ÓPTICA Y MICROSCOPÍA
CÉSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS
Agosto DEL 2006
Concepto de luz. La luz es una forma de energía radiante electr electroma omagné gnétic ticaa que perc percibi ibimos mos con el el sentid sentidoo de la visión La luz es la porción visible de la energía radiante !e considera a la luz como un fenómeno electromagnético" por lo tanto est# constituida por partículas electromagnéticas deno denomin minada adass !otone"# qu quee se desp despla laza zann a trav través és del del espacio espacio a una velocid velocidad ad constante" constante" siguiendo siguiendo tra$ecto tra$ectorias rias rectilíneas" con un movimiento ondulatorio $ propag#ndose en el vacío" en el aire $ a través de todos los cuerpos transparentes como el agua $ el vidrio La luz es irradiada irradiada a través través del espacio espacio en todas todas las direcciones !u movimiento ondulatorio se propaga en línea recta recta $ la veloc velocida idadd de esta esta propag propagaci ación ón dep depend endee de la dens densid idad ad del medi edio tra trans nspa pare rent ntee que que atra atravi vieesa El sol emite emite energía energía radiante electrom electromagnétic agnéticaa %espectr %espectroo radiante& compuesta compuesta por energía energía radiante visible visible %luz&" %luz&" $ energía energía radiante radiante invisib invisible le como como las radiac radiacion iones es ultravioleta %'(& e infrarro)a $ otras radiaciones que se grafican en la figura luz *
un ra$o luminoso posee las características del movimiento ondulatorio
P%op'ed&de" de un& ond& lu$'no"&. lu$'no"&. La figura luz 2 nos mues muestra tra el esqu esquem emaa de una on onda da de luz" en el que se observan las c%e"t&" )&+ de la onda así como sus valles (b). !e denomina un ciclo de la onda a la distancia recorrida por el fotón entre dos crestas o dos valles Las propiedades propiedades de una onda luminosa son Longitud d de onda Es la distancia que e-iste a& Longitu entre dos crestas o dos valles sucesivos de la onda luminosa Las Las long longit itud udes es de on onda da de la luz luz son son mu$ mu$ pequ peque1 e1as as 3eneralmente se miden en nanómetros (nm& (nm& o en angstroms (Å). !i (Å). !i observamos la figura luz * nos percataremos que las longit longitude udess de ond ondaa del espec espectro tro radiante radiante visib visible le abarca abarcann entre 400 nm. (color violeta) a 700 nm. (color rojo).
La longitud de una onda luminosa se e-presa por la letra griega lambda % λ& E-is E-iste tenn otra otrass form formas as de ener energí gíaa radia radiante nte qu quee po pose seen en longit longitude udess de ond ondaa muco muco menore menoress como como la radiac radiación ión ultravioleta" los ra$os ." la radiación de electrones" los ra$os gamma $ a4n m#s cortas como los ra$os cósmicos Entre las formas de energía cu$as longitudes de onda son m#s largas que las de la luz" est#n consideradas la radiación infrarro)a %calór %calórica ica&& $ las ondas de radio radio que suelen suelen medir medir varios varios metros de longitud Las diferentes longitudes de onda de la luz son percibidas como colo%e". Esto significa que cada color observado por el o)o umano o captado por el material fotogr#fico sensible se debe a la estimulación por una determinada longitud de onda del az luminoso
$ue"t%&n %&n l&" l&" d'!e% d'!e%ent ente" e" lon(' lon('tud tude" e" de ond& ond& +igu +igura ra Luz Luz * Se $ue"t
)n&n*$et%o"+ del e"pect%o elect%o$&(n,t'co. L& luz ocup& un pe-ueo e"p&c'o en todo el e"pect%o % &d'&nte. &d'&nte.
