Pemecahan Komponen Makanan (fermentasi)

BAB I
PENDAHULUAN


1. Latar Belakang
Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak dengan cara mengoksidasi
zat-zat hara yang ada di lingkungan untuk menghasilkan energi dan senyawa
awal untuk sintesis komponen-komponen sel. Penggunaan zat hara dipengaruhi
oleh aktivitas metabolisme mikroorganisme dalam memecah molekul kompleks,
seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat menjadi komponen yang
lebih sederhana sehingga dapat diangkut sel ke sitoplasma sebagai sumber
energi dan senyawa awal.
Proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerobik disebut
dengan fermentasi sedangkan proses penguraian makromolekul menjadi molekul
yang lebih sederhana dengan penambahan air disebut juga dengan hidrolisis.
Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim yang dapat mengkatalis reaksi
hidrolisis.
Mikroorganisme amilolitik dapat memproduksi enzim amilase untuk memecah
pati menjadi gula yang lebih sederhana yang dapat dipecah lagi menjadi
asam, gas, alkohol, dan energi. Mikroorganisme proteolitik dapat
menghidrolisis protein dan menghasilkan peptida serta asam amino.
Mikroorganisme lipolitik dapat memecah lemak menjadi asam lemak dan
gliserol, sedangkan mikroorganisme pektolitik dapat memecah pektin dan
menyebabkan hilangnya kemampuan membentuk gel. Mikroorganisme di lingkungan
aerob juga dapat menghasilkan enzim katalase untuk menguraikan hidrogen
peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. H2O2 bersifat toksik terhadap sel
karena dapat menginaktivasi enzim yang ada di dalam sel.
Pewarnaan Gram dapat digunakan untuk membedakan antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif. Adanya perbedaan pada tahap pewarnaan
Gram disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel yang dimiliki bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif. Komponen utama bakteri Gram positif
adalah peptidoglikan sedangkan sebagian besar dinding sel bakteri Gram
negatif tersusun dari lipid.


2. Tujuan
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari sifat-sifat pemecahan komponen
kimia di dalam makanan oleh mikroorganisme, seperti bakteri, kapang, dan
khamir, menguji dan membedakan reaksi pemecahan karbohidrat, protein, dan
lemak oleh kultur jasad renik murni dan mikroorganisme yang ada di makanan,
mengetahui adanya enzim katalase pada mikroorganisme melalui uji katalase,
dan dapat mengamati bentuk dan ciri-ciri dari bakteri melalui pewarnaan
Gram.



















BAB II
TINJAUAN PUSTAKA



Menurut Lay (1994), mikroorganisme dapat tumbuh, berkembang biak, dan
membentuk sel baru dengan menggunakan zat hara yang ada di lingkungannya,
yaitu molekul sederhana, seperti H2S dan NH4+ atau molekul organik
kompleks, seperti polisakarida dan protein. Zat-zat hara ini akan
dioksidasikan oleh mikroorganisme untuk mendapatkan energi dan senyawa awal
agar dapat melakukan sintesis dinding sel, membran sel, dan flagela.
Penggunaan zat hara ditentukan dari aktivitas metabolisme mikroorganisme.
Metabolisme dapat memberikan hasil sampingan yang dapat dipakai untuk
mengidentifikasi mikroorganisme. Salah satu jalur metabolisme adalah
fermentasi yang pemindahan elektronnya berlangsung di antara senyawa-
senyawa organik (Volk dan Wheeler, 1993).

2.1 Fermentasi
Menurut Fardiaz (1992), fermentasi adalah proses pemecahan komponen
karbohidrat dan asam amino oleh enzim mikroorganisme secara anaerobik untuk
menghasilkan energi. Proses ini tidak memerlukan adanya oksigen dan pada
saat fermentasi berlangsung, senyawa organik berperan sebagai penerima
elektron terakhir sehingga hasil fermentasinya lebih stabil. Pada proses
fermentasi, hanya sebagian bahan baku energi yang dipecah sehingga hanya
dihasilkan sejumlah kecil energi, CO2, air, dan beberapa produk akhir,
seperti asam laktat, asam asetat, etanol, serta asam organik volatil
lainnya (Buckle et al., 1987). Karbohidrat merupakan senyawa utama yang
dipecah dalam proses fermentasi sedangkan asam amino hanya dapat dipecah
oleh beberapa jenis bakteri tertentu (Fardiaz, 1992).
2.1.1 Fermentasi Karbohidrat
Karbohidrat merupakan komponen utama yang dipecah di dalam proses
fermentasi. Pertama, polisakarida akan dipecah menjadi gula-gula sederhana
sebelum dilakukan fermentasi, contohnya pati dipecah menjadi glukosa-
glukosa. Selanjutnya, glukosa dipecah lagi menjadi senyawa-senyawa lain
yang lebih sederhana tergantung pada jenis fermentasinya (Fardiaz, 1992).
Selain itu, hasil akhir produk fermentasi juga dipengaruhi dari sifat
mikroorganisme, media biakan yang dipakai, dan faktor-faktor lingkungan,
seperti pH dan suhu. Media yang digunakan harus mengandung senyawa-senyawa
yang dapat dengan mudah difermentasikan dan dioksidasikan oleh
mikroorganisme. Glukosa sendiri merupakan senyawa karbohidrat yang paling
banyak dipakai oleh mikroorganisme dalam proses fermentasi.
Kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasikan berbagai macam
karbohidrat dan produk yang dihasilkan dari fermentasi merupakan ciri-ciri
yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Identifikasi
ini berkaitan erat dengan aktivitas metabolisme mikroorganisme dalam
menggunakan dan menguraikan senyawa kompleks, seperti pati, lemak, protein,
dan asam nukleat (Lay, 1994).
Minimal ada tujuh proses fermentasi glukosa yang berbeda-beda pada
bakteri. Masing-masing proses fermentasi sendiri akan membentuk produk
akhir yang berbeda dan spesifik untuk kelompok bakteri tertentu. Ada dua
tahap fermentasi glukosa, yaitu:
1. Rantai karbon dipecah dari glukosa dan dilepaskan dua pasang atom
hidrogen untuk memperoleh senyawa karbon yang akan lebih mudah
teroksidasi daripada glukosa.
2. Senyawa yang teroksidasi dapat direduksi kembali dengan menggunakan
atom hidrogen dari tahap pertama untuk membentuk produk fermentasi.
Reaksi oksidasi harus seimbang dengan reaksi reduksi yang berlangsung.
Asam piruvat akan selalu dihasilkan pada tahap pertama fermentasi glukosa
(Fardiaz, 1992). Ada empat jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat,
yaitu:
1. Jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis
Jalur EMP merupakan mekanisme yang paling umum digunakan bakteri,
fungi, hewan, dan manusia untuk mengubah glukosa menjadi asam piruvat
(Volk dan Wheeler, 1993). Tahap pertama adalah tahap pembentukan
fruktosa difosfat. Tahap selanjutnya, fruktosa difosfat dipecah
menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat yang dikatalis oleh enzim
aldolase, lalu diteruskan dengan reaksi dehidrogenasi gliseraldehida
fosfat yang juga termasuk reaksi oksidasi yang memproduksi ATP dan
dikatalis oleh enzim gliseraldehida fosfat dehidrogenase.
NAD (Nikotinamida Adenin Dinukleotida) akan menangkap atom hidrogen
yang dilepas untuk membentuk NADH2. Jika NADH2 dioksidasi kembali pada
tahap kedua fermentasi sehingga atom hidrogen dapat dilepas kembali,
maka proses fermentasi dapat berlangsung terus. Pada proses
fermentasi, NAD berperan sebagai pembawa hidrogen.
Energi yang dihasilkan pada tahap oksidasi gliseraldehida fosfat
akan membentuk dua ATP. Satu molekul glukosa dapat membentuk dua
molekul gliseraldehida fosfat sehingga seluruhnya dihasilkan empat
ATP. Namun, karena dua ATP digunakan untuk mengubah glukosa menjadi
fruktosa difosfat sehingga hanya tinggal dua ATP yang dipakai untuk
pertumbuhan tiap molekul glukosa (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + 2(ADP + 2NAD+ 2 piruvat + 2 ATP +
+ Pi) 2 (NADH + H+)
2. Jalur Entner Doudoroff (ED)
Pada jalur ED, akan dihasilkan senyawa antara unik, yaitu 2-keto-3-
deoksi-6-fosfoglukonat (KDFG). Senyawa ini kemudian dipecah menjadi
dua triosa, yaitu piruvat dan gliseraldehida-3-fosfat oleh enzim
aldolase. Selanjutnya, kedua triosa ini memasuki jalur EMP untuk
menghasilkan molekul piruvat kedua dengan cara melepas dua mol ATP,
satu mol NADH, dan H+ (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + NADP+ + NAD+ + 2 piruvat + NADP + H+ +
(ADP+Pi) NADH + H+ + ATP
3. Jalur Heksosamonofosfat (HMF)
Jalur yang dapat ditemui pada berbagai macam organisme ini berperan
penting di dalam metabolisme mikroorganisme agar dapat membentuk
pentosa yang dibutuhkan untuk melakukan sintesis asam nukleat, asam
amino aromatik, vitamin, dan sumber NADP+H+ untuk reaksi biosintesis.
Jalur HMF disebut juga dengan siklus pentosa karena energi tidak
diperoleh secara langsung, tetapi NADP + H+ yang dihasilkan ketika
dimasukkan ke dalam sistem transpor elektron akan menjadi sumber
energi potensial. Enzim yang digunakan di dalam jalur ini adalah
transaldolase dan transketolase (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + 12 NADP+ + ATP 6 CO2 + 12 (NADPH + H+) + ADP + Pi
4. Jalur Fosfoketolase (FK)
Jalur ini hanya dapat ditemui pada kelompok bakteri laktobasili
heterofermentatif. Jalur FK merupakan cabang dari jalur HMF karena
bakteri jenis ini tidak memiliki enzim aldolase yang digunakan untuk
memecah fruktosa 1,6-difosfat menjadi dua triosa-fosfat dan juga tidak
memiliki enzim transaldolase dan transketolase yang berperan penting
di dalam jalur HMF. Ketika asetil-fosfat diubah menjadi asetat, maka
akan dihasilkan 2 ATP yang memiliki ikatan energi tinggi. Reaksinya:
Glukosa + NAD+ + 2 NADP+ + piruvat + asetat + CO2 + NADH
2 ADP + P + H + + 2 NADPH
+ H+ + 2 ATP
Namun jika asetil-fosfat diubah menjadi etanol, maka ikatan
energinya akan hilang sehingga hanya dihasilkan satu mol ATP per mol
glukosa (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + NAD+ + ADP + Pi piruvat + asetat + CO2 +
NADH + H + + ATP

