Practica#9 y #10 ”Espectro del DNA” y “Determinación del punto de fusión” Objetivos -Obtener un espectro de barrido en la región UV que demuestre la longitud de onda máxima en la absorción -Determinar el punto de fusión del DNA mediante un estudio estudi o espectrofotométrico -realizar un perfil de desnaturalización térmica del DNA con el fin de determinar su punto de fusión (Tm)
Introducción
La gráfica que representa la medida de A 260 en función de la temperatura se llama curva de fusión del DNA (Figura inferior). Esta curva presenta las siguientes características: cara cterísticas:
1.- La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por encima de las fisiológicas. En este intervalo, la molécula está en forma de doble hebra. 2.- El aumento de A 260 tiene lugar en un estrecho rango de temperaturas (6-8 ºC). La A 260 empieza a aumentar cuando comienzan a romperse las uniones entre las bases en varios segmentos de la molécula. El número de PB que se rompen aumenta con la temperatura, y con ella la A 260. Al final del tramo ascendente, las dos hebras se mantienen juntas por unos cuantos PB. 3.- La A260 máxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y corresponde al estado en que las dos hebras están completamente separadas. separadas .
Un parámetro muy útil para caracterizar la evolución de la fusión es la temperatura a la que el aumento de la A 260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusión (T m). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C (Figura de la derecha). Como el par de bases G-C está unido por tres puentes de hidrógeno (a diferencia del par A-T que sólo presenta 2) se requiere una temperatura más alta para desnaturalizarlo.
La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes de hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida) se produce la separación de las hebras. Este fenomeno se debe a que en agua muy pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato no es contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na +, Mg+2).
Desarrollo experimental
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Una muestra del DNA aislado y disuelto en solución salina, se diluye de tal manera que se obtenga un D.O. entre 0.8 y 1.0.
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Calentar la solución en un tubo en un baño maria, tomando las lecturas del espectrofotomentro a 260nm.Se toma como temperatura inicial la ambiente y después calentar a las temperaturas indicadas en la tabla siguiente.
Temperatura (C°) Ambiente 50 55 60 65 70 75 80 85 90
D.O. (260nm)
Resultados Para la determinación del punto de fusión del DNA tomamos una muestra de DNA comercial (timo de ternera de la marca Fluka) lo disolvimos en una solución salina y la diluimos de tal manera que se pudiera obtener una D.O entre 0.8 y 1.0.ya obteniendo este D.O. empezamos a calentar la muestra según la tabla y asi obtuvimos los siguientes resultados:
Temperatura (C°)
D.O. (260nm) 0.1522 0.3866 0.4163 0.448 0.502 0.6222 0.7340 0.8022 0.8598 0.86
50 55 60 65 70 75 80 85 90
1 0.9 0.8 0.7 0.6
. O . 0.5 D
0.4 0.3 0.2 0.1 0 50
55
60
65
70
75
80
85
90
Temperatura
Temperatura de Fusión : 85°C Se pudo demostrar como el punto de fusión del DNA esta entre los 85 a 90°C donde las cadenas de DNA se separan completamente, esta temperatura de fusión es bastante alta debido a las uniones guanina citosina que hay en la cadena de DNA comercial de timo de ternera que utilizamos.
Cuestionarios Practica 9 Explicar el fundamento de absorción a 260nm (espectro de absorción de cada una de las bases nitrogenadas).
El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a niv a esa longitud de onda la doble helice absorve la luz UV
Aplicación de las propiedades de absorción de energía en UV La absorción de radiación ultravioleta o visible provoca la excitación de los electrones de enlace y, en consecuencia, los picos de absorción pueden relacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies en estudio. La espectroscopia UV es, por tanto, valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una molécula.
¿A qué se le conoce como efecto hipercromico? Cuando se aumenta la temperatura o se disminuye la concentración salina, la estructura de doble hélice del ADN se separa, a lo que se le llama desnaturalización de la molécula de ADN y por lo tanto hay un incremento en la densidad óptica de las bases purínicas y pirimidínicas, a lo que se le llama efecto hipercrómico por desnaturalización de los ácidos nucleicos.