,omo se puede apreciar" apreciar" la luz ocup ocupaa una zona mu$ reduci reducida da en el con)u con)unto nto de ond ondas as elect electrom romagn agnéti éticas cas del espec espectro tro total" total" tambié tambiénn integrad integradoo por un grupo grupo de ond ondas as invisibles que abarcan" desde un e-tremo a otro" a los ra$os cósmicos cósmicos"" ra$os ra$os gamma" gamma" ra$os ra$os ." radiación radiación ultraviolet ultravioleta" a" ra$os infrarro)os" microondas" ondas de /(" de radio" rad io" etc A pesar que estas radiaciones son invisibles al o)o umano" vari varias as de ella ellass pu pued eden en esti estimu mula larr los los comp compon onen ente tess fotosensibles del material fotogr#fico" como por e)emplo los ra$os . (radiografías) " los ra$os ra$os gamma (gammagrafías) " (fotog ogra rafí fías as obte obteni nida dass con con el aces de electrones (fot microscopio electrónico) $ las fotografías que se captan con inst instru rume ment ntos os espe especi cial ales es %mic %micro rosc scop opio ioss $ c#ma c#mara rass fotogr#f fotogr#ficas& icas& que “iluminan” o irradian irradian a los los ob ob)e )eto toss con ra$os ultravioleta (fluorescencia) o con radiación infrarro)a
'n az de luz blanca es visualizado como tal" cuando lo integran una mezcla uniforme de ra$os luminosos de todas las longitudes de onda El o)o umano percibe el color porque la retina contiene dos cono" ) perciben tipos tipos de célul células as nervio nerviosas sas foto fotose sensi nsible bless cono" perciben colores + $ /&"tone" %captan sensaciones de blanco $ negro& Los conos" a su vez" vez" son son células células que depen dependie diendo ndo de la longitud de onda que los estimula" captan los tres tipos de colores primarios azul" verde $ ro)o El materia materiall foto fotogr# gr#fic ficoo sensib sensible le %pelíc %película ulass $ pap papele eles& s& a colores" posee tres capas sensibles para cada una de estas long longit itud udes es de on onda dass lumi lumino nosa sas" s" po porr lo tanto tanto debe debemo moss considerar que el espectro visible que capta este material est# integrado por los citados ra$os luminosos
Los Los !otone" son partículas sumamente peque1as" de masa igua igualm lmen ente te pequ peque1 e1aa qu quee no pu pued edee ser ser medi medida da pero pero poseedoras de gran energía que" al desplazarse en el espacio lo acen de manera ondulatoria ondulatoria $ en línea recta" por lo tanto *
+igura luz 2 E"-ue$& de un& ond& lu$'no"& $o"t%&ndo "u lon('tud 0
"u &$pl'tud.
b& mplitud de onda. Es la distancia que e-iste entre la parte superior e inferior de la onda %fig luz 2& La amplitud de onda onda le confi onfier eree a un ra$ ra$o lumi lumino noso so"" la intensidad sin modificar el color Esto significa luminosa o brillante! sin que si un az luminoso de un color determinado es m#s intenso o m#s brillante que otro del mismo color es porque la amplitud de onda del primero es ma$or que la del segundo
C&%&cte%1"t'c&" de l& luz. En un determinado medio la luz
se desplaza en línea recta $ con una velocidad constante La luz se desplaza también en un espacio relativamente vacío $ en el vacío total" esto a diferencia diferencia de las ondas sonoras $ de las ondas de agua que requieren de un medio material para que puedan e-istir $ desplazarse ,uando un ra$o luminoso pasa de un medio menos denso %aire" por e)emplo& a otro transparente de ma$or densidad" como el agua" vidrio o pl#stico" su velocidad disminu$e !in embargo" si abandona este medio m#s denso $ se desplaza nuevamente en el medio menos denso" recobra su velocidad original Estos cambios de velocidad son importantes pues producen una de las características de la luz l& %e!%&cc'*n. La luz que se origina de una fuente emisora se desplaza o irradia en todas direcciones De tal forma que su energía se dispersa a medida que se ale)a de su punto de origen5 por lo tanto" la energía luminosa que incide sobre una superficie situada a cierta distancia ser# menor que la que incide sobre la misma superficie pero situada m#s cerca de la fuente emis emisor ora a Este Este ec ecoo se perc percib ibee como como un camb cambio io en la luminosidad ,uando la luz se desplaza a través del aíre suele llegar a la superficie de alg4n ob)eto %fig luz& $" en ese punto la luz puede ser "eflejada . Las superficies de los ob)etos no transparentes refle)an o 7rebotan8 la luz
La energía total de un az luminoso que llega a un ob)eto %luz incidente& debe equivaler a la suma de la energía de la luz refle)ada" absorbida $ trasmitida El material material óptic ópticoo que trasmi trasmite te los los ra$os ra$os luminoso luminosos" s" de acuerdo acuerdo a una disposición disposición $ orientaci orientación ón definida definida $ regular de sus moléculas" se denomina t%&n"p&%ente. !i trasmite trasmite la luz pero desordena el tra$ecto de los ra$os $ los dirige en todas las direcciones" recibe el nombre de t%&n"l4c'do. !i un material absorbe la ma$oría de los ra$os luminosos se dice que es op&co
5&z lu$'no"o
;aterial transl4cido +igu +igura ra luz luz < Reco%%' Reco%%'do do de lo" %&0o" %&0o" lu$' lu$'no" no"o" o" en un $&te%'&l
t%&n"l4c'do.
