DISEÑO DE UNA PLANTA DE TRATAMIENTODescripción completa
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PLEGADORA HIDRAULICADescripción completa
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DEPART DEPARTAMENT AMENTO O DE CIENCIAS CIENCIAS
CURSO: Laboratorio de quimica orgánica TEMA DE INVESTIGACIÓN: Aislamiento y selección primaria de bacterias productoras de amilasa en un suelo productor de yuca
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN PRIMARIA DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA EN UN SUELO PRODUCTOR DE YUCA I.
OBJETIVOS 1.1 Objetivo e!e"#$:
1.1.1 Aislar bacterias productoras de amilasas a partir de muestras de suelo
productor de yuca$
1.% Objetivo e&'e()*i(o: .denti/icar ar las /uentes naturales naturales a partir partir de las cuales es /actible aislar con 1.%.1 .denti/ic 01ito bacterias productoras de amilasas$ 1.%.% Aplicar estrategias que permitan el aislamiento e1itoso de bacterias productoras de amilasas$ 1.%.+ 2eleccionar bacterias productoras de amilasas$
II.
,UNDAMENTO TEÓRICO: II.1 GENERALIDADES GENERALIDADES Los procesos catalizados por enzimas en la industria presentan una serie de %enta'as /rente a los catalizadores con%encionales no biológicos$ entro de las enzi enzima mass más más e1pl e1plot otad adas as se encu encuen entr tran an las las celu celula lasa sass y amil amilas asas as esta estass actu actual alme ment nte e repr repres esen enta tan n cerc cerca a del del 56 y 57 57 del del merc mercad ado o mund mundia iall de las las enzimas9 respecti%amente y son producidas por una gran %ariedad de bacterias$ Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones "idrol:ticas del almidón9 dando origen a di%ersos productos que poseen una gran rele%ancia para algunas operaciones y procesos industriales$ Las amilasas son com;nmente "alladas en animales y plantas sin embargo9 para /ines industriales9 las más utilizadas son aque aquellllas as de orig origen en bact bacter eria iano no o /;ng /;ngic ico$ o$ Las Las amil amilas asas as pose poseen en una una gran gran importancia en la producción de alimentos y de biocombustibles$ Las <=amilasas presentan una gran utilidad tanto para la industria te1til como para la de alimentos pues rompen la mol0cula de almidón en /racciones más cortas >de1trinas? Act;an Act;an directamente sobre los enlaces <=-94 de la mol0cula$ 2e "an utilizados amilasas para la obtención de 'arabes /ructosados$ La producción de dic"as enzimas se "a "ec"o a partir de Bacillus sp $)or lo a;n se sigu siguen en busc buscan ando do micr microo oorg rgan anis ismo moss espe espec: c:/i/ico coss que que repo report rten en me'o me'ore ress rendimientos para optimizar los procesos industriales$
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@na de las /uentes más empleadas para aislar bacterias productoras de amilasas es el suelo$ 2in embargo9 tambi0n es /actible aislarlas a partir de alimentos que contienen almidón9 agua de mar9 etc$ )ara un aislamiento e1itoso9 es necesario considerar que en toda /uente natural 'unto a las bacterias de inter0s9 se encuentran otros microorganismos como le%aduras9 mo"os9 algas y protozoos$ )or lo tanto9 es lógico suponer que es necesario utilizar estrategias espec:/icas que permitan detectar y aislar ;nicamente bacterias productoras de amilasas9 a partir de una población grande y di%ersa$
