POTENCIA MICROBIOLÓGICA DE AMPICILINA SÓDICA. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Potencia microbiologica de ampicilina (generico)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO

TÍTULO DEL PROYECTO:
POTENCIA MICROBIOLÓGICA DE AMPICILINA SÓDICA

Equipo 8
Aguilar Flores María Magdalena
Ecatl Toxqui Jesús
Hernández Hernández Maricruz

Asesor: M. en F. Idalia Leticia Flores Gómez

Semestre 2017-1
TÍTULO DEL PROYECTO: POTENCIA MICROBIOLÓGICA DE AMPICILINA SÓDICA
I. FUNDAMENTACIÓN
*Antibióticos
Los agentes antibacterianos indicados para uso clínico son agentes que destruyen selectivamente bacterias al interferir con el crecimiento bacteriano o la supervivencia. La inhibición del crecimiento y pérdida completa de viabilidad de las bacterias, es a menudo el resultado de una serie de eventos provocados por el tratamiento con un agente antibacteriano, cuyo modo de acción por lo general implica más de un solo objetivo.
En general, los mecanismos de acción están asociados con ruptura de la doble hélice del ADN, con la inhibición de síntesis de ARN dependiente de ADN, cambios energético celular, y con alteraciones de su metabolismo central, entre otros.
Hay evidencia creciente de que ciertos antibióticos ejercen su efecto no sólo por matar o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas, también indirectamente por la inmunomodulación.
Los agentes antibacterianos se utilizan para el tratamiento o la prevención de infecciones bacterianas. Entre los agentes antibacterianos existentes, los antibióticos se definen como compuestos que son producidos por organismos vivos, se derivan de bacterias, hongos, moho, plantas, y fuentes animales; se utilizan para tratar las infecciones bacterianas; y son una de las clases de fármacos con mayor venta en todo el mundo.
Aunque hay varios esquemas de clasificación para los antibióticos, a partir de su origen, tipo de actividad, modo de acción bactericida o bacteriostático (los antibióticos que matan las bacterias se llaman "bactericidas", mientras que los antibióticos que detienen el crecimiento de las bacterias se llaman "bacteriostáticos"); espectro de acción (amplio o bajo); el grupo microbiano contra el que actúa (antibacteriano, antimicótico, antiprotozooario); la vía de administración (inyectable, oral, tópica), etc.
También hay diferentes clasificaciones de antibióticos por familias, que han sido propuestas basadas en estructura química, tales como lactonas macrocíclicas, hidratos de carbono, heterociclos que contienen N y O, compuestos que tienen un esqueleto aromático, y aquellos que presentan una cadena alifática.
Probablemente la clasificación de antibióticos más aceptada, basada en su estructura química es:

ELABORADO POR:
Maricruz Hernández
Hernández
REVISADO POR:
Jesús Ecatl Toxqui
María Magdalena
Aguilar Flores
Vo. Bo. ASESOR
M. en F. Idalia Leticia
Flores Gómez
HOJA 1 DE 13


β-lactámicos
Tetraciclinas
Macrólidos y Lincomicinas
Aminoglucósidos Glucopéptidos
Estreptograminas
La mayoría de los antibióticos son de origen natural y también son derivados semisintéticos, o compuestos sintéticos que imitan la estructura de los productos naturales. Incluso después del descubrimiento de la penicilina hace aproximadamente 80 años, la búsqueda de nuevos antibióticos aún continúa. Hoy en día, aproximadamente 16 500 antibióticos eficaces han sido descritos. Aproximadamente 100 de ellos han sido aprobados y cuentan con aplicaciones médicas. Más de 20 nuevas clases de antibióticos fueron producidos entre la década de 1930 y 1960, pero sólo cuatro de ellos fueron comercializados. Estas cuatro clases de antibióticos son:
β-lactámicos, tetraciclinas, macrólidos y aminoglucósidos. Los principales microorganismos productores de antibióticos son las Actinobacterias, en especial, las especies de Streptomyces, hongos y otras bacterias filamentosas, que todavía representan fuentes inagotables para los nuevos antibióticos en el futuro.
*Mecanismos de acción. De acuerdo al mecanismo de acción que presentan los antibióticos, se clasifican en siete grandes grupos:
Tabla 1. Mecanismo de acción de antibióticos
Mecanismo de acción
Ejemplos
Inhibición de la síntesis de la pared celular
Penicilinas, cefalosporinas, vancomicina, bacitracina, oxacilina, nafcilina
Daño a la membrana plasmática
Polimixina, nistatina, anfotericina B
Inhibición de la síntesis de proteínas
Aminoglucósidos, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina
Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
Rifamicina, actinomicina D, ácido nalidíxico, ciprofloxacino, norfloxacino
Antimetabolitos
Trimetoprim, sulfonamidas
Inhibidores de betalactamasas
Sulbactam, clavulanato, tazobactam
Antifímicos
Etambutol, pirazinamida, isoniazida, estreptomicina, rifampicina

