UNIVERSIDAD AUTONÓMA AGRARIA ANTONIO NARRO DIVISIÓN DE AGRONOMIÁ Departamento de Fitomejoramiento – laboratorio de Genética Materia: Genética Práctica no. 1 Nombre de la práctica: “Determinación de color de cuerpo y herencia con un par de alelos en Drosophila melanogaster (mosquita de la fruta) ”
Buenavista, Saltillo, Coahuila a 18 de abril de 2018
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INTRODUCCIÓN La historia de la genética se considera que comienza con el trabajo del monje agustino Gregor Mendel. Su investigación sobre hibridación en guisantes, publicada en 1866, describe lo que más tarde se conocería como las leyes de Mendel. El año 1900 marcó el “redescubrimiento de Mendel” por parte de Hugo de Vries,
Carl Correns y Erich von Tschermak, y para 1915 los principios básicos de la genética mendeliana habían sido aplicados a una amplia variedad de organismos, donde destaca notablemente el caso de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster ). Bajo el liderazgo de Thomas Hunt Morgan y sus compañeros “drosofilistas”, los especialistas en genética desarrollaron la teoría
mendeliana-cromosómica de la herencia, la cual fue ampliamente aceptada para 1925. Paralelamente al trabajo experimental, los matemáticos desarrollaron el marco estadístico de la genética de poblaciones, y llevaron la interpretación genética al estudio de la evolución. Con los patrones básicos de la herencia genética establecidos, muchos biólogos se volvieron hacia investigaciones sobre la naturaleza física de los genes. En los años cuarenta y a principios de los cincuenta, los experimentos señalaron al ADN como la parte de los cromosomas (y quizás otras nucleoproteínas) que contenía genes. El enfoque sobre nuevos organismos modelo tales como virus y bacterias, junto con el descubrimiento en 1953 de la estructura en doble hélice del ADN, marcaron la transición a la era de la genética molecular. En los años siguientes, algunos químicos desarrollaron técnicas para secuenciar tanto a ácidos nucleicos como a proteínas, mientras otros solventaban la relación entre estos dos tipos de biomoléculas: el código genético. La regulación de la expresión génica se volvió un tema central en los años sesenta, y para los años setenta dicha expresión génica podía ser controlada y manipulada utilizando ingeniería genética. Durante las últimas décadas del siglo XX muchos se enfocaron a proyectos genéticos a gran escala, secuenciando genomas enteros.
OBJETIVOS 1. Confirmar principio de dominancia 2. Confirmar la ley de la segregacion
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HIPOTESIS 1. Que las moscas cuerpo ambar (Silvestre) domine sobre las moscas cuerpo negro (Ebony) 2. Al cruzar los organismos resultantes de la primera generación filial, se observará que el carácter oculto reaparece o vuelve a manifestarse, presentándose una característica en una proporción de ¾ color ámbar y ¼ color oscuro. (75% a 25%)
REVISIÓN DE LITERATURA Dr os ophila melanog as ter Drosophila melanogaster (en latín significa literalmente amante del rocío de vientre
negro), también llamada mosca del vinagre o mosca de la fruta, es una especie de díptero braquícero de la familia Drosophilidae. Recibe su nombre debido a que se alimenta de frutas en proceso de fermentación tales como manzanas, bananas, uvas, etc. Es una especie utilizada frecuentemente en experimentación genética, dado que posee un reducido número de cromosomas (4 pares), breve ciclo de vida (15-21 días) y aproximadamente el 61 % de los genes de enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las moscas de la fruta, y el 50 % de las secuencias proteínicas de la mosca tiene análogos en los mamíferos.