Pada tahap kedua fermentasi, asam piruvat dipecah menjadi hasil produk
akhir yang spesifik untuk digunakan dalam berbagai proses fermentasi dengan
memakai atom hidrogen yang dihasilkan dari tahap pertama fermentasi. Produk
akhir ini dihasilkan dari reaksi yang dikatalis oleh enzim-enzim tertentu.
Contohnya, glukosa yang difermentasi oleh khamir melalui jalur EMP sehingga
menghasilkan alkohol dan CO2.
Glukosa dapat difermentasi menjadi alkohol maupun asam laktat. Pada
fermentasi alkohol, terjadi regenerasi NAD+ sehingga enzim mengubah piruvat
menjadi asetaldehida yang berperan sebagai penerima hidrogen dan CO2. NADH
kemudian membawa elektron dan ion H+ ke dua molekul asetaldehida sehingga
dihasilkan produk akhir berupa alkohol (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa 2 Etanol + 2 CO2
Sedangkan pada fermentasi asam laktat, terjadi regenerasi NAD+. Dua NADH
membawa elektron dan ion H+ ke 2 molekul piruvat yang berperan sebagai
penerima hidrogen sehingga dihasilkan asam laktat sebagai produk akhirnya.
Reaksinya:
Glukosa 2 Asam laktat
Fermentasi di atas disebut juga dengan fermentasi homolaktat karena hanya
dihasilkan asam laktat sebagai satu-satunya hasil fermentasi. Bakteri yang
melakukan fermentasi ini disebut bakteri asam laktat homofermentatif,
contohnya Streptococcus, Pediococcus. Ada juga bakteri asam laktat
heterofermentatif yang tidak hanya membentuk asam laktat, tapi juga senyawa-
senyawa lainnya, seperti etanol, asam asetat, dan CO2. Contoh bakteri ini
adalah Leuconostoc, Lactobacillus (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa Asam laktat + etanol/asam asetat + CO2
Untuk menguji adanya proses fermentasi, dapat dilihat dari pembentukan
asam dan gas. Adanya gas dapat dilihat dengan menggunakan tabung durham
atau tabung smith. Tabung smith dipakai jika harus menentukan jumlah dan
jenis gas sedangkan tabung durham dipakai jika jenis dan jumlah gas tidak
perlu diketahui. Bila ada gas, maka gas tersebut akan masuk ke dalam tabung
dan tampak sebagai gelembung udara yang terperangkap di dalam tabung
sehingga mendorong cairan yang ada di tabung durham.
Media yang digunakan mengandung karbohidrat berupa glukosa, manitol,
laktosa, sukrosa, atau maltosa serta ekstrak sapi dan pepton sebagai sumber
nitrogen, mineral, dan vitamin. Asam yang terbentuk dapat diketahui dengan
menambahkan indikator ke dalam media yang digunakan. Jika pada proses
fermentasi bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, maka
akan terbentuk asam sebagai produk fermentasi yang ditandai dengan
perubahan warna menjadi kuning yang dapat dilihat pada gambar 2.1. Asam ini
akan menurunkan pH media. Indikator yang umumnya dipakai adalah merah fenol
yang berwarna merah atau BCP(Brom Crescol Purple) yang berwarna ungu pada
pH>7 (Lay, 1994).

Gambar 2.1 Hasil fermentasi karbohidrat
Sumber : Johnson (1998)


2.1.2 Fermentasi Asam Amino
Asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa bakteri tertentu,
terutama Clostridia. Protein awalnya akan dipecah menjadi asam amino,
selanjutnya asam amino difermentasi menjadi senyawa lain berupa asam. Asam
amino yang dihasilkan dapat sepasang ataupun satu asam amino saja. Pada
fermentasi sepasang asam amino, satu asam amino akan menjadi oksidan
sedangkan satunya lagi akan menjadi reduktan (Fardiaz, 1992). Jalur
fermentasi sendiri dapat dilihat pada gambar 2.2. Reaksi fermentasi asam
amino:
3 Alanin + 2 H2O 2 asam propionat + asam asetat + CO2 + 3 NH3

Gambar 2.2 Jalur fermentasi
Sumber : Madigan (1997)
Bakteri-bakteri yang biasanya berperan dalam proses fermentasi adalah
bakteri asam laktat, contohnya Streptococcus thermophilus yang berguna
dalam industri susu, Pediococcus cerevisiae berperan dalam fermentasi
sayuran dan daging, Leuconostoc mesentroides dipakai dalam fermentasi
sayuran, dan Lactobacillus lactis penting dalam industri susu dan sayuran;
bakteri asam asetat, contohnya Acetobacter aceti yang dipakai dalam
industri cuka; khamir, contohnya Saccharomyces cerevisiae dalam industri
bir, anggur, roti; kapang, contohnya Aspergillus oryzae untuk membuat
minuman beralkohol dan Aspergillus wentii digunakan dalam fermentasi kecap,
tauco, sake (Buckle et al., 1987).


2. Jenis Bakteri Berdasarkan Sifat Pertumbuhannya pada Makanan
2.2.1 Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat bergram positif, berbentuk batang atau bulat, dan
dapat memfermentasikan gula menjadi asam laktat yang sering digunakan dalam
proses fermentasi sayur-sayuran (pikel, sauerkraut), fermentasi susu
(yogurt, keju, susu asam), dan fermentasi ikan. Bakteri asam laktat
menghasilkan asam secara cepat sehingga dapat menurunkan pH lingkungan dan
mencegah pertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak diinginkan. Contoh
bakteri asam laktat adalah beberapa Lactobacillus, Streptococcus, dan
Pediococcus yang bersifat homofermentatif serta Leuconostoc dan beberapa
Lactobacillus yang bersifat heterofermentatif (Fardiaz, 1992).
2.2.2 Bakteri Asam Asetat
Bakteri asam asetat berbentuk batang, bergram negatif, contohnya
Gluconobacter dan Acetobacter yang dapat mengoksidasi alkohol menjadi asam
asetat. Asam asetat dapat dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2 oleh bakteri
Acetobacter. Spesies yang sering dipakai dalam industri cuka adalah A.
Aceti dan G. Suboxydans (Fardiaz, 1992).
2.2.3 Bakteri Proteolitik
Bakteri ini akan menghasilkan enzim proteinase ekstraseluler yang
merupakan enzim pemecah protein yang dibentuk di dalam sel dan dikeluarkan
dari sel setelah enzim selesai bekerja. Enzim proteinase terdapat pada
semua bakteri, tetapi tidak semua bakteri memiliki enzim proteinase
ekstraseluler. Ada tiga macam bakteri proteolitik, yaitu:
a. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif yang tidak membentuk spora,
contohnya Proteus dan Pseudomonas.
b. Bakteri aerobik dan anerobik fakultatif pembentuk spora, contohnya
Bacillus.
c. Bakteri anaerobik pembentuk spora, contohnya beberapa Clostridium.
Ada bakteri yang bersifat proteolitik asam yang dapat menghidrolisis
protein dan memfermentasi asam, contohnya Streptococcus faecalis dan ada
juga bakteri yang bersifat putrefaktif yang memecah protein secara
anaerobik dan menghasilkan senyawa berbau busuk, contohnya Pseudomonas
(Fardiaz, 1992).
2.2.4 Bakteri Lipolitik
Bakteri ini menghasilkan enzim lipase yang berfungsi sebagai katalis
reaksi hidrolisis lemak menjadi asam-asam lemak dan gliserol. Produk akhir
dari hidrolisis lemak dapat dioksidasi lagi menjadi energi di dalam kondisi
aerob. Kebanyakan bakteri aerobik dan proteolitik aktif juga merupakan
bakteri lipolitik. Contoh bakteri lipolitik adalah Pseudomonas,
Alcaligenes, Serratia, dan Micrococcus (Fardiaz, 1992).
2.2.5 Bakteri Sakarolitik
Bakteri ini memecah disakarida dan polisakarida menjadi gula-gula
sederhana. Hanya sedikit bakteri amilolitik yang dapat menghasilkan enzim
amilase dan menghidrolisis pati di luar sel, contohnya Bacillus subtilis
dan Clostridium butyricum. Ada juga bakteri yang dapat memecah selulosa
(Fardiaz, 1992).
2.2.6 Bakteri Pektolitik
Pektin merupakan karbohidrat kompleks yang dapat ditemui pada buah dan
sayuran. Pektinase (campuran enzim pektolitik) dapat digunakan untuk
memecah pektin dan mengakibatkan busuk lunak atau busuk air pada buah dan
sayur serta hilangnya kemampuan memproduksi gel pada sari buah. Contoh
bakteri pektolitik adalah Erwinia, Bacillus, dan Clostridium (Fardiaz,
1992).
2.2.7 Bakteri Osmofilik
Bakteri osmofilik atau sakarofilik dapat ditemui pada media yang memiliki
kandungan gula tinggi, namun sebenarnya bakteri osmofilik hanya bersifat
osmotoleran sehingga masih dapat tumbuh dengan atau tanpa kandungan gula
yang tinggi, contohnya Leuconostoc (Fardiaz, 1992).

3. Produk-Produk Pangan Hasil Fermentasi
Produk pangan adalah media yang baik bagi pertumbuhan mikroorganisme.
Fermentasi sendiri merupakan perubahan kimiawi yang terjadi pada bahan
pangan yang disebabkan oleh enzim. Sifat produk pangan hasil fermentasi
sangat dipengaruhi oleh mutu dan sifat asli produk pangan itu sendiri.
Fermentasi dari mikroorganisme yang diinginkan akan memberikan bentuk,
rasa, dan tekstur yang bagus.
2.3.1 Sayuran
Bakteri asam laktat dapat memfermentasi hampir semua jenis sayuran dan
buah-buahan yang menyerupai sayuran, seperti tomat, mentimum, dan olive.
Sayuran dan buah mengandung gula yang tinggi dan bergizi untuk pertumbuhan
bakteri asam laktat. Faktor-faktor lingkungan yang akan mempengaruhi proses
fermentasi sayuran adalah:
a. Kondiri anaerobik.
b. Kadar garam yang dapat digunakan untuk menyerap cairan dan zat-zat
gizi dari produk.
c. Suhu yang sesuai untuk proses fermentasi.
d. Tersedianya bakteri asam laktat yang diperlukan.
Pada fermentasi sayuran akan terjadi perubahan-perubahan kompleks yang
ditimbulkan dari pertumbuhan serangkaian bakteri asam laktat, contohnya
fermentasi ini akan dimulai oleh Leuconostoc mesenteroides dan dilanjutkan
oleh Lactobacillus (Buckle et al., 1987).
2.3.2 Sauerkraut (Sayur Asin)
Sauerkraut merupakan kobis asam. Kobis dibersihkan, dicuci, dan diiris
kecil-kecil selebar 1 m, lalu irisan kubis dimasukkan ke dalam tangki dan
ditambahkan garam untuk menyerap cairan dari irisan kobis, kemudian diaduk
serata mungkin. Selanjutnya, tangki ditutup dengan plastik dan air
dimasukkan ke dalam plastik sebagai pemberat dan penutup sehingga irisan
kobis akan terendam. Tidak tercelupnya kobis di dalam larutan garam akan
menyebabkan pertumbuhan khamir dan kapang sehingga mengakibatkan rasa yang
tidak dikehendaki.
Garam menarik air dan zat gizi dari jaringan sayuran sehingga zat gizi
tersebut akan melengkapi substrat yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri
asam laktat. Garam dan asam yang diproduksi dari fermentasi dapat mencegah
pertumbuhan mikroorganisme yang tidak dikehendaki dan memperlambat
pelunakan jaringan kobis. Kandungan garamnya harus cukup agar dapat
menumbuhkan bakteri asam laktat dan dapat menghasilkan kraut yang seimbang
dengan garamnya.
Fermentasi dimulai oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides dan dilanjutkan
oleh Lactobacillus sp. yang lebih tahan terhadap asam. Suhu berpengaruh
besar terhadap kecepatan fermentasi, mutu produk pangan, dan perkembangan
jenis mikroorganisme. Suhu antara 25-300C adalah suhu optimal untuk
fermentasi dan mutu produk pangan yang sempurna dan dapat terjadi dalam
waktu 2-3 minggu. Suhu di atas 300C akan memungkinkan pertumbuhan bakteri
homofermentatif dan menghasilkan produk yang terlalu asam serta flavornya
kurang sedangkan suhu di bawah 250C akan meningkatkan keseluruhan waktu
yang diperlukan untuk fermentasi dan dapat mencapai waktu satu tahun
(Buckle et al., 1987).
2.3.3 Miso (Air Tajin)
Miso merupakan hasil fermentasi beras atau kedelai. Bahan ini digunakan
untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa pada produk pangan. Tahap
pertama fermentasi aeobik dilakukan oleh Aspergillus oryzae dan tahap
fermentasi kedua oleh Saccharomyces rouxii secara anaerobik.
Untuk membuat miso, pertama beras dicuci, direndam, dan direbus, kemudian
diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi proses fermentasi
pada suhu 400C. Beras harus dalam kondisi basah untuk pertumbuhan kapang,
namun harus cukup kering untuk menghambat pertumbuhan bakteri lainnya.
Pertumbuhan miselia kapang harus dihentikan sebelum terjadi pembentukan
spora. Beras yang telah berkapang disebut juga dengan koji yang merupakan
kultur stater untuk fermentasi.
Selanjutnya, kedelai dicuci, direndam, dan direbus, kemudian didinginkan.
Bahan ini dihancurkan bersama garam dengan perbandingan 4 bagian koji, 10
bagian kedelai, 2 bagian garam, dan 1 bagian miso lama serta air. Campuran
ini difermentasi pada suhu 280C selama seminggu secara aerobik, lalu
dimasukkan ke dalam tong untuk memulai fermentasi kedua pada kondisi
anaerobik. Fermentasi kedua akan menggunakan khamir pada suhu 350C selama 2
bulan. Setelah itu, campuran dimatangkan pada suhu kamar untuk beberapa
minggu. Produk akhir kemudian dihaluskan menjadi adonan atau tepung basah
untuk dipakai pada campuran bahan pangan lainnya. Pada fermentasi ini, akan
ikut berperan bakteri-bakteri asam laktat (Buckle et al., 1987).
2.3.4 Air Rendaman Tahu
Dalam fermentasi tahu, pertama kacang kedelai direndam di dalam air dan
didedak hingga menjadi suatu campuran. Campuran ini kemudian disaring dan
diambil filtratnya, yaitu susu kedelai. Selanjutnya, susu kedelai diberi
garam, seperti magnesium klorida atau kalsium sulfat agar dapat menggumpal.
Setelah cukup lunak, gumpalan ini di-press menjadi potongan tahu. Bakteri
yang umumnya berperan dalam fermentasi tahu adalah Bacillus cereus (Ewald,
1997).


