ROYAUME DU MAROC OFFICE NATIONAL DE L’EAU POTABLE
Rapport de stage sur thème : Contrôle de qualité de l’eau
Encadré par : Mr Kaddour Sissani Réalisés par : Boutchich ikram & Nouayti Radoine
Ce stage se déroule : Du 1mai au 31 mai 2012
Durant ce mois de stage et à l’occasion de l’élaboration de ce rapport je tiens à remercier : Monsieur N.DAHMANI le directeur régional à l’ONEP qui ma permis de passe
Stage au
laboratoire. Monsieur K.SISSANI chef de service contrôle qualité à DR6 par son accueil, son assistance Son soutien et par ces précieux conseils qui m’ont permis d’achevé ce modeste rapport. Aussi mes remerciements les plus chaleureux à tous les membres fonctionnaires et cadres de laboratoire qui m’ayant encadré et accompagné par leurs efforts et commentaires au cours ce stage. Et plus particulièrement :
Madame DEKHISSI RAHMA Madame MAHMADI OUAFA E Madame CHOUTNA NAZIHA Monsieur BOUTOUIL MUSTAPHA Monsieur EL YOUSSFI MOHAMMED Madame MJAHAD NACIRA Monsieur SOUSSI MOHAMED Monsieur ATTAR
Pour leurs présences qui a assuré le bon déroulement de mon stage
Rapport de stage
Page 1
Ce rapport réalisé a l’office régional de l’eau potable à Oujda, dans le service de contrôle de qualité des eaux, dans le cadre de mon cursus universitaire pour enrichir l’étude professionnelle en science et technologie de l’eau
au sien
d’université Mohamed v faculté des sciences de Oujda .
I-
Historique et Definition : Crée en 1972, l’ONEP est un établissement public à caractère industriel et commercial doté de
la personnalité civile et de l’autonomie financière. Acteur principal dans le secteur de l’eau potable et de l’assainissement, les missions principales de l’Office vont de la planification de l’approvisionnement en eau potable jusqu’à sa distribution en passant par les phases, étude, conception, réalisation, gestion, exploitation des unités de production, de distribution et d’assainissement liquide et enfin du contrôle de la qualité des eaux jusqu’à la protection de la ressource. D’importants investissements ont pu être réalisés durant les trois dernières décennies pour assurer les infrastructures de base en matière d’eau potable.
Nouvelles orientations stratégiques : Les efforts déployés par l’ONEP durant les trois dernières décennies ont permis d’améliorer le niveau de l’approvisionnement en eau potable en milieu urbain. Aujourd’hui l’Office s’est fixé et nouvelle stratégie visant la généralisation de l’accès à l’eau potable à l’ensemble des citoyens et l’intervention dans le secteur de l’assainissement liquide dans une vision globale et intégrée du cycle de l’eau. Cette nouvelle stratégie qui s’inscrit dans les orientations de S.M. LE ROI MOHAMMEDVI Confirmée dans son discours d’ouverture de la 9ème session du conseil supérieur de l’Eau et du Climat à Agadir le 21 juin 2001, s’articule autour des trois axes suivants : 1-Généralisation de l’accès à l’eau potable. 2-assainissement liquide. 3-Maintien des acquis.
Rapport de stage
Page 2
Coopération internationale : La coopération internationale participe activement au développement du secteur de l’eau potable et de l’assainissement. Parallèlement à son intervention efficace en matière d’alimentation en eau potable d u milieu urbain, cette coopération accompagne la réalisation de projets d’assainissement et d’alimentation en eau potable du milieu rural conformément à l’orientation stratégique de l’ONEP. Elle a également contribué d’une manière substantielle au renforcement des structures de l’ONEP, au développement de son potentiel humain et à l’amélioration de performance. Elle est repartie en deux volets liés respectivement à la coopération financière et à la coopération technique. Deux accréditations accordées au laboratoire central de l’ONEP : Selon le référentiel international ISO 17025, par le Ministère de l’Industrie, du Commerce et de la Mise à Niveau de l’Economie du Maroc, et le Ministère de développement Durable, de l’Environnement et des parcs des Québec (Canada). La Direction Contrôle Qualité des Eaux (DCE) a obtenu courant 2005, pour une durée de 5 ans, deux nouvelles accréditations selon le référentiel international ISO 17025 par le Ministère de l’Industrie, du Commerce et de la mise a niveau de l’Economie du Maroc (MICMNE) et par le Ministère de Développement Durable, de l’Environnement et des parcs (MDDEP) du Québec (Canada). Les domaines accrédités par le MICMNE son las analyses bactériologiques, les analyses physico-chimiques inorganiques et les analyses physico-chimiques des micropolluants organiques. Les mêmes domaines sont accrédités également par le MDDEP avec celui sur la toxicologie de l’eau. Ces deux accréditations sont en fait une actualisation de celles obtenues respectivement en 2002 par le Ministère de Développement Durable, de l’environnement et des Parcs du Québec (ex Ministère de l’Environnement du Québec) et en 2003 par le Ministère de l’Industrie, du Commerce et de Mise en à Niveau de l’Economie du Maroc (ex Ministère du Commerce, de l’Industrie et des Télécommunications), et, ce, selon le referenda international ISO 17025.
Missions : -planification de l’approvisionnement en eau potable (AEP) à l’échelle nationale. -production de l’eau potable. -Distribution de l’eau potable pour le compte des collectivités locales. -Gestion de l’assainissement liquide pour le compte des C.L -Contrôle de la qualité des eaux.
Axes stratégiques : Rapport de stage
Page 3
-Pérennise, sécuriser, et renforcer l’AEP en milieu urbain. -Généraliser l’accès à l’eau potable en milieu rural -Rattraper le retard en matière d’assainissement liquide.
Approche : -Assurer une réveille Technologique. -Intégrer le composant environnement, -Impliquer le citoyen dans l’économie et la protection des ressources en eau.
Atouts : -Une entreprise publique à haute expertise, -Un personnel compétent, -Des partenariats nationaux et internationaux en expertise et R&D.
Projets relatifs à la qualité des eaux d’alimentation humaine : Cette norme fixe les exigences auxquelles doit satisfaire la qualité des eaux d'alimentation humaine. - On comprend par "eau d'alimentation humaine" toute eau destinée à la boisson quelque soit le mode de sa distribution.
- Pour "les eaux minérales naturelles ": c'est une eau de sources ou de puits, qu'en raison de leur température et de la nature spéciale de leur principe salines, gazeux ou radioactifs peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques. Cette norme ne concerne que les eaux d'alimentation humaine. Elle ne doit contenir ni substances chimiques, ni microorganismes nocifs pour la santé, en outre elle doit être aussi agréable à boire que les circonstances le permettent et doivent satisfaire aux exigences de qualité spécifiée. La vérification de conformités des eaux à ces exigences se fera par des normes marocaines suivant les méthodes analytiques suivantes: 1. Analyse de type I: elle est effectuée sur les eaux dont les réseaux de distribution à l'entrée du système de distribution, elle comprend les paramètres de qualités suivantes : la température, le PH, recherche des coliformes totaux et fécaux, germes totaux. 2. Analyse de type II : c'est une analyse de surveillance, elle est effectuée sur chaque captages à l'entrée du système de distribution elle comprend en plus de l'analyse de type I ; la turbidité, conductivité, Ammonium, Nitrate, Nitrite, Oxydabilité au permanganate de potassium, Dénombrement de streptocoques fécaux pour les eaux brutes.
