PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS Y ANTÍGENOS. GENERALIDADES Anteriormente Anteriormente el término antígeno era utilizado para denominar a todos aquellos agentes capaces de estimular una respuesta inmune y además de interaccionar con los productos de ésta (anticuerpos y linfocitos T sensibilizados). Actualmente, Actualmente, se ha establecido establecido que una sustancia puede o no tener dos propiedades diferentes, una la inmunogenicidad y otra la antigenicidad. Por tanto, se considera inmunógeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta inmune al ser introducido a un individuo inmunocompetente. Estas sustancias deben reunir ciertos requisitos para actuar como tales, entre estas características se pueden mencionar: - Ser reconocidas como extrañas por el animal inmunizado, - Su peso molecular , que generalmente es mayor a 10 kDa, - De naturaleza química proteica o polisacárida, - La rigidez estructural, - La complejidad molecular, - El volumen molecular , - El contenido de grupos cargados y configuración - Su difusibilidad El concepto antígeno designa únicamente a aquella sustancia que reacciona con sus anticuerpos específicos. Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no reúnen todas las condiciones de inmunogenicidad, que por sí solas no inducen la respuesta inmune, pero si lo hacen cuando son conjugadas a una proteína acarreadora (complejo hapténico). La respuesta inmune de un animal a un inmunógeno puede ser un fenómeno totalmente natural, como sucede en el caso de infecciones causadas por microorganismos, en estados de hipersensibilidad a distintos elementos del medio ambiente, en las enfermedades autoinmunes o en aquellas ocasiones en que son generadas para rechazar a una neoplasia. Pero también la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un individuo mediante la aplicación del inmunógeno, como sucede en las vacunaciones, en la hipersensibilidad a fármacos, en transplantes o a nivel laboratorio en animales de experimentación con diferentes fines tanto de investigación como de producción de sueros inmunes. En muchos de estos casos se requiere contar con los inmunógenos preparados adecuadamente y un esquema de inmunización ideal para lograr inducir la respuesta inmune.
Entre los inmunógenos y antígenos de mayor interés están: Bacterias Virus Hongos Parásitos Proteínas u otros componentes purificados a partir de estos organismos como las toxinas (toxoides). Sueros heterólogos Proteínas animales heterólogas purificadas Extractos vegetales Proteínas vegetales purificadas. Células animales o vegetales Componentes de células animales o vegetales purificadas Complejos hapténicos Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparación de estos productos biológicos es muy variada, de las cuales podemos mencionar:
Como antígenos: Antígenos
de bacterias, hongos, parásitos y virus para la determinación de anticuerpos en suero, líquido cefalorraquídeo, etc.; para el diagnóstico de enfermedades causadas por estos organismos. Para el estudio de la composición antigénica de microorganismos. En la investigación de reacciones cruzadas entre individuos de diferente especie. En la determinación de estructura, localización de determinantes antigénicos (epítopos), etc.
Como inmunógenos: Producción
de vacunas, ya sea constituidas por microorganismos completos o por fracciones de estos, tanto para uso humano o veterinario. Obtención de sueros inmunes para uso diagnóstico. Preparación de sueros inmunes para uso terapéutico. Producción de sueros inmunes utilizados en control de alimentos y bebidas. Obtención de sueros inmunes de uso en Química Legal. En investigación para el estudio de la respuesta inmune El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparación de antígenos e inmunógenos de diferente naturaleza.
I.
EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMÁTICAS DE ORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DE PERRO, ETC.
MARCO TEÓRICO Los extractos de tejidos o las proteínas plasmáticas de animales son excelentes inmunógenos cuando son inyectados en otro individuo taxonómicamente alejado, por lo que son utilizados en la inmunización de animales de laboratorio para obtener sueros inmunes denominados antiespecie que pueden ser aplicados en el campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden las carnes y sus derivados, en Química Forense para establecer el origen de una mancha de sangre, en diagnóstico para el análisis de proteínas o bien en las pruebas de identidad de sueros de uso terapéutico. En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien suero, estériles que posteriormente serán utilizados en la inmunización de conejos para obtener el correspondiente suero antiespecie.
