UNIVERSIDAD PEDAGOGICA NACIONAL DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA DINAMICA Y MANTENIMIENTO DE LOS SISTEMAS FISICOQUÏMICA Problemas de Cinética y Regulación Enzimática Docente Ligia Marlene Forero Rey MSc. Los estudios del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzimasustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron Menten desarrollaron esta teoría y ppropusieron una ecuación que permite determinar la velocidad velocidad de una enzima, la cual cual se convirtió en la base base de los estudios de la cinética enzimática. Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (V 0) y la concentración inicial de sustrato ([S]) Michaelis y Menten propusieron propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre [E] + [S]
[E-S] →
[E] + [P]
Posteriormente Posteriormente otros científicos trabajaron este tema entre los cuales se destacan Lineweaver y Burk, cuya ecuación se expresa ex presa de la siguiente forma
Con base en estos conceptos y los de equilibrio químico resuelva los problemas que encuentra a continuación, en caso de tener que realizar gráficas elabórelas en papel milimetrado. 1
1- Sea la reacción A+B AB. En la cual las concentraciones iniciales de A y de B son 1 mM y 2 mM respectivamente, la reacción llega al equilibrio después de 45 horas de incubación. Las concentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mM y [AB]=0,5 mM. En presencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. ¿Cuáles serán las concentraciones alcanzadas en este caso? ¿Cuál es el valor de la Keq en ambos casos? 2- Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 μmoles por minuto, siendo su Km para el sustrato de 0,5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM de sustrato, ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min? 3-La determinación del Km en una Enzima Isomerasa que cataliza la transformación de diferentes carbohidratos de la serie D en sus correspondientes isómeros L, muestra diferentes valores, en dependencia del carbohidrato que es transformado. a) D-glucosa Km = 2000 uM b) D-galactosa Km = 4500 uM c) D-manosa Km = 8000 uM d) D-Ribosa Km = 10000 uM e) D-fructosa Km = 9000 uM Explique sobre cual sustrato tiene mayor afinidad la enzima. Ordénelos partiendo del de menor afinidad al de mayor afinidad. Sustente su respuesta. 4-Para estudiar la dependencia de la v frente a [S] de una reacción catalizada enzimáticamente, una cantidad constante de enzima se adiciona a una serie de medios de reacción de 10 ml de volumen conteniendo diferente [S]. Las velocidades iniciales de reacción se han determinado midiendo el número de moles de producto formado por minuto, obteniéndose los siguientes resultados: [S](moles/litro V0(moles/min.)
5 x 10-2 0,25
5 x 10-3 0,25
5 x 10-4 0,25
5 x 10-5 0,20
5 x 10-6 0,071
5 x 10-7 0,0096
Utilizando la Ecuación de Michaelis y Menten responda las siguientes preguntas: a) ¿Cuál es la Vmax. de ésta Enzima?. b) ¿Cuál es la Km de ésta enzima? c) ¿Cuáles serán las velocidades iniciales a [S]=1x10-6 M y a [S]=1x10-1 M?. d) Calcular la cantidad total de producto formado durante los primeros cinco minutos para [S]=2x10-3 M. ¿Se podría hacer lo mismo para [S]=2x10-6 M?. e) Suponiendo que la [E] se incrementase en cada medio de reacción multiplicando por un factor 4. ¿Cuál sería el valor de Km y de la Vmax.? ¿Cuál sería la velocidad inicial para [S]=5x10-6 M? f) Elabore la gráfica y demuestre si ésta reacción sigue o no la cinética de MichaelisMenten.
2
5- Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35 μmoles/min cuando la concentración de sustrato es 0,01 M. La Km para el sustrato es 2 x 10 -5 M. ¿Cuál será la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3,5 x 10-3 M; b) 4 x 10 -4 M; c) 2 x 10 -4 M; d) 2 x 10-6 M y e) 1,2 x 10 -6 M?. A partir de los siguientes datos obtenidos para una reacción catalizada enzimáticamente, calcular gráficamente la Km y la Vmax de dicha enzima: Sustrato (mM)
Velocidad (μmoles/min)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
1,00 1,67 2,40 2,50 2,78 3,00
6 - La cinética de una enzima viene medida como función de la [S] en ausencia y en presencia de un inhibidor a una [I]=10-4 M. Arrojó los siguientes resultados: [S]x10-5 M
0,3
0,5
1
3
9
vo (µmoles/min.) sin I vo (µmoles/min.) con I
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5
2,1
2,9
4,5
6,8
8,1
a) Representar Vo frente a [S] y 1/Vmax. frente a 1/[S]. b) Calcular Vmax. y Km en ausencia y presencia de inhibidor. c) ¿Qué tipo de inhibición es esta? d) Calcular la KI. 7- A partir de una representación de Lineweaver-Burk para una reacción enzimática cuya recta corta al eje de ordenadas en 1/v y en 1/[S], a) Calcular Vmáx y la Km, cuando 1/v= 25 h/mol y extrapolando al eje de las abcisas 1/[S]= -1,3 x 102 (moles/l)-1 b) ¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación de Lineweaver- Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta al eje de abscisas en -40 litros/mol? c) ¿Qué información puede obtenerse de una representación de Lineweaver-Burk sabiendo que cuando (1/[S]) x 10-2= 2,5 M-1, 1/V=0.