,uando un ra$o ra$o luminoso luminoso emitido emitido en un medio medio de menor menor densid den sidad ad incide incide sobr sobree un cuerp cuerpoo transpar transparente ente de ma$or ma$or densidad densidad $ que posee superfici superficies es planas %un vidrio grueso" grueso" por e)emplo& lo puede acer en varios #ngulos de incidencia Depend Dep endien iendo do del #ngu #ngulo lo de incide incidenci nciaa el ra$o ra$o lumino luminoso so e-perimenta varios fenómenos
&+ !i lo ace perpendicularmente a la superficie del cuerpo trasparente El ra$o luminoso lo atraviesa sin e-perimentar ning4n tipo de desviación en su tra$ectoria %figluz6a& La modificación modificación que e-perimenta es disminuir su velocidad La velocidad de la luz es de 00"000 =m>sg en el aire Al atravesar atravesar ese medio transparente %vidrio& su velocida velocidadd se reduce reduce a 200" 000 ?m>sg ?m>sg @or lo tanto tanto el vidrio vidrio tendr# tendr# un poder de refracción de *< pues el índice de refracción se e-presa así
9adiación de calor
)&+
)/+
+igura luz a& luz %e!le2&d&5 b& luz &/"o%/'d& el ob)eto es opaco %no transparente&" la luz no refle refle)ad )adaa en su superf superfici iciee es absor absorbid bidaa por el ob)et ob)etoo $ desaparece La energía luminosa absorbida se transforma en energía calórica dentro del ob)eto
bsorbida. !i
#ransmitida .
!i el ob)eto es transparente" la ma$or parte del az luminoso lo atraviesa $ contin4a su desplazamiento a través del mismo
+igu +igura ra luz : Ond&" lu$'no"&" t%&n"$'t'd&" & t%&3," de un o/2eto
t%&n"p&%ente.
velocidad velocidad de la luz en el aire I R velocidad velocidad de la luz en el medio La cifra e-presa la relación que e-iste entre la velocidad de la luz en el aire $ su velocidad en el medio transparente util utiliza izado do De la mism mismaa maner manera" a" se pu pued eden en ob obte tene nerr los los índices índices de refra refracci cción ón de una serie serie de sustan sustancia ciass que se utilizan tanto en microscopía como en fotografía o en otras actividades en las que se utilizan medios ópticos A continuación se muestran los índices de refracción de una serie de sustancias transparentes
Su"t&nc'& Bndice de refracción t%&n"p&%ente Aire *000 Agua *00 +luorita *::0 3licerina *:C00 Aceite de inmersión *<*<0 2
(idrio +lint irconia Diamante !ulfuro de plomo
*<200 *6600 *200 2:200 *00
seg4n la le$ de !nell" los diversos colores de la luz son refractados $ desviados en distinto grado luz
T&/l& 6. Fndices de refracción de diversas sustancias transparentes
/
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&'%e
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7/
:
+igura luz C D'"pe%"'*n de un :&z de luz /l&nc&; &l &t%&3e"&% un p%'"$&; en %&0o" lu$'no"o" de d'!e%ente" lon('tude" de ond&.