Practica 10 Breve introducción sobre la composición química del DNA
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un polímero de alto peso molecular formado por dos cadenas o hebras de monómeros llamados nucleótidos. Cada nucleótido está conformado por moléculas más pequeñas: una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina o timina), un hidrato de carbono (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Los cuatro tipos de nucleótidos difieren solamente en el tipo de base nitrogenada, las cuales pueden ser púricas (adenina o guanina) o pirimídicas (citosina o timina). Se les llama púricas o pirimídicas porque derivan de moléculas llamadas purina o pirimidina.
Explicacion sobre la estructura del DNA en procariotas y eucariotas La región nuclear de una célula procariota difiere significativamente de la de una célula eucariota. el área nuclear, denominada nucleoide, de una célula bacteriana tiene una única molécula larga y circular de DNA doble, el cromosoma bacteriano, que contiene todas las informaciones necesarias para el funcionamiento y estructuración celular. El cromosoma procariótico está ligado a la membrana plasmática, no contiene histonas, y no se encontra rodeado por una membrana nuclear. Las bacterias pueden contener además del cromosoma, moléculas de DNA doble pequeñas y circulares, denominadas plásmidos. Esas moléculas son elementos genéticos extracromosómicos, no esencialess para la supervivencia bacteriana, y poseen mecanismos
de
replicación independentes
del
DNA cromosómico. La ventaja de poseer un plásmido es que puede contener resistencia
genes
de
a
los
antibióticos, tolerancia a los metales tóxicos, síntesis de enzimas, etc. Estructura “B” del DNA (Watson y Crick)
Desnaturalización del DNA La doble hélice puede desespiralizarse in vitro mediante calor, pH extremos y otras condiciones (urea, … ) en un proceso denominado fusión. Se puede calcular su punto de fusion, que es característico y dependiente de la proporción A/T versus G/C, debido al hecho que hay sólo dos puentes de hidrógeno en la unión A/T, y tres en la G/C, unión más estable. Con la desnaturalización, las propiedades físicas del ADN cambian; por ejemplo, hay un efecto hipercrómico ya que la absorción de la luz a 260 nm es mayor en el ADN desnaturalizado que en el ADN bicatenario. La abosrción de la luz también varía con la proporción A/T vs G/C y es mayor en secuencias ricas en A/T que en secuencias ricas en G/C. La desnaturalización del ADN es importante porque: 1- permite medir el contenido A/T vs G/C; 2- es la base de las técnicas de hibridación Explicar la utilidad de Tm de diferentes organismos (relacionados con diferentes aspectos evolutivos) Según la rama de la familia de la especie q se encuentra tienen puntos de fusión muy cercanos debido al porcentaje de similitud que tienen las bases nitrogenadas de la especie. Por ejemplo, el punto de fusión del DNA del humano es de 85°C y la del chimpancé también, esto es debido a que tienen un 98% de DNA igual.
Temperatura de fusión hipercromicidad ¿es posible determinar el tipo de organismos desde el Punto de vista evolutivo conociendo la temperatura de fusión del DNA? Un parámetro muy útil para caracterizar la evolución de la fusión es la temperatura a la que el aumento de la A 260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusión (T m). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C Como el par de bases G-C está unido por tres puentes de hidrógeno (a diferencia del par A-T que sólo presenta 2) se requiere una temperatura más alta para desnaturalizarlo.
Aplicaciones prácticas del punto de fusión del DNA Entre las aplicaciones prácticas de desnaturalización las técnicas de hibridación son muy conocidas y utilizadas. La hibridación consiste en, partiendo de ADN desnaturalizado, renaturalizar con ADN procedente de otro organismo, con lo que es posible estudiar el grado de semejanza entre los ADN ya que solo se produce emparejamiento en los tramos en los que las secuencias sean complementarias. Este método tiene interés en investigaciones policiales, estudios filogenéticos, también forma parte de las técnicas de manipulación del genoma
Bibliografia www.ucm.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.htm www.adn.es/etiqueta/espectro/
Universidad La Salle. Facultad de Ciencias Químicas.
Laboratorio de Bioquímica del metabolismo.
Práctica 9, 10
”Espectro del DNA” y “Determinación del punto de fusión”
Equipo No. 6 Integrantes. Higuera González Catalina Iraís. López Casique Haydeé Dafne. Solorio G. Diana Lizbeth.
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Dr. José D. Méndez
Calificación
