Reacciones de Precipitación Marzo 25, 2009
Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Inmunología L-121, Campus I Pérez Pérez José Manuel ____________ Pérez Sevilla Alma Beatriz ____________ Equipo 3, Grupo 2802
Introducción: Los ensayos inmunológicos se basan en la especificidad de la unión Ag.- Ac. La unión antígenoanticuerpo depende de la complementariedad entre ambas moléculas. En la interacción in vitro de un Ag. con su correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas 1º Interacción primaria: unión de un Ag. y su correspondiente Ac. No es visualizable directamente y no es demasiado influenciada por la temperatura, la concentración salina o la fuerza iónica ni la agitación. Sólo depende de la complementariedad. 2º Interacción secundaria: los complejos iníciales, se agregan para dar diferentes fenómenos visibles cuya característica dependerá principalmente de la naturaleza del antígeno. Esta etapa se acelera con la temperatura, la agitación y es dependiente de la concentración de electrolitos. Las reacciones reacciones de interacció interacción n secundarias secundarias son:
Precipitación: En este caso el antígeno es una molécula soluble y al ponerse una solución del mismo, en contacto con los anticuerpos que originó, se forman complejos Ag-Ac que al insolubilizarse en su mayor parte, parte, dan una reacción de precipitación, se desarrolla rápidamente formándose los complejos Ag-Ac. después los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzan determinado tamaño y precipitan. Esta etapa se acelera con el aumento de la Tº (se la lleva a cabo normalmente a 37ºC) y es además dependiente de la concentración de electrolito.
Los tipos de reacciones de precipitación son: En medio sólido (precipitación en gel): Se usa como soporte de la reacción un gel de manera que las moléculas difundirán libremente a través de él y a lo largo del recorrido se irá formando un gradiente de concentraciones que hará que en un determinado punto los reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, en ese punto se producirá un precipitado que sobre el gel se verá como una nítida banda blanca que permanece estable mientras un mayor flujo de reactantes no provoque su re disolución. . Difusión simple monodimensional (método de Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en este caso queremos detectar la presencia de un Ac.) Se deja solidificar solidificar y se añade la solución solución de Ag, este va a difundir por el agar formando un gradiente de concentración decreciente hacia el fondo del tubo, en determinada zona Ag y Ac. alcanzarán la relación de equivalencia, formándose ahí la banda de precipitado. Difusión doble monodimensional ( método de Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido, mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1% donde se encuentra disuelto el Ag. Tanto el Ag. como el Ac. migrarán hacia la zona media de menor concentración, de manera que, otra vez, se formarán gradientes .En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación cuyas características dependerán de varios factores y
1
Reacciones de Precipitación Marzo 25, 2009 determinado punto los reactivos estén en equivalencia y precipiten. - Difusión doble bidimensional (método de Oüchterlony): Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag. y Ac. En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación. Esta técnica es una doble difusión en agra, el antígeno y anticuerpo se difunden en un medio forman un inmunopresipitado estable.
-Método de Macini. Inmunodifusion radial. Sistema bidimensional en difusión cualitativa como cuantitativa. La difusión radial del antígeno produce un precipitado cuyo diámetro al cuadrado es proporcional a la concentración de antígeno. Esta técnica determina cuantitativamente la concentración del antígeno. -Contra inmunoelectroforesis Conocido como inmunofloresis, el método se basa en la electroforesis simultanea de antígeno y anticuerpo, en direcciones opuestas, de pozos separados en el gel, los anticuerpos se mueven hacia el cátodo debido a un fenómeno de electroendosmosis, mientras el antígeno que debe estar cargado negativamente se mueve al anado, en el punto de encuentro se observa una precipitación. Solo se puede usar antígeno con carga negativa -Inmuno electroforesis Combina 2 técnicas la electroforesis y la Inmunodifusion radial. La electroforesis que separa a las proteínas en sus constituyentes de acuerdo a sus diferentes propiedades iónicas, basada en la migración proteica.
Objetivo: Evaluar y comparar los diferentes métodos de precipitación, como precipitación en capilar, Inmunoelectroforesis, precipitación en gel por método de Ouchterlony, Contrainmunoelectroforesis con en diferentes antígenos, y anticuerpos.