3'd%'o
&'%e
8
7c
+ig luz 6 G El e"-ue$& %ep%e"ent& l& t%&0ecto%'& de t%e" %&0o" lu$'no"o" )3'd%'o+.
-ue 'nc'den en l& "upe%!'c'e de un cue%po t%&n"p&%ente
/+ El ra$o luminoso incide de manera oblicua sobre la superficie" en un #ngulo equivalente a :< o grados o menos En estas condiciones" el ra$o luminoso no atraviesa el cuerpo transparente" $ 7rebota8 sobre su superficie" en un #ngulo similar al de incidencia %fig luz 6b& A esta característica se le denomina %e!le9'*n de la luz $olor de un objeto
!i un ob)eto coloreado" opaco o transparente" es iluminado por un az de luz blanca" refle)ar# o trasmitir# 4nicamente los ra$os luminosos que tengan una longitud de onda similar al del color del ob)eto Los ra$os luminosos de otras longitudes de onda que componen el az de luz blanca ser#n absorbidos por el ob)eto De la misma manera" si el ob)eto refle)a todas las longitudes de onda del az luminoso que incide sobre él" la sensación de color que percibimos ser# el “color” blanco En cambio si absorbe todas las longitudes de onda" la sensación visual ser# la del “color” negro.
c+ El ra$o luminoso incide de manera oblicua sobre la superficie en #ngulos ma$ores a :< o grados En este caso el ra$o luminoso se desvía en su tra$ectoria acerc#ndose acia el ra$o que incide de manera perpendicular %ra$o 7a8 o normal & $ no se desvía Al abandonar el medio transparente $ discurrir en el medio de menor densidad" el ra$o luminoso vuelve a desviarse %fig luz6c&" pero aora ale)#ndose de la normal A esta característica del ra$o luminoso se le denomina %e!%&cc'*n.
D'"pe%"'*n o de"co$po"'c'*n de l& luz. La velocidad de un ra$o de luz" en un medio depende de su longitud de onda Los ra$os luminosos de ondas cortas pierden m#s velocidad que aquellos de ondas largas5 un ra$o de luz azul se desplaza m#s lentamente que un ra$o de luz ro)a" esto significa que el índice de refracción de un cuerpo transparente varía con la longitud de onda del ra$o luminoso que lo atraviese @or lo tanto"
Esta propiedad por la que las ondas luminosas de diferente longitud" integrantes de un az de luz blanca" se desplazan a diferente velocidad en un cuerpo transparente $ e-perimentan desviaciones en su recorrido en diferentes grados de desviación se denomina d'"pe%"'*n o de"co$po"'c'*n de la luz El e)emplo m#s evidente es el que se produce cuando un az de luz blanca incide en la superficie de un prisma Las diferentes longitudes de onda de los ra$os acen que estos se refracten $ dispersen en #ngulos distintos ocasionando que por la superficie opuesta del prisma emer)an los ra$os luminosos de distintos colores Los ra$os violetas $ azules se refractan m#s $ su grado de desviación ser# ma$or que los ra$os de color naran)a o ro)o %+igluzC&
Pol&%'z&c'*n de l& luz La luz irradiada por un cuerpo emisor se desplaza en forma rectilínea en todas las direcciones del espacio $ las ondas luminosas oscilan en todos los planos perpendiculares a su desplazamiento" es decir" en #ngulos rectos con respecto a dicas tra$ectorias %fig luz H& !i en el camino que siguen los ra$os se interpone un dispositivo que tenga un arreglo molecular de sus componentes en forma de re)illas mu$ finas orientadas en un solo plano % prismas o filtros de polarización&" el ra$o luminoso que continuar# su recorrido ser# aquel cu$o plano de vibración coincida con la orientación del dispositivo5 en cambio" los otros ra$os luminosos detendr#n su tra$ectoria !e afirma que el ra$o que contin4a vibrando" al atravesar la re)illa de polarización" es un ra$o luminoso polari!ado. 'n az de lu! polari!ada esta integrado por ra$os luminosos que vibran en una sola dirección o en un solo plano de polarización
+igura luz H Se $ue"t%& l& $&ne%& co$o "e (ene%& luz pol&%'z&d&.
