FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
CINÉTICA ENZIMÁTICA EN ZIMÁTICA DE LA FOSFATASA FOSFATASA ALCALINA ALCALINA .
Casas Hernández María Fernanda; Hernández Pando Daniel Alejandro; Lagar Quinto Frida; López Huerta Eric Departa!ento de "io#uí!ica E$peri!ental; %rupo &; E#uipo' &( ) de a*ril de +,-.
Resumen En est esta prác prácti tica ca se det determi ermina narron las cons consta tant ntes es ciné cinéti tica cas, s, Km y Vmax Vmax,, de la enzima fosfatasa alcalina, para la reacción de desfosfori desfosforilació lación, n, manteniendo manteniendo constante constante la conc oncentraci ación de enzi nzima, el pH y la temperatura previamente determinados para
tene tenerr condi condici cion ones es ópti óptima mas s de reac reacci ción ón.. También También se aadió un in!ibidor "#olibdato de $odio% $odio% y se determ determina inaron ron las consta constante ntes s cinéticas apare arente ntes par para as& poder determinar el tipo de in!ibición.
1. Int Introdu rodu !" !"n n
catalizada por una enzima, sólo a concentraciones baas del o los sustratos se obtiene una reacción de se*undo orden. ) conc concen enttraci racion ones es alta altas s de sust sustra rato to la velocidad es independiente de la concentración de sustrato, debido a 'ue no !ay más enzima 'ue lleve a cabo la reacción. -a reac reacci ción ón a conc concent entra raci cion ones es alta altas s de sustrato se llama reacción de orden cero y también se representa como una l&nea recta, pero con pendiente casi i*ual a cero.
El térmi término no cinéti cinética ca enzimá enzimátic tica a impli implica ca el estu estudi dio o de la velo veloci cida dad d de una una reac reacci ción ón catalizada por una enzima y los efectos 'ue pued pueden en tene tenerr vari varios os fact factor ores es como como los los in!ibidores. (no de los principales estudios 'ue se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concen concentra tració ción n de enzim enzima, a, el pH, la fuerz fuerza a iónica del medio, la temperatura, entre otros. Tanto en una reacci reacción ón catali catalizad zada a por una enzima como en una reacción 'u&mica, se espera 'ue la velocidad de la reacción de conver conversió sión n de sustra sustratos tos a produc productos tos,, sea directamente proporcional a la concentración de los los reac reacta tant ntes es 'ue 'ue part partic icip ipan an en la reacción, es decir si se duplica la concentración de cual'uiera de los sustratos la velo veloci cida dad d de la reac reacci ción ón tamb tambié ién n se duplica. ) una reacción as& se denomina reacción de se*und se*undo o orden orden y se repres represent enta a como como una l&nea recta con pendiente positiva y diferente de cero. ero. +ero ero en una una reacc eacciión 'ue 'ue es
En resumen, en una reacción catalizada por una enzima la variación en la concentración del del o los los sust sustra rato tos s pres presen enta ta dife difere rent ntes es órdenes de reacción. +ara un *ran nmero de enzi enzima mas s la *ráf *ráfic ica a 'ue 'ue se prod produc uce e se pued puede e desc descri ribi birr medi median ante te la expr expres esió ión n matemá matemátic tica a de una !ipérb !ipérbola ola rectan rectan*ul *ular ar.. /omo en cual'uier expresión matemática se expr expres esan an en ella ella la rela relaci ción ón entr entre e las vari variabl ables es unt unto o a 0 o más más cons consta tant ntes es.. El trab traba ao o pion pioner ero o de #ic! #ic!ae aeli lis s y #ent #enten en y 1rin 1rin** **s s y Hald Haldan ane e llev llevó ó a desc descri ribi birr la ecuación de la !ipérbola rectan*ular, a!ora cono conoci cida da como como ecua ecuaci ción ón de #ic! #ic!ael aelis is22 #ent #enten en,, con con ella ella es posi posibl ble e prede predeci cirr el comportamiento de la enzima en condiciones
