Laboratorio Bioquímica 2° Semestre 2014
Ped. En Ciencias con Mención UC del Maule.
EXTRACCIÓN DE ADN EN CÉULUAS VEGETALES Y ANIMALES OBJETIVO En esta práctica realizaremos la extracción del ADN de células vegetales y animales, poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que permite el empaquetamiento en el núcleo ce lular de las larguísimas cadenas de esta molécula.
INTRODUCCIÓN Los ácidos nucleicos son moléculas orgánicas de gran importancia en la transmisión transmisión de los caracteres hereditarios y en la síntesis de proteínas. Los avances científicos en este campo tienen aplicaciones médicas, agrícolas, ganaderas e industriales. Gran parte de las investigaciones en biología molecular actual se realizan sobre estas moléculas orgánicas A nivel químico los ácidos nucleicos son polímeros lineales de nucleótidos, quienes a su vez se componen de un azúcar de cinco carbonos, bases nitrogenadas y un grupo fosfato. Existen dos tipos de ácidos nucleicos:
ADN, polímero de desoxirribonucleótidos
ARN, polímero de ribonucleótidos
Los desoxirribonucleótidos desoxirribonucleótidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y timina forman parte del ADN. Los ribonucleótidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y uracilo forman parte de los ARN. El ADN contiene la información genética que determina el desarrollo del individuo y sus características; esto es así en todas las especies, salvo en algunos virus
que contienen la
información genética en el ARN. La estructura del modelo actual de ADN fue descrita por primera vez por los investigadores F. Crick y J. Watson, en 1953, quienes postularon que que dos moléculas de de ADN, conformadas, cada cada una, por una cadena de polinucleotidos, se enrollaban bajo un mismo e je formando una hélice con capacidad de rotación.
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En las células eucariotas, el ADN se encuentra en el núcleo, y una pequeña cantidad en las mitocondrias y los cloroplastos. En las células procariotas, la molécula de ADN es circular, y además, estas células pueden tener otras moléculas más pequeñas de ADN llamadas plásmidos. El ARN es un polirribonucleótido formado fundamentalmente por los ribonucleótidos de adenina, guanina, citosina y uracilo (en vez de la timina del ADN). La pentosa es la ribosa, que tiene un grupo hidroxilo en el carbono 2'. La interacción de los ácidos nucleicos en la expresión de la información genética queda expresada en lo que se conoce como dogma central de la biología molecular.
FUNDAMENTO El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo para después romper éste y liberar el ADN. Una vez liberado se debe separar de las proteínas y precipitarlo para su extracción.
EXTRACCIÓN DE ADN DE CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL PRESENTES EN LA SALIVA MATERIALES - Alcohol de 90° frío. - Un tubo de ensayo. - Varilla de vidrio. - Vaso de precipitados de 50 mL - Solución para extracción (10 mL)
PROCEDIMIENTO 1. Preparar un tubo de ensayo con alcohol etílico de 96º.
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2. Poner un poco de agua en un vaso y enjuagarse la boca enérgicamente durante al menos medio minuto para arrastrar el mayor número posible de células de descamación de la mucosa bucal (antes de hacerlo conviene haber tragado saliva para eliminar la acción de los enzimas contenidos en ella) 3. Al vaso con la solución de saliva, adicionar 15 mL de la solución de extracción y remover con la varilla de vidrio suavemente durante varios minutos sin que se forme espuma. 4. Añadir la solución suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol dejándola resbalar por la pared del tubo inclinado. El filtrado, más denso que el alcohol y algo turbio se deposita en el fondo del tubo. Dejar reposar durante 2 ó 3 minutos sin moverlo en absoluto. El alcohol formará un sobrenadante por encima de la fase acuosa en la que se encuentra el ADN en disolución provocando que éste precipite. 5. Esperar unos minutos mientras el ADN precipita en la interfase alcohol-agua formando una masa blanquecina que asciende lentamente formando un frumo de aspecto algodonoso.
EXTRACCIÓN DE ADN EN CÉLULAS VEGETALES MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES: Para la extracción de ADN:
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2 a 3 frutillas congeladas desde al menos una noche antes.
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20 mL de alcohol etílico (etanol) 90° frío (se recomienda refrigerar desde una noche previa del experimento).