II.% LA AMILASA Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones "idrol:ticas del almidón9 dando origen a di%ersos productos que poseen una gran rele%ancia para algunas operaciones y procesos industriales$ Las amilasas son com;nmente "alladas en animales y plantas sin embargo9 para /ines industriales9 las más utilizadas son aquellas de origen bacteriano o /;ngico$ Las amilasas poseen una gran importancia en la producción de alimentos y de biocombustibles$ Tambi0n presentan gran utilidad en la industria te1til$ 2e "an utilizados amilasas para la obtención de 'arabes /ructosados$ La producción de dic"as enzimas se "a "ec"o a partir de Bacillus sp $)or lo a;n se siguen buscando microorganismos espec:/icos que reporten me'ores rendimientos para optimizar los procesos industriales$ II.+ AISLAMIENTO
II.+.1 De*i!i(i-!: s la separación de un determinado microorganismo del resto que le acompa,an$ 2on t0cnicas usadas en el laboratorio de microbiolog:a para la trans/erencia de un microorganismo de un ambiente a otro con la /inalidad de inducir su crecimiento para su identi/icación$
II.+.% T(!i(#& De Ai&$#/ie!to: •
2iembra por estriado en placa de )etri$
•
aciado en placa &ulti%o por dilución y agitación$
Aislamiento con %arilla angular de %idrio$
•
Aislamiento con aplicadores de algodón 2iembra por picadura$
•
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II.0 SELECCIÓN •
2elección ambiental$ s la más tradicional$ &onsiste en obtener la cepa de su
•
"ábitat com;n en la naturaleza$ @na %ez "allado el microorganismo en su "ábitat9 es necesario establecer los m0todos de separación apropiados para obtener la cepa de inter0s de /orma rápida y con la mayor selecti%idad posible$
II.0.1 De*i!i(i-!: La selección o screening consiste en la aplicación de procedimientos para detectar y aislar e1clusi%amente las c0lulas o metabolitos de inter0s a partir de una gran población de microorganismos distintos$
II.0.% ti'o& e &e$e((i-!: II.0.%.1 Po" e$ P"o(e&o: )rimaria y 2ecundaria II.0.%.% Po" e$ P"o'-&ito: &ulti%os +ue%os y &ulti%os !e'orados II.0.%.+ Po" e$ ,2!#/e!to: mp:rica y #acional$ )or ello9 es necesario emplear programas de selección9 que permiten separar las c0lulas que nos interesan del resto del culti%o$ s muy complicado identi/icar el producto o cepa de inter0s9 y una %ez obtenida la cepa aislada9 "ay que me'orarla y preser%arla de /uturas alteraciones$ &uando sometemos una cepa sal%a'e a me'ora gen0tica para obtener la cepa optimizada9 no todas las c0lulas su/ren el proceso de mutación y de la /orma deseada$ La selección de cepas me'oradas gen0ticamente y la creación de nue%os genomas microbianos utilizan t0cnicas de ingenier:a gen0tica que permiten obtener cepas con nue%as caracter:sticas o con caracter:sticas propias me'oradas y potenciadas$ A ni%el industrial9 cada /irma posee su propia colección de organismos9 muc"os de los cuales "an sido me'orados a tra%0s de t0cnicas clásicas de mutación o de ingenier:a gen0tica$
II.3 EL GENERO BACILLUS
l g0nero Bacillus pertenece a la /amilia Bacilliaceae9 es un g0nero que "oy en d:a incluye más de 6 especies de bacilos$ ste g0nero está /ormado por microorganismos bacilares Gram positi%os9 /ormadores de endosporas9 quimi"eterotro/os que normalmente son mó%iles y rodeados de /lagelos
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periticos$ 2on anaerobios o aerobios /acultati%os son catalasa positi%os$ Las c0lulas bacterianas de este g0nero tienen un amplio tama,o que %ar:a 697 a 597 Cm 1 -95=-6 Cm$ ste g0nero se encuentra com;nmente en suelos y plantas donde tienen un papel importante en ciclo del carbono y el nitrógeno$ 2on "abitantes comunes de aguas /rescas y estancadas9 son particularmente acti%os en sedimentos$ >(oneman9 566-?$ Ta1onómicamente seg;n la segunda dición del !anual BergeyDs >-E85?$ l g0nero Bacillus pertenece a la /amilia . Bacilliaceae9 del orden . Bacillales de clase tres Bacilli9 del /illum BF... /irmicutes del ominio bacteria$ n la primera edición del g0nero es claramente di%erso desde el punto de %ista /enot:pico y genot:pico$ La di/erenciación entre especies del g0nero Bacillus se centró en los resultados en la /ermentación de lactosa9 sorbitol9 manitol9 melobiosis9 "idrólisis de la urea9 y descarbo1ilacion de la lisina$>Anderson et al$95663?