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8- La cinética de un enzima (estudio de la velocidad enzimática utilizando distintas concentraciones de sustrato) se analizó en presencia de dos inhibidores diferentes (Ia e Ib) obteniéndose los siguientes resultados experimentales:
Sustrato [S] x 10 - 5 M 0,3 0,5 1,0 3,0 9,0
Velocidad (mmoles/min/mg) Sin inhibidor Con inhibidor Con inhibidor Ia Ib 10,4 4,1 2,1 14,5 6,4 2,9 22,5 11,3 4,5 33,8 22,6 6,8 40,5 33,8 8,1
a) Representar Vo frente a [S] y 1/Vo frente a 1/[S]. b) Calcular Km y Vmax en ausencia y presencia de ambos inhibidores ¿De qué tipo de inhibición se trata? 9- Estudiando el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se trabajó de acuerdo a dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se preincubó la enzima a distintos pHs y luego se midió la actividad de la misma a pH 7. En el otro caso (B) se determinó la actividad de la enzima a distintos pHs. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
ACTIVIDAD Protocolo A 7,9 8.1 8.0 8.2 7.8 8.0 8.0 8.1 4.0 2.0 0.2
Protocolo B 1,0 1.9 3.2 4.9 7.3 9.0 8.0 6.3 2.5 1.0 .0.0
a) Elabore la gráfica velocidad vs pH y establezca el rango de pH ideal para esta enzima. b) Explique el comportamiento enzimático en cada caso.
4
10) La actividad de una enzima se determinó a diferentes temperaturas obteniéndose los valores que se indican a continuación. Temperatura °C Actividad (µ/ml)
0
10
20
25
30
40
5
10
21
30
20
10
Cuando la enzima se preincubó a cada una de las temperaturas anteriores y su actividad se ensayó a la temperatura óptima se obtuvieron los mismos valores de velocidad, excepto para las alícuotas de enzima provenientes de la incubación a 30 C y 40 C, las que fueron significativamente menores. Con los datos anteriores, indique: a) ¿Cuál es la temperatura óptima de reacción? b) ¿Por qué la actividad enzimática cuando se ensayó a la temperatura óptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a distintas temperaturas? °
°
11) La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenasa de levadura es de 1,3.10-2 M. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59,2 μg/ml ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato?, ¿Cuando la velocidad de reacción sea igual a Vmax, qué valores tomarán estas proporciones? 12) La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes concentraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fue la siguiente:
[Enz] (mg de proteína) [AcetilCoA] (mM)
0.1
0.2
0.5
Velocidad (mmol / min)
0.05
0.275
0.546
1.373
0.14
0.482
1.001
2.502
0.23
0.580
1.185
2.891
0.32
0.642
1.385
3.463
0.50
0.755
1.494
3.656
0.59
0.766
1.497
3.810
a) Calcular para cada experimento el valor de Km y el valor de Vmax. b) ¿Son los valores de Km y Vmax iguales o diferentes? c) Explique si lo que observó es lo que esperaba obtener 5
13) Dos estudiantes A y B aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa de músculo de caballo que cataliza la reducción de piruvato siguiendo los mismos pasos de purificación. Una vez obtenida una solución concentrada de enzima midieron actividad en función de la concentración de sustrato obteniendo los siguientes datos: Sustrato] (M) VA µmol.min.mg-
2 x10-6 16
5 x10-6 33
1 x10-5 50
5 x10-5 83
1 x10-4 90
25
50
75
125
136
2 x10-4 1 x10-3 95 100
1
VB µmol.min.mg-
143
150
1
a) Sin graficar haga una estimación aproximada de Km y Vmáx observando los datos de A y B. Justifique. b) Intente una explicación para la discrepancia observada entre los parámetros cinéticos de A y B. c) Qué variables graficaría para obtener Km y Vmáx. Justifique. 14) A partir de un experimento de inhibición se obtuvieron los datos de la tabla. Mediante una gráfica de Lineweaver-Burk. Determine si el compuesto en estudio es un inhibidor competitivo o no competitivo. Determine Ki (la concentración del inhibidor es 1µM)