https://es.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster
Genética Mendeliana: Experimentos de Mendel Mendel escogió el chícharo de comer o guisante como organismo experimental porque es una planta anual con caracteres bien definidos que se pueden cultivar y cruzar fácilmente. Además, los chícharos tienen flores perfectas, es decir, flores que contienen partes femeninas y partes masculinas, que se autofecundan, esto quiere decir que el óvulo (gameto femenino) es fertilizado por el polen (gameto masculino) proveniente de la misma planta (por lo general de la misma flor). Mendel fue afortunado al elegir una planta diploide, ya que los organismos diploides contienen dos juegos de cromosomas. Si hubiera elegido un organismo poliploide, con más de dos juegos de cromosomas, no hubiera obtenido resultados sencillos y comprensibles. A través de muchas generaciones de autofecundación, los chícharos habían dado origen a líneas puras. 3
Por lo tanto, una sola alteración en un carácter se ref lejaba en una diferencia visible entre variedades. Además, en los siete pares de caracteres contrastantes que Mendel eligió para estudiar, las dos formas parentales presentan caracteres morfológicos o efectos visibles bien definidos y contrastantes en las plantas. Los tallos son altos o enanos; las vainas son verdes o amarillas; las flores son axiales (distribuidas a lo largo del tallo) o terminales (agrupadas en la punta); los cotiledones de las semillas maduras son amarillos o verdes; la superficie externa de la semilla es lisa o arrugada; y la testa (cubierta) de la semilla es blanca o gris. El color de la flor se correlaciona con este último en carácter. Las semillas con cubiertas blancas producen plantas cuyas flores son blancas, y las que tienen cubiertas grises producen plantas con flores color violeta. (Gardner, 1980).
Thomas Morgan El descubrimiento de estudios enfatizados en Drosophila se la debe al padre de la genética experimental moderna, el biólogo estadounidense Thomas Hunt Morgan (1866-1945). Desde 1910 Morgan y sus jóvenes colaboradores centraron toda actividad investigadora en el estudio genético de Drosophila Melanogaster , logrando conseguir aislar un número considerable de mutantes morfológico para el color del cuerpo, color de ojos, tamaño y forma de las quetas, aspectos de las alas y entre muchas más formas de mutaciones (Eduard Petitpierre 1997).
En 1915 Morgan encontró 85 mutantes diferentes con una gran variedad de estructuras afectadas. Conforme se aislaron las mutantes de Drosophila melanogaster , fueron criadas, cruzadas y mantenidas como reserva en el laboratorio. Tal como se esperaba, las 85 mutaciones no se permutaron de manera independiente; en vez de eso, Morgan encontró que pertenecían a 4 diferentes grupos ligados, uno con muy pocos genes mutantes. Este dato se relaciona perfectamente con la observación de que las células de Drosophila poseen 4 pares de cromosomas homólogos. (Karp, 1998).
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Drosophila Melanogaster silvestre: presenta ojos rojos, de forma oval, alas de
borde liso, venación uniforme que se extienden hasta más allá del abdomen y setas largas y suaves, el color del cuerpo marron, con un patrón de áreas claras y oscuras. Genéticamente hablando, la gente y las moscas de la fruta son sorprendentemente parecidas, explica la bióloga Sharmila Bhattacharya del Centro de Investigación Ames de la NASA. "Aproximadamente el 61% de los genes de enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el código genético de las moscas de la fruta, y el 50% de las secuencias proteínicas de la mosca tiene análogos en los mamíferos". Esta es la razón por la cual las moscas de la fruta, conocidas para los científicos como Drosophila melanogaster , son comunes en los laboratorios de investigación genética. Para propósitos de investigación, fácilmente pueden reemplazar a los humanos. Se reproducen rápidamente, de modo que muchas generaciones pueden ser estudiadas en un corto tiempo, y ya se conoce e l mapa completo de su genoma. "La Drosophila es utilizada como modelo genético para varias enfermedades humanas, incluyendo las de Parkinson y de Huntington", hace notar Bhattacharya.