Inte%!e%enc'& de lo" %&0o" lu$'no"o". Dos ondas luminosas que se emiten desde un mismo punto $ discurren paralelas
entre sí aciendo coincidir sus cimas $ valles %se dice que las ondas luminosas est#n en fase&" suman sus intensidades %brillantez& $ al incidir sobre un ob)eto lo iluminan con ma$or intensidad o brillantez %fig luz a& En cambio" si dos ondas luminosas discurren ligeramente desfasadas" en un I ó en J longitud de onda % contraste de fases de las ondas luminosas& la intensidad de ellas se anula" de manera parcial o total" respectivamente %fig luz b $ c& Esto se traduce en que el ob)eto iluminado por ellas recibir# la mitad de la intensidad luminosa %*>: de desfase& o al anularse totalmente %*>2 de desfase& no ser# iluminado A este comportamiento de dos ondas luminosas desfasadas se le denomina interferencia
+igura
luz E"-ue$&" -ue %ep%e"ent&n el %eco%%'do de ond&" lu$'no"&" cu&ndo e"t8n en &+ !&"e; /+ de"!&"&d&" en < de lon('tud de ond& 0 c+ en un = de lon('tud de ond&.
LENTES. !e denominan lentes a ciertos aditamentos transparentes %vidrio" pl#stico" etc& que presentan por lo menos una de sus superficies curvas E-isten dos tipos de lentes Lente" con3e%(ente" o po"'t'3&" !e caracterizan porque concentran los ra$os luminosos paralelos que se desplazan a través de ellas" en un punto denominado !oco. !e reconocen como tales porque son m#s gruesas en la parte central $ m#s delgadas en la parte periférica E-isten tres clases de lentes convergentes o positivas" como se muestra en la figura luz
)&+
)/+
)c+
+igura luz *0 . D'!e%ente" cl&"e" de lente" d'3e%(ente"> &+ /'c*nc&3&; /+ pl&n&?c*nc&3& 0 c+ con3e9&?c*nc&3& ) $en'"co d'3e%(ente+.
CARACTERISTICAS @ENERALES DE LAS LENTES. Los ra$os luminosos procedentes de un cuerpo emisor5 los refle)ados o los trasmitidos por un ob)eto iluminado $ que se trasladan en el espacio" al incidir sobre la superficie de una lente biconve-a" le confieren a ésta una serie de características tales como Cent%o *pt'co de l& lente !e denomina así a un punto situado en el centro de la lente" sobre el e)e principal %fig luz ** co& Kueda establecido que los ra$os luminosos que atraviesan una lente $ pasan por el centro óptico" no se refractan El requisito indispensable para que se cumpla esta condición es que los ra$os luminosos incidan de manera perpendicular sobre la superficie curva de la lente E2e o %&0o p%'nc'p&l. Es la línea marcada por la tra$ectoria de un ra$o luminoso que incide perpendicularmente sobre la superficie curva de la lente $ la atraviesa por el centro óptico %a& Este ra$o luminoso no e-perimenta ni refracción ni refle-ión 3eométricamente se define como la línea que conecta el centro de las dos esferas" de cu$as superficies se originan las dos superficies curvas de la lente %fig luz **& Las diversas mediciones que se acen con relación a las lentes toman como referencia el e)e principal %b& %a&
!
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co
!
!
%c& %a&
%b&
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+igura luz D'!e%ente" cl&"e" de lente" con3e%(ente"> &+ /'con3e9&; /+ pl&n& con3e9& 0 c+ c*nc&3&?con3e9& )$en'"co con3e%(ente+.
Lente" d'3e%(ente" o ne(&t'3&" !on las lentes en los cuales los ra$os luminosos paralelos que las atraviesan tienden a dispersarse impidiendo que se constitu$a un foco El foco de estas lentes se forma por la pro$ección virtual de los ra$os dispersados" en el mismo lado de la lente de donde provienen los ra$os luminosos @or esta razón se dice que es un foco negativo Las lentes divergentes se reconocen porque son m#s delgadas en la parte central $ m#s gruesas en la parte periférica Las lentes negativas son de tres clases" tal como se observa en la figura luz *0
+igura luz**G C&%&cte%1"t'c&" de un& lente /'con3e9&.