$ II.3.1 B#(i$$2& &2bti$i& i%isión *irmicutes *amilia Bacilliaceae G0nero Bacillus specie Bacillus subtilis s una bacteria Gram positi%a9 produce endospora las que son termorresistentes y tambi0n resiste /actores /:sicos per'udiciales como la desecación la radiación los ácidos y los desin/ectantes qu:micos9 produce enzimas "idro/ilicas e1tracelulares que descomponen polisacáridos9 ácidos nucleicos permitiendo que el organismo emplee estos productos como /uente de carbono y electrones9 producen antibióticos como la bacitricina9 polimi1ina9 gramicidina y circulina9 /ermentan la case:na y el almidón9 %i%e dentro de los l:mites de 77 a H6I&$ s un gran controlador biológico9 Bacillus subtilis promue%e el desarrollo de las plantas y pre%iene las en/ermedades del suelo causadas por 2clerotium rol/sii9 *usarium spp$9 erticillium spp9 2clerotinia sclerotiorum9 )"ytop"t"ora capsici9 )yt"ium spp9 y el nematodo nodulador de ra:ces >!eloidogyne spp? y #"izoctonia solani9 agente causal de la en/ermedad denominada mal del tallitoK del algodonero$ >&alderón et al9 $ 5665?$
III.
REALIDAD PROBLEM4TICA:
dad de )iedra en uropa meridional9 en el +orte de uropa se empleó la lan
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a desde la dad de Bronce9 y la seda originaria de &"ina se /abrica "ace más de 7666 a,os$ !uc"o tiempo despu0s9 desde el siglo F...9 con la re%olución industrial y la in%ención de la máquina de %apor9 se comenzaron a /abricar y con/eccionar telas a gran escala$ n la actualidad9 la industria te1til está constituida por subsectores di/erentes aunque interrelacionados9 que producen9 desde las /ibras "asta productos para el "ogar$ &ada subsector puede considerarse como una industria por separado9 aunque el producto que se obtiene en cada etapa de la producción constituye el principal insumo de materia prima para la siguiente$ n todas las etapas se emplea una amplia %ariedad de tintes y otros compuestos qu:micos >ácidos9 bases9 sales9 agentes "umectantes9 colorantes?9 cuyos productos son desec"ados en los e/luentes9 y pueden impactar en el ambiente$ )or esto9 uno de los ob'eti%os de los tratamientos te1tiles modernos es obtener el e/ecto deseado en las /ibras9 utilizando procesos que conlle%en el m:nimo impacto ambiental$ entro de este conte1to9 se comenzaron a utilizar di%ersos procesos biotecnológicos9 mediante el empleo de enzimas$ stas cumplen el requisito de ser respetuosos con el medio ambiente >debido a que las enzimas son biodegradables?9 act;an sobre mol0culas espec:/icas y act;an ba'o condiciones sua%es$
.lustración - squema de empleo de biotecnolog:a en procesos industriales
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III.1
U&o e e!5i/#& e! $# i!2&t"i# te6ti$
n t0rminos del proceso de /abricación9 la industria te1til puede di%idirse en cuatro etapas principales )roducción de la "ebra9 "ilado9 te'ido9 acabado de los te'idos /abricación del producto te1til$ n la industria te1til las enzimas se pueden aplicar tanto al tratamiento de /ibras proteicas naturales >lana y seda?9 como en /ibras celulósicas >algodón9 lino y cá,amo? y en /ibras sint0ticas$stas enzimas se usan en las /ases de "ilado9 te,ido y acabado de los te'idos con el ob'eti%o de limpiar la super/icie del material9 reducir las pilosidades y me'orar la sua%idad$n el siguiente esquema9 se muestran las etapas de la /abricación de telas y las enzimas utilizadas en cada etapa$ La rama in/erior muestra la producción de tela enim9 con la que se con/eccionan los 'eans$
.lustración 5 )roceso para obtención de amilasa
III.%
AMILASAS