experimentales diferentes. Entonces, la ecuación se describe as&, las dos variables de la ecuación son la velocidad "v% y la concentración de sustrato "s%. #ientras 'ue las dos constantes son la Km y la Vmax. -a Km es llamada la constante de #ic!aelis2 #enten. El valor de Km de una enzima para un sustrato espec&fico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. -a Vmax es la velocidad teórica máxima de una reacción. ) concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se lle*a a ésta. -os valores de Km y Vmax son caracter&sticos de una enzima, aun'ue dependen de las condiciones en las 'ue se llevó a cabo la reacción, ya 'ue !ay 'ue recordar 'ue la enzima es una prote&na 'ue responde modificando su estructura y car*a eléctrica cuando los componentes de la solución cambian. (na manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima también llamados parámetros cinéticos de una enzima, es *raficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la desventaa de 'ue se *rafica una curva y no una l&nea recta por lo 'ue la interpolación es dif&cil. 3tra manera, es la de utilizar al*una de las expresiones matemáticas 'ue producen una l&nea recta como son la de Eadie2Hosftie, la de Hanes o la más popular la de -inea4eaver21ur5. -as formas lineales de la ecuación de #ic!aelis2#enten son expresiones matemáticas simples y aun'ue cada una tiene sus problemas de interpretación son tiles para obtener los valores de Km y Vmax. (na de las formas de re*ulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas 'ue disminuyen su velocidad de reacción, in!ibidores. -os in!ibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos 'ue se utilizan como !erramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas. #uc!os compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o
!erbicidas son in!ibidores de enzimas 'ue son responsables de reacciones vitales para la célula. -a interacción de un in!ibidor y la enzima no es siempre la misma, ya 'ue depende de la naturaleza 'u&mica del in!ibidor, as& como de la reacción 'u&mica 'ue cataliza la enzima. +ara dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del in!ibidor en las constantes cinéticas de la enzima. 6n!ibidores competitivos. $on moléculas 'ue tienen una similitud estructural y 'u&mica al sustrato de la enzima. 7ebido a lo anterior el in!ibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. +ero como el in!ibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el in!ibidor a producto. El in!ibidor simplemente blo'uea el sitio activo, por re*la no es posible 'ue tanto el in!ibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. $i se adiciona más sustrato y el in!ibidor es reversible, el aumento en la concentración de sustrato reduce la in!ibición. El in!ibidor afecta exclusivamente el valor de la Km de la reacción catalizada por la enzima. 6n!ibidor no competitivo. El in!ibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio aleado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. (n in!ibidor no competitivo puro es a'uel en el 'ue sólo se altera la capacidad de unir al sustrato. -a mayor parte de los in!ibidores son in!ibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. 7ebido a lo anterior, los in!ibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km de la enzima. 6n!ibidor acompetitivo. Es un in!ibidor 'ue no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al compleo Enzima2$ustrato. -o anterior puede deberse a 'ue la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el in!ibidor, en el o fuera del sitio activo. (na vez 'ue el in!ibidor se une la enzima se previene la formación de producto.
El in!ibidor acompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima. $in embar*o, a diferencia de la *ráfica 'ue se produce con un in!ibidor de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de in!ibidor son paralelas en este ltimo. El #olibdato de $odio "8a 9#o3:;9H93%. El ión #olibdato unto con el vanadato son
potentes in!ibidores frecuentemente utilizados en la caracterización de
>:? 1ozzo et al , 9@@9.% =eneralmente, los metales pesados disminuyen la actividad por'ue desestabilizan la conformación nativa o desactivan los residuos del centro activo.$in embar*o pocos metales se !an identificado como activadores enzimáticos.
#. M$ter!$%es & M'todos
Preparar cur/a patrón
Leer a 0-1 n!
%ra2car
Preparar seg3n ta*la
Leer a 0-1 n!
4*tener el tie!po ópti!o
5na /ez 2jado el tie!po( pro*ar con distintos pH
Medir a 0-1 n!