4. Pemecahan Makanan oleh Mikroorganisme
Mikroorganisme menggunakan zat-zat hara untuk dapat melakukan sintesis
sel dan memperoleh energi (Fardiaz, 1992). Zat-zat hara ini biasanya berupa
molekul besar, seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat (Lay,
1994). Karbohidrat dan protein merupakan sumber energi untuk dapat
menghasilkan ATP sedangkan asam amino dari protein, purin dan pirimidian
dari asam nukleat, vitamin, serta mineral sebagai faktor-faktor
pertumbuhan. Zat-zat lainnya yang diperlukan mikroorganisme adalah unsur-
unsur makro, seperti C, O, N, H, P, dan S serta unsur-unsur mikro, yaitu
Ca, K, Mg, Fe, Mn, Cl, Cu (Fardiaz, 1992).
Agar dapat digunakan oleh sel, maka makromolekul harus dihidrolisis
terlebih dahulu. Hidrolisis sendiri merupakan proses penguraian molekul
dengan menambahkan air. Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim (eksoenzim)
yang dapat mengkatalis pemecahan makanan menjadi molekul-molekul sederhana.
Molekul kecil ini akan dibawa ke sitoplasma untuk dipakai sebagai sumber
energi dan senyawa awal dalam sintesis sel (Lay, 1994).
Umumnya makanan mengandung karbohidrat mulai dari monosakarida sampai
polisakarida, tetapi tidak semua mikroorganisme dapat menghidrolisis
karbohidrat, terutama pati. Hanya mikroorganisme yang bersifat amilolitik
saja yang dapat memecah pati sedangkan monosakarida dan disakarida dapat
dengan mudah dipecah oleh mikroorganisme.
Pada buah-buahan yang banyak mengandung monosakarida, sering terjadi
fermentasi spontan yang menghasilkan asam dan gas sedangkan pada susu yang
banyak mengandung disakarida (laktosa), sering terjadi fermentasi asam
laktat. Asam yang dihasilkan mikroorganisme sering ditemui pada makanan
yang banyak mengandung karbohidrat, namun kapang dan khamir biasanya tidak
menghasilkan asam.
Perubahan biokimia juga terjadi pada makanan yang banyak mengandung
protein, namun karena molekul protein lebih kompleks daripada karbohidrat
sehingga hanya mikroorganisme yang memiliki sistem enzim yang kompleks saja
yang dapat memecah protein, yaitu mikroorganisme proteolitik. Protein akan
dipecah menjadi asam amino yang dapat dipakai sebagai sumber energi sel.
Selain asam amino, pemecahan protein juga akan menghasilkan gas, asam, dan
produk-produk akhir lainnya yang tidak diinginkan, seperti bau busuk.
Makanan juga banyak mengandung lemak yang bermacam-macam komposisinya.
Komponen penyusun lemak adalah asam-asam lemak dan gliserol. Asam-asam
lemak berantai pendek lebih mudah dipecah dibandingkan asam-asam lemak
berantai panjang. Asam lemak berantai pendek dapat ditemui pada lemak
hewani sedangkan asam lemak berantai panjang banyak terdapat pada minyak
nabati. Lemak lebih sulit dipecah daripada karbohidrat dan protein.
Pemecahan lemak kadang-kadang merugikan karena menyebabkan bau tengik dan
tidak dikehendaki pada pematangan keju (Fardiaz, 1992).
2.4.1 Pemecahan Karbohidrat
Karbohidrat terdiri dari atom-atom C, H, dan O. Karbohidrat dapat dibagi
menjadi lima macam, yaitu monosakarida (glukosa, fruktosa, galaktosa) yang
tersusun dari aldehid dan keton dari alkohol polihidrat, disakarida yang
tersusun dari dua monosakarida (laktosa, maltosa, sukrosa, selobiase),
trisakarida (rafinose), oligosakarida (dekstrin, tetrasakarida), dan
polisakarida (pati, glikogen, selulosa).
Karena karbohidrat lebih mudah dipecah, maka makanan yang banyak
mengandung karbohidrat lebih mudah diserang oleh mikroorganisme.
Karbohidrat akan dipecah menjadi asam, gas, dan produk-produk lainnya.
Pemecahan gula bersifat spesifik untuk mikroorganisme tertentu, contohnya
glukosa, laktosa, dan sukrosa akan dipecah menjadi asam dan gas oleh
bakteri Enterobacter aerogenes, Staphylococcuc aureus akan memecah gula-
gula tersebut menjadi asam, sedangkan bakteri Alcaligenes faecalis tidak
akan menghasilkan asam dan gas.
Pati dapat digunakan oleh bakteri tertentu untuk menghasilkan energi dan
komponen gum agar dapat melindungi sel dari pembentukan asam berlebih yang
dapat mengakibatkan pembusukkan makanan, contohnya kerusakan roti yang
disebut juga roti berlendir karena ketika pati dan protein pada roti
dipecah, terbentuk bau dan tekstur yang berbeda dari roti yang masih
berkualitas bagus.
Asam laktat adalah asam yang paling banyak dihasilkan dalam proses
fermentasi makanan, contohnya fermentasi sayur asin dan susu. Konsentrasi
asam yang dihasilkan sangat tinggi sehingga dapat mencegah pertumbuhan
mikroorganisme yang memproduksinya maupun bakteri yang tahan asam.
Pertumbuhan bakteri akan terhambat apabila asam yang dihasilkan mencapai pH
3-4,3. Jenis mikroorganisme, kandungan gula, dan jenis makanan akan
mempengaruhi produksi asam yang dihasilkan.
Produk-produk yang dihasilkan dari pemecahan gula akan dipengaruhi oleh
jenis organisme. Enzim-enzim yang ada di sel mikroorganisme akan memecah
komponen karbohidrat kompleks menjadi lebih sederhana, yaitu:
Sukrosa invertase glukosa + fruktosa
Maltosa maltase glukosa + glukosa
Laktosa β-galaktosidase glukosa + galaktosa
Karena pati merupakan karbohidrat kompleks yang sulit untuk dipecah, maka
pembentukan asam dari pati lebih lama dibandingkan pembentukan asam dari
karohidrat lainnya karena pati harus dipecah terlebih dahulu menjadi
glukosa oleh enzim amilase yang hanya dihasilkan mikroorganisme amilolitik
(Fardiaz, 1992). Enzim amilase terdiri dari β–amilase dan α–amilase yang
memiliki kemampuan menghidrolisis lebih kuat daripada β-amilase (Winarno,
1995). Aktivitas enzim amilase akan mempengaruhi jumlah asam dan gula yang
dihasilkan dari pati (Fardiaz, 1992).
Yodium akan bereaksi secara kimiawi dengan pati dan masuk ke dalam bagian
pati yang kosong dan berbentuk spiral sehingga terbentuk warna biru-
kehitaman. Proses yodinisasi ini akan membentuk molekul yang dapat menyerap
semua cahaya, kecuali warna biru. Jika pati telah dipecah menjadi maltosa
atau glukosa, maka warna birunya akan hilang karena bentuk spiralnya sudah
tidak ada. Tidak terbentuknya warna pada saat larutan yodium ditambahkan ke
dalam media menunjukkan terjadinya hidrolisis pati.
Pada media yang mengandung pati, maka pati di sekitar pertumbuhan bakteri
akan dihidrolisis oleh enzim amilase yang dihasilkan bakteri. Jika zat pati
dihidrolisis, maka pada media agar yang diteteskan larutan yodium akan
timbul daerah transparan di sekitar pertumbuhan bakteri yang ditunjukkan
pada gambar 2.3. Sebaliknya, jika pati tidak dihidrolisis, maka akan timbul
warna biru-kehitaman di sekitar pertumbuhan (Lay, 1994).
Media yang biasa digunakan pada uji hidrolisis karbohidrat adalah media
Starch Agar (SA) yang mengandung tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati
terlarut, agar, dan air. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks,
tripton dipakai untuk menyediakan nitrogen, karbohidrat, dan garam mineral,
air untuk menyalurkan nutrient yang dibutuhkan mikroba, sedangkan pati
berfungsi sebagai komponen karbohidrat yang akan dihidrolisis pada uji ini
(Fardiaz, 1992).

