Pemeriksaan Penanda Limfosit Metode Immunophenotyping(1).docx

Kepada Yth : Rencana Baca : Waktu/Tempat :

Tutorial Imunologi

PEMERIKSAAN PENANDA LIMFOSIT DENGAN METODE

I MMUNO MMUNOPHE NOTYPING NOTYPING

Eko Putri Rahajeng, Asvin Rahajeng, Asvin Nurulita, Uleng Bahrun Program Studi Ilmua Patologi Klinik FK UNHAS / RSUP dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar

I.

PENDAHULUAN

Semua sel yang berfungsi dalam respon imun diketahui berasal dari sel induk pluripoten yang kemudian berdiferensiasi melalui dua jalur, yaitu jalur limfoid yang akan berperan dalam pembentukan limfosit dan jalur mieloid yang akan berperan dalam pembentukan sel-sel fagosit. Sel-sel imunologi yang yang utama adalah limfosit T dan limfosit B, keduanya dapat dibedakan dari fungsi yang berbeda dan kemampuan dalam mengekspresikan antigen permukaan yang khas untuk masing-masing jenis sel sehingga ada keterkaitan antara antigen permukaan dengan stadium diferensiasi (clusters (clusters

of

differentiation

antigen/

cluster

designation = designation = CD).1 Cluster of differentiation differentiation (CD) adalah molekul permukaan sel yang bertindak sebagai reseptor atau ligan dan dapat diidentifikasi dengan antibodi monoklonal spesifik untuk epitop tunggal antigen (molekul) yang terekspresi pada permukaan sel. Penemuan antibodi monoklonal pada tahun 1980-an membuat masing-masing subset limfosit dapat dibedakan satu dari yang lain karena mengekspresikan petanda permukaan (Cluster ( Cluster of differentiation) differentiation) yang berbeda, sehingga jumlah setiap sub populasi limfosit dapat diketahui dengan menentukan menentukan proporsi petanda permukaan yang diekspresikan oleh masing-masing sub populasi.1,2 Cluster of differentiation differentiation 45 (CD45) adalah protein tyrosine phosphatase yang terdapat pada permukaan semua jenis leukosit (sel limfoid maupun mieloid), Sehingga disebut leucocyte common antigen, antigen, tetapi ekspresinya pada setiap sel berbeda-beda, dengan ekspresi terbesar pada limfosit. CD45 diketahui merupakan molekul yang mengendalikan rangkaian sinyal intraselular dan memegang peranan penting pada reseptor sel T. Sel B mengekspresikan CD45 dengan berat

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping

1

Trusted by over 1 million members

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial Cancel Anytime.







molekul yang paling besar, sedangan timosit mengekspresikan CD45 dengan berat molekul terendah. terendah. Ekspresi isoform CD45 juga tergantung pada aktifitas dan dan stadium diferensiasi. Limfosit T naive mengekspresikan Isoform CD45RA, sedangkan limfosit sel T memori mengekspresikan CD45RO. CD45 berperan dalam proses aktivasi limfosit melalui stimulasi aktivitas kinase p56lck.1,3 Cluster of differentiation dapat differentiation dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi sel melalui proses yang dikenal sebagai immunophenotyping , yaitu teknik mengidentifikasi antigen sel melalui interaksi antara antibodi monoklonal (telah dilekatkan fluorokrom) yang spesifik terhadap antigen di membran atau sitoplasma (intra selular) dari sel tertentu. Teknik yang digunakan untuk imunophenotyping biasanya berupa flow cytometry. Flow cytometry cytometry merupakan teknologi yang secara bersamaan mengukur dan kemudian menganalisis karakteristik fisik suatu partikel (biasanya sel) saat mengalir dalam cairan melalui seberkas cahaya, karakteristik partikel yang dianalisis berdasarkan ukuran sel, struktur intrasel atau granul dan fluoresens.2,4,5 Perkembangan teknologi mutakhir telah memungkinkan identifikasi sel dengan menggunakan alat otomatis yang disebut disebut flowcytometer dan dan cell sorting . Prinsip flow Prinsip flow cytometry dan cytometry dan cell sorting ( flourescence flourescence activated cell sorter sort er , FASC) adalah, mengabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi karakteristik setiap permukaan sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis. Selain itu FASC juga dapat mengukur densitas antigen yang diekspresikan. 1,4 Pada pemeriksaan CD45 menggunakan flow cytometry cytometry dapat melihat ekspresi antigen pada permukaan seluruh sel leukosit dengan tingkat intensitas fluoresensi yang berbeda, tetapi CD45 tidak terekspresi pada eritroid atau sel nonhematologi. Limfosit dapat dengan mudah diidentifikasi dengan intensitas pewarnaan CD45 yang lebih tinggi dari pada monosit dan granulosit. Perbedaan dalam intensitas fluoresensi antara sel dan side dan side scatter properties sehingga properties sehingga CD45 dapat menjadi gating menjadi gating parameter parameter untuk mengidentifikasi leukosit dari linage yang