Al comenzar el tratamiento de la /ibra9 se debe e1traer el almidón que la recubre >proceso llamado desengomado?$ l proceso de desengomado con%encional puede ser realizado por "idrólisis >ruptura del almidón en presencia de agua?9 donde los productos te1tiles son tratados con ácido9 álcalis o agentes o1idantes$ Tambi0n se puede eliminar por descomposición del almidón por /ermentación9 en agua con microorganismos presentes en /orma natural9 que descomponen el almidón del te'ido$ Actualmente9 estos Curso: QUÍMICA ORGÁNICA
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tratamientos se encuentran en desuso debido a las di/icultades propias del m0todo9 de'ando lugar al uso de las enzimas amilasas$ Las amilasas son enzimas que inter%ienen en la degradación del almidón$ )ara ello se utilizan las amilasas bacterianas pro%enientes de Bacillus subtilis y Bacillus lic"en/ormis9
las
cuales
son
estables
a
altas
temperaturas$
)ara e%itar la desnaturalización >p0rdida de la estructura terciaria y la /unción? de esta enzima durante el desengomado9 primero se debe a,adir agua9 calentar "asta alcanzar la temperatura óptima >entre 6 y -66I&?9 establecer el pM óptimo >neutro? y entonces a,adir la enzima$
2eg;n su temperatura óptima9 se distinguen 3 grupos de amilasas N
Temperatura óptima de 6=H6I& se utiliza para el desengomado en
N
un ba,o de larga duración que dura entre 5 a "oras$ Temperatura óptima de 86I& usadas en máquinas de la%ado
N
continuo por algunos minutos$ Temperatura óptima -66I& tratamientos con %apor por - a 5 minutos$
IV.
ANTECEDENTES Y JUSTI,ICACIÓN : IV.1
A!te(ee!te&
IV.1.1
VARGAS7
n
%88%.
Lima
)er;9
se
aislaron
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microorganismos de suelos de c:tricos de la localidad de Muaral9 de las cuales se identi/icaron 4 cepas con capacidad de "idrólisis sobre el almidón que representan el 38$339 e1istiendo un predominio de B$ circulans9 con 58$33 B$ *irmus9 53$E- *aenibacillus spp$-H$3E B$ coagulns 9 -7$559 B$ megaterium9 8$H6 B$ al%ei9 4$37 B$ Lentus9 5$-H$ #eportando como mayor productor a Bacillus megaterium con -$-6 @Oml >3?$
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IV.1.% CASTRO Y (o$. %889. n Bogotá P &olombia9 aislaron microorganismos productores de amilasas para producir enzimas "idrol:ticas del almidón$ l agente productor detectado /ue una cepa del g0nero Aspergillus sp$ Los resultados indican que las amilasas presentes en el comple'o enzimático obtenido del culti%o de Aspergillus sp$9 sobre sal%ado de trigo9 /ueron acti%as en el desdoblamiento de la mol0cula de almidón a pM 7$6 y temperatura de 3HI& demostrando su carácter d0bilmente ácido y su pro%eniencia mesó/ila$ l equi%alente de de1trosa como medida cuantitati%a de la "idrólisis del polisacárido /ue de $79 e%idenciando la capacidad enzimática amilol:tica del comple'o enzimático obtenido$
IV.1.+ ACI7O.; Y COL <%88%= $#eportan el estudio de producción de amilasa por Bacillus al%ei9 encontrando una alta acti%idad de amilasa de 88 @OmL utilizando almidón de yuca en un medio basal compuesto por /os/ato de potasio9 sul/ato de magnesio9 tryptona9 cloruro de calcio9 e1tracto de le%adura9 citrato de sodio y "arina de soya a pM $8 y temperatura de 46 Q&9 en que demuestran que la /uente de nitrógeno de origen orgánico como el e1tracto de le%adura9 "arina de soya9 incrementa el crecimiento celular9 mientras que los de origen inorgánico >sul/ato de amonio9 cloruro de amonio? decrecen el crecimiento de las c0lulas9 mientras que la adición de 6$- de citrato de sodio en el medio basal estimula la s:ntesis de amilasa9 esto puede ser por que el calcio es esencial para la producción de amilasa o su estabilización en el que el citrato ayuda a mantener el calcio en sol$
V.