R&0o" "ecund&%'o" !on todos los ra$os luminosos %b $ c& que se desplazan en forma paralela al e)e principal de la lente %fig luz **b& $ no atraviesan el centro óptico /odos ellos" en menor o ma$or grado" inciden de manera oblicua sobre la superficie curva de la lente $" al atravesarla" son refractados Al emerger $ continuar su recorrido cruzan el e)e principal en un punto denominado !oco %f&. Boco o punto !oc&l de un& lente Es el lugar del e)e principal en donde los ra$os paralelos o secundarios que inciden en una lente" al ser refractados" convergen en un determinado punto 'na lente que opera en un medio de igual índice de refracción" a ambos lados de ella" posee dos puntos focales o focos equidistantes del centro óptico de la lente %fig luz **& :
Las lentes positivas tienen focos reales En este sistema de lentes convergentes el primer foco % f & esta localizado en el espacio enfrente de la lente del lugar donde proviene el az de luz" el segundo foco % f & est# detr#s de la lente %fig luz **& al lado de donde se descarga la luz refractada En las lentes divergentes los ra$os paralelos al e)e principal que inciden en una de sus superficies %lente bicóncava& se refractan $ emergen de la lente ale)#ndose del e)e principal" por lo tanto" no e-iste la posibilidad que formen un foco real @ara representar el foco de esta lente se deben prolongar los ra$os refractados acia el mismo lado del punto donde se originó la luz En el punto donde estas prolongaciones convergen se considera que se forma el foco virtual de la lente negativa D'"t&nc'& !oc&l Es la distancia que e-iste entre el foco $ el centro óptico de la lente %fig luz **& /oda lente al poseer dos focos también tiene dos distancias focales" una a cada lado de la lente Do/le de l& d'"t&nc'& !oc&l Es la distancia equivalente a dos distancias focales %2f& /ambién e-isten dos distancias focales %fig luz **& a cada lado de la lente De la misma manera" se pueden se1alar sobre el ra$o principal tres %f&" cuatro %:f& o infinitas %nf& distancias focales Bo%$&c'*n de l& '$&(en de un o/2eto & t%&3," de un& lente. La construcción geométrica de la imagen de un ob)eto" cu$os ra$os luminosos inciden $ atraviesan una lente debe cumplir las siguientes condiciones Desde cualquier punto del objeto “O”, por ejemplo desde el punto “p”, se emiten varios rayos luminosos. Para que se forme la imaen de ese punto “p” se tra!an dos rayos luminosos que se despla!an siuiendo dos trayectorias diferentes" #no de ellos, paralelo al eje principal, se refracta al atravesar la lente y prosiue su recorrido para interceder con el foco (f$) de la lente y continuar su despla!amiento, de manera indefinida, al otro lado de la lente. %l otro rayo que parte del mismo punto “p” incide de manera perpendicular sobre la superficie de la lente, atraviesa el centro &ptico, por lo tanto no se refracta, y contin'a su trayectoria. %n el luar donde los dos rayos se interceptan se forma la imaen del punto “p”. uando todos los puntos del objeto ayan construido sus correspondientes im*enes al otro lado de la lente, entonces la sucesi&n de ellos interar* la imaen del objeto (fi. lu! +.). @ara que se forme la imagen de un punto de un ob)eto" los dos ra$os luminosos que se originen del citado punto deben interceptarse al otro lado de la lente
Bo%$&c'*n de '$8(ene". La capacidad de las lentes para
formar im#genes" en una serie de instrumentos ópticos" tales como microscopios" lupas" c#maras fotogr#ficas" telescopios" binoculares" etc" depende en gran medida de las
características de los ra$os luminosos que incidan en la lente $ la distancia que guarda el ob)eto con relación a la lente De acuerdo a estos criterios" e-isten varios procedimientos para la formación de im#genes a través de una lente