Gambar 2.3 Daerah transparan pada uji hidrolisis pati
Sumber : Rossbach (2004)


2.4.2 Pemecahan Protein
Komponen utama protein adalah asam amino yang terdiri dari unsur C, O, N,
dan H. Ada tiga macam protein yaitu protein sederhana (albumin, globulin,
gultelin, prolamin, dan albuminioid), protein terkonjugasi (glikoprotein,
fosfoprotein, nukleoprotein), dan turunan protein (protein terkoagulasi,
metaprotein, pepton, peptide). Contoh-contoh makanan yang mengandung
protein adalah telur, daging, susu, serelia, dan kacang-kacangan.
Pemecahan protein lebih kompleks dibandingkan pemecahan karbohidrat.
Produk akhir yang dihasilkan juga lebih bervariasi karena protein memiliki
struktur yang lebih kompleks. Oleh karena itu, hanya mikroorganisme yang
memiliki sistem enzim yang kompleks saja yang dapat mendekomposisi protein
menjadi senyawa-senyawa sederhana, yaitu:
Protein proteosa pepton polipeptida
peptida asam amino NH3 dan N
Produk akhir dan senyawa antara yang terbentuk sangat bervariasi.
Pemecahan protein juga akan menghasilkan alkohol, beberapa gas, seperti
CO2, hidrogen, metana, amonia, dan komponen-komponen yang berbau busuk,
seperti indol, skatol, hidrogen sulfida, kadaverin.
Dekomposisi protein oleh mikroorganisme disebut juga dengan proses
putrefaksi (Fardiaz, 1992) yang menggunakan enzim protease untuk
menghidrolisis ikatan peptida di protein dan melepas asam amino (Volk dan
Wheeler, 1993). Selain terjadi pemecahan asam amino, pada proses ini juga
akan dihasilkan komponen-komponen sederhana yang berbau busuk, contohnya
Clostridium memecah protein menjadi senyawa-senyawa sulfur berbau busuk
secara anaerobik. Pemecahan protein secara anaerobik menghasilkan produk
akhir yang lebih stabil sehingga berbau busuk dan menyengat. Sebaliknya,
pemecahan protein yang terdiri dari asam-asam amino sulfur secara aerobik
tidak akan menyebabkan bau busuk karena produk akhirnya lebih stabil dan
dioksidasi secara sempurna.
Walaupun dekomposisi protein sering mengakibatkan bau busuk, namun
pemecahan protein tetap merupakan tahap yang penting dan dikehendaki dalam
beberapa proses pengolahan pangan, terutama pengembangan daging dan
pengolahan keju. Di dalam proses tersebut, akan terjadi hidrolisis atau
denaturasi protein agar dapat mengempukkan protein daging dan mengumpulkan
protein susu (Fardiaz, 1992).
Pada hidrolisis protein, jika susu yang mengandung kasein dicampur dengan
media, maka akan timbul warna keruh pada media akibat reaksi kasein dengan
ion Ca2+ sehingga membentuk Ca-kasein. Kompleks Ca-kasein tidak dapat larut
di dalam media sehingga kompleks ini akan membentuk larutan koloidal yang
menyebabkan media menjadi keruh.
Jika mikroorganisme memproduksi enzim kaseinase yang dapat menghidrolisis
kasein, maka daerah di sekitar koloni bakteri akan berwarna jernih yang
dapat dilihat pada gambar 2.4. Kejernihan ini akibat penguraian molekul
kasein menjadi asam amino yang larut di dalam media sehingga kekeruhan di
sekitar koloni bakteri menjadi hilang. Enzim yang digunakan untuk
menghidrolisis protein disebut juga enzim proteinase (Lay, 1994).
Media untuk uji hidrolisis protein adalah media SMA (Skim Milk Agar) yang
tersusun dari tripton, dekstrosa, ekstrak khamir, agar, air destilata, dan
20% susu skim bubuk. Biasanya media ini dapat bekerja pada pH netral, yaitu
pH 7. Tripton sebagai sumber sumber N dan mineral, ekstrak khamir sebagai
sumber vitamin B kompleks, dekstrosa sebagai sumber energi, sedangkan susu
skim bubuk mengandung kasein yang akan dipecah pada uji hidrolisis ini
(Fardiaz, 1992).

Gambar 2.4 Areal bening pada uji hidrolisis protein
Sumber : Tugmon (2003)


2.4.3 Pemecahan Lemak
Lemak yang terdiri dari asam-asam lemak dan gliserol merupakan komponen
pangan yang sering ditemui pada tanaman dan hewan. Jenis asam-asam lemaknya
akan mempengaruhi sifat lemak. Asam lemak yang terdiri dari ikatan rangkap
dan tidak memiliki jumlah atom H maksimum disebut asam lemak tidak jenuh
yang mudah dipecah oleh mikroorganisme dan banyak ditemukan pada minyak
tumbuhan sedangkan asam lemak yang mempunyai jumlah atom H maksimum disebut
asam lemak jenuh dan banyak ditemui pada minyak hewani.
Jika asam-asam lemak berantai pendek (asam butirat) dihidrolisis, maka
akan timbul bau yang menyengat. Sebaliknya, asam-asam lemak berantai
panjang (asam oleat dan palmitat) bila dihidrolisis tidak akan menyebabkan
bau yang menyengat karena asam lemak berantai panjang dan jenuh memiliki
titik cair yang lebih tinggi daripada asam lemak tidak jenuh berantai
pendek.
Lemak lebih sulit dipecah oleh mikrooganisme daripada karbohidrat dan
protein sehingga hanya mikrooganisme lipolitik yang menghasilkan enzim
lipase saja yang dapat memecah lemak menjadi asam-asam lemak bebas dan
gliserol dengan bantuan air (Fardiaz, 1992), selanjutnya gliserol
dimetabolisasi melalui jalur EMP dan asam lemaknya diuraikan melalui asetat
pada siklus asam sitrat (Volk dan Wheeler, 1993). Reaksi hidrolisis ini
akan dipercepat lagi dengan adanya asam, basa, dan enzim-enzim (Winarno,
1995). Kapang dapat menghasilkan enzim lipase dalam jumlah yang banyak
sehingga sering menyerang makanan yang kaya akan lemak dan menyebabkan bau
tengik (Fardiaz, 1992).
Jika lemak di dalam media dihidrolisis oleh enzim lipase, maka daerah di
sekitar koloni bakteri menjadi asam akibat terbentuknya asam lemak.
Indikator pH yang ditambahkan ke dalam media akan membantu menunjukkan
adanya proses hidrolisis yang ditandai dengan perubahan warna yang
dintujukkan pada gambar 2.5. Indikator pH yang dipakai akan mempengaruhi
perubahan warna (Lay, 1994).
Media NA (Nutrient Agar) merupakan media yang dipakai untuk hidrolisis
lemak. Agar dapat digunakan untuk menguji adanya mikroba lipolitik, maka
pada media ini ditambahkan lemak 1%. Komponen-komponen media ini adalah
ekstrak sapi sebagai zat hara untuk menyediakan karbohidrat, nitrogen,
vitamin, dan garam mineral, pepton untuk mengontrol pH, agar, air untuk
transportasi nutrient yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba, dan merah
netral sebagai indikator (Fardiaz, 1992).

Gambar 2.5 Warna merah yang terbentuk pada uji hidrolisis lemak
Sumber : Engsterhold (1991)
2.5 Uji Katalase
Menurut Lay (1994), katalase merupakan enzim yang digunakan untuk
mengkatalis reaksi penguraian H2O2 (hidrogen peroksida) menjadi H2O dan O2.
Hidrogen peroksida yang dihasilkan dari metabolisme aerob ini bersifat
toksik terhadap sel karena dapat menginaktivasi enzim yang ada di dalam
sel. Oleh karena itu, senyawa toksik ini harus diuraikan oleh
mikroorganisme yang hidup di lingkungan aerob dengan menggunakan enzim
katalase. Enzim peroksidase juga dapat digunakan untuk menguraikan H2O2,
namun tidak akan terbentuk O2 pada penguraian ini.
Uji katalase dapat digunakan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri
tertentu, contohnya uji katalase dipakai untuk membedakan Staphylococcus
dan Streptococcus pada kelompok bakteri kokus karena kelompok bakteri
Staphylococcus bersifat katalase positif sedangkan Streptococcus bersifat
katalase negatif.
Uji katalase dapat dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 3% pada
koloni yang terpisah. Jika bakteri bersifat katalase positif, maka akan
timbul gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi yang dikatalisasi oleh
enzim katalase adalah sebagai berikut:
H2O2 H2O + ½ O2
katalase gelembung udara

2.6 Pewarnaan Gram
Menurut Lay (1994), pewarnaan Gram biasanya digunakan untuk membedakan
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Biakan yang dipakai
hendaknya yang masih segar dan berumur 24-48 jam sehingga dapat memberikan
hasil yang baik dan tepat. Pada saat kultur bakteri diberi kristal violet
sebagai pewarna primer, maka baik bakteri Gram positif dan negatif akan
sama-sama berwarna ungu.
Tahap selanjutnya adalah pemberian larutan lugol sebagai mordan yang
berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatannya menjadi lebih kuat. Kristal violet dan lugol akan
membentuk kompleks yang berwarna ungu. Setelah ditambahkan larutan mordan,
zat warna akan lebih jelas dan sulit untuk dilarutkan.
Ketika bakteri diberi larutan pemucat (aseton alkohol), maka bakteri Gram
negatif menjadi tidak berwarna karena lipidnya larut di dalam larutan
pemucat sehingga pori-pori dinding sel menjadi besar dan kompleks kristal
violet-yodium dapat lepas sedangkan bakteri Gram positif tetap berwarna
ungu karena kompleks kristal violet-yodium dapat dipertahankan dan tetap
melekat pada dinding sel.
Penambahan safranin sebagai zat warna sekunder mengakibatkan bakteri Gram
negatif menjadi berwarna merah karena kompleks kristal violet-yodium telah
larut dan dinding selnya mengikat safranin sedangkan bakteri Gram postif
tetap berwarna ungu karena dinding selnya sudah mengikat kristal violet
sehingga tidak bisa mengikat safranin lagi. Fungsi safranin adalah sebagai
zat warna pembeda terhadap pewarna primer.
Adanya perbedaan pada tahap perwarnaan Gram disebabkan perbedaan struktur
dinding sel yang dimiliki bakteri Gram positif dan negatif. Sebagian besar
dinding sel bakteri Gram positif tersusun dari peptidoglikan sedangkan
komponen utama dinding sel bakteri Gram negatif adalah lipid yang dapat
larut di dalam alkohol dan aseton sehingga dinding selnya menjadi besar dan
kompleks kristal violet-yodium dapat keluar.

2.7 Bacillus cereus
Menurut Fardiaz (1992), Bacillus cereus termasuk bakteri pembentuk spora
yang berbentuk silinder dan tidak membengkak. Bakteri ini berkatalase
positif, bergram positif, aerob sampai anaerob fakultatif, dan sering
menghasilkan asam tanpa gas yang sering merusak makanan kaleng. Spesies ini
juga bersifat proteolitik yang dapat menghasilkan enzim proteinase yang
digunakan untuk memecah protein menjadi polipeptida dan asam amino. Enzim
yang diproduksi ini menyerupai rennin sehingga sering mengumpalkan susu.
Bakteri ini juga termasuk bakteri lipolitik yang dapat memecah lemak
menjadi asam lemak dan gliserol. Bakteri Bacillus cereus dapat dilihat pada
gambar 2.6.

