PRACTICA RACT ICA DE LABOR L ABORATOR ATORIO IO TECNICA DE TINCION GRAM I ) INTRODUCCIÓN: La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la visualización de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que desarrolló un método de tinción en 1884. Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de Gram, la habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con con un solvente orgánico tal como el alcohol o la acetona , las bacterias Gram positivas retienen la tintura y aparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener y se tiñen de color rojo para ser vistas con el microscopio
En esta práctica de microbiología se va a realizar la técnica de Tinción Gram para poder examinar las células bacterianas que se encuentran en el yogurt determinar al tipo al que pertenecen.
II) OBJETIVO: 1. Emplear técnicas bacteriológicas simples. 2. Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram. 3. Utilizar colorantes y comprender su utilización. 4. Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión. 5. Observar células procariotas Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram de todos los integrantes del grupo y comprender la importancia y la diferencia entra las estructuras de las diferentes bacterias .
IV) MATERIALES Y METODOS INSTRUMENTOS 03 Portaobjetos Goteros, Pipetas, Mechero, Microscopio con lente de inmersión.
REACTIVOS agua destilada. Cristal violeta, Gotas de Yogurt
Solución de Lugol Alcohol 95º Solución Fucsina o Safranina para contrateñir
V) DESARROLLO DE LA PRACTICA PROCEDIMIENTO:
Preparar ar un porta porta SIEMBRA: Prepar bien limpio y Coger una porc porció ión n pequ pequeñ eña a de yogu yogur r con con un palil alillo lo o una una agu aguja enmangada y hacer una extensión sobre el porta.
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FROTIS: Se fijo las células células de ida y vuelta vuelta – hasta que que se desagrego desagrego - hasta hasta la mitad del portaobjetos. FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y luego, que nuestra muestra permanezca en el porta objeto (Se fijo por calor – a mechero TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de violeta y se deje en reposo 1 minuto siempre que colocamos un colorante o mordiente es recome recomenda ndable ble deshac deshacers erse e de los exceso excesoss de líquid líquido o ya que puede pueden n interf interferi erir r cuando apliquemos otra sustancia. Cubrir con lugol durante 3´. El Lugol actúa como "mordiente", vale decir, cristaliza la solucion Violeta de Genciana formando un complejo insoluble en H2O pero soluble en alcohol-acetona.El Lugol forma un complejo cristal violeta-iodo). Si hay excedente se lava. lava. En este caso hubo exceso exceso DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el portaobjetos en ambos lados o a cada extremo, hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con agua. . Este Este paso paso es fundam fundament ental al porque porque en el reside reside la respuest respuesta a diferen diferencia ciall de las Gram + y las Gram – . Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto. Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los de las Gram Ento Entonc nces es,, la solu soluci ción ón alco alcoho hol,l, cont contra rae e los poro poross de las las bact bacter eria iass cerra cerrand ndo o completamente los de las Gram + y parcialmente los de las Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.
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CONTRATINCIÓN: Sobr Sobre e el frot frotis is se echo echo 2 gota gotass de Safra afrani nina na bási básica ca es parcialmente soluble en H2O e ingresará sólo en las Gram - ya que las otras contin continúan úan cerra cerradas das por efecto efecto del alcoho alcohol-a l-acet cetona ona.. La safran safranina ina Básica Básicamen mente te interactúa con la membrana celular y forma un complejo insoluble en H2O. para realizar la contra tinción y realizar frotis. Al cabo de 1 ó 2 minutos se vierte el colorante, el preparado se lava con agua si es que hay exceso, y se deja secar. ELIMINAR EL EXCESO y lavar con H2O para eliminar restos de colorante. Si bien los colo colora rant ntes es ahor ahora a son son inso insolub luble less en agua agua (rec (recor orde demo moss que que el Viol Violet eta a de Genciana fue “fijado” con lugol), el agua actúa lavando el exceso de arriba del portaobjetos por arrastre. La explicación más simple de esto es usando la analogía de la mancha de aceite en la vereda: si quisiéramos limpiarla usando agua vamos a notar que es imposible disolver el aceite pero si uso una manguera a presión puedo “empujar” la mancha a otro sector. Esto es lo que hacemos en el porta objeto: empujamos el exceso de colorante hacia fuera del portaobjetos, para poder ver lo que hay debajo Observar en el microscopio
MARCO TEORICO TÉCNICA DE TINCION GRAM
Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción Gram involucra estos pasos:
1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal-violeta. En este paso todas las células se tiñen de morado. 2. Mordente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y forma el complejo: cristal violeta-yoduro. Las células continúan moradas.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, que actúa lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas (estas quedan incoloras). Este es el paso crítico, pues si se exagera, decolora las Gram positivas o de lo contrario, no decolora a las Gram negativas. 4. Contratinción: Se vuelve a teñir con Safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que habían quedado incoloras, se tilen de rosado a fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan con la contratinción.
Basándonos en la reacción a esta tinción de las bacterias, éstas se han clasificado, taxonómicamente hablando, en grampositivas y gramnegativas. Las gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que las grampositivas pueden presentar respuestas variables frente a determinadas
condiciones, son gramlábiles. Para explicar el mecanismo de tinción se han propuesto varias hipótesis, fundadas en la naturaleza química de la pared
VI) RESULTADO DEL EXPERIMENTO OBSERVACIÓN Realizar una tinción de Gram: mediante esta coloración se pueden diferenciar las bacterias típicas del yogur (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus), que son Gram ( +), de las bacterias
CONCLUSION Hemos podido reconocer a través del método de tinción Gram, en este caso se identifico bacterias y sus formas y los lactobasilos del yogurt, en nuestro caso se juntaron las bacterias de streptococcus y los lactobasilos estando unidos en el portaobjetos y diferenciándose por los colores rosa y los lactobasilos eran gran posi positiv tivas as y de colo colorr rosa rosa y los los strep strepto toco cocc ccus us eran vien vien la obser observa vaci ción ón del microscopio se pudo apreciar su formas bien definidas y diferenciadas. Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.
VII) GRAFICOS
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.
Esta solución es fijado al vidrio del portaobjetos portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio mi croscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.
GRAN POSITIVAS LACTOBACILOS Y STREPTOCOCCUS
YOGURT
Portaobjetos MEDIANTE LA TÉCNICA DEL FROTIS SE COMBINA COMBINARO RO LAS DOS BACTERIAS.