de la courbe permet d'éliminer la diffusion simple. Pour la suite, on se place à l'équilibre : • Si diffusion facilitée : [GB]int = [GB]ext. • Si transport actif : [GB]int >> [GB]ext (50 à 1000 fois plus)
[GB]int :
54,4 dpm -> 1nmol [GB]intracellulaire / mg de protéine -> 2,2 microlitres
6204 dpm -> 110 nmol [GB] : 2,2 microlitres
-> 50 nmol/microlitre 50 micromole/mL 50 mmol/L
-> [GB]int = 50 mM
A l'équilibre : 100 fois plus de [GB]int que de [GB]ext donc transport actif (mais on ne sait pas quel type primaire, secondaire ou tertiaire)
3 - Cette même expérience réalisée sur la souche MKH13 montre qu'aucune radioactivité n'est détectée dans les cellules. Commenter
La GB ne rentre pas donc les transporteurs sont mutés
4 - On réalise une série d'expériences avec la souche MC4100 en faisant varier la concentration en GB afin de déterminer les vitesses initiales (exprimées en unités arbitraires). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit. Interpréter.
Concentra tion en 0 GB en mM
0,013
0,025
0,050
0,250
1112
1444
2209
Vitesse en unités 0 arbitraire
714
3 sur 6
Plus la concentration augmente, plus la vitesse augmente jusqu'à une vitesse max qui correspond à la saturation du transporteur. -> détermination de l'affinité du transporteur pour GB (Km)
V
1/Vi
[S]
1/[S]
714
0,00140
0,013
76,4
1112
0,00089
0,025
40
1144
0,00069
0,050
20
2209
0,00045
0,250
4
-> Voir courbe
- 1/Km = - 30 mM^(-1) Vmax = 2500 UA
Km = 0,033 mM = 33 microlitres
MC4100 -> Km = 33 microM
4 sur 6
5 - Cette expérience réalisée sur des cellules de 2 autres souches d'E.coli GM50 et BK32 (mutants) a permis de déterminer le Km de la glycine bétaine. Il est estimé à 1 microM pour la souche GM50 et 40 microM pour la souche BK32. Interpréter.
GM50 -> BK32 ->
Km = 1 microM Km = 40 microM
-> affinité forte -> affinité plus faible
Hypothèse : • changement de conformation du transporteur.
- une mutation donne une meilleur affinité
- une mutation donne une affinité plus faible • modification de l'expression du transporteur
- quantité plus ou moins forte de transporteurs
5 sur 6
Chez E.coli, il y a 5 types de transporteurs pour le galactose.
• Dans la souche sauvage : 2 systèmes de transports pour la GB.
BK32 -> 1 seul transporteur
GM50 -> 1 seul transporteur (un autre)
GM50 : les transporteurs de faible affinité sont mutés.
BK32 : les transporteurs de forte affinité sont mutés
-> Quantité transporteurs faible >> quantité transporteur forte affinité. MKH13 -> les 2 système sont mutés.
6 sur 6