Rapport de stage
Page 4
3. Analyse de type III : Elle est utilisée pour les mêmes fins de l'analyse de type II sauf pour la confirmation d'une pollution bactérienne à l'intérieure du réseau de distribution d'eau, elle sert également à l'étude des ressources en eau qu'on ce propose d'utiliser pour l'approvisionnement public en eau; elle comprend tous les paramètres pour lesquels une valeur maximale admissible ou une valeur minimale requise et qui sont fixées par les normes applicables à l'eau d'alimentation. En plus des analyses de type I & II on trouve la détermination d'Oxygène dissout, Fer, Manganèse. Pour le contrôle, l’Office nationale de l’eau potable dispose d’un laboratoire central à rabat et de 27 laboratoires décentralisés répartis sur tout le territoire national. Parmi ces laboratoires, on trouve le laboratoire régional de l’oriental à Oujda.
II.
Laboratoire regional d’Oujda :
Presentation:
Le laboratoire régional d’Oujda à pour tache la surveillance de la qualité des eaux brutes et leur traitement dans les centres relevant de la direction régionale de l’oriental. Dans le but à livrer aux consommateurs une eau potable. le laboratoire régional dispose d’un : Laboratoire régional d’Oujda. Laboratoire de la station de traitement de Berkane. Laboratoire de la station de traitement de Zaïo. Laboratoire de la station de traitement de Nador.
Le laboratoire régional dresse des plannings mensuels de la direction de la qualité des eaux dans l’ensemble des centres de la Direction Régionale de l’Orientale. En se basant sur le planning annuel de missions établis par le laboratoire central. En plus des missions de contrôle de la qualité de l’eau. Le personnel du laboratoire est chargé de : La préparation de réactifs chimiques et des milieux de culture bactériologique. La mise au point et l’étalonnage des appareils de mesure. L’établissement des tableaux de bord. L’interprétation des résultats. Gestion de stock Remplir les registres du nouveau matériel livré par le laboratoire central. Rapport de stage
Page 5
Le laboratoire régional d’Oujda et composé des salles :
Salle pour le lavage, le stockage des différents matériels (flacons, tubes, etc.) et la stérilisation ; soit la stérilisation par chaleur : utilisée surtout pour les milieux de cultures. Elle se fait dans l’autoclave (à 120°C, 1bar, pendant 15 à 20 minutes), soit la stérilisation par chaleur sèche: utilisée surtout pour le matériel de laboratoire, dans le four de 170°C pendant 30 minutes. Il faut d’abord nettoyer, puis sécher et emballer par du papier kraft. Deux salles pour les analyses physico-chimiques, une pour la Spectroscopie d’Absorption Atomique et l’autre pour autres analyses physico-chimiques ; mesure de la turbidité , le pH, la conductivité, le fluorure (F-), l’oxydabilité au permanganate de potassium, le chlorure (Cl-), le titre alcalimétrique (TA), le titre alcalimétrique complet (TAC), le titre hydrotimétrique (TH), l’oxygène dissous, etc. cette salle est munie d’un stock des produits chimiques, des matériels de manipulation :(à part les matériels simples comme les pipettes, les béchers, les érlenmeyers, les entonnoirs, les fioles jaugés (à double trait), les pipettes jaugés, il y a aussi des pipettes automatiques, des distributeurs automatiques, des burettes automatiques, des micropipettes, qui facilitent le travail. Les différents matériels en verre, en plastiques, sont bien organisés, chaque type à ça place. Salle d’analyses bactériologiques : Dans cette salle s’effectuent les analyses bactériologique et la préparation des milieux de cultures, elle est équipée de : -Quatre incubateurs réglés à des températures différentes (37±1; 44±0,5; 36±2; 22±2) °C selon l’incubation préconisée - Un bain marie de température environ (75±5) °C, -Un e balance, -Une plaque chauffante -Un agitateur -U ne rampe de filtration -Un PH mètre portable -Un conductivimetrie portable -Un compteur de colonie -Un réfrigérateur réglé a une température de consigne (4±2°C) -Un ordinateur GDAL (gestion des données analytiques).
Rapport de stage
Page 6
Après la connaissance de la terre, son noyau très dense s’est échauffé et a libère des particules. Par les fissures de la croûte terrestre, se sont ainsi échappé l’eau, le gaz carbonique et l’azote. A mesure que les températures se sont élevées, l’atmosphère s’est emplie de vapeur d’eau. Les nuages se sont accumulés. Les eaux du ciel sont retombées pour former les océans. C’était il y a 3.5 milliards d’années. Ainsi l’eau est apparue sur terre il y a quelques 3.5 milliards d’années et depuis, la planète gère une masse d’eau de 1.35 milliards de km3 dont entre 500 000 et 1 000 000 de km3 la quantité d’eau qui représente l’eau douce (les lacs, les rivières, les mares, les fleuves, les eaux souterraines…etc.), 25 millions de km3 représente les calottes glacières et 50 000 de km3 se trouve dans l’atmosphère sous forme de nuages et de vapeurs. L’eau de formule H2O et de masse moléculaire 18.016 g/mole est un liquide incolore, inodore, transparent, l’eau est la substance la plus abondante à la surface du globe. Pour la protection et l’exploitation de cette source, parmi les directions réalisées, l’Etat a construit l’Office National de l’Eau Potable (ONEP).
But de stage Pour l’amélioration de notre système pédagogique, nécessairement on doit par l’évaluation de toutes les actions d’enseignement entreprise. Mon stage au sein de laboratoire de contrôle de qualité des eaux dans office régional de l’eau potable d’Oujda est une expérience très enrichissante qui m’a permis d’appliquer mes connaissances théoriques et d’apprécier d’autres d’informations d’ordre pratique. Il est évident que ce qu’est demande nom seulement l’évaluation de la cour, mais l’amélioration de notre situation dans le domaine socioéconomique, d’où la nécessité d’un tel stage pour compléter mon cursus d’études universitaire
Rapport de stage
Page 7
Les activités effectuées au cours de stage A. Salle de lavage
Lavage des flacons de prélèvement en plastique destinées pour analyse physico-chimique:
Tremper les flacons dans un mélange de l’eau et de détergent
Rinçages à l’eau de robinet pour enlever le détergent
Egouttage Contrôle qualité de lavage : Prendre 3 flacons par un lot de 30 unités ;
-Remplir les flacons au ¾ avec l’eau distillée ; -Laisser une nuit puis effectuer une analyse de conductivité et comparer à celle d’eau distillée ; - Accepter seul les lots dont la valeur de conductivité ne dépasse pas 8 us/cm. nettoyage des flacons utilisés pour l’absorption atomique:
Trois rinçages ou plus à l’eau froide du robinet pour enlever toute trace de détergent ;
Trois rinçages avec une solution de HNO3 25% ;
Trois rinçages à l’eau distillée ou de qualité équivalente ;
Égoutter puis ranger.
