Reporte 8 Determinación de Proteínas (Bradford)

Reporte Practica No.8 Determinacion de la concentracion de proteinas

Materia: Laboratorio de Biotecnología Biotecnolog ía Molecular

Unidad Profesional Interdisiplinaria de Ingenieria Campus Guanajuato

Ingeniería Biotecnológica Laboratorio de Biotecnología Molecular Practica 8.- Determinación de la concentración de proteinas

5BV1 27/04/2014 Hugo Ramírez Rodríguez 2011660475 Juan Cristóbal García García 2012660213 José Gilberto Savi Tejeda 2012660319 Ricardo Rafael Marín Mosqueda 2010660234 Erick Noé Soto Martínez 2011660270

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Materia: Laboratorio de Biotecnología Molecular

Resultados

Para estimar la concentración de proteínas presentes en una muestra problema mediante el ensayo Bradford, se realizaron diluciones de un stock de albúmina de suero bovino (BSA) de 1mg/mL, estas diluciones se utilizaron para la construcción de una curva estándar, leyendo las diluciones y la muestra problema a una absorbancia de 595 nm. Tabla 1. Lectura de Absorbancia para la curva de calibración para la concentración de albumina

Concentración de albumina (mg/mL)

Absorbancia a 595nm

0.3157

-0.152

0.5

-0.057

1

0.306

Se realizó una regresión lineal con el software estadístico minitab 17® para la construcción de una curva estándar.

Figura 1. Curva de calibración para la concentración de Albumina BSA Página 2



Si se despeja la ecuación de la recta obtenida es posible realizar una estimación de una muestra problema.

Ecuación 1

La muestra problema se midió por triplicado en un espectrofotómetro UV a una absorbancia de 595 nm, obteniendo los siguientes resultados. Tabla 2. Lectura de absorbancia de la concentración de la muestra probema

Muestra Problema Absorbancia a 595 nm por triplicado.

Lectura 1

0.435

Lectura 2

0.423

Lectura 3

0.458

Promedio

0.4387

Desviación Estándar

0.0178

Discusión de Resultados

Tabla 3. Cuadro comparativo entre diversas técnicas para la cuantificación de proteínas Método

Ventajas

Inconvenientes

Métodos de

No se pierden las muestras

Interfieren muchos compuestos que absorben

absorción

en el UV

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Reporte Practica No.8 Determinacion de la concentracion de proteinas Método

Ventajas


Inconvenientes

Métodos derivados Colorimétricos

Biuret

Bastante específico para

Tiene poca sensibilidad.

proteínas. Muestra con pocas Interferencias. Método económico. Lowry

Muy sensible

No todas las proteínas reaccionan igual.

Menos afectado por la

La muestra puede tener interferencias con

turbidez.

varios compuestos como detergentes no

Método relativamente simple

iónicos, sulfato de amonio etc.

se puede completar en 1 a 1.5 horas. Bradford

BCA

Método muy sensible a bajas

La muestra puede tener interferencias con

concentraciones de proteína.

detergentes y soluciones básicas.

Es el método mas sensible.

El color no es estable con el tiempo.

Es el que presenta menos

Los azúcares reductores interfieren con la

interferencias con la

reacción.

muestra.

La respuesta en la absorbancia no es lineal

Métodos derivados Fluorimétricos

o-ftalaldehido

Muy sensible

Interferencia de aminas contaminantes en la muestra No todas las muestras reaccionan igual

(Fernandez, 2002) 1

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El ensayo de Bradford es un método de determinación de proteína que consiste en la unión del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 a las proteínas. (Bradford, 1976) 2

El colorante existe en tres formas: catiónico ( rojo) , neutro ( verde ), y aniónico (azul). En un medio ácido, el colorante es predominantemente en forma catiónica roja doblemente protonado (Amax = 470nm) . (Compton y Jones 1985) 3

Sin embargo , cuando el colorante se une a la proteína, esta se convierte en una forma no protonada azul estable ( Amax = 595 nm ) (Reisner et al.1975 , Fazekes de St. Groth et al . 1963 , Sedmack y Grossberg 1977) 4,5,7