Diagrama de Flujo: Inmunoprecipitación en capilar
Dividir 12 capilares en 4 Realizar diluciones del suero de rata (Ab)
Tomar el capilar y absorber por capilaridad el Ag (anti suero de rata) hasta la primera marca Girar 180 el capilar y por el otro extremo tomar la dilución del Ab hasta la primera marca. En una barra de plastilina colocar cada capilar Realizar para cada dilución del ab Llenar 2 capilares uno con Ag y otro con Ac Dejar a temperatura ambiente 1 hora y guardar en refrigeración 48 horas Técnica de Ouchterlony
Barnizar con agarosa al 0.1%
-Electroforesis La electroforesis en acetato de celulosa separa las proteínas del suero en cinco fracciones que son la albumina y la globulinas (alfa 1, alfa 2, beta y gama)
Perforar el agar conagujeros. Adicionar antígeno en los pozos inferiores Incube 24 horas en cámara húmeda
Adicionar un anticuerpo en el pozo superior
2
Reacciones de Precipitación Marzo 25, 2009
Resultados:
Inmunoelectroforesis En una placa con agar realizar un canal y dos perforaciones colocar en una el suero problema y en el otro gammaglobulina
Precipitación en capilar. Tabla 1.Precipiración del complejo (Antigeno-Ancicuerpo) en milímetros (mm) con respecto a la concentración de Antigeno adicionada (%/mL).
1
1
Concentración %/mL 100.0000
2
1:2
50.0000
10
3
1:4
25.0000
9
4
1:8
12.5000
8
5
1:16
6.2500
7
6
1:32
3.1250
5
7
1:64
1.5625
4
8
1:128
0.7812
3
9
1:256
0.3906
2
10
1:512
0.1953
1
11 Blanco
1
Antisuero de Rata
Negativo
12 Blanco
1
Suero de Rata
Negativo
Tubo Adicionar azul de bromofenol y correr la electroforesis por 30 minutos a 30miliamperes
Adicionar antisuero humano y dejar precipitar durante 24 horas en cámara húmeda
Contrainmuno electroforesis
Precipitación (mm) 15
Grafica 1. Curva de calibración, para la zona de equilibrio del antígeno suero de rata contra anticuerpo de suero de rata Realizar en un gel de agarosa dos perforaciones
-
Dilución
+
Curva de calibración de mm de precipitación vs concentración de antigeno de rata 16 14
Colocar en un pozo el antígeno, y en otro el anticuerpo y ejercer corriente. Por 30 minutos
) 12 m m ( 10 n ó i c 8 a t i p 6 i c e r P 4
2 0 -5.00 5.00 15.00 25.00 35.00 45.00 55.00 65.00 75.00 85.00 95.00105.00
% de Antigeno/mL
Método de Ouchterlony Se realizo 3 sistemas en una placa de agarosa como se muestra en la imagen
3
Reacciones de Precipitación Marzo 25, 2009
Imagen A. Diseño de Identidad Cruzada, No identidad e Identidad Total, en todos los casos no se observo precipitación
Tabla 2. Resultados de 3 sistemas propuestos de precipitación por el método de Ouchterlony Sistema Ac Ag Experimental Esperado Identidad Cruzada
Anti-AHV
No Identidad
Anti- GM Anti-AHV
Identidad
Anti-AHV
AHM
Negativo
AHV
Negativo
AHV GH AHV
Negativo Negativo Negativo
AHV
Negativo
Identidad cruzada de AHM y AHV Precipitado Precipitado Curva homogénea de precipitación
AHM = Albumina Humana AHV = Albumina de Huevo ANTI-AH = Antialbumina de Huevo GH = Gamaglobulina Humana ANTI-GM = Anti-gamaglobulina Humana ANTI-AHV = Anti Albumina de Huevo ANTI-AHV = Anti Albumina de Huevo
Imagen C. Se observa banda de precipitación en gammaglobulina y albumina por lo cual se encuentra contraminado con albumina Tabla 4. Resultados de Inmunoelectroforesis de suero humano total y Gammaglobulina, para observar la pureza de ésta ultima Sistema con anti Experimental Esperado suero humano Suero Humano Total Gammaglobulina Humana
Múltiples bandas Varias bandas
Múltiples bandas Una banda en Gamaglobulina
Electroforesis Se diseño un sistema con tres muestras los cuales se colocaron por duplicado y triplicado, en acetato de celulosa.