4*tener el pH ópti!o en el #ue opera la enzi!a
Prepara ensa6os para encontrar la te!peratura ópti!a
Con los pará!etros ópti!os de pH( tie!po 6 te!peratura prepara ensa6o para /er el e7ecto del sustrato
Por 3tli!o adicionar in8i*idor a di7erentes concentraciones de sustrato
leer a 0-1 n!
leer a 0-1 n!
leer a 0-1 n!
4*tener te!peratura ópti!a a un ti!epo 6 pH especí2cos
%ra2cár e7ecto del sustrato
4*tener constantes 6 tipo de in8i*ición
Resu%t$dos( Determinación de t, T y pH
)r$*!$ 1A /urva patrón del producto 'ue se formará en las pruebas posteriores
Cur+$ ,$tr"n de ,-n!tro*eno%
)r$*!$ A 7eterminación de pH óptimo para la enzima con diferentes amorti*uadores.
,)
E*eto de ,2 so3re %$ +e%o!d$d ,
,.
Abssorbencia
,0
79$: ; .<)-0&$ = , >? ; -
, ,
,+
Velocidad (M/min)
,
, ,
, , , , , , , ,
,
Concentración p-nitrofenol
.
@
)
<
-,
--
pH
Los a!ortiguadores usados 7ueron >B pH @<; %licina pH <-,0; car*onatos pH -,0--1 El pH ópti!o resultó ser el correspondiente a glicina pH'
)r$*!$
#A 7eterminación del tiempo apropiado para realizar pruebas posteriores. ro/reso de %$ re$!on en0!m$t!$
)r$*!$ 4A 7eterminación de la temperatura
,0 79$: ,,-$ = ,, >? ,<@
,&
Absorbencia
óptima de la enzima .
,+ ,, ,
1 -, -1 +, +1 &
Tiempo (min) $e tomaron 9@ min como tiempo adecuado ya 'ue después de dic!o tiempo se empieza a observar la tendencia de la a bsorbencia a volverse constante.
-+
E*eto de %$ tem,er$tur$ , ,
Velocidad (M/min)
, , , +@, +), +<, & ,, &-, &+
Temperatura ( La /elocidad dis!inu6e despus al superar los &@C 9&-,G:( por lo cual se decidió #ue sta es la te! eratura ó ti!a
Determinación de Km y Vmax =raficando la velocidad contra la concentración de sustrato se obtiene una *ráfica de tipo #ic!aeliana cuya función se describe mediante la ecuaciónA V =
Vmax∗S S + Km
)r$*!$ 5A Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad. Bepresentacion de #ic!aelis2#enten , , ,
Velocidad (M/min)
, , , , ,
,
,
,
,
,
,
,
Sustrato (M) La /elocidad au!enta con7or!e au!enta la concentración de sustrato pero 8asta cierto punto cuando la /elocidad se e!pieza a !antener constante( indicando el lí!ite de capacidad de la
/on la *ráfica C es dif&cil y poco exacto determinar tanto la Vmax como Km, por esta razón se recurrirá a la representación de -ine4eaver 1ur5 'ue sirve para linealizar la ecuación de #ic!aelis2#enten, 'uedando de la si*uiente manera A Km 1 V
Vmax =
∗1
1 +
S
?
Vmax
+osteriormente podrán calcularse los parámetros Vmax y Km con las si*uientes ecuacionesA Vmax =
1 b
?
Km= b∗ m=
Km Vmax
∗b
+ara calcular 5m y Vmax aparentes se usará el modelo de line4eaver bur5 y para determinar el tipo de in!ibidor del 'ue se trata.
)r$*!$ 6A Bepresentación lineal de la ecuación de #ic!aelis2#enten
)r$*!$ 9A Evaluación del tipo de in!ibidor Representación de ine!ea"er #
utilizado
-+
E*eto de !n8!3!dor
-, )
%/V (min/M)
@,,,,,
.