Esta forma de proteína - colorante azul es la que se detecta a 595 nm en el ensayo utilizando un espectrofotómetro. Spector (1978) encontró que el coeficiente de extinción de una solución del complejo del colorante con albúmina BSA fue constante en una gama de concentración de 1 µg/mL hasta 15µg/mL de albúmina BSA. Por lo tanto, la ley de Beer se puede aplicar para la cuantificación exacta de la proteína mediante la selección de una relación adecuada de volumen de colorante para la concentración de la muestra.

(Spector,1978) 8

Ciertos interacciones químicas con el colorante pueden interferir con el ensayo. La interferencia de compuestos no proteínicos se debe a su capacidad de cambiar los niveles de equilibrio del colorante entre las tres especies de colores. Las fuentes conocidas de interferencia, tales como algunos detergentes, flavonoides, y tampones básicos de proteínas, estabilizan el colorante neutro verde ya sea por la unión directa con el colorante o por un cambio en el pH impidiendo la reacción de coloración. (Compton y Jones 1985, Fanger 1987) 3,4 Página 5



Figura 2.- Curva de calibración para un ensayo Bradford donde se muestra la región de concentración que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer.

Los valores de concentración para realizar la curva de calibración y de la muestra problema no se encuentran dentro de la región que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer, por lo que es necesario un ajuste estadístico que mejor se adapte a los resultados, por otro lado los resultados obtenidos para las primeras dos mediciones de la curva de calibración son valores negativos lo cual indica un error. Con lo mencionado, el presunto motivo por el cual se obtuvieron lecturas erróneas fue por la presencia de restos de detergentes en los materiales usados durante la sesión, pudiendo estar principalmente contaminados los tubos de ensaye y probablemente las celdas donde se colocaron las muestras para ser analizadas o bien estas se encontraban en malas condiciones. Página 6



En el caso particular de los resultados obtenidos en las mediciones de la muestra problema, se puede observar que se encuentran dentro del rango de sensibilidad que cita Fernandez (2002), por lo cual se descartan posibles problemas de contaminación con detergentes que pudieran interferir en las lecturas de la muestra problema. Se realizó una estimación de una curva estándar ideal utilizando una relación proporcional tomando como referencia el valor positivo (0.306) de absorbancia a 595nm obtenido para una concentración de 1 (mg/mL) de albumina.

Figura 3. Curva de calibración ficticia basada en la lectura positiva obtenida experimentalmente

Se realizo un despeje de la ecuación obtenida para poder estimar la concentración de la muestra problema a partir de la absorbancia.

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Ecuación 2

El análisis de regresión lineal es una técnica estadística utilizada para estudiar la relación entre variables. Cabe destacar que la estimación realizada no tiene validez estadística, debido a que no se puede realizar una regresión lineal asumiendo una relación proporcional y=mx+b con un solo valor como variable de respuesta. Se compararon nuestros resultados con los obtenidos del estudio “ Plasmid vectors

for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger” donde realizan un ensayo Bradford debido a la dificultad para medir la

densidad óptica del hongo, ya que crece en estructuras complejas, son pesados y unicelulares. Por lo tanto optaron por la medición de extractos de proteínas del hongo. Para el ensayo de Bradford realizaron una serie de diluciones estándar con concentraciones conocidas de albúmina de suero bovino (BSA) se realizaron con el fin de determinar las concentraciones de las proteínas. (Storm, 2005)9 Tabla 4. Tabla de concentraciones de la curva de calibración del estudio “Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger”

Standard µL standard µL dH2O Concentration Std 1

300 µL stock 1200µL

2 mg/ml

Std 2

200 µL stock 1000µL

1,67mg/ml

Std 3

700 µL Std 1 700µL

1 mg/ml

Std 4

700 µL Std 2 700µL

0 mg/ml

Std 5

700 µL Std 3 700µL

0,5 mg/ml

Std 6

700 µL Std 4 700µL

0 mg/ml

Std 7

700 µL Std 5 700µL

0.25mg/ml

Std 8

700 µL Std 7 700µL

0,125mg/ml

Std 9

-

0 mg/ml

700µL

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Figura 4. Curva de calibración del estudio “Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger”

Donde la ecuación despejada para conocer la concentración utilizando la absorbancia de una muestra problema es la siguiente.