Gambar 2.6 Bacillus cereus
Sumber : Loi (2007)

2.8 Fusarium moniliforme
Kapang ini banyak ditemui pada makanan dan sulit untuk dikenali karena
penampakan pertumbuhannya yang bervariasi. Ciri utama dari Fusarium sp.
adalah adanya makrokonidia yang berbentuk pedang, multisel, dan berwarna.
Kadang-kadang juga terdapat mikrokonidia yang berbentuk oval. Biasanya
kapang ini menghasilkan enzim hidrolitik, seperti amilase, lipase, dan
proteinase yang dapat digunakan untuk memecah makromolekul menjadi komponen
yang lebih sederhana sehingga Fusarium sp. dapat dtumbuh pada media yang
mengandung pati, lipid, pektin, dan protein.
Kapang ini dapat memproduksi asam giberelat yang dapat digunakan untuk
memproduksi benih dan mengganti hormon pertumbuhan. Selain itu, Fusarium
sp. sering dipakai dalam fermenatsi makanan, namun kelemahan fermentasi
kapang adalah adanya miselium yang dapat menganggu penampakan makanan.
Kapang ini juga dapat menghasilkan antibiotik, enzim, dan asam. Enzim
amilase dan proteinase merupakan enzim utama dalam fermentasi makanan oleh
kapang. Hidrolisis pati digunakan dalam industri yang memakai tape, ragi,
dan koji sebagai starternya, hidrolisis proein dalam industri kecap dan
tauco, sedangkan hidrolisis lemak dalam industri susu (Fardiaz, 1992).
Fusarium miniliforme dapat dilihat pada gambar 2.7.

Gambar 2.7 Fusarium moniliforme
Sumber : Rohmhaas (2006)

2.9 Candida tropicalis
Khamir ini bersifat oksidatif, tetapi bersifat fermentatif lemah atau
negatif juga dan sering ditemui pada makanan yang mengandung kadar garam
dan asam dalam jumlah yang tinggi. Spesies ini dapat membentuk film pada
permukaan bahan pangan dan sering merusak produk pangan berkadar garam dan
asam tinggi. C. tropicalis dapat memfermentasi monosakarida dan disakarida,
seperti galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, laktosa, dan raffinosa,
tetapi jarang yang dapat memfermentasi pati karena jumlah enzim pemecah
polisakaridanya sangat rendah. Dari proses fermenatsi, khamir dapat
menghasilkan alkohol, CO2, dan produk-produk lain (Fardiaz, 1992). C.
tropicalis dapat dilihat pada gambar 2.8.

Gambar 2.8 Candida tropicalis
Sumber : Doctorfungus (2007)



































BAB III
METODE KERJA


3.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah gelas benda, gelas
penutup, jarum ose, lampu spiritus, mikroskop, penjepit, hair dryer, hand
counter, inkubator dengan suhu 30-320C, dan vortex.
Bahan-bahan yang dipakai adalah cat Gram A yang berupa larutan cat
Hucker's crystal violet, larutan Gram B berupa larutan mordan lugol's
iodine, larutan Gram C berupa larutan aseton-alkohol, cat Gram D berupa
larutan cat safranin, alkohol, tabung Glucose Broth (GB) + indikator Brom
Cresol Purple (BCP) + tabung durham, tabung Sucrose Broth (SB) + indikator
BCP + tabung durham, tabung Lactose Broth (LB) + indikator BCP + tabung
durham, cawan Starch Agar (SA), cawan Skim Milk Agar (SMA), cawan Nutrient
Agar (NA) + 1% lemak + neutral red, tabung dan cawan kontrol untuk masing-
masing media, larutan lugol (yodium), larutan H2O2 3%, kultur murni Candida
tropicalis, Fusarium moniliforme, dan bakteri Bacillus cereus, serta sampel
erlenmeyer air sayur asin, air rendaman tahu, air asinan, dan air tajin.

3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Uji Fermentasi
1. Empat tabung berisi GB + indikator BCP + tabung durham, empat tabung
berisi SB + indikator BCP + tabung durham, dan empat tabung berisi LB
+ indikator BCP + tabung durham disiapkan.
2. Satu tabung dari masing-masing media diinokulasi dengan satu ose
kultur murni dari khamir Candida tropicalis, satu tabung diinokulasi
dengan satu ose kultur murni Fusarium moniliforme, satu tabung lagi
diinokulasi dengan satu ose kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan
satu tabung lainnya dengan satu ose sampel air tajin.
3. Tabung-tabung yang telah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 30-
320C selama 2 hari.
4. Gas yang terbentuk pada tabung durham dan asam yang terbentuk pada
media yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi
kuning diamati dan dibandingkan dengan tabung kontrol.

3.2.2 Uji Hidrolisis Pati
1. Setengah bagian cawan SA digores langsung dengan ose yang telah
dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah
bagian lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari
kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose
dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya
digores dengan ose dari sampel air tajin.
2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
3. Larutan yodium diteteskan pada semua cawan SA sehingga semua bagian
terendam.
4. Bagian transparan (kuning) yang mengelilingi koloni yang menunjukkan
adanya hidrolisis pati diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.

3.2.3 Uji Hidrolisis Protein
1. Setengah bagian cawan SMA digores langsung dengan ose yang telah
dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah
bagian lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari
kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose
dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya
digores dengan ose dari sampel air tajin.
2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
3. Areal bening yang mengelilingi koloni mikroba proteolitik yang
menunjukkan adanya hidrolisis protein diamati dan dibandingkan dengan
cawan kontrol.

3.2.4 Uji Hidrolisis Lemak
1. Setengah bagian cawan NA yang mengandung 1% lemak dan neutral red
digores langsung dengan ose yang telah dipijarkan dari kultur murni
Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi,
satu cawan digores dengan ose dari kultur murni Fusarium moniliforme,
satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri Bacillus
cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel air
tajin.
2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
3. Warna merah yang terbentuk di bagian bawah koloni yang menunjukkan
adanya hidrolisis lemak diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.



3.2.5 Uji Katalase
1. Air steril diteteskan di atas gelas objek, kemudian dua ose
pertumbuhan kultur Candida tropicalis diambil dan diletakkan di atas
air steril pada gelas objek.
2. Dua tetes larutan 3% H2O2 diteteskan di atas gelas objek tersebut.
3. Langkah di atas diulangi untuk kultur Fusarium moniliforme, Bacillus
cereus, dan sampel air tajin.
4. Gelembung-gelembung kecil oksigen yang terbentuk yang menandakan
adanya enzim katalase diamati.

3.2.6 Pewarnaan Gram
1. Pewarnaan Gram dilakukan pada sampel air tajin yang digunakan.
2. Hasil pewarnaan tersebut diamati.
3. Jumlah bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dinyatakan kira-
kira dalam persen.













BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Bakteri Bacillus cereus
Tabel 4.1 Hasil uji yang dilakukan terhadap bakteri Bacillus cereus
" "Pertumbuhan "
" "Bakteri "
"Uji "GB "gas "- "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "- "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "- "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "- "
"Uji Hidrolisis Protein "+ "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "- "
" "NA + lemak "+ "


Fermentasi merupakan proses pemecahan molekul-molekul, seperti
karbohidrat dan asam amino tanpa membutuhkan oksigen agar dapat memproduksi
energi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba. Proses fermentasi sering
terjadi pada komponen karbohidrat, yaitu sukrosa, laktosa, glukosa,
maltosa, dan sebagainya.
Pada uji fermentasi, media yang digunakan harus mengandung karbohidrat
agar dapat difermentasi oleh mikroba yang ada. Dalam percobaan ini, media
yang dipakai adalah Glucose Broth, Sucrose Broth, dan Lactose Broth. Media-
media ini mengandung ekstrak sapi, pepton, air destilata, dan yang paling
utama adalah glukosa, sukrosa, dan laktosa untuk masing-masing media.
Pepton dan ekstrak sapi berperan sebagai sumber nitrogen, vitamin, dan
mineral untuk pertumbuhan mikroba (Fardiaz, 1992).
Indikator BCP yang ditambahkan ke dalam media berfungsi untuk mengetahui
terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu
menjadi kuning karena indikator BCP akan berwarna ungu pada pH>7 dan
berwarna kuning pada pH asam sedangkan tabung durham digunakan untuk
menangkap gas yang terbentuk pada proses fermentasi. Tabung durham biasanya
dipakai bila jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui. Gas yang masuk ke
dalam tabung ini akan tampak sebagai gelembung-gelembung udara yang
terperangkap dan mendorong cairan yang ada di dalam tabung (Lay, 1994).
Bacillus cereus banyak terdapat pada makanan. Bakteri ini berkatalase
positif, aerobik sampai anaerobik fakultatif, bergram positif, dan dapat
membentuk spora. B. cereus dapat memproduksi asam tanpa gas jika
ditumbuhkan pada makanan dan memiliki sifat proteolitik kuat yang
menghasilkan enzim proteolitik yang bersifat menyerupai rennin sehingga
mampu menggumpalkan susu. Spesies ini juga termasuk bakteri lipolitik yang
mampu memecah lemak (Fardiaz, 1992).
Dari hasil percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa B. cereus dapat
memecah glukosa menjadi asam yang ditunjukkan dengan perubahan warna media
GB dari coklat menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada fermentasi
ini. Asam yang dihasilkan ini akan menurunkan pH media sehingga mengubah
warna indikatornya karena BCP akan berwarna kuning pada pH asam.
Ada dua tahap pada proses fermentasi glukosa, yaitu proses pemecahan
rantai karbon glukosa dan pelepasan atom hidrogen untuk memproduksi asam
piruvat serta pereduksian asam piruvat oleh atom hidrogen untuk
menghasilkan senyawa-senyawa, seperti asam dan gas sebagai produk
fermentasi. Reaksi ini merupakan reaksi redoks yang harus seimbang
(Fardiaz, 1992).
B. cereus memecah glukosa menjadi asam piruvat melalui jalur EMP (Embden
Meyerhoff Parnas). Bakteri ini akan menghasilkan enzim aldolase untuk
memecah fruktosa difosfat menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat dan
enzim gliseraldehida fosfat dehidrogenase untuk mengkatalis reaksi
fosfogliseraldehida yang akan memproduksi ATP.
Asam piruvat yang dihasilkan pada jalur glikolisis (EMP) akan direduksi
oleh NADH2 untuk memproduksi asam laktat. Karena B. cereus hanya
memproduksi asam laktat saja sebagai satu-satunya hasil akhir fermentasi,
maka bakteri ini dapat digolongkan sebagai bakteri asam laktat
homofermentatif yang dapat menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang
tinggi. Reaksi yang terjadi adalah:
Glukosa 2 Asam laktat
B. cereus juga dapat memproduksi enzim yang dapat memecah sukrosa dan
laktosa menjadi monosakarida. Enzim yang dihasilkan adalah β-galaktosidase
yang akan memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim
invertase yang memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Uji fermentasi
yang dilakukan menujukkan bahwa terbentuk asam laktat sebagai produk
fermentasi pada media SB yang berubah warna dari merah menjadi kuning dan
LB yang berubah warna dari biru keunguan menjadi kuning akibat penurunan pH
media.
Zat-zat nutrient di alam biasanya masih berupa makromolekul, seperti
karbohidrat, protein, lipid, dan asam nukleat. Agar dapat dipakai oleh sel
untuk mensintesis komponen-komponennya, maka makromolekul tersebut harus
dihidrolisis terlebih dahulu. Proses hidrolisis sendiri merupakan pemutusan
ikatan molekul dengan menambahkan air (Lay, 1994). Protein lebih sulit
dihidrolisis dibandingkan dengan karbohidrat karena strukturnya yang
kompleks sedangkan lemak merupakan komponen yang paling sulit dihidrolisis.
Karbohidrat akan dihidrolisis menjadi komponen yang lebih sederhana,
seperti disakarida atau monosakarida, asam, gas, dan produk-produk akhir
lainnya. Asam laktat merupakan asam utama yang dihasilkan pada proses
pemecahan ini. Protein akan dipecah menjadi asam amino, alkohol, beberapa
gas, contohnya CO2, hidrogen, amonia, dan senyawa berbau busuk, seperti
indol dan skatol sedangkan lemak akan dihidrolisis menjadi asam lemak dan
gliserol (Fardiaz, 1992).
Dari uji hidrolisis pati, lemak, dan protein, dapat diketahui bahwa B.
cereus merupakan bakteri proteolitik dan lipolitik tetapi tidak termasuk
bakteri amilolitik. Hasil ini tidak cocok dengan teori yang ada. Menurut
Kim (2004), B. cereus merupakan bakteri amilolitik yang dapat memecah pati.
Hal ini dapat dilihat karena tidak terbentuknya daerah transparan pada
media SA setelah ditetesi lugol yang menunjukkan adanya hidrolisis pati.
Kesalahan ini dapat terjadi karena koloni yang tumbuh terlalu sedikit atau
lugol yang ditambahkan kurang banyak.
B. cereus termasuk bakteri proteolitik kuat dan juga bakteri lipolitik
yang dapat memecah lemak (Fardiaz, 1992). Bakteri ini termasuk bakteri
proteolitik ditunjukkan dengan terbentuknya daerah bening yang mengelilingi
koloni pada media SMA. Daerah yang jernih ini dapat terbentuk karena kasein
di dalam susu pada media telah dihidrolisis oleh enzim kaseinase yang
diproduksi bakteri B. cereus menjadi asam-asam amino yang mudah larut di
dalam media sehingga kekeruhan yang disebabkan kompleks Ca-kasein menjadi
hilang (Lay, 1994).
B. cereus juga termasuk bakteri lipolitik yang ditandai dengan
terbentuknya area yang berwarna merah di bagian bawah koloni. Indikator
neutral red yang ditambahkan ke dalam media akan membantu untuk menunjukkan
adanya proses hidrolisis lemak melalui perubahan warna menjadi merah. B.
cereus akan memproduksi enzim lipase untuk menghidrolisis lemak menjadi
asam lemak dan gliserol. Asam lemak yang dihasilkan dari proses hidrolisis
ini akan menurunkan pH media (Lay, 1994).
Media yang digunakan untuk hidrolisis karbohidrat adalah media SA (Starch
Agar) yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut,
agar, dan air. Tripton berfungsi sebagai sumber karbohidrat, N, dan
mineral, ekstrak khamir untuk sumber vitamin B, air untuk transport zat-zat
nutrient, sedangkan pati sebagai komponen yang akan dipecah pada hidrolisis
karbohidrat.
Media untuk hidrolisis protein adalah media SMA (Skim Milk Agar) yang
mengandung tripton, ekstrak khamir, dekstrosa, agar, air destilata, dan 20%
susu skim bubuk. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks, tripton
dipakai untuk menyediakan nitrogen dan mineral, sedangkan kasein yang ada
di dalam susu akan menyebabkan media menjadi berwarna keruh.
Media untuk hidrolisis lemak adalah media NA (Nutrient Agar) yang terdiri
dari ekstrak sapi, pepton, 1% margarin, agar, air destilata, dan ditambah
dengan indikator neutral red. Ekstrak sapi sebagai sumber nitrogen,
karbohidrat, vitamin, dan mineral, pepton untuk mengatur pH, air untuk
menyalurkan nutrient, neutral red sebagi indikator (Fardiaz, 1992).
Pada saat uji hidrolisis karbohidrat pada media SA dan uji hidrolisis
lemak pada media NA+lemak, bakteri B. cereus bersifat katalase positif
sedangkan pada uji hidrolisis protein pada media SMA, bakteri ini bersifat
katalase negatif. Katalase sendiri merupakan enzim yang dapat digunakan
untuk mengkatalis reaksi penguraian H2O2 menjadi O2 dan air. H2O2 sendiri
bersifat toksik karena dapat menginaktivasi enzim. Adanya enzim katalase
dapat ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil O2 di
sekitar koloni setelah ditetesi H2O2. B. cereus termasuk bakteri
berkatalase positif (Fardiaz, 1992). Namun bakteri ini berkatalase negatif
pada saat uji hidrolisis protein padahal seharusnya berkatalase positif.
Hal ini dapat terjadi karena kurangnya larutan H2O2 yang ditambahkan atau
koloni B. cereus yang diambil kurang banyak.