Pour l’analyse de l’ion ferrique II au moment du lavage L’NHO3 doit être remplacée par L’HCL 8M. Lavage de la verrerie et des flacons de prélèvement en bactériologies:
La propreté de la verrerie et des flacons de prélèvent constitue un élément essentiel de la qualité de l’analyse ; il est donc nécessaire de s’assurer que le lavage de la verrerie est adéquat et conforme de façon à minimiser une possible contamination des échantillons liées à la verrerie ou des flacons de prélèvement lors de l’analyse. Cette procédure a pour objet de décrire les modalités de lavage des verreries utilisées pour les déférentes déterminations ainsi que des flacons de prélèvements elle s’applique à tous les secteurs ou des analyses sont effectues. Rapport de stage
Page 8
NOTE 1 : les flacons de prélèvement, verrerie courante et tubes utilisées dans les laboratoires de bactériologie doivent êtres exemptes de substances bactéricides ou bactériostatique et avoir un pH voisin de neutralité. NOTE2 : les flacons de prélèvement, verreries courantes et tubes destinés à l’analyse des eaux potables, naturelles, piscines et les flacons destinés à l’analyse des eaux usées. NOTE 3 : l’instruction de lavage doit être affiches dans le secteur de la verrerie. Procédures de lavage des verreries
Cette procédure à pour objet de décrire les modalités de lavage de la verrerie utilisée au cours des analyses bactériologiques ainsi que les flacons de prélèvement. a. Trempage : -
Utiliser un détergent sans phosphate et de pH neutre pour le lavage de toutes les verreries de la bactériologie ;
-
Tremper les flacons de prélèvement, verrerie courante, pipettes et tubes, dans le bac contenant le mélange eau et détergent ;
-
Laisser immerger pendant 1 heure ;
-
Enlever les restées d »écritures de marqueur avec l’éthanol ; brosser écouvillon l’intérieur des flacons, des tubes et autre verreries ;
b. Rinçage : -
Rincer à l’eau du robinet ;
-
Rincer 3 à 4 fois chaque verrerie avec de l’eau distillée.
c. Egouttage –séchage -
Egoutter le tot de matériel sur la paillasse (flacons avec le goulot orienté vers le bas
-
Sécher le lot de matériel contrôle dans le four pasteur à environ 50 à 60 °C
d. Stérilisation de la verrerie :
La stérilisation est l’opération qui a pour objet la destruction le micro organismes, contenus dans une préparation, tant sous leur forme végétative que sous leur forme résistante. On cite deux types de stérilisation : humide et sèche. La stérilisation par voie humide se fait grâce à un autoclave dont la température est réglée à 121 °c pendant 15min avec utilisation d’un RUBAN comme indicateur (le ruban indicateur est incolore au départ après stérilisation sa couleur devient noir, le ruban dans ce cas porte un symbole sous forme de / et seulement cette partie du ruban qui change de couleur), il existe aussi un autoclave consacré pour la décontamination des déchets des analyses bactériologiques (boites Pétri utilisées, pipettes et entonnoirs à usage unique, gants…) avant d’être jetés à la nature et les matériaux réutilisables (tubes, lames...) pour éviter tout risque de contamination. Chaque mois on contrôle la Rapport de stage
Page 9
qualité de la stérilisation des autoclaves on met une ampoule de stérikon au fond de chaque autoclave, après la stérilisation on la met dans le séchoir avec une autre ampoule (témoin) non stérile. La température de four de pasteur doit être entre 50 et 60°c. Si la stérilisation est suffisante les spores de stérikon stérilisé sont détruites, la couleur du contenu de l’ampoule reste violette et limpide, si non le contenu devient jaune. Stérilisation par chaleur sèche: se fait grâce à une étuve réglée à une température de 170 °c. Cette stérilisation concerne les verreries suivantes : flacons de prélèvement et les tubes. Avant la stérilisation des flacons de prélèvement (destinés pour le prélèvement des eaux traitées) on introduit 1 ml de thiosulfate de sodium à 3 % dans chaque flacons afin de neutraliser le chlore résiduel libre présent dans les eaux traitées après on suit les étapes suivantes : -Boucher le goulot avec du coton cardé puis couvrir le bouchon et le goulot avec du papier KRAFT ; -Mettre un ruban indicateur sur le lot à stériliser (le ruban indicateur dans ce cas porte un symbole sous forme de V et seulement cette partie du ruban qui change de couleur); -Ecrire le numéro du lot, date de stérilisation et le terme T (traitée) ou B (brute) sous Chaque flacon. ; -Mettre les flacons au four à 170° C pendant 1h30min. Contrôle de qualité du matériel : On dispose quelques gouttes de bleu de bromothymole sur la paroi de chaque type de verrerie et on observe la réaction de l’indicateur au contact de la verrerie par virage au jaune à pH< 6.5.Et bleu vert à bleu à pH > 7.5 NC et si la couleur est vert 6.5
Page 10
l’incube dans un étuve à 37°C, et si le TSB change d’aspect et devient trouble, tous les flacons doivent êtres rinces et stérilise pour chaque fois. Se qui concerne le contrôle des milieux de culture, après la stérilisation en mesure le pH et en le compare avec les normes déclaré par le fabricant, puis en prend au hasard des boites contenant le milieu ,une placé a 44°C et l’autre à 37°C pendant 24h ( la même chose pour les liquides (rothe,Litsky,…) sauf le gélose et TSB collé dans une boite de 50 mm et en le met dans une jarre assure l’anaérobiose dans 37 °C ). S’il n’ya pas de résultats positifs en accepte la procédure de stérilisation, donc on est dans les normes se qui indiques que notre résultats d’analyses avec ces milieux est faibles. Si en observe des boites présentes des colonies ou des tubes troubles en rejettent le lot, il faut refaire les milieux à nouveaux.
B.
Salle d’ Analyses bactériologiques :
Les micro-organismes sont rencontrés dans tous les types d'environnement présents dans la nature, ils colonisent tous les écosystèmes. Ils sont isolés du sol, des eaux douces et des eaux marines, de l'air, mais aussi d'environnement plus hostiles tel que les pôles, les déserts, les geysers, le fond des océans. De là, l’analyse bactériologique paraît importante, afin de se rassurer de l’inexistence de bactéries pathogènes dans les eaux. Les deux méthodes utilisées pour le dénombrement dans le laboratoire régional d’Oujda sont : - La méthode MF (membranes filtrantes) pour les eaux traitées. - La méthode NPP (le nombre le plus probable) pour les eaux brutes. Procédure de la qualité de l’environnement du secteur de bactériologie
Assurance de qualité: Avant de pouvoir commencer l’analyse, il faut bien se rassurer de la qualité du matériel et du milieu de travail. Les analyses bactériologiques ne sont pas exemptes, car le matériel et les milieux de cultures sont soupçonnés inadéquats jusqu'à la confirmation par contrôle.
Contrôle de stérilisation des flacons de prélèvements : comme on l’a vu dans la page précédant. Contrôle de l’air ambiant : C’est un contrôle mensuel, réalisé dans la salle des analyses bactériologiques, et dans tous les incubateurs et le réfrigérateur qui existe dans la salle, il consiste à vérifier si l’air du milieu où se réalise l’analyse est adéquat ou non.