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1 bolsa pequeña de plástico con cierre (tipo Ziplock)
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9 tubos de ensayo
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1 gradilla
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1 probeta de 50 mL
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1 vaso de precipitado 100 ml
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1 embudo pequeño
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1 pipeta de 5 mL
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1 ó 2 círculos de papel filtro
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2 palillos largos o varillas de vidrio
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Solución para extracción (30 mL)
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Cubos de hielo para enfriar los extractos y el alcohol
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Marcador permanente o masking tape para etiquetar los tubos de ensayo
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1 cronómetro
Para observar las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos
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3 tubos con las hebras de ADN obtenidas en la extracción
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10 mL de clara de huevo (2 huevos enteros por grupo)
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10 ml de agua destilada
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10 ml de HCl 0.1 N
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10 ml de reactivo biuret
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3 tubos de ensayo
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4 pipetas
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Mechero y trípode
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1 gradilla para tubos de ensayo
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Vaso de precipitado de 500 mL
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Termómetro
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Pinza para tubo de ensayo
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1 cronómetro
PROCEDIMIENTO:
I.- Extracción de ADN 1.- Tiempo antes de comenzar la práctica congelar las frutillas y enfriar el alcohol (es mejor meterlo al refrigerador una noche antes de su uso). 2.- Colocar las frutillas en una bolsa plástica, agregar 20 mL de solución de extracción, sacar todo el aire de la bolsa y cerrar ésta. 3.- Machacar las frutillas con los dedos durante 5 minutos. 4.- Coloca la bolsa al hielo por un minuto y repe tir el machacado por otros 5 minutos. 5.- Filtrar el machacado usando un embudo y papel filtro de filtrado rápido, recibir el líquido en un probeta o vaso precipitado.
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6.- Colocar 2 mL de filtrado en un tubo de ensayo cuidadosamente agregar un volumen igual de alcohol al 90% frío lentamente sin mezclar. De jar reposar el tubo durante 5 m inutos. Es importante mantener el alcohol frío en la mesa de trabajo, colocando éste en un baño de hielo. 7.- Transcurrido ese tiempo notarás que aparece una sustancia viscosa. Introduce el palito de madera y varilla y sácalo a la superficie. 8.- ¡Este es el ADN de las frutillas! 9.- Repetir 3 veces la obtención de la hebra de ADN y colocar cada uno en un tubo de ensayo (del punto 5 al 8). Rotular cada tubo con la letra a, estas muestras de ADN se usará para los siguientes ensayos. 10.- Elimina los restos de alcohol mediante decantación. Ten cuidado ya que es fácil perder la muestra.
II.- Ensayos para observar las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos. A continuación comprobaremos que la muestra obtenida es ADN con base en algunas de sus propiedades fisicoquímicas. Utilizaremos la muestra de ADN obtenida, así como clara de huevo como un ejemplo de proteína (albúmina). Estos dos tipos de muestra usaremos en los próximos ensayos. Antes de empezar las pruebas coloca 0,5 mL de clara de huevo en 3 tubos de ensayo rotulados con la letra b.
II A.- Efecto de la temperatura. 1.- A una muestra de ADN contenida en un tubo de ensayo agregar 2 mL de agua destilada. Hacer lo mismo con la muestra de 0.5 mL de clara de huevo y agitar levemente ambos tubos. 2.- Colocar los 2 tubos dentro de un vaso de precipitado con agua hirviendo durante 2 minutos, sacar del baño con ayuda de una pinza y agitar levemente. 3.- Observar cuidadosamente los dos tubos ¿notas alguna diferencia? Como te habrás dado cuenta se observa que el ADN se ha disuelto (tubo a) y la clara de huevo ha formado un coágulo de color blanco (tubo b)
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II B.- Efecto de un medio ácido. 1.- En un tubo de ensayo conteniendo una muestra de ADN agregar 2ml de HCl 0,1 N y agitar vigorosamente por 2 minutos. Esta operación puede efectuarse fácilmente sujetando el tubo por la parte superior con una mano y golpeando con el dedo índice de la otra mano. 2.- A una muestra de 0,5 mL de clara de huevo agregar 2 mL de HCl 0,1 N y agitar vigorosamente durante 2 minutos. 3.- Compara los dos tubos e identifica en qué son diferentes las soluciones que contienen. Se observa que el ADN se ha disuelto (tubo a) y la clara de huevo en el tubo b a formado varios agregados blancos en medio de un líquido incoloro (coagulación de la proteína)
III C.- Determinación cualitativa de proteínas 1.- En un tubo de ensayo conteniendo una muestra de ADN agregar 5 gotas de reactivo Biuret y agitar. 2.- En otro tubo, conteniendo una muestra de 0,5 mL de clara de huevo agregar 5 gotas de reactivo Biuret y agitar. 3.- Comparar los resultados obtenidos en cada tubo. En el tubo a (muestra de ADN) el color azul del reactivo Biuret permanece debido a que en la muestra no hay presencia de proteínas en cambio en el tubo b (clara de huevo) el líquido presenta un color violeta debido a la presencia de proteínas. En este caso la albúmina de la clara de huevo.
CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué es necesario moler o machacar las fresas?
2.- investiga la función de cada una de las sustancias en la extracción del ADN.
SUSTANCIA Detergente Sal Alcohol
FUNCIÓN
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3.- ¿Por qué será importante re alizar el experimento en un baño de hielo?
4.- ¿Qué función tiene llevar a cabo la filtración?
5.- ¿Por qué se utiliza el reactivo Biuret para la identificación de proteínas?