4.2 Kapang Fusarium moniliforme
Tabel 4.2 Hasil uji yang dilakukan terhadap kapang Fusarium moniliforme
" "Pertumbuhan Kapang"
"Uji "GB "gas "- "
"Fermentasi " "asam "- "
" "LB "gas "- "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "- "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "+ "
"Uji Hidrolisis Protein "0 "
"Uji Hidrolisis Lemak "0 "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "0 "
" "NA + lemak "0 "

Kapang banyak digunakan di dalam fermentasi makanan tradisional dan
pembuatan keju, namun fermentasi oleh kapang memiliki kelemahan, yaitu pada
permukaan makanan yang difermentasi dapat tumbuh miselium yang mempengaruhi
penampakan dari makanan. Pada proses fermentasi, kapang akan menghasilkan
asam, enzim, dan antibiotik. Enzim utama yang berperan dalam fermentasi
makanan oleh kapang adalah enzim amilase dan proteinase. Pemecahan pati
oleh enzim amilase banyak digunakan dalam industri pembuatan produk yang
memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya, pemecahan protein oleh
enzim proteinase digunakan dalam industri pembuatan kecap dan tauco,
sedangkan pemecahan lemak dipakai untuk industri keju.
Fusarium sp. termasuk kapang bersekat dan tidak memiliki spora seksual.
Kapang ini sering ditemukan pada makanan dan sulit diidentifikasi karena
penampakan pertumbuhannya bervariasi. Ciri utama yang membedakan Fusarium
sp. dari kapang lainnya adalah adanya makrokonidia yang tampak sebagai
pedang dan tersusun dari beberapa sel serta berwarna. Fusarium sp. biasanya
dipakai untuk mengganti hormon pertumbuhan dan memproduksi benih (Fardiaz,
1992).
Dari hasil uji fermentasi, didapat bahwa Fusarium sp. hanya dapat memecah
laktosa dan sukrosa menjadi asam yang ditandai dengan perubahan warna media
dari ungu menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada tabung durham.
Fusarium sp. akan memproduksi enzim β-galaktosidase yang digunakan untuk
memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim invertase yang
memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Monosakarida-monosakarida ini
kemudian dipecah lagi untuk menghasilkan produk akhir lainnya, seperti ragi
tape, koji. Proses fermentasi oleh kapang banyak digunakan untuk pembuatan
produk-produk yang memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya.
Pada uji hidrolisis karbohidrat, dapat dilihat bahwa Fusarium sp.
termasuk mikroba amilolitik yang dapat memecah karbohidrat menjadi komponen
yang lebih sederhana dengan menggunakan enzim amilase yang diproduksi
kapang ini dan ditandai dengan terbentuknya daerah transparan yang
mengelilingi koloni setelah diteteskan dengan yodium. Yodium akan bereaksi
dengan pati dan masuk ke bagian pati yang kosong dan berbentuk spiral
sehingga membentuk warna biru kehitaman. Jika pati telah dihidrolisis
menjadi disakarida maupun monosakarida, maka warna biru ini akan hilang
karena bentuk spiralnya sudah tidak ada. Hal ini cocok dengan teori yang
ada. Menurut Mader (2007), Fusarium sp. dapat menghasilkan enzim amilase
pada pati.
Pada uji hidrolisis protein dan lipid, kapang Fusarium sp. tidak dapat
tumbuh pada media SMA dan NA+lemak. Hal ini disebabkan karena penggoresan
yang tidak menyentuh permukaan agar sehingga tidak ada kapang Fusarium sp.
yang tumbuh pada media tersebut. Umumnya, kapang dapat tumbuh pada makanan
yang mengandung pati, protein, dan lipid karena kapang dapat menghasilkan
enzim hidrolitik, yaitu enzim amilase, proteinase, dan lipase untuk memecah
komponen makanan kompleks menjadi sederhana (Fardiaz, 1992). Sebenarnya
mungkin ada sedikit Fusarium sp. yang tumbuh, namun karena penampakan
pertumbuhan kapang ini bervariasi sehingga sulit untuk diidentifikasi.
Menurut Rodier (1996), Fusarium sp. termasuk mikroorganisme proteolitik dan
lipolitik yang dapat memecah protein dan lemak.
Pada uji katalase, Fusarium sp. dapat menghasilkan enzim katalase untuk
memecah senyawa beracun H2O2 pada media SA menjadi air dan oksigen yang
ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen di sekitar koloni
setelah ditetesi H2O2, tetapi karena pada media SMA dan NA+lemak tidak ada
kapang yang tumbuh sehingga tidak dapat dilakukan uji katalase. Namun
sebenarnya Fusarium sp. termasuk mikroba berkatalase positif dan juga
mikroba aerob karena H2O2 biasanya terbentuk pada metabolisme aerob.

4.3 Khamir Candida tropicalis
Tabel 4.3 Hasil uji yang dilakukan terhadap khamir Candida tropicalis
" "Pertumbuhan Khamir"
"Uji "GB "gas "+ "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "- "
" " "asam "- "
" "SB "gas "+ "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "- "
"Uji Hidrolisis Protein "- "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "+ "
" "NA + lemak "+ "

Berdasarkan sifat metabolismenya, ada dua kelompok khamir yaitu khamir
fermentatif yang dapat memecah glukosa menjadi alkohol dan CO2 melalui
jalur glikolisis EMP dan khamir oksidatif yang membutuhkan oksigen untuk
pertumbuhannya. Beberapa spesies Candida sp. bersifat oksidatif tetapi
dapat melakukan fermentasi secara lemah atau negatif juga.
Pada proses fermentasi oleh khamir, khamir yang ditumbuhkan pada media
glukosa umumnya mengandung jumlah enzim penghidrolisis disakarida dan
polisakarida yang sangat rendah. Banyak khamir yang dapat melakukan
fermentasi terhadap disakarida dan trisakarida, namun hanya beberapa
spesies khamir yang dapat memfermentasi polisakarida. Gula yang biasanya
difermentasi oleh khamir adalah galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, dan
laktosa.
C. tropicalis umumnya membentuk film pada permukaan makanan dan sering
merusak makanan yang berkadar garam dan asam tinggi. Khamir ini biasanya
digunakan untuk memecah gula dan memproduksi massa sel dari molase tebu
(Fardiaz, 1992).
Pada uji fermentasi, dapat diketahui bahwa C. tropicalis dapat
memfermentasi glukosa dan sukrosa serta menghasilkan asam dan gas yang
ditandai dengan perubahan warna media GB dari coklat menjadi kuning dan
perubahan warna media SB dari merah menjadi kuning serta terbentuknya
gelembung gas di tabung durham pada kedua media. Glukosa akan dipecah
menjadi asam piruvat yang dipecah lagi menjadi asam laktat, asam asetat,
etanol, CO2, dan metabolit-metabolit lain sedangkan sukrosa dipecah menajdi
fruktosa dan glukosa oleh enzim invertase yang diproduksi C. tropicalis.
Laktosa sendiri tidak bisa difermentasi oleh C. tropicalis karena tidak ada
perubahan warna pada media LB yang telah diberi indikator dan tidak ada
gelembung gas yang terbentuk pada tabung durham.
Pada uji hidrolisis, diketahui bahwa C. tropicalis termasuk mikroba
lipolitik, amilolitik, dan proteolitik. C. tropicalis termasuk mikroba
lipolitik karena dapat memproduksi asam secara lemah yang ditandai dengan
terbentuknya sedikit warna merah di sekitar koloni. Hal ini menunjukkan
bahwa khamir ini dapat menghasilkan enzim lipase yang memecah lemak menjadi
asam lemak dan gliserol. Asam yang terbentuk akan menurunkan pH media.
C. tropicalis juga termasuk mikroba amilolitik yang dapat menghasilkan
enzim α-amilase untuk memecah pati menjadi komponen yang lebih sederhana,
yaitu disakarida maupun monosakarida. Hal ini ditunjukkan dengan
terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi koloni setelah ditetesi
dengan yodium karena sudah tidak adanya kompleks pati-yodium yang berbentuk
biru kehitaman. Hal ini sesuai dengan teori. Menurut Azoulay (1980), C.
tropicalis mengeluarkan enzim yang dapat digunakan untuk menghidrolisis
pati, yaitu α-amylase menjadi komponen-komponen yang lebih sederhana,
terutama gula.
C. tropicalis juga menunjukkan hasil yang positif pada uji hidrolisis
protein yang ditunjukkan dengan terbentuknya areal bening yang mengelilingi
koloni C. tropicalis karena asam amino hasil hidrolisis protein dapat larut
di dalam media SMA. Hal ini cocok dengan teori yang ada. Menurut Okumura
(2006), C. tropicalis termasuk mikroba proteolitik yang dapat memecah
protein menjadi peptida dan asam amino.
Pada uji katalase, C. tropicalis bersifat katalase positif untuk semua
media yang ada. Hal ini menunjukkan bahwa khamir ini memiliki enzim
katalase yang dapat digunakan untuk menguraikan hidrogen peroksida menjadi
air dan oksigen yang ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas
di sekitar koloni setelah diteteskan H2O2.