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Maricruz Hernández
Hernández
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María Magdalena
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HOJA 2 DE 13
TÍTULO DEL PROYECTO: POTENCIA MICROBIOLÓGICA
*Ampicilina
La ampicilina es una penicilina semisintética que tiene un espectro más amplio que la bencilpenicilina frente a las especies gramnegativas tales como H. influenzae, es un derivado del ácido 6- (D(-)α-amino-fenilacetamido)penicilánico. De acción bactericida.

Figura 1. Estructura de ampicilina

Cuyo mecanismo de acción es inhibir la síntesis de la pared celular. Actúa a distintos niveles de la biosíntesis del peptidoglucano. Actúa inhibiendo la última etapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas específicas llamadas PBPs localizadas en la pared celular. Impide que la pared se construya correctamente, que ocasiona la lisis de la bacteria y la muerte.
La ampicilina es bactericida tanto para Gram positivas como para bacterias Gram negativas. Es un polvo de apariencia cristalina, de color blanco y con olor característico de las penicilinas.

*Potencia microbiológica
La potencia de una sustancia antimicrobiana se define como la habilidad específica o capacidad de un producto de lograr su efecto planeado y se basa en la medición de algún atributo del producto, por ejemplo, su efecto inhibitorio frente a un determinado microorganismo (halo de inhibición). La potencia debe ser una propiedad o atributo definible y medible para un producto biológico o semisintético, y debe estar presente en los estudios de estabilidad. La potencia puede ser demostrada mediante el efecto inhibitorio de la sustancia en cuestión cuando es evaluado frente a un microorganismo. En los análisis de potencia, se compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico con el efecto producido por una preparación estándar en las mismas condiciones y para la cual ya se ha determinado exactamente su actividad, obteniendo así un valor de potencia relativo al del estándar de referencia. Si se prueban las muestras en diferentes concentraciones se puede determinar una concentración mínima inhibitoria.
La potencia o actividad de los antibióticos se calcula comparando el grado de inhibición de microorganismos sensibles y específicos producida por concentraciones conocidas del antibiótico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya actividad se ha definido por un organismo internacional.

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HOJA 3 DE 13
Para valorar microbiológicamente un antibiótico, se pueden emplear dos métodos: Método cilindro-placa (método de difusión en agar) y Método turbidimétrico, ambos comparan la respuesta del microorganismo de prueba, frente a una sustancia de referencia (SRef) de actividad conocida y una muestra tratada con las mismas condiciones.
La potencia de los antibióticos, cualquiera que sea el método seguido para su determinación, se expresa en unidades de actividad. En sentido absoluto, una unidad equivale a x microgramos de la sustancia pura que inhiben totalmente el desarrollo de un microorganismo dado. Por ejemplo, la unidad tipo de penicilina es la actividad específica contenida en 0.6 microgramos de la sustancia pura contra Staphylococcus aureus y la unidad de estreptomicina es la actividad de 1 microgramo
de la sustancia cristalina contra Escherichia coli. En sentido más general, la unidad puede ser la expresión de una prueba de inhibición, como por ejemplo la cantidad de antibiótico añadido a 1 mL de medio que inhibe el crecimiento de un microorganismo dado, o bien la dilución en tubo o en caja que inhibe completamente a este microorganismo.
*Método 2+2
El diseño de este método emplea 2 niveles de dosis tanto para la muestra como para el patrón de referencia (estándar) del antibiótico en estudio. La proporción entre la dosis alta y la dosis baja es la misma para ambas presentaciones. El método 2+2 se realiza en placas de agar en el que el microorganismo de referencia se siembra masivamente, colocando posteriormente las soluciones de estándar y las muestras en penicilindros desde los que se dan la difusión del antibiótico, tanto el antibiótico de referencia como la muestra se colocan en concentraciones altas y bajas. Cada uno de los cuatro penicilindros que contiene la caja incluye cada una de las cuatro dosis, este diseño se dice es simétrico o balanceado.
El principio de este método es la concentración de dos líneas paralelas, cada una correspondiente a la muestra o al estándar.
Las soluciones de la muestra y las del patrón de referencia tienen la misma potencia nominal. Su diferencia en potencia es revelada por la distancia vertical entre las dos líneas paralelas.
Se basa entonces en la difusión del antibiótico y en el crecimiento del microorganismo que se encuentra inoculado en la placa en la capa semilla por lo que esto provoca la formación de zonas de inhibición o halos de inhibición, cuyo diámetro está relacionado a la concentración del antibiótico.