.,,,,,
0
79$: +.-&$ = 0,@.,00@ 1,,,,, >? ,)
+ ,
79$: +,,, 0,,, .,,, >? , %/S (%/M)
,
0,,,,,
%/V (min/M)
&,,,,, +,,,,,
5sando los /alores o*tenidos de la regresión se o*tu/o #ue !a$
−6
2.14 x 10
MI!in;
−3
Km= 9.28 x 10
7espués de evaluar el in!ibidor se obtuvo lo si*uienteA
)r$*!$ 7A /omparación de la velocidad con y sin in!ibidor
E*eto de !n8!3!dor mo%!3d$to de sod!o , , ,
Velocidad (M/min)
, , , ,
, , , , , , , S (M) Línea naranja' sustrato sin in8i*idor Línea azul' sustrato = in8i*idor( se o!itió una !edición #ue salía de la tendencia e o*ser/a clara dis!inución de la /elocidad de reacción enzi!ática( sin e!*argo es di7ícil deter!inar si se trata de in8i*idor co! etiti/o o
-,,,,, ,
M 1,,,
79$: , >? , %/S (%/M)
1,,,
e eli!inaron puntos de a!*as gra2cas #ue a7ecta*an la correlación lineal de l os datos asi co!o la pendiente con la cual resulta*an /alores de -I!a$ ne ati/os
T$3%$ 1( Evaluación y comparación de Km y Vmax al a*re*ar in!ibidor
Sustr$to >!n8!3!do r m
:9G.@0
m
3
:CC:F
Tem,er$tur$:; 9.0>:9x0@J2 Vmax ap <
b
+e%o!d$d 9,:>CCGx0@J :M=se/<
@I @.@@@>9F0I I
"#min% 9.0C 5m ap "#% 9>G.0C
2@I F.C0:ICE20@ @.@@@0@CG 9.0I9@>E2@F
[email protected]
9.G9>9E2@F
[email protected]
G.@:CGFE2@F
G0F.0C
0.>00E2@F
G9G.0C
:.CC0IE2@>
Vm$? :M=m!n< @m :M<
Sustr$to s!n !n8!3!dor :9,GI :@@0I
8o !ubo variación si*nificativa de la Vmax, sin embar*o, parece 'ue Km tuvo LNT$3%$ ; 1=T usados una mayor de )rr!enius. para la Ecuación ( Valores modificación, lo [email protected]:@I9 @.@@GI@F0C: cual indica 'ue 20.I:>I@F @.@@G:0099G podr&a tratarse una 20.CC0CF @.@@G9>FI> de in!ibición de 20.G@@CC @.@@G99:9:I tipo competitiva. 20.:9@FF
@.@@G0:G00
20>.9@C9
@.@@G@>:CGF
+ara el cálculo de la Ener*&a de activación "Ea% se utilizaron los resultados correspondientes a la evaluación del efecto de la temperatura y la ecuación de )rr!enius, la cual se presenta a continuaciónA ln K =
− Ea
1
R
T
+ ln A
7ondeA 5A constante de velocidad de la reacción. )A factor de frecuencia o factor preexponencial. Es un &ndice relacionado con la frecuencia de las colisiones entre las moléculas de reactivos y sus unidades dependerán de las de 5. EaA ener*&a de activación de la reacción, normalmente dada en 5Dmol20 BA constante de los *ases ideales. $i Ea viene dada en 5Dmol20, su valor es F,G00@2G 5Dmol20K TA temperatura, en 5elvin
$e calculó primero la concentración y la cantidad de producto por cada temperatura evaluada, utilizando la curva de calibraciónA
T$3%$ #( /oncentración y cantidad de producto.
$e calculó la velocidad dividiendo la concentración entre 9@ minutos "09@@
Absorbanc Concentrac Cantidad ia ión (M) (mol) ,,-& -,[email protected],. +1100E -, ,-)@ +1<01E,1 .0).+.E ,< ,+,+@<1,&E,1 .<)@1
,
,
,
,
,
,
,
,
-,
Ln G -1 +,
79$: <&&,&& $ = -&+ & >? ,)1
+1
-I
)r$*!$ ( Ecuación de )rr!enius ) partir de la ecuación obtenida con el *ráfico de las temperaturas en las 'ue es activa la enzima se calculó la Ea, 'ue resultó ser de .F 5Dmol.