I.1.1 PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO MATERIAL 1 2 1 1 1 1 1 1
Embudo de 6 cm de diámetro con tres capas de gasa. Pipetas de 10 mL (1/10) Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm diám.) Tijeras de punta recta. Matraz Erlenmeyer de 125 mL. Bisturí. Balanza granataria. Licuadora con vaso de 250-500 mL.
40 g 60 mL
Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc. Solución salina isotónica (SSI).
TÉCNICA 1. 2.
3. 4. 5. 6.
Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm. Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una proporción de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido esté perfectamente homogeneizado. Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeración durante toda la noche para extraer la mayor cantidad de proteínas. Filtrar a través de tres capas de gasa para eliminar las partículas gruesas y en seguida por papel de poro grueso. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 4).
I.1.2 PREPARACIÓN DE UN SUERO HETERÓLOGO MATERIAL 1 1 1 2 1 1
Jeringa de 20 mL estéril. Aguja hipodérmica del No. 17 de 3” estéril. Aplicador de madera Tubos de centrífuga de 50 mL de plástico. Matraz Erlenmeyer de 100 mL. Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta).
40 mL 60 mL
Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc. Solución salina isotónica (SSI).
TÉCNICA 1. 2. 3. 4. 5.
Tomar por punción venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo, burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrífuga. Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el coágulo de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m. Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y pasarlo al matraz Erlenmeyer. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 7).
NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con CaCl2 como se describe en el anexo I.A, para evitar la formación de redes de fibrina que interfieran durante la filtración.
I.2
ESTERILIZACIÓN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO
MATERIAL 1
2 2 2 2 2 2
Equipo para filtración estéril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato de 500 mL, manguera para vacío de 50 cm, material filtrante EKS-1 y manguera de látex de 10 cm. Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados. Pipetas de 10 mL (1/10) estériles. Pipetas de 1.0 mL (1/10) estériles. Frascos tipo “vial” de 10 mL con tapó n estériles. Mecheros
9 mL
Solución salina isotónica (SSI) estéril.
TÉCNICA 1. 2.
Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtración en filtro Seitz, aplicando vacío ligero para que no se forme espuma. En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los frascos “vial” y el resto en el segundo frasco.
3. 4.
5.
Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estéril y mezclar (dilución 1:10). Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado en refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.
NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.
II.
PREPARACIÓN DE PROTEINAS PURIFICADAS ALBÚMINA SÉRICA HUMANA Ó GLOBULINA HUMANA
MARCO TEÓRICO La mayoría de las proteínas animales y vegetales cumplen con los requisitos de inmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmunógenos en su forma nativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunológica, es necesario purificarlas. Los métodos de purificación dependen de las propiedades fisicoquímicas de cada una de las proteínas tales como su solubilidad, peso molecular, tamaño, carga eléctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos:
BASADOS EN:
M TODO Precipitación con sales neutras Precipitación con metales pesados Precipitación con solventes orgánicos Precipitación con ácidos o bases (pI) Electroforesis Cromatografía de intercambio iónico Permeación molecular Ultracentrifugación en gradiente
Diferencias de solubilidad:
Diferencias en carga eléctrica: Diferencias en PM y tamaño:
Estas prácticas se llevarán a cabo a partir de proteínas purificadas comerciales y el ejercicio consistirá en la preparación de soluciones estériles de éstas con la concentración necesaria para la inmunización de conejos, para obtener los correspondientes anticuerpos.
MATERIAL 2 2 4 2 2 2
Tubos de 16 X 150 estériles Pipetas de 10 mL (1/10) estériles Pipetas de 1 mL (1/10) estériles Frascos tipo “vial” de 12 mL c/tapón estériles Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.