https://ciencia.nasa.gov/science-at-nasa/2004/03feb_fruitfly
Teniendo en cuenta lo anterior las características y la importancia en estudios genéticos con Drosophila Melanogaster , este informe pretende evaluar una de las variables mutaciones que se pueden presentar en estas moscas, la mutación ebony en Drosophila melangaster realizando cruces y retro-cruces entre individuos silvestres con individuos ebony, con el fin de analizar el proceso biológico y los patrones de herencias al transcurrir etapas F1 y F2. Para evaluar la mutación se tendrá en cuenta el método experimental de conteo según características presentes en las moscas y confirmando los resultados con la prueba de chi-cuadrado. Para lo propuesto se debe tener en cuenta las características de cada mosca que vamos a cruzar y el ciclo de vida que Drosophila melanogaster presenta.
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MATERIALES Y METODOS El experimento fue llevado a cabo dentro del laboratorio de Genética, que corresponde al departamento de Fitomejoramiento, ubicado dentro de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Buenavista, Saltillo, Coahuila. CP. 25315. Los materiales que utilizamos para realizar las cruzas, se enlistan a continuación:
Microscopio (sin marca)
Cepas de Drosophila melanogaster
Éter
Aceite
Aguja de disección
Frasco anestesiador
Estufa
Embudo
Frasco con alimento Platina de acrílico Pincel
Medios de cultivo En el laboratorio los medios de cultivo utilizados requieren una preparación especial, a fin de evitar serios problemas tales como contaminación por hongos o bacterias, licuefacción del medio etc. Las principales características que debe reunir un medio de cultivo son las siguientes: a) Contener la cantidad necesaria de azúcar para permitir el crecimiento de las levaduras, principal alimento de las larvas, ya que constituyen una fuente de proteínas y vitaminas. b) Tener una consistencia apropiada, para que no se desprenda al sacudir el frasco, lo cual se logra al añadir agar bacteriológico o carragenina en combinación con harina de maíz; esta última se utiliza como fuente de carbohidratos. c) Inhibir el crecimiento de hongos y bacterias que contaminan los cultivos y retardan o impiden el desarrollo de las moscas. 6
El medio que más se utiliza en este laboratorio es el siguiente: Componentes:
Agar bacteriológico 10 g Azúcar común 50 g Harina de maíz 50 g Levadura de cerveza (comercial) 15g Ácido propiónico 4 ml (como inhibidor de hogos y bacterias) Agua 1250 ml
PROCEDIMIENTO Cruza Monohíbrida Cepas de Drosophila melanogaster utilizadas:
Normal o silvestre (E): Cuerpo color ámbar Ebony (e): Cuerpo color negro
Fecha de apareamiento: 31 de enero de 2018
Cruza Directa 1. Para realizar las cruzas es necesario tener, machos y hembras (vírgenes) de la misma edad de cada cepa por emplear. 2. Se utilizó dos frascos, uno con 10 hembras silvestres (ámbar) y otro con 10 machos Ebony (oscuros). 3. En cada uno se golpeó suavemente el frasco con el fin de que las moscas bajaran y se entorpecieran, a continuación, con la ayuda de un embudo se colocaron hembras y machos en un mismo frasco con medio de cultivo fresco. 4. Se etiquetó el frasco con: fenotipos de la cruza, generación, fecha, sección y equipo. P1)
♀ Silvestre x ♂Ebony
EE (ámbar)
ee (oscura)