Gambar 1: Plot CD45 berdasarkan lineage dan lineage dan maturasi sel leukosit (Sumber : Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis.2013) Diagnosis.2013)5

Pada tutorial ini akan diuraikan tentang pemeriksaan sel CD45 menggunakan metode FACS dengan alat Becton Dickinson FACScanto II. Reagen BD FASC BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 digunakan untuk invitro diagnostik

dalam

mengidentifikasi

sel

yang

mengekspresikan

antigen

CD3/CD8/CD45/CD4.

II.

TUJUAN

Tujuan dari tes ini yaitu untuk mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen CD3/CD8/CD45/CD4 dengan metode imunofenotyping menggunakan menggunakan alat Becton Dickinson FACScanto II.

III. METODE 6

A. PRA ANALITIK

1). Persiapan

pasien

:

Pasien

tidak

sedang

menggunakan me nggunakan

obat

imunosupresan. 2). Persiapan sampel : 1. Sampel yang digunakan adalah darah perifer dengan antikoagulan ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA). (EDTA).







2. Darah yang mengandung antikoagulan antikoagulan disimpan pada suhu kamar (20°C – (20°C – 25°C) 25°C) dilakukan staining dilakukan staining dalam dalam 48 jam setelah pengambilan dan kemudian dianalisis dalam 24 jam setelah pewarnaan. 3)

Alat dan bahan : 1. Alat : a. BD Facscanto II b. Tabung BD BD Trucount c. Tabung vakutainer EDTA d. Mikropipet & tip e. Vortex

a

b Gambar 2. Alat yang dibutuhkan (Sumber : Dokumen Pribadi)

2. Bahan : a. Reagen yang trersedia dalam kit 6 Komposisi reagen dalam kit : BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 disediakan dalam 1 mL buffer salin dengan 0.1% sodium azide. BD Multitest mengandung Antibodi CD3 berlabel FITC, clone SK7; antibodi CD8 berlabel PE, clone SK1; abtibodi CD45 berlabel PerCP, clone 2D1 (HLe-1); and antibodi CD4 berlabel APC, clone SK3. Antibodi CD3, CD8, CD45, and CD4 terdiri dari mouse mouse IgG1 heavy chains chains and kappa light







Nilai konsentrasi antibodi dalam tabel di bawah ini: Reagen

Konsentrasi

CD3 FITC

2.3

CD8 PE

1.75

CD45 PerCP

7.50

CD4 APC

0.92

b. Reagen yang tidak tersedia dalam kit : 1.

Reagen lysing solution (100 mL buffer yang mengandung formaldehida <15% dan dietilen glikol <50%) <50%)

B. ANALITIK

a. Prinsip tes Tabung reagen mengandung antibodi berlabel flourokrom terhadap molekul yang akan dideteksi. Ketika darah ditambahkan ke dalam reagen, antibodi berlabel flourokrom dalam reagen mengikat antigen khusus yang ada dipermukaan sel leukosit (Gambar 3).6 CD 45+, CD 3-

CD 45

CD 45-, CD 3 +

CD 3

Gambar 3. Prisinp Kerja Reagen







Saat

melewati

sinar

laser

flurokrom

menyerap

sinar

dan

akan

memancarkan cahaya, cahaya diteruskan melewati suatu filter dan ditangkap oleh detektor (Gambar 4). Sinyal yang ditangkap (memberikan informasi tentang ukuran sel, kompleksitas internal, dan intensitas fluoresensi) akan dianalisis oleh komputer dengan menggunakan software software sehingga data dapat divisualisasikan dalam bentuk histogram maupun dot plot. Setiap sel yang melewati berkas sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai karakteristik sel yang bersangkutan (Gambar 5). 6,8

Gambar 4. Mekanisme Deteksi Ukuran, Ukuran, Kompleksitas Sel dan Fluoresens Pada FACS (Sumber : BD FACS Calibur) 9

Pemisahan populasi sel yang heterogen menjadi beberapa sub populasi atas dasar seleksi molekul penanda khusus yang telah terkonjugasi dengan fluorokrom. Pemisahan didasarkan pada jenis muatan sel. Sel yang memiliki kesaman dari kriteria yang diinginkan akan diberikan muatan positif dan demikian sebaliknya. Pemberian muatan listrik pada droplet sel dilakukan sebelum sel tunggal melewati elektroda tersebut. Sel bermuatan positif akan mengalir ke chamber negatif, sedangkan sel bermuatan negatif akan mengalir ke chamber









Gambar 5. Prinsip Kerja FACS (Sumber : Fibriantoi Y, BD FASCanto II) 10

b.