0.3 mL
Albúmina sérica humana (ASH) comercial de 25% ó globulina humana al 1% estériles. Solución salina isotónica (SSI) estéril
25 mL
TÉCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD 1.
A partir de una solución comercial estéril de albúmina sérica humana (ASH) ó de globulina humana purificadas cuya concentración es de 25
2. 3.
4.
g/100 mL ó 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solución salina isotónica estéril: Para ASH: 1:50 para tener una concentración de 5 mg/mL 1:250 para tener una concentración de 1 mg/mL Para globulina humana: 1:2 para tener una concentración de 5 mg/mL 1:10 para tener una concentración de 1 mg/mL Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 3235°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Etiquetar y guardar en refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.
III.
PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS CELULARES GLÓBULOS ROJOS DE CARNERO
MARCO TEÓRICO Las células de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicos antigénicos debido a la compleja composición de sus organelos. La preparación de antígenos e inmunógenos celulares tiene varias aplicaciones, entre las que se puede mencionar la producción de anticuerpos específicos usados como reactivos para la identificación de alguna población específica de células como en el caso de la tipificación sanguínea y la determinación de moléculas de histocompatibilidad HLA (antígenos de los leucocitos humanos), pero también se han utilizado para la investigación de marcadores y receptores celulares. Para estas aplicaciones, la elaboración de anticuerpos monoclonales ha cobrado mayor importancia. En esta sección se ejemplifica la preparación de antígenos celulares con la obtención de eritrocitos de carnero lavados para su utilización inmediata en la inmunización de conejos para así obtener el correspondiente suero inmune.
MATERIAL 1 2 1 1 2 1
1 1 2
Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estéril Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL c/tapón estériles Pipeta de 1 mL (1/10) estéril Pipeta de 5 mL (1/10) estéril Pipeta de 10 mL (1/10) estéril Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm. Bulbo para pipeta Frasco tipo “vial” de 10 mL con tapón estériles Mecheros Centrífuga con cabezal para tubos de 15 mL
3 mL Solución de Alsever estéril 100 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril
TÉCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD
1. 2.
3.
Llenar la jeringa con 3 mL de la solución de Alsever estéril y puncionar la vena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre. Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril dejándola resbalar por las paredes. Tapar el tubo. Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm.
4. 5.
6. 7. 8.
Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succión y la pipeta de 10 mL estéril. Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10 mL de SSI estéril, resuspender los glóbulos rojos perfectamente con una pipeta estéril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500 rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo de succión. Al término de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una pipeta estéril y pasarlos al frasco “vial” estéril. Agregar 13.5 mL de SSI estéril para tener una suspensión al 10%, que es como se va a utilizar para la inmunización del conejo. Tapar el frasco. Esta suspensión deberá conservarse en refrigeración, entre 4 y 6 °C hasta el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 días, ya que el envejecimiento desnaturaliza a los antígenos presentes en los eritrocitos.
IV. PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS BACTERIANOS E s c h e r i c h i a c o l i , Shigella dysenteriae , B r u c e l l a a b o r t u s , S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). MARCO TEÓRICO Las bacterias están constituidas por un gran número de fracciones antigénicas diferentes, de aquí que se pueda utilizar como antígenos o inmunógenos tanto las células íntegras o sus fracciones aisladas; ya sea componentes somáticos, flagelares o capsulares, dependiendo del tipo de bacterias. Otras veces se utilizan los productos del metabolismo de estos microorganismos como son las toxinas. No todas las bacterias tienen una estructura antigénica similar. En algunas hay predominio de componentes proteicos, en otras los carbohidratos constituyen los Ag que permiten su diferenciación; y en algunos casos particulares son fosfoglucolípidos complejos. Para ejemplificar la complejidad del mosaico antigénico de las bacterias se mencionarán las características de los principales antígenos de las enterobacterias: Antígenos somáticos u “O”: Son lipopolisacáridos que se encuentran formando parte de la pared celular bacteriana, resisten temperaturas de 100°C por tiempos prolongados y no se destruyen con alcohol, ni con ácidos diluidos. Corresponden a la endotoxina de muchas enterobacterias entre ellas Salmonella y su especificidad antigénica reside en la parte oligosacárida. Antígenos flagelares o “H”: Son componentes de naturaleza proteica localizados en los flagelos de las bacterias, lábiles a temperaturas mayores de 60°C y al tratamiento con alcohol o ácido. Antígeno de virulencia o “Vi”: Es también superficial, de naturaleza glucolipídica y difiere químicamente del antígeno somático “O”, se encuentra en algunas especies del género Salmonella y en otras enterobacterias, es termolábil. Antígenos capsulares o “K”: Se encuentran en las envolturas o cápsulas de algunas bacterias, generalmente de naturaleza polisacárida que tienen secuencias repetidas de dos o tres azúcares, son termorresistentes.