Rapport de stage
Page 11
Les boites de pétri de 90mm, contenant le milieu de culture MTC (Microbial Cotent agar) sans couvercles sont exposées à l’air ambiant pendant 17 minutes, puis fermées et incubées à une température de 37°C pendant trois jours. Si le résultat ne dépasse pas 15unité formant colonie (UFC), le contrôle est conforme. Contrôle de surface du travail : l’entretien des surfaces du travail s’effectué par nettoyage humide. Les surfaces du travail sont aseptisées à l’aide de solution désinfectante avant et après chaque manipulation, pulvériser les surfaces avec le désinfectant puis essayer avec un papier à usage unique. NB : alterner le désinfectant (acide/alcalin).vérifier mensuellement l’asepsie des surfaces du travail lord des activités analytiques. L’échantillonnage est fait à l’endroit désignés par la liste de prélèvement figurant sur les formulaires de contrôle de qualité bactériologique des surfaces du travail. La méthode d’écouvillonnage : consister à frotter les surfaces sur une dimension donnée avec un échantillon humide et d’inoculer celui-ci sur un milieu propice au développement des microorganismes Cette méthode est utilisée pour évaluer la contamination des incubateurs et des réfrigérateurs qui sont des endroits rugueux, irréguliers, convexes et difficilement accessibles. -
Dissoudre ces composées dans un bécher 1 litre sur une plaque chauffante, refroidir et compléter le volume à 1 litre avec l’eau distillée
-
Stériliser cette solution à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.
-
De façon aseptique, répartir la solution en volume de 10 ml dans des tubes à bouchon vissés préalablement stérilisés.
Ecouvillonnage
-
Identifier un tube pour chaque point de prélèvement.
-
Plonger un écouvillon stérile dans la solution de rinçage et enlever l’excès de liquide en pressant l’écouvillon sur le bord de tube.
-
écouvillonner une surface de 25 cm2 délimitée par un cadre de 5cm × 5cm, en évitant de toucher un cadre. rincer l’écouvillon dans la solution de rinçage.
-
Répéter cette opération pour quatre autres surfaces de 25 cm2 du même endroit de prélèvement, en ayant soin de rincer l’écouvillon dans le tube de rinçage entre chaque prélèvement.
-
Apres le cinquième prélèvement, remettre l’écouvillon dans le solution de rinçage et lui couper la tige avec des ciseaux stérile.
-
Refermer le tube et le conserver à 4O C jusqu'à le moment de l’analyse
Rapport de stage
Page 12
-
Pour l’analyse agiter rigoureusement
le tube contenant l’écouvillon
et prélever
aseptiquement 1.0 ml et 0.1ml de la solution de rinçage afin de faire le dénombrement par incorporation à la gélose MCT ; -
Incuber les boites de pétri à 37°C pendant 48 h.
-
Dénombrer les colonies et calculer le nombre de colonies par ml (UFC/ml)
-
Sachant que 1.0ml correspond à 10 cm2 de surface évaluées, exprime les résultats cihaut mentionné en UFC/25 cm2 en le multipliant par facteur de 2.5. inscrire les résultats dans le formulaire.
-
Un résultat < UFC/25 cm2 est juge satisfaisant .si un résultat > UFC/25 cm2 est obtenu, désinfecter la surface faire une reprise du test et avertir le chef de service de microbiologie.
Méthode par boite de rodac : -
Identifier les endroits de prélèvement sur les boites de rodac
-
Appliquer le gélose sur la surface à prélever
-
Refermer la boite
-
Incuber à 37°C pendant 48 h
Résultats Dénombrer les colonies sur chaque boite de pétri et rapporter les résultats en UFC/25 cm2. Si la limite est dépassée, une désinfection de la paillasse doit être effectuée et puis reprendre l’analyse. Nettoyage et entretien du sol : l’entretien du sol s’effectue par un nettoyage humide .le sol doit être nettoyé au moins une fois par semaine à l’aide d’une solution désinfectante. -
Tremper une vadrouille dans un seau contenant de l’eau et le désinfectant
-
Retirer la vadrouille et la passer humide sur le sol avec un mouvement de va et vient.
-
Repérer l’opération deux à trois fois en change l’eau de seau
NB : cette opération de nettoyage doit s’effectuer dans le sol de la marche en avant. Condition ambiante : noter la température ambiante de toutes les salles de travail quotidiennement, en début et d’après –midi si possible. la température doit se situer entre le 16 et 27°C. Si les limites supérieures et inferieures sont dépassées revoir le système de climatisation de salle. Contrôles des boites de pétris des nouveaux lots réceptionnés :
Rapport de stage
Page 13
La gélose PCA (Plat counet agar) est introduite dans 10 boites du lot à contrôler. 5 de ces boites sont incubées à 37°C, tandis que les 5 restantes sont incubées à 22°C, pendant 3 jours. La stérilité des boites est indiquée par l’absence de colonie. Contrôles des pipettes jetables des nouveaux lots réceptionnés: Le contenu d’un tube en TSB (Tryptone soy broth), est pipeté puis réintroduit dans le tube, cette opération est refaite 3 à 4 fois pour chaque pipette (5 pipettes sont analysées de chaque lot). Les tubes sont incubés à 37°C pendant 3 jours. Si : La solution dans le tube reste limpide = lot de pipettes adéquat ; La solution dans le tube devient trouble = une reprise est effectuée en vérifions chacune des étapes si encore une fois les critères d’acceptabilités sont dépasser prévenir immédiatement le chef de service contrôle qualité et en retire le lot concerné du stock. Contrôle des entonnoirs jetables : des nouveaux lots réceptionnés Contrôle de stérilité : Pour le contrôle de la stérilité, 5 entonnoirs de chaque lot sont pris, puis 100 ml d’eau de rinçage est filtrée sur des membranes de 0.45 µm de porosité. Les membranes sont insérées dans des tubes contenant du TSB puis incubées à 37°C pendant 48 heures. L’absence de turbidité indique que les entonnoirs sont vraiment stériles Calibration : Les entonnoirs gradués jetables utilisés lors de la filtration des échantillons d’eau doivent être vérifiés à l’aide d’une fiole jaugée de 100ml. On vérifie la calibration de 5 entonnoirs par lot. Le niveau de l’eau doit être égal au trait prédéterminé de l’entonnoir. Si ce n’est pas le cas ; on rejette tout lot dont les entonnoirs ne sont pas conformes. Contrôle de la qualité des milieux de culture : Chaque milieu de culture est muni d’une fiche de contrôle qui comporte : - La date de préparation. -
La date d’expiration.
-
Le volume préparé.
-
Le résultat du contrôle du milieu après la préparation.
-
Numéro de lot
-
Numéro de code
-
PH recommandé
-
PH après stérilisation
-
Résultat du control de la stérilité
-
Matricule du préparateur
Rapport de stage
Page 14
Contrôle de la qualité des appareils: Chaque appareil est muni d’une fiche de contrôle. *Les étuves, les bains maries et le réfrigérateur sont munis des fiches de contrôle de la température qui se lit 2 fois par jours (à partir d’un thermomètre étalonné qui se trouve au sein de chaque appareil) et des fiches de suivi de maintenance. *La balance est aussi munie de deux fiches, une de vérification de niveau et l’autre de la masse *Le pH-mètre est aussi vérifié avant chaque mesure et étalonné en cas de non conformité. Au niveau du laboratoire le matériel subit aussi un contrôle externe auprès des entreprises de métrologie afin de mesurer leur capacité de donner des résultats qui répondent aux normes internationales. N.B : Chaque appareil possède un dossier qui comporte : une fiche de vie, des certificats d’étalonnage des entreprises de métrologie, et un manuel
Analyse bactériologique : Introduction : L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas d’effectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celle qui est susceptibles d’être pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes assurant l’absence de contamination et la survie bactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodes générales d’examen bactériologique des eaux suivies des recherches de bactéries indicatrices de pollution et d’efficacités de traitement puis des bactéries spécifiques pathogènes. Les analyses bactériologiques de l’eau se fait selon le type de l’eau à analysé (l’eau brute et l’eau traitée). Prélèvement : Un examen bactériologique ne peut être valablement interprété que s’il est effectué sur un échantillon correctement prélevé, dans un flacon stérilisé, selon un mode opératoire précis évitant toute contamination accidentelle, ou variation
de la quantité des bactéries présentes lors du
prélèvement. Méthode analyse La méthode ou bien la technique d’analyse pour l’estimation de la qualité bactérienne dans un échantillon dépend en premier lieu de la nature de l’échantillon (eau traitée ou eau brute) et de la nature des bactéries recherchées. Rapport de stage
Page 15
méthode d’analyse bactériologique de l’eau traitée : Qualité de l’eau : Recherche et dénombrement des Escherichia Coli : Définition : les Escherichia Colis sont des bactéries coliformes, capables de produire de l’indole à partir du tryptophane dans les 24 ±4hreures à 44 ±0.5°c.