JUSTI,ICACIÓN ste proyecto tiene el ob'eti%o de la selección principal de bacterias productoras de amilasas9 ya que las celulasas participan en el rompimiento de enlaces glicos:dicos presentes en la celulosa mientras que las amilasas9 debido a su di%ersidad9 pueden romper enlaces presentes en el almidón9
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liberando unidades de glucosa$ La celulasa y amilasa actualmente representan cerca del 56 y 57 del mercado mundial de las enzimas9 respecti%amente$ La industria está demandando continuamente procesos más limpios y económicos9 por lo que surge la necesidad de cubrir una cierta serie de necesidades primordiales$ &on/orme a lo anterior es de igual importancia conocer que con%eniencia trae este proyecto a las industrias en general$
VI.
PROBLEMA R&uál es la e/iciencia del aislamiento de bacterias productoras de amilasa a partir de una muestra de suelo productor de yuca en el %alle 2anta &atalina P !oc"e >Tru'illo? en el a,o 56-S
VII.
IPÓTESIS 2u e/iciencia del aislamiento de las bacterias productoras de amilasa es /a%orable en la muestra de suelo9 pues se obtendrá un aislamiento primario de la amilasa en las condiciones requeridas$
VIII.
METODOS Y PROCEDIMIENTO VIII.1 !0todo 2elección VIII.% M#te"i#$e&: VIII.%.1 !uestras 2uelo de terrenos de culti%o >n práctica culti%o de yuca?$ •
VIII.%.% !edio de culti%o •
Agar almidón 1tracto de Le%adura >AA=L?$
VIII.%.+ #eacti%os9 colorantes y soluciones • • • •
Agua destilada est0ril Alco"ol yodado 2olución de lugol 2et para coloración Gram
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VIII.%.0 !aterial de %idrio Asa de rigalsy Beacer de 566 mL *rascos %ac:os de penicilina Laminas portaob'eto !atraces de 576 mL )ipetas de -9 7 y -6 mL )lacas )etri Termómetro>6=-66 Q&? arilla VIII.%.3 quipos • • • • • • • • •
• • • •
Autocla%e stu/a Morno !icroscopio
VIII.%.> Utros • • • • • • • • • • • • • •
Asa bacteriológico Algodón Balanza de platillo Bande'a de plástico Bistur: Bolsas de polietileno>nue%as? &ocina el0ctrica &olador de plástico ncendedor spátula de metal Gradillas Guantes *ranela )lumón de proyección permanente
VIII.+ P"o(ei/ie!to e6'e"i/e!t#$ VIII.+.1 #ecolección de las muestras y pre=enriquecimiento
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Almidón de yuca
VIII.+.% )reparación de muestra de suelo
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VIII.+.+ e la solución 7ml se trata t0rmicamente a 86Q& por -6 min y la los otros 7ml sin tratamiento t0rmico$
VIII.+.0 )rimer culti%o VIII.+.3 Aislamiento y selección primaria de bacterias productoras de amilasas$
VIII.+.> 2elección de culti%os productores de amilasas
2embrar los culti%os puros en placas conteniendo VIII.+.>.1 AA=L antes de la siembra %eri/icar que las placas est0n completamente secas$ La siembra por puntura debe
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"acerse en /orma equidistante considerando el n;mero de culti%os aislados$ .ncubar a 36 Q& y obser%ar crecimiento a partir VIII.+.>.% de las 56 "asta las 48 "rs$ Alcanzado el crecimiento adecuado de las colonias9 si es necesario9 colocar las placas a -6 Q& "asta el momento de ser e%aluadas$ Adicionar el lugol en toda la super/icie de la placa VIII.+.>.+ y de'ar en reposo durante 5 minutos$ liminar el e1ceso de lugol adecuadamente9 y VIII.+.>.0 medir el diámetro del "alo total de "idrólisis de almidón y el diámetro de la colonia$ 2i estas tienen /orma irregular9 "acer %arias mediciones y sacar el promedio correspondiente$
&on los datos obtenidos9 calcular el "alo neto de VIII.+.>.3 "idrólisis de almidón y seleccionar las colonias que presenten los mayores "alos netos de "idrólisis$