Dentro de las aplicaciones más importantes de los antígenos bacterianos está la determinación cuali y semicuantitativa de anticuerpos en muestras de suero humano en el diagnóstico de infecciones bacterianas y la titulación de sueros hiperinmunes de animales inmunizados, mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Como inmunógenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulación de vacunas tanto de uso humano como veterinario, así como en la inoculación de
animales de laboratorio para la obtención de sueros inmunes cuya aplicación es amplia en la identificación de bacterias, tanto en muestras biológicas de origen humano para diagnóstico, como en el control microbiológico de alimentos y productos farmacéuticos. Durante la preparación de antígenos bacterianos es importante conocer el fenómeno llamado variación antigénica el cual implica la pérdida de antígenos o cambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infección por bacteriófagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias. Además, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se debe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzada entre especies diferentes, hecho que cobra importancia cuando se hace tipificación bacteriana o cuando se obtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos de purificación para aumentar su especificidad. Brevemente, los procedimientos más relevantes para la obtención de estos preparados bacterianos involucran: Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo adecuados, que permitan la expresión de los componentes antigénicos de interés, atenuarla (disminución de la virulencia) o inactivarla (perdida de viabilidad) según sea el caso, mediante métodos que eviten la desnaturalización de los componentes antigénicos y, finalmente ajustar a una concentración determinada, que está en relación a su uso. La atenuación de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembras sucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos de casos de infecciones leves, etc.; mientras que para la inactivación se cuenta con métodos físicos (exposición al calor), químicos (tratamiento con formol o timerosal) o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides (pierden toxicidad pero no su composición antigénica tratándolas con formaldehído). Durante la producción de un antígeno o inmunógeno bacteriano se deben llevar a cabo una serie de controles que son más o menos rigurosos según sea el destino del biológico preparado, así una vacuna (principalmente de uso humano) requiere de un mayor número y más estrictas pruebas de control, muchas de ellas reglamentadas o bien definidas en las farmacopeas. Estas pruebas de control pueden ser biológicas en donde se incluye: identidad, pureza, inactivación, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y micótica, inocuidad, potencia, etc.; o bien químicas como: pH, determinación de adyuvantes y conservadores, proteínas totales, cloruros, sólidos totales, humedad residual, solubilidad, etc.
En los siguientes ejercicios se describe la preparación de inmunógenos a partir de cepas de, E. co li , Sh. dysenteriae, B . a b o r t u s y S . t y p h i que serán utilizados en la inoculación de conejos para la obtención de sueros inmunes antibacterianos. E. co li : Tiene Ag “O” que han servido para identificar más de 150 serotipos,
además presenta Ag “K” que de acuerdo con su termorresistencia han sido clasificados en: Ag “A” (estables a más de 120°C), Ag “B” (a 100°C pierden su inmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag “L” (son destruidos a 100 °C). Sh. dys enteriae : No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antígenos “H”, sin
embargo sus antígenos somáticos “O” tiene n un alto poder antigénico y en base a ellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella. Salmonella 9,12,d,Vi
(serotipo Typhi): Inicialmente el género Salmonella fue
clasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antígenos somáticos “O”, que difieren químicamente en cuanto a su composición de azúcares, presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosídicos alfa y beta. Actualmente esta clasificación se ha completado y se describen 9 grupos denominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos más de 1020 serotipos diferentes. Además, algunas cepas de Salmonella son móviles y presentan flagelos y en base a sus antígenos flagelares o “H” se puede hacer una clasificación más precisa de estos microorganismos. B . a b o r t u s : Las seis especies del género B r u c e l l a son antigénicamente similares,
siendo su lipopolisacárido y sus proteínas de membrana externa (PME) los antígenos más importantes. Las PME están clasificadas en tres grupos, considerándose a las del grupo II como porinas.