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Cruza Recíproca 1. Para realizar las cruzas es necesario tener, machos y hembras vírgenes, de la misma edad de cada cepa por emplear. 2. Utilizamos dos frascos, uno con 10 hembras Ebony (oscuras) y otro con 10 machos silvestres (ámbar). 3. En cada uno se golpeó suavemente el frasco con el fin de que las moscas bajaran y se entorpecieran a continuación con la ayuda de un embudo se colocaron hembras y machos en un mismo frasco con medio de cultivo fresco. 4. Se etiquetó el frasco con: fenotipos de la cruza, generación, fecha, sección y equipo. 5. Se almacenó el frasco en una cámara de temperatura constante de 25ºC. P1)
♀ Ebony x ♂Silvestre
ee (oscura)
EE (ámbar)
Fecha de liberación de P1: 07 de febrero de 2018 Liberación de progenitores 1. Al transcurrir una semana después de las cruzas se liberaron los progenitores de la cruza monohíbrida (directa y recíproca). 2. Inicialmente en un frasco se agregó éter a la gasa con un gotero y se tapó para conservar los vapores. 3. Se golpeó suavemente el frasco, con el fin de que las moscas bajaran y entorpecieran. 4. Se vaciaron a un frasco limpio con ayuda del embudo y se le colocó nuevamente la gasa con éter. 5. Se dejó transcurrir un tiempo de aproximadamente 20 segundos, hasta que las moscas quedaron dormidas. 6. Finalmente se colocaron en aceite. 7. Los frascos con medio de cultivo ya tenían huevos y pupas de mosca y se devolvieron a la cámara de temperatura constante. 8
Fecha de evaluación de F1: 14 de febrero de 2018 1. Obtuvimos nuestra generación F1. 2. Cuando emergieron todas las moscas en los cultivos procedimos a evaluar resultados. 3. En un frasco limpio se agregó éter a la gasa con un gotero y se tapó para conservar los vapores. 4. Se vaciaron las moscas del medio de cultivo de la cruza recíproca al frasco con la ayuda de un embudo, las moscas se quedan dormidas en un lapso de aproximadamente 15 a 20 segundos (se debe cuidar que no se expongan por más tiempo, de lo contrario morirán). 5. A continuación, se colocaron las moscas ya dormidas sobre una platina de acrílico. 6. Se colocó la platina de acrílico en el microscopio estereoscopio y procedimos a su evaluación, nos apoyamos con un pincel y una aguja de disección para obtener un mejor manejo de las moscas. 7. Se evaluó que hubiese uniformidad, contamos y anotamos el número de hembras y de machos y el fenotipo que presentaron. 8. Se hizo el mismo procedimiento tanto en la cruza directa como en la recíproca.
Fecha de cruzamiento: 14 de febrero de 2018 P2) F1 X F1 1. Se colocaron 5 hembras y 5 machos procedentes de la cruza monohíbrida directa (resultado del paso anterior Filial 1) en un frasco con medio de cultivo fresco. 2. Se colocaron 5 hembras y 5 machos procedentes de la cruza monohíbrida recíproca (resultado del paso anterior Filial 1) en un frasco con medio de cultivo fresco. 3. Llevamos ambos frascos a la cámara de temperatura constante.
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Fecha de liberación P2: 21 de febrero de 2018 1. Al transcurrir una semana después de las cruzas se liberaron los progenitores 2 de la cruza monohíbrida (directa y recíproca). 2. Inicialmente en un frasco se agregó éter a la gasa con un gotero y se tapó para conservar los vapores. 3. Se golpeó suavemente el frasco, con el fin de que las moscas bajaran y entorpecieran. 4. Se vaciaron al frasco con ayuda del embudo y se le colocó nuevamente la gasa con éter. 5. Se dejó transcurrir un tiempo de aproximadamente 20 segundos, hasta que las moscas quedaron dormidas. 6. Finalmente se colocaron en aceite. 7. Los frascos con medio de cultivo ya tenían huevos y pupas de mosca y se devolvieron a la cámara con temperatura de 25º c.
