PRACTICA N° 03 04 05 - FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA) FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE OBSTETRICIA

CURSO DE BIOQUIMICA “FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA” I. COMPETENCIAS.Al finalizar la Práctica de Laboratorio el alumno será capaz de: 

Explicar la actividad enzimática de la pepsina sobre las proteínas.



Explicar el efecto de un factor enzimático sobre la actividad de la pepsina.



Determinar gráficamente la Temperatura optima de la pepsina.



Determinar gráficamente el pH óptimo de la pepsina.

II. PRE-REQUISITOS PARA LA PRÁCTICA DE LABORATORIO.Conceptos Básicos:

-

Enzima – Sustrato - Producto.

-

Complejo Enzima-Sustrato.

-

Cinética Enzimática.

-

Constante de Michaelis-Menten (Km).

-

Velocidad Máxima (Vmáx).

-

Cinética de Michaelis-Menten.

-

Diagrama de Lineweaver-Burk.

-

Peptidasa - Proteasa.

-

Zimógeno.

-

Pepsinógeno - Pepsina.

Guía de Practicas del Curso de Bioquímica UNMSM – Facultad de Medicina - Semestre 2011 0 Profesor Responsable Blgo. Marco Antonio Núñez Fonseca

III. GENERALIDADES.-

Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas, son proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados substratos) sobre los que actúan. La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan

una

herramienta

bioquímica

muy

útil

para

calcular

la

concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima. La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por las concentraciones de la enzima y el substrato. A medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes substratos, en tanto que la concentración de la enzima no se altera. La actividad enzimática puede expresarse: a) Por la desaparición del Substrato (S) b) Por la aparición de Productos (P) c) Por modificación de Cofactores (C)


El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:

[E] + [S]

[E] + [P] C

C’

Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como: 1) Concentración de Substrato [S] 2) Concentración de la Enzima [E] 3) pH del medio 4) Influencia de la temperatura 5) Efecto de inhibidores y activadores En las siguientes prácticas (Prácticas N° 05, 06 y 07) estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimática de la pepsina en presencia de albúmina La pepsina es un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por las células principales de las glándulas gástricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces peptídicos, descomponiendo así las proteínas en aminoácidos. La pepsina solo realiza la proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo que es precisa la presencia de ácido clorhídrico para la realización de la digestión gástrica de las proteínas. Las células de las glándulas gástricas no producen directamente pepsina, sino que su producto es el pepsinógeno, sustancia precursora sin capacidad digestiva que se convierte en pepsina en la luz de la glándula, al entrar en contacto con el ácido clorhídrico y con la pepsina ya producida. La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato (disminución de la turbidez en los tubos que contiene albúmina), la cual se determinará en el Espectrofotómetro a 450 nm.





CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO Nº 03 “EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO” III. COMPETENCIA.Al finalizar la Práctica de Laboratorio el alumno será capaz de: 

Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la albúmina a partir de la gráfica de vi contra [S].



Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la albúmina a partir de la gráfica de dobles reciprocas 1/v i contra 1/[S].

IV. PARTE EXPERIMENTAL.Preparar la siguiente batería de 8 tubos como se indica a continuación: TUBOS N°

1

2

3

4

5

6

7

8

Agua Destilada

8.0 ml 7.0 ml 6.0 ml 5.0 ml 4.0 ml 3.0 ml 2.0 ml

---

HCl 1N

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

---

Albúmina 5%

1.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 4.0 ml 5.0 ml 6.0 ml 7.0 ml

---

Pepsina 1%

---

---

---

---

---

---

---

5.0 ml

Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en el espectrofotómetro. Considerar las Absorbancias como Lectura Inicial. Luego, Incubar los ocho tubos a 37ºC por 5 min. Añadir 0.5 ml de pepsina a cada tubo (del tubo 8 a los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7). Incubar por 5 min a 37ºC. Detener la reacción en un baño de hielo.


Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 en el espectrofotómetro. Considerar las Absorbancias como Lectura Final. Hacer la diferencia:

Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final

El resultado de ésta diferencia se considerará como Actividad Enzimática.

Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimática en el eje Y versus [S] en el eje X.

1/Actividad Enzimática en el eje Y versus 1/[S] en el eje X.

Calcular el Km y Vmáx de la pepsina en cada una de las gráficas




CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORO Nº 04 “EFECTO DEL pH” III. COMPETENCIA.Al finalizar la Práctica de Laboratorio el alumno será capaz de: 

Determinar el pH óptimo en el cual la actividad enzimática de la pepsina es máxima.

IV. PARTE EXPERIMENTAL.Seguir el siguiente protocolo de trabajo: TUBOS N°

1

2

3

4

5

6

B

Agua Destilada

-

1.5 ml

2.0 ml

1.5 ml

-

-

5.0 ml

HCl 1N

2.0 ml

0.5 ml

-

-

-

-

-

Na2CO3 10%

-

-

-

0.5 ml

2.0 ml

-

-

Albúmina 5%

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml

-

5.0 ml

Pepsina 1%

-

-

-

-

-

20.0 ml

-

pH

Incubar los tubos (del 1 al 6) por 5 min. Añadir del tubo Nº 6, 3 ml de pepsina a los tubos Nº 1 al 5. Mezclar e incubar a 37ºC por 5 min.

Leer en el espectrofotómetro los tubos 1, 2, 3, 4, y 5 y el tubo blanco (B).


Restar la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de c/u de los 5 tubos. La diferencia será asumida como actividad enzimática.

Determinar: Los valores del pH final para cada uno de los tubos


Actividad Enzimática versus pH




CURSO DE BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO Nº 05 “EFECTO DE LA TEMPERATURA” III. COMPETENCIA.Al finalizar la Práctica de Laboratorio el alumno será capaz de: 

Determinar la temperatura óptima para la actividad de la pepsina.

IV. PARTE EXPERIMENTAL.Preparar dos series de tubos: SERIE Nº 1 TUBOS N°

1S

2S

3S

B

Agua Destilada

3.5 ml

3.5 ml

3.5 ml

3.5 ml

HCl 1N

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

Albúmina 5%

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml

1E

2E

3E

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

SERIE Nº 2 TUBOS N° Pepsina 1%


Incubar los 6 tubos por 5 min según el siguiente cuadro de temperaturas: TUBOS N°

1S y 1E

2S y 2E

3S

3E

Temperatura

0°C

37°C

37°C

100°C

Agregar el contenido de los tubos 1 E, 2 E, y 3 E a sus respectivos tubos 1 S, 2 S, y 3 S. Luego incubar cada tubo a las correspondientes temperaturas 0ºC, 37ºC y 37ºC respectivamente, por 5 min.

Posteriormente colocar los tubos en agua helada para detener la reacción.

Leer las Absorbancias en el espectrofotómetro a 450 nm.

La actividad enzimática se encontrará restando la lectura del tubo blanco (B) menos lectura de los otros tres tubos (correspondiente a cada temperatura).


Actividad Enzimática versus Temperatura


PRACTICA N° 03 04 05 - FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

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