IV.1 PROPAGACIÓN DE LAS CEPAS CEPAS: B. abortus E. coli Sh. dysen teriae S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtención
de Ag “H”
MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medio para el desarrollo de la cepa : Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de medio. 1
Medio de propagación: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350 mL de medio.
CEPA
MEDIO PARA EL DESARROLLO DE LA CEPA
MEDIO DE PROPAGACION
Caldo triptosa
Agar triptosa
9,12,d,Vi Salmonella
Agar BHI inclinado Agar BHI inclinado Veal-infusion
Agar BHI Agar BHI Agar Veal-infusion
(serotipo Typhi) Ag “O” Salmonella 9,12,d,Vi
Veal-infusion
Veal-infusion
B. abortus
E. coli Sh. dysenteriae
(serotipo Typhi) Ag “H”
MATERIAL 1 2 1 2
Asa bacteriológica Mecheros Juego de colorantes para Gram. Portaobjetos. Microscopio. 15 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril (Exclusivo para E. coli y Sh. d y s e n t e r i a e) . 500 mL Solución salina isotónica (SSI) formolada al 0.6% estéril. (Exclusivo para Ag “H” de S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).
TÉCNICA IV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE E s c h e r i c h i a c o l i . IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigella dysenteriae . 1.
Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un cultivo puro de E. coli o de Sh. dysenteriae e incubar 24-48 h a 37°C.
2.
3.
4.
5. 6. 7.
Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estéril al cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo varias veces. Verificar la pureza del cultivo mediante tinción de Gram. Debe observarse sólo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo. Pasar la suspensión bacteriana al matraz que contiene el medio de propagación, extender el inóculo por toda la superficie e incubar el matraz 18-24 horas a 37°C. Adicionar 15 mL de SSI estéril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotación suaves. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMÚN PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18).
IV.1.3 ANTÍGENOS TOTALES DE B . a b o r t u s . IV.1.4 ANTÍGENO SOMATICO (O) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). 1.
2.
3.
4.
5.
Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inóculo abundante de la cepa de B . a b o r t u s o S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) e incubar 24-48 h ó 18-24 h, respectivamente a 37°C. Verificar la pureza del cultivo mediante una tinción de Gram. Deberán observarse únicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella y bacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algún tipo de contaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No. 3. Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagación, extender el inóculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio sólido, o agitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es líquido. Incubar el matraz 18-24 h a 37°C. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram. Para los cultivos en medio sólido primero adicionar 15 mL de SSI estéril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotación suaves. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es satisfactoria continuar en el caso de B . a b o r t u s y Ag “O” de S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMÚN PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18) y para el Ag “H” de S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) a partir del paso 1b.
IV.2 PROCEDIMIENTO COMUN PARA TODOS LOS ANTIGENOS BACTERIANOS.
MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm con 12 mL de tioglicolato fluido. 1
Medios para prueba de esterilidad micótica : Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de agar Sabouraud inclinados.
1
Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de medio.