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Fórmulas para calcular la potencia microbiológica por el método 2+2:
-Diferencia debida a la respuesta
E=12S2+T2-S1+T1
-Diferencia debida a la dosis
F=12T1+T2-S1+S2
-Relación entre las dosis
I=log [ ]mayor – log[ ]menor
-Relación respuesta-dosis
b=EI
-Número de veces de la potencia de la muestra en relación al estándar
μ=antilogFb
-Potencia microbiológica de la muestra
Pmuestra=μ (Pstd)
II. OBJETIVO
Determinar la potencia microbiológica de una muestra de ampicilina sódica (genérico) mediante el método 2+2 en difusión en placa.
Comparar la potencia microbiológica de un antibiótico de patente (ampicilina sódica) con una muestra de un genérico de ampicilina sódica.
Establecer la relación dosis – respuesta en análisis microbiológico por difusión en placa.
III. HIPÓTESIS
La ampicilina sódica que proviene de genérico (muestra) preparada a la misma concentración que la ampicilina de patente, mostrará halos de inhibición semejantes por lo que su potencia microbiológica será muy similar.

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IV. METODOLOGÍA
*Material
Material general
4 Cajas Petri con tapas de porcelana
16 penicilindros
1 Matraz Erlenmeyer de 25 mL
2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 pipeta graduada de 1 mL
1 pipeta graduada de 10 mL
1 probeta graduada de 25 mL
6 perlas de ebullición
1 termómetro de inmersión parcial
10 tubos de 18x150 mm
4 jeringas para insulina
*Equipo
Autoclave
Incubadora
Estufa
Espectrofotómetro

*Reactivos y microorganismo de prueba
Solución salina estéril
Agar no 11 para antibióticos
Micrococcus luteus
*Procedimiento
Usando material limpio se preparó agar del no. 11 y se colocó en tubos de ensayo. Se sometió a esterilización y una vez solidificado el agar se sembró Micrococcus luteus en uno de ellos incubando a 32-35°C. Cada 24 horas se realizaron resiembras hasta el día de la práctica.

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Se lavó material de vidrio. Se esterilizaron las cajas petri con tapa de porcelana y los penicilindros por calor seco en estufa a 170°C por 1h.
Se preparó agar del no. 11 para antibióticos y solución salina isotónica (0.9%).
El material de vidrio, la solución salina y el agar se esterilizaron en autoclave a 15 libras de presión por pulgada cuadrada durante 15 minutos.
Se prepararon 4 soluciones: a concentraciones de 0.06 µg/mL y de 0.12 µg/mL de ampicilina sódica tanto de patente como de genérico.
Con ayuda de la probeta graduada estéril de 25 mL se añadieron 21 mL de agar no. 11 para antibióticos a las cajas Petri que funcionó como agar base; se dejó reposando hasta solidificar.
Se añadieron 2 perlas de ebullición a los 4 últimos tubos de ensayo con las resiembras de Micrococcus luteus además de 3 mL de solución salina estéril.
Se recuperaron los 3 mL vertidos en cada tubo de ensayo en un matraz Erlenmeyer estéril de 25 mL recuperando todo el microorganismo, haciendo una suspensión.
Se ajustó la suspensión de Micrococcus luteus a una transmitancia del 23-27% a una longitud de onda de 580 nm y de ésta se tomaron 0.25 mL y se colocó en un matraz con 90 mL de agar no. 11.
A cada caja Petri se le añadieron 4 mL de ésta suspensión y se dejó solidificar, funcionando como agar semilla o capa siembra.
Se colocaron 4 penicilindros a cada una de las cajas Petri con ayuda de unas pinzas esterilizadas a la flama.
Se llenaron los penicilindros, cada uno con una solución diferente de las preparadas a de ampicilina sódica.
Se incubaron las placas por 40 horas a 32-35° C y se observaron para ver si se habían formado halos de inhibición.