Fecha de evaluación F2: 28 de febrero de 2018 1. Cuando emergieron todas las moscas en los cultivos procedimos a evaluar resultados. 2. En un frasco se agregó éter a la gasa con un gotero y se tapó para conservar los vapores. 3. Se vaciaron las moscas del medio de cultivo de la cruza recíproca al frasco con la ayuda de un embudo, las moscas se quedan dormidas en un lapso de aproximadamente 15 a 20 segundos. 4. A continuación, se colocaron las moscas ya dormidas sobre una platina de acrílico 5. Se colocaron la platina de acrílico en el microscopio estereoscopio y procedimos a su evaluación, nos apoyamos con un pincel y una aguja de disección para obtener un mejor manejo de las moscas. 6. Evaluamos resultados, contamos y anotamos el número de hembras y de machos y el fenotipo que presentaron. 7. Se hizo el mismo procedimiento tanto en la cruza directa como en la cruza recíproca.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN Cruza Monohíbrida Cepas de Drosophila melanogaster utilizadas:
Normal o Silvestre (E): Cuerpo color ámbar Ebony (e): Cuerpo color negro Fechas de apareamiento: 31 de enero de 2018
Cruza Directa: P1
x
Silvestre EE (Ámbar)
Cruza Recíproca: P1
Ebony
ee (Oscura)
x
ee (Oscura)
Ebony
Silvestre EE (Ámbar)
Fecha de liberación P1: 07 de febrero de 2018 Fecha de evaluación de F1: 14 de febrero de 2018 F1 Clases Fenotípicas Silvestre (cuerpo ámbar) Total =
Monohíbrida Directa Número de individuos 5 5
Monohíbrida Recíproca Número de individuos 5 5
10
10
En la cruza directa, como en la recíproca, obtuvimos un gran número total de individuos (los cuales no se contaron) pero finalmente, solo escogimos 5 machos y 5 hembras del total, todos de color de cuerpo ámbar. Los 5 machos y 5 hembras fueron seleccionados e introducidos en su respectivo frasco, uno para cru za directa y oro para cruza recíproca. Teniendo un total de 10 individuos color ámbar en cada frasco.
P2
F 1 x F1
Fecha de cruzamiento: 14 de febrero de 2018 Fecha de liberación P2: 21 de febrero de 2018 Fecha de liberación de F 2: 28 de febrero de 2018 11
F2 Monohíbrida Directa
Monohíbrida Recíproca Clases Fenotípicas Número de Individuos Número de Individuos Silvestre (cuerpo 103 127 ámbar) Ebony (cuerpo 25 32 negro) Total = 128 159
Al cruzar nuestros individuos resultantes en la F1, obtuvimos la generación F2. En la cruza directa obtuvimos 103 moscas de cuerpo ámbar y 25 de cuerpo negro, en total: 128 Dividiendo nuestro total entre 4, significa que esper ábamos 32 de cuerpo negro, (1/4 del total) y al multiplicar 32 por 3, significa que esperábamos 96 de cuerpo ámbar (3/4 del total). En el cuadro se observa que nuestros resultados son muy aproximados a los esperados. Por otro lado, en la cruza recíproca obtuvimos 127 moscas de cuerpo ámbar y 32 de cuerpo negro, en total: 159. Dividiendo nuestro total entre 4, significa que esperábamos 39.75 de cuerpo negro, (1/4 del total) y al multiplicar 39.75 por 3, significa que esperábamos 119.25 de cuerpo ámbar (3/4 del total). En el cuadro se observa que nuestros resultados son muy aproximados a los esperados.
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FOTOS
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Prueba de ji cuadrada (chi cuadrada) El estadístico ji-cuadrado (o chi cuadrado), que tiene distribución de probabilidad del mismo nombre, sirve para someter a prueba hipótesis referidas a distribuciones de frecuencias. En términos generales, esta prueba contrasta frecuencias observadas con las frecuencias esperadas de acuerdo con la hipótesis nula.