ANTIGENO B. abortus E. coli
Sh. dysen teriae
9,12,d,Vi Salmonella
MEDIO PARA PRUEBA DE VIABILIDAD Agar triptosa inclinado Agar BHI inclinado Agar BHI inclinado Agar Veal-infusion inclinado
(serotipo Typhi) Ag “O” S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi
Agar Veal-infusion inclinado
(serotipo Typhi) Ag “H”
MATERIAL 1
2 2 3 1 1 1 2 1 1 1 4
Equipo de succión estéril. Constituido por: Frasco de centrífuga de 250 mL, tapón del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro de gasa, tubo de vidrio de 12 cm en ángulo de 90° con trampa de aire, tubo de vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramo de manguera para vacío de 50 cm. Frascos tipo “vial” de 50 mL con tapón estériles. Pipetas de 1 mL (1/10) estériles. Pipetas de 10 mL (1/10) estériles. Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta). Tapón de hule del No. 6 estéril. Asa bacteriológica. Mecheros. Juego de colorantes para Gram. Termómetro de 0 a 100°C. Charola de peltre para desechar material contaminado. Portaobjetos. Microscopio. Centrífuga con cabezal para frascos de 250 mL. Nefelómetro Klett Summerson con filtro verde y celdas. Incubadora a 37 °C.
Baño de agua de temperatura controlada. 25 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril. 100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estéril, adicionada de fenol al 0.5% ó de formol al 0.3%.
TÉCNICA 1a. Antígenos de E. coli , Sh. dysenteriae , B . a b o r t u s y Ag “O” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Cosecha: Por medio del equipo de succión y empleando un vacío leve extraer la suspensión bacteriana. Sustituir el sistema de succión por un tapón de hule sin horadar y proceder a llevar a cabo la inactivación.
Inactivación: Colocar el frasco de centrífuga en el baño de agua a: 5556°C, 2 h para B. abortus , E. coli y Sh. dys enteriae y baño de agua hirviente, 2.5 h para el antígeno “O” de S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi); agitando de vez en cuando. Prueba de viabilidad: Sembrar 0.2 mL de la suspensión calentada en el medio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inóculo perfectamente en toda la superficie e incubar a 37°C, 48-72 h. Al cabo de este tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrario deberá hacerse un tinción de Gram y observar si no se trata de contaminación y si no es así , calentar por 1 hora más ya que los microorganismos están todavía vivos. Después del segundo calentamiento repetir la prueba de viabilidad. Continuar con el paso No. 2. 1b.
Antígeno “H” de S a l m o n e l l a 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inactivación: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSI formolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios días.
Prueba de viabilidad: Para el 4° ó 5° día probar si ya se destruyó la viabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensión perfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado, extendiendo el inóculo perfectamente en toda la superficie del medio e incubar a 37°C, 24-48 h. Si todavía hay crecimiento deberá hacerse un tinción de Gram y observar si no se trata de contaminación, y si no es así, se dejar transcurrir 3 a 4 días más y se repite la prueba de viabilidad. La prueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo.
Cosecha: dejar reposar la mezcla de un día para otro y evitando que se resuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizando un sifón estéril y decantar el sedimento a 1 ó 2 frascos de centrífuga de 250 mL, estériles.
2.
3.
4.
Centrifugar la suspensión 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSI fenolada al 0.5% estéril (para B . a b o r t u s , E. coli y Sh. dy senteriae ) ó SSI formolada al 0.3% estéril (para los antígenos “O” y “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)). Preparar una dilución 1:10 de la suspensión directamente en la celda del nefelómetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contra SSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor de dilución e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C) determinar la concentración de bacterias/mL. La lectura también se puede realizar en un colorímetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades de absorbancia equivalen a 1 X 10 9 microorganismos/mL. Ajustar la concentración de una alícuota de la suspensión a 10 9 microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada o formolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema de inmunización (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente fórmula: Concentración que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregar Concentración que se desea por cada mL de la suspensión concentrada
5. 6.
Envasar en frascos “vial” tanto la suspensión concentrada como la diluida y rotular adecuadamente. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto sembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeración hasta su uso.