Méthode par filtration membrane
Test présomptif
Dénombrement des colonies typiques (jaune avec halo jaune) et les colonies atypiques (différentes couleurs et morphologies) Test confirmatif
Isoler Isolement par isolement sous forme de stries sur le TSA Incubation à 36°±2°C/ 21H±3H
Ensemencement sur le tube d’eau peptonnée exempte d’indole Incubation à 44°C±0.5°C / 21H±3H
21H+/-3H
Par suite on ajoute 0,2 à 0,3 ml du réactif de Kovac dans les tubes d’eau peptonnée
Apparition de coloration rouge à la surface de l’eau peptonnée confirme la production de l’indole présence d’E. Coli
Nombre de colonies Confirmées en UFC/100ml Rapport de stage
Page 16
Qualité de l’eau : recherché et dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux traité
Définition : le terme ‘entérocoque intestinaux’ désigne l’ensemble des bactéries de forme de cocci à gram positif Formant généralement des chaînes, capable de réduire le chlorure de 2,3,5-triphényl-tétrazoliumen formazan et d’hydrolyser l’esculine sur les milieux de slanetez et bartley, et faisant partie de la flore intestinaux normale de l’homme ou d’autre animaux à sang chaud Méthode par filtration membrane
Test présomptif
Dénombrer les colonies rouges, marron ou roses
Test confirmatif
Transfert de la membrane sur boite contenant le milieu BEA Incubation à 44 °C±0.5°C/2à4H
Dénombrement des colonies brune ou noire
Nombre de colonies typique confirmées en UFC /100ml Rapport de stage
Page 17
Qualité de l’eau : recherche et dénombrement des bactéries coliformes Définition : Le terme « bactéries coliformes » regroupe plusieurs espèces bactériennes de la famille des Entérobactéries. Se sont des micro-organismes aérobies et anaérobies facultatifs, en forme de bâtonnets, gram négatif. De plus les bactéries coliformes produisent une réaction négative à l’épreuve du cytochrome oxydase (oxydase négative). Milieu de culture pour le démembrement : même milieu de culture pour la recherche et le dénombrement d’E. coli sauf l’incubation se fait à 36°c±2°c/21h±3h jusqu’à 44h±4h Test confirmative : étalement de la colonie sur le TSA, et incubation à 36°c pendant 24h. Réactif à l’oxydase: tetramethyl-1.4-phenylenediamine dihydrochloride. KIT gram color(voir annexe ) Qualité de l’eau : Recherche et dénombrement des spores de bactéries des anaérobies de clostridium sulfitoréducteurs dans l’eau traite
Définition. clostridia : Micro-organismes anaérobies formant des spores et sulfitoréducteurs, appartenant à la famille des Bacillacées at. au genre Clostridium. Principe et réactions: La recherche des spores d’organismes anaérobies sulfitoréducteurs (clostridia) dans un échantillon d’eau de volume déterminé, passe par les étapes suivantes. Sélection des spores: Avant qu’il soit procédé à l’essai, l’échantillon d’eau doit être chauffé dans un bain d’eau à 75±5°C pendant 15 min à partir du moment où cette température a été atteinte. Un flacon similaire contenant le même volume d’eau que celui de I’ échantillon pour essai doit être utilisé parallèlement comme témoin afin de vérifier le temps de chauffage nécessaire. La température de l’eau dans le flacon témoin peut être enregistrée de manière permanente à l’aide d’un thermomètre. Filtration sur membrane &culture: Filtration de l’échantillon d’eau au travers d’une membrane filtrante dont les pores présentent une dimension telle que les spores des bactéries (0,2um) sont retenues à l’intérieur de la membrane filtrante ou sur celle-ci. Après filtration, enlever la membrane avec des pinces stériles et la placer la face supérieure tournée vers le bas dans le fond d’une boîte de Pétri en s’assurant qu’il ne reste pas de bulles d’air prises sous le filtre. Verser ensuite soigneusement 18 ml du milieu TSC liquéfié entier (avec supplément D-cyclosérine) et préalablement refroidie à 50°C sur la membrane en l’immobilisant avec des pinces stériles. Après que cette couche de milieu se soit déposée, incuber anaérobiquement, ou bien dans d’autres conditions assurant I’ anaérobiose, à une température de 37°C ±1°C dans l’incubateur pendant 20 ± 4 h et 44 ± 4 h. Interprétation: Compter toutes les colonies noires (nombre de colonie exprimé en UFC/100ml) Principe : Ensemencement, par mélange dans un milieu de culture spécifié coulé dans des boîtes de Pétri, de volumes mesurés d'un échantillon ou de ses dilutions. Incubation d'un jeu de boîtes à 36°C pendant 44 h et d'un autre jeu à 22°C pendant 68 h .Calcul du nombre
d'unités formant colonie (UFC) par millilitre (ml) d'échantillon à partir du nombre de colonies formées dans le milieu. Boîtes de Pétri en verre ou en matière de plastique : de diamètre 90 mm ou 100 mm Milieux de culture et diluants :Composants de base Pour la préparation du milieu, utiliser des composants de qualité uniforme et des produits chimiques de qualité analytique, ou bien utiliser un milieu de culture équivalent complet déshydraté et suivre les instructions du fabricant. Rapport de stage
Page 18
Pour préparer le milieu, utiliser de l'eau distillée dans un appareil en verre ou de l'eau déionisée conforme à la qualité 3 de l'EN ISO 3696 et exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l'essai. NOTE: L'utilisation de produits chimiques d'autres qualités est permise, sous réserve de démontrer qu'ils ont une Performance égale pour l'essai. - Diluant Pour les dilutions, utilisé le diluant à base de peptone indiqué dans l'ISO 8199. -
Gélose à l'extrait de levure
Tryptone (Peptone de caséine, pancr.) Extrait de levure déshydraté Gélose, en poudre ou en paillettes Eau
6,0 g 3,0 g 10 g à 20 g (en fonction du pouvoir gélifiant) 1 000 ml
Ajouter les composants ou le milieu complet déshydraté, à l'eau et dissoudre par chauffage. Ajuster le pH si nécessaire de façon qu'après stérilisation il soit de 7,2 ± 0,2 à 25°C. Répartir le milieu par volumes de 15 ml à 20 ml dans des tubes, flacons ou autres récipients. Pour conserver des volumes plus importants, utiliser des récipients de capacité allant jusqu'à 500 ml. Stériliser à l'autoclave (en chaleur humide) à (121 ± 3) °C pendant (15 ± 1) min. Pour l'emploi, faire fondre le milieu, le laisser refroidir et le maintenir à (45 ± 1) °C au moyen du bain marie d’eau. Il est recommandé de ne pas garder le milieu plus de 4 h à 45 °C, après quoi le milieu doit être rejeté.