Formula general Cuadro 1.1 Individuos resultantes de la Cruza Monohíbrida Directa Cruza Monohíbrida Directa Esperadas 96 Total 128
Ámbar Obtenidas 103
Esperadas 32
Oscura Obtenidas 25
Cuadro 1.2 Individuos resultantes de la Cruza Monohíbrida Recíproca Cruza Monohíbrida Recíproca Esperadas 119.25 Total 159
mbar Obtenidas 127
Esperadas 39.75
Oscura Obtenidas 32
Cuadro 1.3 Prueba de ji cuadrada en cruza Monohíbrida Directa Fenotipos Ámbar Oscura
Prop. 3/4 1/4 Total
O 103 25
E 96 32
O-E 7 -7
(0-E)2 49 49 X2=
(O-E)2 /E 0.51 1.53 2.04
O= Número de individuos observados E= Número individuos esperados
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Cuadro 1.4 Prueba de ji cuadrada en cruza Monohíbrida Recíproca Fenotipos Ámbar Oscura
Prop. 3/4 1/4 Total
O 127 32 159
E 119.25 39.75
O-E 7.75 -7.75
(0-E)2 60.06 60.06 X2=
(O-E)2 /E 0.50 1.51 2.01
O= Número de individuos observados E= Número individuos esperados
En nuestro experimento, de la cruza Monohíbrida, analizando con la prueba de ji cuadrada, obtuvimos un valor de: Directa = 2.04 Reciproca = 2.01 Grado de libertad = 1 Alfa = 0.05 Valor tabulado =3.841 “Si x2 (valor calculado) > x2 (tabla 0.05) = Hay diferencia significativa ” “Si x2 (valor calculado) < x2 (tabla 0.05) = No hay diferencia significativa ”
Por lo tanto: Si comparamos los resultados obtenidos con los de la tabla podemos observar que es menor al tabulado así que podemos decir que se acepta la hipótesis en ambas cruzas (directa y reciproca).
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CONCLUSIONES En un experimento, Mendel cruzó variedades altas y variedades enanas de chicharos. Toda la descendencia de la primera generación, es decir F1 (Primera generación filial) consistió en plantas altas. En nuestro experimento con Drosophila melanogaster obtuvimos en la primera generación, moscas 100% color ámbar. Confirmando el principio de dominancia y con ello aceptando nuestra hipótesis referente a este. Hablando de los experimentos de Mendel, cuando las plantas altas hibridas se autofecundaron y se clasificó la descendencia (segunda generación filial: F2), algunas plantas fueron altas y otras enanas. La clasificación cuidadosa de las plantas mostró que cuando se consideraron grandes números, cerca de ¾ eran altas y ¼ eran enanas. Para ser exactos, una F2 de 1064 consistió en 787 plantas altas y 277 plantas enanas, una proporción casi perfecta de 3:1. Un hecho importante de los resultados de Mendel fue que todas las plantas de la descendencia F1 exhibieron todos los caracteres expresados en una de las plantas parentales, el carácter expresado en la otra planta parental no apareció en la F1, pero reaparecía en la F2. En genética se le denomina carácter dominante al que aparece en la primera generación, y carácter recesivo al que permanece oculto. En base a nuestros resultados presentados anteriormente, en ambas cruzas (directa y recíproca) no hay diferencia significativa, y se acepta nuestra segunda hipótesis (el carácter oculto -en este caso color negro- reaparece o vuelve a manifestarse, presentándose una característica en una proporción de ¾ color ámbar y ¼ color oscuro) puesto que el valor que obtuvimos es menor al presentado en la tabla. Y la proporción es en un 99% de exactitud de ¾ a ¼.
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BIBLIOGRAFÍAS
Gardner, E. J. 1980. Principios de Genética. Quinta edición, editorial Limusa, México.
Demerec, M, and B.P. Kaufman 1962. Introducción a la genética citología de Drosophila Melanogaster . Comisión nacional de energía nuclear. Mexico.p.44.
https://es.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster
https://ciencia.nasa.gov/science-at-nasa/2004/03feb_fruitfly
http://www.efn.uncor.edu/departamentos/divbioeco/anatocom/Biologia/Gene tica/sexo.htm
https://www.medwave.cl/link.cgi/Medwave/Series/MBE04/5266
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