Contrainmunoelectroforesis
El sistema se diseño con Gammaglobulina Humana, GHM y Anticuerpo para Globulina Humana ANTI-GMH.
γ globulina
Albúmina humana
Suero humano
Imagen B. Sistema con GMH y Anti-GMH, con nula precipitación a los 20 minutos, debido a la ruptura del agar .
Suero humano
γ globulina
Albúmina humana
Suero humano
γ globulina
Imagen D. Corrimiento electroforético de 8 muestras,
Tabla 3, Resultado del sistema propuesto para contrainmunoelectroforesis. Diseño Experimental Esperado ANTI-GMH vs GMH
Negativo a precipitación
Precipitación
Inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis, mediante Suerto Total Humano, y Gamaglobulina Humana, en el canal se deposito Antisuero total
Análisis de Resultados: Precipitación en capilar
La concentración del suero de rata se tomo a una concentración de 100%/mL debido a que no se conocía la concentración, además el suero proviene de un animal previamente sangrado. Tabla 1.
4
Reacciones de Precipitación Marzo 25, 2009 En este experimento no se logro obtener la zona de equilibrio de antígeno y anticuerpo en suero de rata debido a que se requería mayor dilución del suero de rata (antígeno) debido a una alta concentración de éste, Grafica 1.
Método de Ouchterlony Mediante este método se diseño tres sistemas para la identificación de antígenos con identidad parcial, no identidad y identidad total, se esperaba como lo indica la tabla 2, que en los tres sistemas se registrara precipitación con sus respectivos resultados, sin embargo al realizar la lectura a las 72 h, no se obtuvo precipitación, probablemente a una nula zona de equilibrio entre el anticuerpo y el antígeno, llenado inadecuado, velocidad de difusión tardía, incubación y que los recipientes de antígenos o anticuerpos estuvieran contaminados, todos estos factores, probablemente con llevaron a no observar precipitación. Método de Contrainmunoelectroforesis En éste método se esperaba la una zona de precipitación en la cual el anticuerpo de gammaglobulina humana hubiera precipitado al antígeno gammaglobulina humana Imagen B, sin embargo no se observo, posiblemente a que se haya colocado de manera inadecuada el antígeno y anticuerpo, o que ambos no se correspondieran Tabla 2, también es posible a una nula zona de equilibrio, así como tiempo de incubación o contaminación de ambos reactivos.
Imagen C, y se comparo con una muestra de gamma humana para observar la pureza de la muestra Tabla 4, la cual presento varias bandas, en especial en la albumina, por lo cual la muestra de gammaglobulina no se encontraba pura. Debido a una inadecuada dilución por utilizar pipetas no calibradas o de diferente volumen, y se debe considerar que el estudio no se llevo bajo condiciones estandarizadas como el manejo de la muestra, tratamiento y errores del operador.
Conclusión: Con base en el análisis de resultados, se cumplió de manera parcial el evaluar y comparar los métodos de precipitación en capilar, método de Ouchterlony, Contrainmunoelectroforesis, Inmunoelectroforesis y electroforesis, con diferentes antígenos y anticuerpos respectivos, debido a que solo se logro evaluar los métodos de Inmunoelectrodifusión y electroforesis, se debe considerar que el estudio no se llevo bajo condiciones estandarizadas como el manejo de la muestra, tratamiento y errores del operador, factores que contribuyeron a un no cumplimento total de los objetivos.
Referencias: Gualde N, Bourinat-Lafon J. Inmunología. México: Ed. Norma, 1994: Vol. 20: 23-50 Hudson L. C. Hay F. Inmunología práctica. España: Ed. Jims, 1979: 27-51. Roitt I, 1- 26
et al .
Inmunología. 5ª edición. España: Harcourt, 2000:
Aníbal Margni R. Inmunología e inmunoquímica fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana, 1996: 418-423.
Método de Inmunoelectrodifusión. En una primera etapa se lleno un pozo con Suero Humano Total (parte superior) y en otro con Gammaglobulina (parte inferior) purificada en sesiones anteriores, se realiza la electroforesis en la cual separo cada muestra en su carga y peso, posteriormente se utilizo un antisuero humano el cual se coloco en el pozo entre cada muestra y con ello se comparo las bandas del suero total humano contra antisuero total, en la cual se observo múltiples bandas
5