Analyse bactériologique de l’eau brute (eau naturelle) : Le dénombrement des bactéries sur milieux liquides est basé sur la technique du nombre le plus probable (NPP). Il s’agit d’une technique de dénombrement indirecte par calcul statistique après répartition de l’inoculum dans un milieu de culture liquide. Dans ce type de méthode les bactéries se multiplient librement dans le milieu liquide
**NPP /100ml: nombre le plus probable de la table Mac CRADY. milieux de culture liquide et bactéries recherchées Coliformes totaux : sont utilisée depuis très longtemps comme indicateur de la qualité microbienne de l’eau parce qu’ils peuvent être indirectement associée à une pollution d’origine fécale. Les coliformes totaux sont définis comme étant des bactéries en forme en bâtonnets aérobies ou anaérobies facultatifs permettant l’hydrolyse du lactose à 36°c. Milieu de culture: -
Bouillon lauryl sulfate-tryptose (37°c/48h). Milieu de confirmation :
-
Bouillon lactosée bilié au vert brillant (37°c/48h)
Coliformes fécaux : sont des sous groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose à une température de 44°c, l’espèce la plus fréquemment associée à ce groupe bactérien est E. Coli. -
Milieux de cultures : Bouillon lauryl sulfate-tryptose (37°c/48h). milieu de confirmation :
-
Bouillon EC medium (44°c/24h).
Rapport de stage
Page 19
Streptocoques fécaux Sont des bactéries à Gram positif, de forme sphérique ou ovoïde formant des chaînettes et capable de se développer en présence de l’acide de sodium à37° (agent sélectif) pendant 48 heure et dans un bouillon gélosé en présence de l’acide de sodium et de l’éthyle violet à 37°C pendant 48 heure. -
Milieu de culture : Bouillon glucose à l’azide de sodium (37°c/48h). Milieu de confirmation : Bouillon litsky ((37°c/48h).
Remarque : Les tubes positifs (trouble+gaz, trouble et /ou dépôt) repiquer sur les milieux confirmatifs
C. Analyses physico-chimiques Introduction : Les analyses physico-chimiques de l’eau consistent à analyser plusieurs paramètres Pour caractériser l’eau en tenant compte des normes, chaque paramètre à une valeur maximale admissible (VMA). les paramètres physico-chimiques : 1. température : La température est un facteur écologique important du milieu .elle agit sur la conductivité électrique et le pH. La température de l’échantillon est mesurée au moment de prélèvement. La température généralement mesuré à l’aide d’un thermomètre à mercure étalonné et avec une graduation d’au moins 0.5°c. 2. conductivité électrique ou bien la minéralisation : C’est la quantité de sels minéraux contenus dans l’eau : Anions: HCO3-, SO4--, Cl-……… Cations: Ca2+, Mg2+, Na+, K+……… La conductivité est mesurée par la méthode électrométrie qui se base sur la mesure de la résistivité de l’échantillon. 3. pH: Le pH est mesuré sur place par une électrode de verre ou bien par un indicateur coloré ou par papier pH. Il caractérise l’acidité de l’eau .l’eau destiné à l’alimentation humaine doit avoir un pH entre 6.5 et 8.5. 4. turbidité : La turbidité varie suivant les matières en suspension de l’eau, son principe consiste à mesurer la lumière Dispersée par les particules en suspension présentes dans l’eau .la turbidité est mesurée par un turbidimètre. 5. l’oxygène dissous : L’oxygène dissous dans l’eau est mesuré par la méthode iodométrique. la fixation de l’oxygène doit être Effectué au moment de prélèvement en introduisant successivement 1ml de solution de chlorure de manganèse (Mncl2) et 1ml d’iodure de potassium (KI), l’échantillon doit être prélevé dans des flacons spécialement réservés Pour le dosage de l’oxygène dissous.
Rapport de stage
Page 20
Dosage iodométrique : L’aide d’une pro pipette on met 1ml d’acide sulfurique (H2SO4) concentré on agite le flacon pour que l’iode soit bien répartit. Transvasons le contenu dans erlenmeyer de 100ml et on effectue le titrage avec le thiosulfate de Na. La valeur maximale admissible de l’o2 est comprise entre 5mg et 8mg. (Dosage pour 125ml d’échantillon). 6. chlorure : Les chlorures donnent une saveur désagréable à l’eau surtout en présence de sodium, calcium et magnésium. Les chlorures sont dosés en milieu acide par le nitrate mercurique Hg (NO3)2e en présence de diphénylcarbason. 7. fluorures : Le dosage est basé sur la mesure potentiométrique de la quantité d’ion fluorures à l’aide d’une électrode spécifique à cristal de fluorure de lanthane. Les échantillons doivent être prélevés dans des flacons en polyéthylène ou en verre. 8. la dureté totale et calcique : La dureté totale est la concentration en ions calcique et magnésium et d’autres cations bivalents et trivalents. La dureté se détermine par un dosage complexométrique par L’éthylénediamine tetraacétate disodique (EDTA), En présence de noir d’ériochrome qui donne une couleur rouge foncée ou violette avec le calcium et le magnésium. L’acide calcon carboxylique est un indicateur de calcium, précipite sous forme d’hydroxyde pendant lors du dosage. La dureté calcique est la concentration des ions calcium dans l’eau. 9. oxydabilité : L’indice de permanganate de potassium d’une eau est la quantité d’oxygène en mg/l cédée par l’ion de permanganate MnO4- et consommée par les matières oxydables contenues dans un litre d’eau dans les conditions définies par la présente norme. Son principe consiste De chauffer 100ml d’échantillon dans un bain marie en présence de 10ml KMNO4 (excès) et 2ml d’acide sulfurique (fixation de l’oxygène) pendant une période de 13min.une partie de KMNO4 est réduite par les matières oxydable de l’échantillon et l’excès de KMNO4 sera déterminer par l’addition de l’acide oxalique en excès, suivi par un titrage de l’excès de l’oxalate par le permanganate de potassium. Permanganate de potassium : un oxydant fort. Acide oxalique : acide et un réducteur fort (H2C2O4). 10. titre alcalimétrique (TA) et titre alcalimétrique complet (TAC):
Titre alcalimétrique :
Le titre alcalimétrique (TA) correspond à la neutralisation des ions hydroxydes (OH¯) et à la transformation des ions carbonates (CO3 2¯) en hydrogénocarbonates (HCO3¯) par un acide fort (acide chlorhydrique de 0.1N). Dans Erlenmyer contenant 100ml d’échantillon, on lui ajoute 3gouttes de phénolphtaléine si le pH de l’échantillon est : <8.3, l’échantillon ne se colore pas en rose ------ le TA=0 >8.3, l’échantillon est rose, le TA est déterminer par addition de l’acide chlorhydrique de 0.1N.