4.4 Air Tajin
Tabel 4.4 Hasil uji yang dilakukan terhadap air tajin
" "Pertumbuhan "
" "Mikroba "
"Uji "GB "gas "+ "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "+ "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "+ "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "+ "
"Uji Hidrolisis Protein "+ "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "+ "
" "NA + lemak "+ "

Beras yang difermentasi akan menghasilkan miso yang biasanya digunakan
untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa makanan. Pertama-tama, air
beras diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi proses
fermentasi pada suhu 400C secara aerobik. Agar dapat ditumbuhi kapang,
beras ini harus daalm keadaan basah. Beras berkapang disebut koji yang
merupakan stater untuk fermentasi.
Campuran bahan dengan garam, koji, kedelai, miso, dan air difermentasi
pada suhu 280C selama seminggu secara aerobik, lalu campuran ini dimasukkan
ke dalam tong untuk memulai fermentasi kedua dengan menggunakan khamir
Saccharomyces rouxii pada suhu 350C selama 2 bulan secara anaerobik. Pada
fermentasi ini, bakteri-bakteri asam laktat akan ikut berperan (Buckle et
al., 1987).
Dari hasil percobaan, diketahui bahwa mikroba-mikroba yang tumbuh di air
tajin dapat memecah glukosa, sukrosa, laktosa menjadi asam dan gas yang
ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi kuning dan
terbentuknya gas pada tabung durham. Hasil pemecahan komponen karbohidrat
di air tajin akan menghasilkan produk akhir, berupa miso yang dapat dipakai
untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa pada makanan. Selain itu, juga
dihasilkan asam laktat, alkohol, enzim, CO2, dan produk-produk lainnya.
Mikroba-mikroba yang ada di dalam air tajin adalah bakteri-bakteri asam
laktat, kapang Aspergillus oryzae, dan khamir Saccharomyces rouxii.
Bakteri asam laktat akan memecah gula dan menghasilkan asam laktat
sebagai produk akhir serta menurunkan pH lingkungan pertumbuhannya akibat
terbentuknya asam. Aspergillus oryzae dapat menghasilkan enzim protease
untuk membuat minuman beralkohol dari nasi sedangkan S. rouxii bersifat
osmofilik dan tahan dengan kandungan gula yang tinggi (Fardiaz, 1992).
Mikroba-mikroba di air tajin juga menunjukkan hasil yang positif pada uji
hidrolisis karbohidrat, protein, dan lemak. Mikroba-mikroba ini termasuk
mikroba amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Hal ini ditunjukkan dengan
terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi koloni pada media SA,
koloni yang dikelilingi areal bening pada media SMA, dan terbentuknya
daerah yang berwarna merah di bagian bawah koloni pada media NA.
Pada uji katalase, mikroba-mikroba ini juga termasuk katalase positif
yang ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil O2 pada koloni.
Hal ini berarti mikroba-mikroba ini memiliki enzim katalase yang dapat
memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.

4.5 Air Rendaman Tahu
Tabel 4.5 Hasil uji yang dilakukan terhadap air rendaman tahu
" "Pertumbuhan "
" "Mikroba "
"Uji "GB "gas "+ "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "+ "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "+ "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "+ "
"Uji Hidrolisis Protein "+ "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "+ "
" "NA + lemak "+ "

Tahu dibuat dari kacang kedelai yang direndam dan didedak hingga menjadi
suatu campuran antara air dengan kacang kedelai. Campuran ini disaring
sehingga hanya susu kedelai yang dapat lewat. Susu kedelai kemudian diberi
garam, seperti magnesium klorida atau kalsium sulfat agar menggumpal.
Selanjutnya, gumpalan ini di-press menjadi potongan tahu. Menurut Ewald
(1997), bakteri yang biasa berperan di dalam fermentasi tahu adalah
Bacillus cereus.
Pada percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa mikroba di air tahu dapat
melakukan fermentasi terhadap semua komponen karbohidrat yang ada, baik
glukosa, sukrosa, maupun laktosa. Fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa
ditandai dengan terbentuknya asam pada media yang dilihat dari perubahan
indikator pada media menjadi kuning dan gas yang terdapat pada tabung
durham. Glukosa akan dipecah menajdi asam piruvat yang dipecah lagi menjadi
asam laktat dan CO2 atau etanol sedangkan enzim invertase memecah sukrosa
menjadi fruktosa dan glukosa. Laktosa dipecah oleh enzim β-galaktosidase
menjadi galaktosa dan glukosa.
Pada uji hidrolisis, mikroba yang ada di air tahu termasuk mikroba
amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya
daerah transparan yang mengelilingi koloni pada media SA, areal bening di
sekitar koloni pada media SMA, dan terbentuknya warna merah di bawah koloni
pada media NA+lemak. Hal ini sesuai dengan teori yang ada. B. cereus
termasuk bakteri lipolitik dan proteolitik (Fardiaz, 1992) dan juga bakteri
amilolitik (Kim, 2004).
Dari uji katalase, diketahui bahwa mikroba di air tahu termasuk mikroba
aerob yang dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.
Mikroba ini dapat menghasilkan enzim katalase untuk semua media yang ada.
Hal ini cocok dengan teori yang ada. B. cereus berkatalase positif
(Fardiaz, 1992).


6. Air Sayur Asin
Tabel 4.6 Hasil uji yang dilakukan terhadap air sayur asin
" "Pertumbuhan "
" "Mikroba "
"Uji "GB "gas "- "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "- "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "- "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "+ "
"Uji Hidrolisis Protein "+ "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "+ "
" "NA + lemak "+ "

Sayur asin terbuat dari kobis yang diasamkan. Kobis yang telah diiris-
iris dimasukkan ke dalam tangki yang berisi air garam. Air dan nutrisi di
jaringan sayuran akan ditarik oleh garam sebagai substrat untuk pertumbuhan
bakteri asam laktat. Garam dan asam yang dihasilkan dari proses fermentasi
dapat menghambat pertumbuhan mikroba lain. Fermentasi diawali oleh bakteri
Leuconostoc mesenteroides dan diteruskan oleh Lactobacillus delbrückii yang
lebih tahan terhadap asam. Fermentasi dilakukan pada suhu antara 25-300C
dalam waktu 2-3 minggu (Buckle et al., 1987). Pada sayur asin, juga dapat
tumbuh khamir (Fardiaz, 1992).
Dari hasil percobaan uji fermentasi, dapat diketahui bahwa mikroba-
mikroba yang ada di air sayur asin dapat memecah glukosa, laktosa, dan
sukrosa menjadi asam. Asam ini dapat berupa asam laktat yang merupakan asam
utama pada proses fermentasi ini. Terbentuknya asam ditandai dengan
perubahan warna media LB dari biru keunguan menjadi kuning, media SB yang
berubah warna dari merah menjadi kuning, dan media GB yang berubah warna
dari coklat menjadi kuning. Seharusnya, pada percobaan fermentasi ini
dihasilkan gas pada tabung durham karena bakteri Leuconostoc sp. dapat
memfermentasi gula menjadi asam laktat dan CO2 atau asam asetat (Fardiaz,
1992). Hal ini dapat terjadi karena gas yang terbentuk kurang banyak
sehingga sulit untuk diamati.
Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang dapat memfermentasikan
gula menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol. Bakteri ini juga bersifat
halofilik sehingga dapat tahan dengan kadar garam yang tinggi dan berperan
penting dalam fermentasi awal bahan pangan yang mengandung kadar garam
tinggi, seperi pikel dan sauerkraut. Selain itu, bakteri ini dapat
melakukan fermentasi secara cepat sehingga dapat mencegah pertumbuhan
bakteri lain. Pada fermentasi sukrosa, akan dihasilkan juga lendir
berlebih.
Lactobacillus delbrückii bersifat homofermentatif dan sering ditemui pada
fermentasi pikel. Bakteri ini akan memecah gula menjadi asam laktat sebagai
produk akhirnya (Fardiaz, 1992).
Pada uji hidrolisis pati, mikroba-mikroba yang ada di sayur asin
menunjukkan hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya daerah
transparan di sekitar koloni. Mikroba-mikroba ini dapat menghasilkan enzim
amilase yang dapat digunakan untuk memecah pati menjadi komponen yang lebih
sederhana. Mikroba-mikroba ini juga termasuk mikroba lipolitik dan
proteolitik yang masing-masing dapat digunakan untuk memecah lemak dan
protein. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah di bawah
koloni pada media NA+lemak dan areal bening di sekitar koloni pada media
SMA.
Mikroba ini juga termasuk mikroba yang dapat menghasilkan enzim katalase
untuk memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen yang
ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas O2 di sekitar
koloni setelah diteteskan dengan H2O2. Walaupun sebagian besar mikroba yang
ada di air sayur asin merupakan bakteri berkatalase negatif, tetapi mungkin
ada mikroba lain seperti khamir yang dapat menghasilkan enzim katalase.