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Cálculos para la preparación de las disoluciones de ampicilina de un estándar (patente) y muestra (genérico).
Pesar 300mg de ampicilina
Concentración= 0.12µg/mL
300mg ampcilina50mL agua2ml100ml1ml100ml=0.00012mg/mL
0.00012mg/mL1000µg1mg=0.12µg/mL

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Concentración= 0.06 µg/mL
300mg ampcilina50mL agua1ml100ml1ml100ml=0.00006mg/mL
0.00006mg/mL1000µg1mg=0.06µg/mL
V. RESULTADOS
Tabla1. Tamaño de halo de inhibición de cada peniclindro

Tamaño de halo de inhibición (mm)

Tamaño de halo de inhibición (mm)
Caja
Std 0.12 µg/mL
Std. 0.06 µg/mL
Caja
Mta 0.12 µg/mL
Mta 0.06 µg/mL
A
17
16
C
18
17
A
21
20
C
21
21
B
14
13
D
16
13
B
16
16
D
15
15
Ỹ
17
16.25
Ỹ
17.5
16.5

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Muestra Muestra EstándarEstándarLog concentración Log concentración Halo de inhibición (mm)Halo de inhibición (mm)
Muestra
Muestra
Estándar
Estándar
Log concentración
Log concentración
Halo de inhibición (mm)
Halo de inhibición (mm)

CALCULOS
S1=16.25 T1=16.5
S2= 17 T2=17.5
E=12S2+T2-S1+T1

E=1217+17.5-16.25+16.5
E= 0.875
F=12T1+T2-S1+S2

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F=1216.5+17.5-16.25+17
F= 0.375
I=log [ ]mayor – log[ ]menor
I=log [0.12] – log[0.06]
I= log 2
b=EI
b=0.875log2
b=2.9067
μ=antilogFb
μ=antilog0.3752.9067
µ=1.346
P= µ*980mcg7mg
P= 1319.08 mcg/mg
Potencia microbiológica del estándar
980 mcg/mg
Potencia microbiológica de la muestra
1319.08 mcg/mg

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VI. ANÁLISIS DE RESULTADOS
La potencia correspondiente de la muestra y del estándar, se puede notar que la muestra es más potente que el estándar, ya que se creyó que iban a tener una misma potencia o que la ampicilina de patente iba a ser un poco más potente que la ampicilina de genérico. Observando la tabla con los datos de la medición de los halos de inhibición, en algunas cajas se notan que los halos miden lo mismo a pesar de que sean de diferentes concentraciones, esto se debe a que la cantidad del M. luteus fue grande o que la concentración del antibiótico menos de lo que se creía; también tiene mucha influencia el que se haya leído en más de 24h
VII. CONCLUSIONES
Se determinó la potencia de la ampicilina (genérico) que es de 1319.08mcg/mg, comparándola con el estándar (patente) es más potente, esto se demuestra en la gráfica observando la relación dosis-respuesta tanto de la muestra como del estándar, donde la línea del estándar se encuentra antes que la de la muestra, notándose que los halos de la muestra fueron un poco más grandes.
VIII. SUGERENCIAS
Medir los halos de inhibición 24 horas posteriores de su incubación debido al alto crecimiento del microorganismo en estudio.
Distribuir la capa siembra sosteniendo la placa en la mano procurando el expandimiento por toda la placa debido a que el típico "número 8" no llega a distribuir la capa siembra alrededor de toda la placa.

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IX. REFERENCIAS BILIOGRAFICAS
Antibióticos y su control mediante el laboratorio. Bryant A.I.M.L.T. Editorial El manual moderno, México 1976, pp 19-20.
Ruben Vardanyan and Victor Hruby. Synthesis of Best-Seller Drugs. Academic Press: USA; 2016.
Brooks F. Microbiología Medica.25ª Edición. México: Editorial Mc Graw Hill;2010.
Tortora G. Microbiology an Introduction. Fifth Edition. Estados Unidos: Editorial Benjamin Cummings; 1995.
Burrows W. Tratado de microbiología. 20ª Edición. México: Editorial Interamericana; 1974.
Murray P., Microbiología Medica. 5ta Edición. Madrid España: Editorial El servier; 1996.

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