Ecuación 3

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Tabla 5. Comparación de los resultados obtenidos en el laboratorio con los obtenidos del estudio “Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger”

Origen de la curva

Ecuación Obtenida

estándar

Concentración estimada de la muestra problema en mg/mL. (Valor Promedio)

Curva obtenida en

1.20

el laboratorio. R 2=0.991

Curva ficticia

1.433

construida con el valor de

R 2=1

absorbancia positivo. Curva del

1.071

trabajo “Plasmid vectors for protein

R 2=0.996

production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger”

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Conclusiones

No es posible realizar una estimación correcta de la muestra problema con el ajuste de la curva estándar obtenida, debido a que se obtuvieron valores de absorbancia negativos y el numero de diluciones es muy reducida como para realizar una curva estándar con validez estadística, sin embargo al hacer uso de la curva estándar de (Storm, 2005)9, se logró estimar que la concentración de la muestra problema es de 1.071 mg/mL. Cuestionario

1. Menciona que rango de concentración de proteínas puedes detectar en el método de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm. El método de Lowry posee diversos grados de sensibilidad dependiendo de la longitud de onda a la cual se analice la muestra (Badui, 1999). A una longitud de onda de 550 nm el método presenta una baja sensibilidad permitiendo así detectar únicamente concentraciones de proteínas elevadas (Storch, 2000), el rango va de 100-2000 mg/mL o en su defecto, de 25 a 100 mg de proteína (M. Walker, 2002) A una longitud de onda de 750 nm el método presenta una alta sensibilidad por lo que es posible detectar bajas concentraciones de proteína (Storch, 2000), para un rango de concentraciones menores a 500 mg/mL o en su defecto, de 1 a 2 mg de proteína (M. Walker, 2002) A una longitud de onda de 660 nm el método presenta su máximo de absorbancia y por ende es la longitud de onda más empleada, pues pues incrementa el rango de identificación de las proteínas (Hall, 1996), sin embargo, al no presentar la misma sensibilidad que a 750 nm diversos compuestos no proteicos pueden Página 11



interferir en la lectura. A esta longitud se puede detectar proteínas en un rango de 2 a 30 mg (Universidad del Quindio, 2010). 2. Menciona ventajas y desventajas en el uso del método de Lowry. Ventajas  Es

más sensible que muchos métodos como el de Biuret (50-100

veces) o absorción de rayos UV a 280 nm (10-20 veces). 

Es más específico.

 Relativamente

simple debido a que se puede llevar a cabo en un

tiempo corto. 

Es menos afectado por la turbiedad de la muestra

Desventajas  El  El

color varía con diferentes proteínas. color no necesariamente es proporcional a la concentración de

proteínas. 

Puede tener interferencia con varios compuestos como lo son azúcares reductores (Nielsen,2010).

3. Escribe el fundamento de los métodos de Bradford y el ácido bicinconínico (BCA) utilizados en la determinación de la concentración de proteínas. El método de Bradford se basa en la unión no covalente de la forma aniónica del colorante Azul de Coomassie G-250 con la proteína. El colorante reacciona principalmente con los residuos de Arginina, los cuales poseen una cadena cargada positivamente, y tiene pequeñas interacciones con otros residuos básicos (Histidina y Lisina) y residuos aromáticos (Tirosina, Triptófano y Fenilalanina). En ausencia de proteína el colorante es de color rojo pálido y, una vez se une a la

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proteína, se forma una coloración azul con una absorbancia máxima a 590 nm a la cual se realiza la lectura en el espectrofotómetro.