Rapport de stage
Page 21
Titre alcalimétrique complet TAC : Le titre alcalimétrique complet correspond à la neutralisation des ions hydroxyde, carbonates et hydrogénocarbonates (HCO3¯) par l’acide chlorhydrique. La mesure de TAC elle succède à Celle de TA sur la même échantillon, si le TA est non nul, ne pas réajustons la burette de la solution d’acide chlorhydrique à zéro. Dans l’échantillon précédent on ajoutant 3 gouttes d’hélianthine. Si Le pH <4.3, la solution est immédiatement rouge : TAC=TA LE PH >4.3, la solution est jaune, le TAC est déterminer de la même manière que le TA. Remarque : Le TA et TAC se mesurent après détermination du pH de l’échantillon. 11. Ammonium : En milieu fortement basique (10,8≤pH≤11,4), l’ammoniac réagit quantitativement avec l’hypochlorite et donne une monochloramine selon la réaction : NH3 + HOCl NH2Cl + H2O Le monochloramine forme avec du phénol, en présence de nitroprussiate et un excès d’hypochlorite, du bleu d’indophénol, susceptible d’un dosage colorimétrique à la longueur D’onde 630nm (par spectrophotométrie) selon les réactions : NH2Cl + C6H5 + 2HOCl ClNC6H4O + 2H2O + 2HCl C6H5OH + ClNC6H4O OC6H5NC6H4O + H+ +Cl¯ Les concentrations en ammonium doivent être comprises entre 2µg/l et 15000µg/l en NH4+.Avant les analyses, les échantillons concentrés contenant plus de 1,5µg/l en NH4+ doivent être dilués. La valeur maximale admissible (VMA) pour l’ammonium dans l’eau d’alimentation est 0,5mg/l. Remarque : - la verrerie utilisée pour effectuer le dosage ne doit servir qu’à cet usage. - il est préférable après chaque série d’analyse de laisser les verreries sans lavage, jusqu’à la prochaine analyse. - la verrerie est conservée à l’obscurité après chaque analyse. 12. nitrates : La concentration des nitrates dans les eaux est généralement faible. Origine :
Minéralisation de la matière organique. Engrais azotés. Résidus animaux, fumier. Eaux usées domestiques et station d’épuration.
Les nitrates sont très recherchés dans les eaux d’alimentation. Après l’ajustement du pH qui doit être entre 7et9, l’échantillon est dilué dans un tampon puis passé sur une colonne du grain de cadmium recouvert de noir de cuivre, pour réduire les nitrates NO3¯ en nitrites NO2. Les nitrites résultants (ceux présents dans l’échantillon +ceux issu de la réduction) donnent une réaction de diazotation avec la sulfanilamide (NED), puis un couplage avec le chlorhydrate d’ α-naphtyléthylènediamine, pour former un complexe rose, dont l’intensité de la coloration est mesuré par une spectrophotométrie à 540nm. L’intensité mesurée est proportionnelle à la concentration initiale en nitrates réduits+nitrites présent déjà dans l’échantillon. La valeur maximale admissible (VMA) pour les nitrates (NO3¯) est de l’ordre de 50mg/l Rapport de stage
Page 22
Remarque L’échantillon traverse la colonne avec un débit de 7 à 10 ml/min. il ne faut jamais laisser la colonne à sec avant et après les analyses. après l’ajout de NED, nous devons attendre 30min et nous ne dépassons pas 120min pour mesurer l’absorbance de l’échantillon. 13. silicates : L’acide molybdique, en présence d’ions silicates à un pH 1.2, produit une coloration jaune due au complexe silico-molybdique dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ions silicates. Cette méthode est applicable pour la détermination des concentrations en silicates comprise entre 0.05mg/l et 2.5mg/l, pour les échantillons dont la concentration en silicate est supérieure peuvent être analysé après dilution.
Remarque :
l’eau distillée doit avoir une teneur en silicate inférieure à 0.025mg/l. Le prélèvement des échantillons se fait dans des bouteilles en polyéthylène. Le délai de conservation ne doit pas dépasser 7jours. 14. bore : En milieu tamponné, le bore donne avec l’azométhine H un complexe jaune steristique dont l’intensité est mesurée au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 420nm avec une cuve de trajet optique de 10 mm. Cette méthode s’applique à la détermination de la teneur en bore dans les eaux destiné à la consommation humaine.
Remarque :
Le délai de conservation de l’échantillon ne doit pas dépasser 28jours. 15. sulfates : Les ions sulfates sont précipités en présence de chlorure de baryum, en milieu acide d’une manière telle qu’il se forme des cristaux de sulfate de baryum de taille uniforme. La quantité de la suspension du sulfate de baryum est mesurée soit au spectrophotomètre UV visible à 420nm soit au turbidimètre. La valeur maximale admissible (VMA)=400mg/l.
Remarque : 1) on porte l’échantillon en agitation pendant une minute. 2) la lecture se fait dans les premières secondes. 3) pour les échantillons chargés il est nécessaire de faire une dilution. spectrométrie d’absorption atomique (SAA) : Le principe de cette technique utilise les propriétés des atomes d’être excités à condition qu’on lui fournisse de l’énergie égal à la différence d’énergie entre le niveau excité et le niveau fondamental, l’énergie fournie peut être d’origine thermique, cinétique ou lumineuse .Lorsque les atomes d’un élément ont été excités, le retour à l’état fondamental s’accompagne de l’émission des radiations propre à l’élément. L’utilisation de ce phénomène constitue la base de la spectrométrie d’émission. Le même élément dispersé à l’état atomique dans un four ou une flamme possède également la propriété d’absorber tout rayonnement de même radiation, il résulte une absorption du rayon incident liée à la concentration de l’élément considéré par la relation : Rapport de stage
Page 23
Log (Io/I) =K.l.C
Io, I : intensités de la radiation incidente et transmise, K: coefficient d’absorption ou section efficace de capteur d’un photon. L : longueur de chemin optique, dans l’atomiseur. C : concentration de l’élément à doser.
Deux systèmes sont utilisés par cette technique pour générer des atomes : flamme et four. 1. spectrométrie d’absorption atomique par flamme (SAAF) : La solution est aspirée par un fin capillaire. Le capillaire amène la solution dans le nébuliseur dans le rôle est de produire un aérosol solution gaz dans le quel les gouttes sont les plus fines possibles, ce mélange (solution+gaz) qui va arriver à la base de brûleur et pénétrer ensuite dans la flamme. Le temps nécessaire pour passer d’une goutte de solution à un atome libre en phase vapeur dépend de la taille de la goutte et de la température de la flamme. Les éléments doser par cette technique: Zn, Mn, Fe, Cu, K+, Na. Le dosage se fait par des lampes spécifiques pour chaque élément. 2. spectrométrie d’absorption atomique par four (SAAE) : L’introduction de la solution dans le tube en graphite se fait automatiquement. Après l’introduction de l’échantillon à l’intérieur du tube, celui-ci est chauffé par effet Joule par passage du courant élevé dans électrodes suivant un programme thermique qui se déroule en trois étapes principales : séchage, décomposition et atomisation. Les éléments dosés par cette technique : Al, Pb, As, Se, Cr, Cd, Ba, Ni. Le dosage se fait par des lampes spécifiques pour chaque élément.
Remarque : Une erreur qui s’est produite pendant la durée du stage au niveau de l’application de l’appareil ce qui a rendu les analyses impossibles. Contrôle de la qualité des analyses physico-chimiques 1. Contrôle de la qualité analytique : Chaque série d’analyse comporte différents contrôles à savoir :
blanc de la méthode : L’analyse de blanc (eau distillée) à chaque série d’analyse permet démontrer s’il y a eu de contamination pendant la préparation de l’échantillon ou bien lors de l’analyse. Le résultat du blanc doit être inférieur à trois fois la limite de détection de la méthode.
matériau de référence (MR) : Le matériau de référence est un échantillon de contrôle utilisé pour mesurer la performance de la méthode. il informe sur l’exactitude de la méthode sans considération l’effet de la matrice des échantillons à analyser et permet de prendre une décision sur l’acceptabilité des résultats analytiques. Le matériau de référence est
Rapport de stage
Page 24
préparé à partir d’une solution mère différente de celle servant à la préparation des solutions étalons. Le % d’écart relatif acceptable est inférieur ou égale à 20%.