7. Air Asinan
Tabel 4.7 Hasil uji yang dilakukan terhadap air asinan
" "Pertumbuhan "
" "Mikroba "
"Uji "GB "gas "+ "
"Fermentasi " "asam "+ "
" "LB "gas "+ "
" " "asam "+ "
" "SB "gas "+ "
" " "asam "+ "
"Uji Hidrolisis Pati "+ "
"Uji Hidrolisis Protein "+ "
"Uji Hidrolisis Lemak "+ "
"Uji Katalase"SA "+ "
" "SMA "+ "
" "NA + lemak "+ "

Asinan biasanya terbuat dari sayur-sayuran atau buah-buahan. Sayuran dan
buah-buahan biasanya berkadar gula tinggi dan dibutuhkan untuk pertumbuhan
bakteri asam laktat. Ada empat faktor yang mempengaruhi fermentasi sayuran,
yaitu kondisi anaerobik, kadar garam yang cukup untuk menyerap nutrient,
suhu yang sesuai, dan adanya bakteri asam laktat yang dibutuhkan. Bakteri
asam laktat yang sering dipakai dalam fermentasi syuran adalah Leuconostoc
mesenteroides dan Lactobacillus (Buckle et al., 1987).
Pada uji fermentasi, bakteri-bakteri asam laktat pada air asinan dapat
memfermentasikan komponen-komponen karbohidrat, seperti sukrosa, laktosa,
dan glukosa menjadi asam dan gas. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH
media sehingga media yang mengandung indikator BCP akan mengalami perubahan
warna menjadi kuning bila terbentuk asam. Hal ini ditandai dengan
perubahan warna media LB dari biru keunguan menjadi kuning, media GB yang
berubah warna dari cokelat menjadi kuning, dan media SB yang berubah warna
dari merah menjadi kuning. Asam yang dihasilkan dapat berupa asam laktat
atau asam asetat. Pada percobaan ini, juga dihasilkan gas yang ditangkap
oleh tabung durham dan tampak sebagai gelembung udara. Gas tersebut
merupakan CO2 sebagai produk samping hasil fermentasi.
Bakteri Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang akan memecah gula
menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol/asam asetat. Bakteri ini juga
termasuk bakteri halofilik yang tahan kadar garam tinggi dan dapat
melakukan fermentasi secara cepat dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri
lain sedangkan Lactobacillus sp. bersifat homofermentatif dan memecah gula
menjadi asam laktat (Fardiaz, 1992).
Pada uji hidrolisis pati, bakteri-bakteri di air asinan akan membentuk
daerah transparan yang mengeliling koloni setelah diteteskan dengan lugol.
Hal ini menunjukkan bahwa baketri-bakteri di air asinan memiliki enzim
amilase yang dapat memecah pati menjadi komponen karbohidrat yang lebih
sederhana, terutama glukosa.
Pad uji hidrolisis protein, terbentuk areal bening yang mengelilingi
koloni pada media SMA. Hal ini berarti bakteri-bakteri di air sayuran
termasuk bakteri proteolitik yang memiliki enzim proteinase yang dapat
digunakan untuk memecah protein menjadi peptida dan asam amino. Bakteri-
bakteri ini juga termasuk bakteri lipolitik yang ditandai dengan
terbentuknya warna merah di bagian bawah koloni pada media NA+lemak
sehingga dapat diketahui bahwa bakteri ini memiliki enzim lipase yang dapat
memecah lemak menjadi gliserol dan asam lemak yang akan menurunkan pH
medium.
Bakteri-bakteri ini juga menunjukkan hasil yang positif pada uji
katalase. Namun sebenarnya, bakteri-bakteri yang ada di sayuran berkatalase
negatif, seperti Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. Hal ini mungkin
disebabkan kontaminasi dari mikroorganisme lain yang berkatalase positif
atau hidrogen peroksida (H2O2) yang ditambahkan terlalu banyak sehingga
reaksinya menjadi berlebihan.

4.8 Pewarnaan Gram
Tabel 4.8 Hasil pewarnaan Gram pada sampel
"Kelompok"Sampel "Gram + "Bentuk"Gram – "Bentuk"
" " "(%) " "(%) " "
"1 "Air tajin "79,41 "kokus "20,59 "kokus "
"2 " "64,84 "kokus "35,16 "kokus "
"3 "Air rendaman tahu"81,35 "kokus "18,65 "kokus "
"4 " "100 "kokus "- "- "
"5 "Air sayur asin "100 "kokus "- "- "
"6 " "100 "kokus "- "- "
"7 "Air asinan "86,1 "kokus "13,9 "kokus "
"8 " "45,18 "basil "55,82 "kokus "

Pada pewarnaan Gram air tajin, dapat dilihat bahwa kebanyakan bakteri-
bakteri yang ada di air tajin merupakan bakteri asam laktat, seperti
Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, dan Pediococcus yang bergram
positif dengan persentase antara 65-80% dan sisanya yaitu antara 20-35%
merupakan bakteri Gram negatif. Hal ini menunjukkan bakteri di air tajin
memiliki dinding sel yang sebagian besar tersusun dari peptidoglikan,
kebutuhan akan nutrient relatif kompleks, dan lebih tahan terhadap
perlakuan fisik.
Kebanyakan bakterinya berbentuk kokus, yaitu Streptococcus dan
Pediococcus yang homofermentatif serta Leuconostoc yang bersifat
heterofermentatif, namun ada satu bakteri bergram positif yang berbentuk
diplobasil, yaitu Lactobacillus yang bisa bersifat homofermentatif atau
heterofermentatif.
Dari pewarnaan Gram air rendaman tahu, bahwa bakteri utama di air tahu
adalah bakteri Gram positif dengan persentase 80-100%, yaitu bakteri
Bacillus cereus dan sisanya merupakan bakteri Gram negatif dengan
persentase 0-18,65%. Semua bakterinya berbentuk kokus pada saat pengamatan,
padahal Bacillus cereus sendiri berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi
karena adanya kesalahan pengamatan mikroskopik.
Pada percobaan pewarnaan Gram air sayur asin, diketahui bahwa bakteri-
bakteri di sayur asin 100% merupakan bakteri Gram positif yang ditunjukkan
dengan koloni yang semua berwarna ungu pada saat pengamatan mikroskopik.
Hal ini cocok dengan teori yang ada karena Leuconostoc sp. dan
Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz, 1992). Dari pengamatan,
diketahui bahwa semua bakteri di sayur asin berbentuk kokus, yaitu
Leuconostoc sp., tetapi pada air sayur asin masih ada bakteri Lactobacillus
sp. yang berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi karena areal pandang yang
diambil terlalu sedikit sehingga bakteri yang berbentuk batang tidak
kelihatan.
Pada pewarnaan Gram air asinan, diketahui bahwa bakteri-bakteri di
sayuran 45-86% merupakan bakteri Gram positif sedangkan 14-56% merupakan
bakteri gram negatif. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang ada karena
Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz, 1992).
Kesalahan ini mungkin disebabkan kontaminan bakteri lain yang bergram
negatif atau kesalahan pengamatan mikroskopik. Bentuk bakterinya kebanyakan
kokus, yaitu Leuconostoc sp. dan ada juga yang berbentuk basil, yaitu
Lactobacillus sp.













































BAB V
KESIMPULAN



Fermentasi adalah proses pemecahan molekul, seperti karbohidrat dan asam
amino tanpa membutuhkan oksigen sedangkan hidrolisis adalah proses
pemutusan ikatan molekul dengan penambahan air. Berdasarkan sifat pemecahan
komponen makanan, ada mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik,
pektinolitik, dan osmofilik. Mikroba aerob juga dapat memecah H2O2 menjadi
air dan O2.
Bacillus cereus dapat melakukan fermentasi terhadap komponen karbohidrat
dan menghasilkan asam, termasuk bakteri amilolitik, proteolitik, lipolitik,
berkatalase positif, dan bergram positif. Fusarium moniliforme hanya dapat
memfermentasi laktosa dan sukrosa menjadi asam, merupakan mikroba
amilolitik, proteolitik, lipolitik, dan berkatalase positif. Candida
tropicalis hanya dapat memfermentasi glukosa dan sukrosa serta termasuk
mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik dan berkatalase positif.
Air tajin mengandung bakteri asam laktat, Aspergillus oryzae, dan
Saccharomyces rouxii yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan
glukosa, termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase
positif, kebanyakan bergram positif, dan berbentuk kokus. Pada air rendaman
tahu, terdapat bakteri Bacillus cereus yang dapat memfermentasi sukrosa,
laktosa, dan glukosa, termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik,
berkatalase positif, dan kebanyakan bergram positif.
Air sayur asin dan air sayuran mengandung Leuconostoc mesenteroides dan
Lactobacillus delbrückii yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan
glukosa, termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase
negatif, kebanyakan bergram positif dan berbentuk kokus, tetapi ada juga
yang berbentuk basil.








LAMPIRAN


"Areal Pandang "Jumlah bakteri Gram "Jumlah bakteri Gram "
" "+ "- "
"1 "7 "- "
"2 "12 "4 "
"3 "34 "14 "
"4 "26 "7 "
"5 "57 "12 "
"Rata-rata "27 "7 "

% Bakteri Gram + = 27 × 100 % = 79,41%
27+7
% Bakteri Gram - = 7 × 100 % = 20,59%
27+7




















DAFTAR PUSTAKA


Azoulay, Edgard. "Fermentation Methods for Protein Enrichment of Cassava
and Corn with Candida tropicalis," AEM Online. Home pageon-line.
Available from
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=291281
; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Buckle, K. A., dkk. Ilmu Pangan. Jakarta: UI Press, 1987.

Doctorfungus. "Candida sp.," Doctorfungus Online. Home pageon-line.
Available from http://www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.htm;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Engsterhold, Robert. "Untersucht Bacteria Gruppe: E. coli," UL Online. Home
page on-line. Available from http://wwwstud.uni-
leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/mainFrame.htm; Internet; accessed 18
Agustus 2007.

Ewald, Heather T. "Micro-organisms for Education," TCWM Online. Home pageon-
line. Available from http://www.science-projects.com/safemicrobes.htm;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Fardiaz, Srikandi. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT Raja Garfindo
Persada, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: PT Gramedia Pustaka
Utama, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor: IPB Press,
1992.

Johnson. "Carbohydrate Fermentation," MicroVision Online. Home page on-
line. Available from
http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cho.html; Internet;
accessed 18 Agustus 2007.

Kim, H, J., dkk. "Characterization of Bacillus cereus Isolates from Raw
Soybean Sprouts," Sproutnet Online. Home page on-line. Available from
http://www.sproutnet.com/Research/characterization_of_bacillus_cer.html;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Lay, Bibiana W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo
Persada, 1994.

Loi, Enrico. "Batteri," ECplanet Online. Home page on-line. Available from
http://www.ecplanet.com/canale/scienza-1/batteri-
66/0/0/6855/it/ecplanet.rxdf ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Mader, Algacyr M. "Culture Medium for Amylase Production by Toxigenic
Fungi," Scielo Online. Home page on-line. Available from
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132000000
500003; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Madigan, Michael T., John M. Martinko, and Jack Parker. Brock Biology of
Microrganisms. USA: Prentice Hall International, 1997.

Okumura, Yoshiyuki, dkk. "Isolation & Characterization of aNovel Acid
Proteinase, Tropiase from Candida Tropicalis IFO 0589," JSMM Online. Home
page on-line. Available from http://www.jsmm.org/common/jjmm48-1_019.pdf;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rodier, M. H, dkk. "Purification of an intracellular metallopeptidase of Mr
45000 in Fusarium moniliforme," Cambridge Online. Home page on-line.
Available from
http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=4
1943; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rohmhaas. "Fusarium," Rohmhaas Online. Home page on-line. Available from
http://www.rohmhaas.com/rhcis/markets_and_products/images/microorganisms/G
allery/fusarium_mycelium.jpg&imgrefurl; Internet; accessed 18 Agustus
2007.

Rossbach. "Starch Hydrolysis Medium," Bios Online. Home page on-line.
Available from
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Starch%20Hydrol
ysis%20Medium.html; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Tugmon, Cathy R. "Skim Milk Agar," Biol Online. Home page on-line.
Available from http://www.aug.edu/biology/skimmilkpage2.htm; Internet;
accessed 18 Agustus 2007.

Volk, Wesley A. dan Margaret F. Wheeler. Mikrobiologi Dasar. Jilid 1. Edisi
kelima. Jakarta: Erlangga, 1993.

Winarno, F. G. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama,
1995.