Figura 5. Estructura del azul de coomassie (Mikkelsen & Cortón, 2004) El método del ácido bicinconínico (BCA) es también conocido como el método de Smith y se basa en el uso de este reactivo. El BCA en la forma de una sal de sodio es soluble en agua, estable y altamente específico y un reactivo sensible a a iones de   en solución alcalina. Es similar al método de Lowry en el sentido de que en solución alcalina, , los enlaces peptídicos y los residuos de principalmente Cisteína, Cistina, Triptófano y Tirosina reaccionan con los iones de reducen a





(Reacción de Biuret). Entonces el









y los

forma un complejo con 2

moléculas de BCA para producir un color púrpura el cual es soluble en agua y tiene una fuerte absorbancia a 562 nm.

Figura 6. Reacción del método del BCA

(Hall, 1996)

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4. Menciona que compuestos pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el ensayo de Bradford. Existen varios compuestos que pueden causar interferencia dependiendo de su concentración y su efecto sobre el reactivo que ayuda en la cuantificación, sin embargo, solo se han caracterizado algunos de ellos , por lo que solo se mencionarán algunos de ellos. Bradford; 

Detergentes iónicos y no iónicos (Triton y SDS) (Nielsen,2010).



Tris



Glicina



Acetato de Sodio



Bicarbonato de Sodio



Glucosa



Urea



Azida de Sodio



EDTA



2-Mercaptoetanol



Acido Ascórbico



Acetona



Etanol



Metanol (Sigma,2012)



Glucosa



Sacarosa



Sulfato de Amonio



Tris



Fosfato de Sodio

Lowry;

Página 14

Reporte Practica No.8 Determinacion de la concentracion de proteinas 

Glicina



Urea



Cloruro de Sodio



Azida de Sodio



Ácido clorhídrico



Hidróxido de Sodio



EDTA (Hall,1996)


Referencias

1. Fernández, E. (2002). Métodos para la cuantificación de proteínas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. España 2. Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248 –254 3. Compton SJ and Jones CG (1985), Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay, Anal Biochem 151, 369 –374 4. Fanger B (1987), Adaptation of the Bradford protein assay to membranebound proteins by solubilizing in glucopyranoside detergents, Anal Biochem 162, 11 –17 5. Fazekas St. Groth S et al. (1963), Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips, Biochim Biophys Acta 71, 377 –391

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6. Reisner AH et al. (1975), The use of Coomassie Brilliant Blue G-250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels, Anal Biochem 64, 509 –516 7. Sedmak JJ and Grossberg SE (1977), A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 79, 544 – 552 8. Spector T, (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 micrograms of protein, Anal Biochem 86, 142 –146 9. Storm R, et al. (2005), Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger , El Sevier, Plasmid 53, 191 –204 Referencias Cuestionario 1. Badui, S. (1999). Química de los Alimentos. México: Pearson Educación. 2. Hall, G. (1996). Methods of Testing Protein Functionality. Great Britain: Chapman and Hall. 3. Fernández, E. (2002). Métodos para la cuantificación de proteínas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. España 4. M. Walker, J. (2002). The Protein Protocols Handbook. New Jersey: Humana Press. 5. Mikkelsen, S., & Cortón, E. (2004). Bioanalytical Chemistry. New Jersey: John Wiley & Sons. Página 16



6. Nielsen, S. (2010). Food Analysis, 4th Edition. Indiana, USA: Springer. 7. Sigma. (s.f.). Bradford Reagent Technical Bulletin . Recuperado el 25 de Abril

de

2014,

de

http://www.chem.uky.edu/courses/che554/1_Photometry/SigmaBulletin_b69 16bul.pdf 8. Storch, W. (2000). Inmunofluorescence in clinical inmunology: a primer and atlas. Boston: Birkhauser.

9. Universidad del Quindio. (2010). Laboratorio de Bioquímica: una visión práctica. Colombia: Universidad del Quindio.

10. Zor, T., & Selinger, Z. (1995). Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies. Analytical Biochemestry .

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