%d’écart
=
(résultat expérimental – résultat théorique) *100. Résultat théorique
duplicata de l’échantillon : Le duplicata de l’échantillon donne une indication de la précision de la méthode d’analyse en tenant compte de l’effet de la matrice de l’échantillon, un échantillon en duplicata est analysé à chaque série d’analyse. Le % d’écart entre les deux résultats doit être inférieur ou égale) 20%.ce % d’écart ne s’applique pas pour les échantillons dont la concentration est dix fois plus élevée que la limite de détection de la méthode.
%d’écart= (Résultat de l’échantillon- résultat du duplicata) (Résultat de l’échantillon + résultat du duplicata)/2
échantillon fortifié (AJD) : L’ajout dosé un mélange entre un échantillon choisi au hasard et une prise d’essai bien déterminer pris de la solution mère qu’est réservée au contrôle (en général la concentration de l’AJD est ½ de la concentration de l’MR). Le % récupération informe sur l’exactitude de la méthode en considérant l’effet de la matrice des échantillons à analyser, le % doit être entre 80 et 120%.
% récupération = (Cf – C)*100/Ca
Cf. : concentration de l’échantillon fortifié C : concentration de l’échantillon non fortifié. Ca : concentration de l’ajout dosé. contrôle de la courbe d’étalonnage : C’est une solution étalon dont la concentration correspond à la mi- courbe, il est au moins une fois à tous les17 échantillons pour vérifier le maintien de l’étalonnage. le % d’écart doit être inférieur à 10%. vérification de l’étalonnage : La qualité de l’étalonnage est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation linéaire (r) de la courbe de l’étalonnage. La valeur de (r) doit être supérieure ou égale à 0,995
Rapport de stage
Page 25
’Eau constitue un élément vital pour cela il faut préserver et assurer sa persistance continuelle, non seulement pour fournir à l’homme une quantité suffisante pour ces besoins mais pour lui assurer une irréprochable qualité. Pour cela fessait l’objet de notre étude. Aujourd’hui, la qualité de l’eau et de l’environnement nous concerne tous. La qualité de l’eau est prioritairement une exigence de la santé. C’est la raison pour la quelle, il est nécessaire de la traiter et de l’économiser.
Rapport de stage
Page 26
Certains genres de bactéries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ils forment le groupe des bactéries Gram Positives (Gram +) Toutes les autres bactéries soit qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement différentes se laissent décolorer par la méthode de Gram. Elles sont dites Gram négatives. (Gram -)
Matériel
Microscope biologique avec immersion. Culture (ou prélèvement) bactérienne. Lames dégraissées. Pince à lames Bec Bunsen (ou bien lampe à alcool) Pissette d'alcool absolu ou alcool-acétone. Pissette d'eau.
COLORANTS o
o
o
o o
Violet phéniqué (Nicole) Violet de gentiane (cristal violet) 1 gramme Alcool absolu...................... 10 ml Eau phéniquée à 1%............... 90 ml Liquide de Lugol (IKI) Iode ................... 1 g Iodure de potassium... 2 g Eau distillée......... 300 ml (200 g d'après Nicole) Solution de Fuchsine Solution de fuchsine saturée dans l'alcool 10 ml Eau distillée ................................90 ml Alcool Absolu. ou bien Alcool-Acétone (Nicole) Alcool Absolu 5 Volumes Acétone ......1 Volume
Rapport de stage
Page 27
Composition du Kit de GRAM HUCKER (RAL) 1. 2. 3. 4.
Cristal Violet Oxalate Liquide de Lugol stabilisé Différenciateur lent Safranine
AVERTISSEMENT :
La manipulation de matériel infectant doit être effectué par du personnel qualifié en respectant les règles d'asepsie.
Protocole
1. ÉTALEMENT. L'étalement doit se faire en couche mince, sur une lame dégraissée. 2. DESSICCATION. Laisser sécher à l'air. 3. FIXATION. Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement. On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool méthylique versées Rapport de stage
Page 28
directement sur le prélèvement. A ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants. 4. COLORATION de GRAM. 1. Déposer quelques gouttes de Violet 2. Laisser agir 4 à 6 secondes 3. Égoutter sans rincer. 4. 5. 6. 7.
Déposer quelques gouttes de Lugol Laisser agir 4 à 6 secondes. Égoutter et recommencer avec le Lugol. Égoutter.
8. Faire couler sur la lame (pas sur l'étalement) l'Alcool ou l'Alcool-Acétone. Jusqu'à disparition du Violet. 9. Laisser agir quelques gouttes de Fuchsine 25 secondes. 10. Laver. 11. Sécher. 5. EXAMEN. Examiner à l'objectif à immersion. Commentaires
La coloration de Gram se fait en trois phases suivies d'une phase facultative de coloration du fond.
A-(1, 2,3) Coloration au Violet. Tous les éléments sont colorés en Violet.
B- (4, 5, 6,7) Le Lugol fixe le Violet sur les structures membranaire des bactéries Gram+.Tous les éléments sont colorés en noir.
C-(8) Décoloration. Les bactéries Gram + sont colorés en violet foncé, les autres éléments ne sont pas colorés.
D-(9, 10,11) Recoloration du fond à la Fuchsine. Les éléments tissulaires et les bactéries Gram- sont colorés en rose. Les Bactéries Gram+ sont colorés en violet.
Rapport de stage
Page 29
Une oxydase est une enzyme catalysant une réaction d'oxydoréduction impliquant une molécule de dioxygène (O2) comme accepteur d'électron. Dans ces réactions, l'oxygène est réduit en eau (H2O) ou en peroxyde d'hydrogène (H2O2). La recherche d'oxydase est un test fondamental pour orienter l'identification des bacilles Gram-. On utilise comme réactif le chlorhydrate ou le PDA, on l'utilise généralement avec des disques imprégnés de ce réactif (disques oxydases). Sur une lame, on place un disque imprégné du réactif et on dépose après une colonie avec une pipette pasteur. S'il y a apparition d'une tache violette au bout de 30 secs, on conclut que la bactérie est oxydase+ et qu'elle possède le cytochrome oxydase. Et s'il n'y a rien qui apparaît ça veut dire que la bactérie est oxydase- et qu'elle ne possède pas l'enzyme respiratoire (cytochrome oxydase
Test oxydase Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram -. Ce test permet de mettre en évidence une enzyme : la phénylène diamine oxydase des bactéries à partir de leur culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable d’oxyder un réactif : le N diméthyle paraphénylène diamine. - Si la colonie prend une teinte rose, violette. Le germe possède une oxydase : le test est positif. - Si la colonie reste incolore, le germe ne possède pas d’oxydase, le test est négatif. Le réactif peut se trouver sous deux formes :
soit en solution : sur une lame de verre, déposer un carré de papier filtre et l’imbiber d’une solution fraîchement préparée de réactif, soit sous la forme d’un disque pré-imprégné par le réactif. Dans les deux cas, écraser avec une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes à étudier sur ce papier (instrument n’oxydant pas le réactif).
Rapport de stage
Page 30