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M+ =
M+ =
M+ =
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65V-7mm
63V-mm
#egistro y conser%ación de culti%os productores VIII.+.>.> de amilasas$ Llenar las /ic"as de registro para cada VIII.+.>.>.1 culti%o seleccionado$ Acondicionar los culti%os sellados y VIII.+.>.>.% rotulados en recipientes est0riles y conser%arlos en re/rigeración9 "asta realizar la selección secundaria
I?. I?.1
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Re&2$t#o&
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I!te"'"et#(i-! l almidón es un producto de almacenamiento importante de muc"os culti%os de importancia económica tales como trigo9 arroz9 ma:z9 tapioca9 y patata$ W Los suelos poseen una inmensa di%ersidad microbiana9 en base a esto9 se recolectó la muestra de suelo agr:cola cuyo sembr:o era de yuca9 ya que al contener gran cantidad de almidón en su composición9 el suelo que lo rodea tiene bacterias productoras de amilasas >que "idrolizan las mol0culas de almidón rompiendo sus enlaces <=>-=4? y <=>-=?9 liberando unidades de glucosa?$ l pre enriquecimiento con almidón de yuca9 se realiza con el propósito de darle sustrato a estas bacterias para que puedan recuperarse si están
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M+ =
M+ =
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da,adas y as: puedan incrementar su población$ n practica9 para /ines comparati%os se traba'ó con 5 muestras9 a una se le aplico tratamiento t0rmico >para que sobre%i%an solo las /ormas bacterianas esporuladas? y otra sin tratamiento t0rmico >muestra testigo?$ )ara la siembra se utilizó Agar almidón e1tracto de le%adura >AA=L? donde el e1tracto de le%adura proporciona la /uente nitrogenada y el almidón es usado como sustrato para la producción de las amilasas >porque es una enzima inducible?$ Mabiendo ya crecimiento en el AA=L9 de acuerdo a la obser%ación de las caracter:sticas de sus colonias9 ya que son de aspecto cremoso9 blanquecinas9 /orma irregular9 bordes lobulados9 dan la apariencia de estar secas9 tambi0n se obser%a una protuberancia en el centro de las colonias lo cual les da una apariencia de "ue%o estrellado$se puede decir que se trata de Bacillus sp$ lo que se con/irmar:a "aci0ndole una coloración Gram %i0ndose bacilos grampositi%os$ Lo siguiente ser:a realizar los culti%os puros9 donde del mismo modo para %eri/icar su pureza se le realiza una coloración Gram$ Wa teniendo los culti%os puros de las cepas >n este caso se aisló 3 cepas? se siembra por puntura en AA=L para obser%ar luego de su incubación9 el ni%el de producción de amilasa de cada una9 mediante la medición del diámetro del "alo neto de "idrólisis9 que se e%idencia con la adición de lugol al medio de culti%o$ W /inalmente9 "abi0ndole realizado todas las pruebas9 se registró y se conser%ó los culti%os productores de amilasas$ l aislamiento de bacterias productoras de amilasas9 es importante porque tienen aplicación potencial en una amplia serie de procesos industriales9 tales como las industrias de alimentos9 de /ermentación y /armac0uticas$ onde las enzimas procedentes de /uentes /;ngicas y bacterianas "an dominado aplicaciones en sectores industriales$
I?.%.1 Aislar bacterias productoras de amilasas a partir de muestras de suelo productor de yuca$
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Objetivo e&'e()*i(o: I?.+.1 .denti/icar las /uentes naturales a partir de las cuales es /actible aislar con 01ito bacterias productoras de amilasas$ I?.+.% Aplicar estrategias que permitan el aislamiento e1itoso de bacterias productoras de amilasas$ I?.+.+ 2eleccionar bacterias productoras de amilasas$