Cara kerja a). Persiapan Sampel6,11 1. Reagen BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD8/CD45/CD4 dimasukan 20 μL ke dalam tabung BD Trucount. 2. Darah yang mengandung antikoagulan EDTA ditambahkan 50 µL ke dalam tabung BD Trucount yang mengandung reagen BD Multitest. 3. Tabung ditutup dan vorteks

tabung dengan lembut untuk







7. Sampel dianalisa menggunakan alat Facscanto II menggunakan sofwer BD FACSC anto II.

Gambar 6. Persiapan Sampel (Sumber Ruiz P dkk. Productivity dkk. Productivity and Efficiency of 6-Color BD Multitest and BD Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte Subsets )11

b). Analisis Flow Analisis Flow Cytometry 1. Jika sampel tidak segera dianalisis setelah persiapan, simpan dalam ruang gelap pada suhu kamar (20°C – (20°C – 25°C). 25°C). 2. Vortex sampel secara menyeluruh (kecepatan rendah) untuk mengurangi cytometer.

agregasi

sebelum

sampel

diperiksa

pada flow







Gambar 7. Data Representatif Sampel Hematologi Nor mal Mengunakan BD Multitest CD3 / CD8 / CD45 / CD4 (Sumber : Insert kit BD Multitest™ ) 7

C. PASCA ANALITIK







Persentase atau jumlah dari limfosit CD4 T helper berguna dalam memantau individu yang terinfeksi human immunodeficiency virus virus (HIV). Individu dengan HIV biasanya menunjukkan penurunan stabil jumlah limfosit T helper yang menandakan progresifitas infeksi sedang berlangsung. Persentase dari CD8+ meningkat pada banyak pasien dengan defisiensi imun bawaan atau didapat seperti severe combined immunodeficiency immunodeficiency (SCID) atau acquired immune deficiency syndrome (AIDS). syndrome (AIDS).7







DAFTAR PUSTAKA

1.

Kresno, SB. Imuno Diagnostik. Dalam: Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Edisi kelima. Jakarta:Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2010: p50-7, 472-82, 513-4.

2.

Lakschevitz F. Identification of CD Marker Expression and Neutrophil Surface Marker Changes in Health and Diseaseusing High through put screening

flow

cytometry.

2006.

Available

from

:

https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/75103/3/Lakschevitz_Flavia _201611_MSc_thesis.pdf. _201611_MSc_thesis.pdf. 3.

Tipu HN. Cluster of Differentiation 45: An Adjunct to Flowcytometric Diagnosis of Leukemias. Iranian Journal Of Blood and Cance. Available from: https://www.researchgate.net/publication/273080854_Cluster_of_Differentiat ion_45_An_Adjunct_to_Flowcytometric_Diagnosis_of_Leukemias.

4.

Wohlfahrt A, Hannel L, Oliveira L, Soares P, Silva. The importance of immunophenotyping by flow cytometry in distinction between hematogones and

B

lymphoblasts. lymphoblasts .

2015.

Available

from

:

http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v51n1/1676-2444-jbpml-51-01-0007.pdf. 5.

Becton Dickinson company. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. Guide.

2002.

Available

from:

https://www.bu.edu/flow-

cytometry/files/2010/10/BD-Flow-Cytom-Learning-Guide.pdf. 6.

Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology









10. Fibrianto Yoni, 2016. Becton Dickinson and Company. 11. Ruiz P, Borowitz MJ, Tilahun H, dkk. Productivity and Efficiency of 6-Color BD Multitest and BD Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte Subsets. Subsets.

2007.

Available

from

:

https://www.bdbiosciences.com/documents/FACSCanto_II_app_note.pdf 12. Lam L, Hubbard. Hubbard. Laboratory Procedure Manual. Manual. 2004. Available from : https://www.cdc.gov/Nchs/data/nhanes/nhanes_03_04/l03_c_met_CD4%2B_ CD8%2B.pdf.

Pemeriksaan Penanda Limfosit Metode Immunophenotyping(1).docx

Recommend Documents