,
,
T$3%$ 4( Besultados *rupales &'
t(mi n)
%
+,
,
-1
-
+,
.
+,
-1
0
-1
p H
T( C)
&a (K*/mo l)
Vma+ (M/min )
Km (M)
-,( 0 -,( 0 -,( 0 -,( 0 -,( 0 -,( 0
01
-11<
01
01
&0.,& @ @(@)E= ,,0.
&@
-@(@0
,,,,0 ) -(.,E ,& <(+)E ,& -(,.E ,0 ,(&&
01
+<(,@< .<
+(&&E ,& 1(@@E ,. +(-
&@J
@(&,E ,&
Vma+ ap (M/min ) &(<@E ,& -(1.E ,. +(1,E= ,. 0(1
+ara todos los e'uipos resultó ser una in!ibición competitiva.
ANALISIS DE RESULTADOS( -as condiciones ideales de temperatura y pH 'ue se determinaron desde el inicio eran fundamentales para obtener resultados confiables en los parámetros Km y Vmax y 'ue de esa forma ase*urábamos un óptimo rendimiento de la enzima. -as temperatura ideal a las 'ue se llevó a cabo el experimento coincide con la del cuerpo !umano "GL/% 'ue es donde se encuentra presente esta enzima y como su nombre lo dice, funciona meor a un pH alcalino "0@.:% sin embar*o el medio no puede ser demasiado básico ya 'ue su actividad disminuye como se observa en la *ráfica G. El molibdato de sodio desde un principio se sospec!aba 'ue fuera un in!ibidor competitivo ya 'ue su estructura tiene parecido con el sustrato de la enzima el cual es el ion fosfato, independientemente de la molécula 'ue esté desfosforlandose. )mbos tienen : ox&*enos con estructura tetraédrica y un átomo central.
$m ap (M)
-(+1E ,& &(0,E ,0 -(,.E ,0 +(0@E ,& ,(1+ 1(0,E ,+
-os in!ibidores competitivos tienen la caracter&stica de ser parecidos estructuralmente al sustrato de la enzima, a diferencia de los no competitivos, los cuales se unen de manera covalente al sitio activo de la enzima, sin necesidad de competir por éste? un in!ibidor de este tipo provocar&a una disminución en la velocidad máxima de la enzima ya 'ue ser&an menos la enzimas disponibles para catalizar la reacción.
ANALISIS )RUALES
DE
RESULTADOS
) partir de los datos *rupales es posible observar 'ue !ubo coincidencia entre los parámetros esco*idos por los e'uipos en cuando a tiempo, temperatura y pH, lo cual es indicativo de 'ue los resultados deb&an variar poco. En efecto, si bien los valores numéricos no son los mismos debido a la variación 'ue el mismo experimentador causa, los valores de la Vmax, la Vmax ap, la Km y la Km ap están dentro del mismo orden de ma*nitud por lo 'ue no !ay tanta variación. E el cálculo de la Ea, los valore obtenidos var&an más, sin embar*o, esto puede venir del mismo proceso
experimental o de la forma en 'ue se calculó este parámetro. )l final de la práctica, todos los e'uipos concluyeron en 'ue no !ay diferencia si*nificativa entre las Vmax y Vmax ap y si la !ay entre Km y Km ap, por lo 'ue se trata de una in!ibición competitiva.
REFERENCIAS( •
•
CONCLUSIONES( ) pesar de pe'ueas variaciones obtenidas por otros e'uipos, podemos concluir 'ue el in!ibidor molibdato de sodio es un in!ibidor de tipo competitivo.
•
#d!ealt!.com"9@0C% Lactate Dehydrogenase (LDH) Bevisado el G de octubre de 9@0C M(B-A !ttpA444.md2 !ealt!.com-7H.!tmlN $tuart 6ra,
Ginga Ducz!al( MaKgorzata Darosa( Ea D >acz6nsa( pectral 9DFB>( FB> and 5: si!ilarities and diNerences *eteen su*strate 9p6ru/ate: and in8i*itor 9o$a!ate: o7 lactic de86drogenase 9LDH:( +,,0