[ Sustrato ] v sin inhibidor (moles/l) (µmol/min) -4 0,50. X10 0,42 0,67. X10-4 0,50 -4 1,00. X10 0,60 1,30. X10-4 0,66 2,70. X10-4 0,80 5,30. X10-4 0,88
v con inhibidor (µmol/min) 0,17 0,20 0,24 0,27 0,32 0,36
15) Calcule el Km y la Vmáx de la enzima E y de la enzima E en presencia del compuesto I a partir de los datos que se indican en la siguiente tabla: [S] (mM) 0.100 0.125 0.250 0.500 0.750 1.000 0.154 0.185 0.250 0.345 0.370 0.400 V control (µ/mg) v con inhibidor (µ/mg) 0.065 0.081 0.133 0.217 0.263 0.294 Indique qué tipo de inhibidor es el compuesto agregado. 6
16) Se determinaron los parámetros cinéticos de una enzima en ausencia y en presencia de una serie de compuestos, algunos de los cuales se supone podrían ser inhibidores de la misma. Los resultados obtenidos con la enzima sin agregados se detallan en la tabla 1. En la tabla 2 se presentan los valores de Vmáx y de Km obtenidos en presencia de los compuestos en estudio. a) Calcule los valores de Vmáx y de Km a partir de los datos de la tabla 1. b) Indique qué tipo de inhibidor es cada uno de los compuestos agregados. TABLA 1 [S](µ M) Actividad (µmol/min/mg) 2.0 0.029 2.5 0.032 3.3 0.037 5.0 0.043 10.0 0.053 50.0 0.063 100.0 0.063
Vmax (µ mol/min/mg) 0.033 0.065 0.064 0.033
TABLA 2 Compuesto A B C D
Km (µ M) 2.5 5.0 2.4 1.3
17) Al estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la enzima hexoquinasa (Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP) se observó que es inhibida por piruvato. La tabla muestra los valores de actividad en µmol/min obtenidos cuando se varía la concentración de sustrato y/o de piruvato. [I] (mM) [S]=1,00 mM [S]=1,82 mM [S]=2,50 mM [S]=10,00mM 0.0 1.25 2.00 2.50 5.00 0.2 0.83 1.33 1.67 3.33 0.4 0.63 1.00 1.25 2.50 0.6 0.50 0.80 1.00 2.00 0.8 0.42 0.67 0.83 1.67 1.0 0.36 0.57 0.71 1.43 En base a estos datos indique: a) Qué tipo de inhibidor es el piruvato. b) El valor de Km c) El valor de Vmáx d) El valor de Ki. 7
18) Para estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la actividad de una enzima se incuba la misma con los mismos durante 5 min. Luego se agrega el sustrato en la misma cubeta y se determina la velocidad inicial de la reacción. Se obtienen los siguientes resultados: Preincubación con 0 A B C D
Vi(µ M/min) 10.10 12.5 9.8 5.30 0.50
a) ¿Qué efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? b) ¿Cómo puede determinar si la interacción en cuestión es reversible o irreversible? 19) Los datos de velocidad y concentración que se muestran en la tabla se obtuvieron para una enzima que cataliza una reacción S P. a- Calcular Km y Vmáx. b- Comprobar que la enzima sigue una cinética de saturación hiperbólica [Sustrato] Sustrato M velocidad nmol/l.min 2,5 3,3 4,0 5,0 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 1,0
X10-6 X10-6 X10-6 X10-6 X10-5 X10-5 X10-5 X10-4 X10-3 X10-2
24 30 34 40 60 80 96 109 119 120
20- Una enzima con un Km de 2,4 10-4 M se ensayó con las siguientes concentraciones de sustrato: (a) 2,0 X10 -7 M, (b) 6,3 x 10-5 M, (c) 1,0 x 10 -4 M, (d) 2,0 x 10-3 M y (e) 5,0 x 10 -2 M. La velocidad observada a 5,0 x 10 -2 M fue de 128 nmol/l/min. a) Calcular las velocidades iniciales con las otras concentraciones de sustrato. b) Si la concentración de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, ¿Cuál sería la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? c) ¿Si se aumentara la concentración de sustrato cinco veces? 8