C&%&cte%1"t'c&" (ene%&le" de l&" '$8(ene" !o%$&d&" po% un& lente> %magen real. Es
la imagen que se forma al otro lado de la lente de donde esta situado el ob)eto !e caracteriza porque puede ser recogida o pro$ectada en una pantalla %o en una película fotogr#fica& %magen virtual Es la imagen que se forma en el mismo lado de la lente donde est# situado el ob)eto !e caracteriza porque no puede ser recogida o pro$ectada en una pantalla %magen aumentada o de ma&or tama'o ,omo su nombre lo indica es una imagen del ob)eto aumentada varias veces el tama1o real del mismo %magen de menor tama'o Es m#s peque1a que el tama1o real del ob)eto %magen dereca ;uestra el e-tremo superior e inferior de la imagen en la misma posición que tiene el ob)eto %magen invertida Los e-tremos superior e inferior de la imagen est#n situados de manera inversa a la posición real que posee el ob)eto5 así mismo" los lados dereco e izquierdo est#n invertidos ,asos que se presentan en la formación de im#genes 6. %magen de un objeto cuando est situado entre la lente & el foco. Los dos ra$os luminosos que emite cada punto del ob)eto atraviesan la lente" se refractan pero no se interceptan entre sí" porque no logran converger sino" al contrario divergen @ara que se pueda construir la imagen" deben prolongarse los ra$os luminosos" al mismo lado de la lente donde est# el ob)eto %fig luz *2&
!
o
!
+ig luz*2 O/2eto "'tu&do ent%e l& lente 0 el !oco.
,aracterísticas de la imagen > de $&0o% t&$&o; de%ec:& 0 3'%tu&l. E)emplos la lupa & el ocular del microscopio %magen de un objeto situado en el foco. Los dos ra$os luminosos que se emiten en los puntos del ob)eto $ atraviesan la lente no convergen pues se desplazan de manera paralela" por lo tanto no se interceptar#n $ tampoco se formar# la imagen en ninguno de los lados de la lente %fig luz*& !i el ob)eto fuera un punto luminoso" al otro lado de la lente" se pro$ectar# un az luminoso que se prolonga al infinito
<
+igura luz*6 . O/2eto "'tu&do $8" &ll8 de !.
!
!
co
E)emplos cmara fotogrfica* el condensador del
!
microscopio.
F. %magen de un objeto situado muco ms all del doble de la distancia focal. ,onforme el ob)eto se sit4a muco m#s all# del doble de la distancia focal" la imagen se va aciendo cada vez m#s peque1a %fig luz *C&" asta transformarse en un punto
+igura luz* O/2eto "'tu&do en el !oco.
E)emplos una linterna a baterías* un faro & un reflector +ue sirve para iluminar espectculos.
. %magen de un objeto situado entre el foco & el doble de la distancia focal (entre f & ,f). Los ra$os luminosos emitidos por cada punto del ob)eto forman una imagen con las características siguientes de $&0o% t&$&o; %e&l e 'n3e%t'd& %figluz*:&
!
!
co
!
!
+igura luz*C. O/2eto "'tu&do $uc:o $8" &ll8 del do/le de l& d'"t&nc'& !oc&l) 'n!'n'to+.
E)emplo los indicadores luminosos +ue se usan se'alar 2f
f
determinadas partes de la imagen pro&ectada de una transparencia. La concentración de ra&os del sol a travs de una lupa.
f
co
A/e%%&c'one" de l&" lente". En todo sistema óptico" por la +igura luz*:. O/2eto "'tu&do ent%e ! 0 !.
E)emplos el objetivo del microscopio* el pro&ector de diapositivas o transparencias* el pro&ector de cine.
. %magen de un objeto situado en el doble de la distancia focal (en ,f). De acuerdo a la construcción geométrica de la imagen Msta tiene las siguientes características > del mismo tama1o" real e invertida %!'(.luz.6& -jemplo "
-istema &ptico para copiar diapositivas.
2f
f
c
f
. %magen de un objeto situado ms all del doble de la distancia focal ( ms all de ,f). De acuerdo al dise1o de formación de im#genes" las características que muestra la imagen % fig luz*6& son de $eno% t&$&o; %e&l e 'n3e%t'd&.
!
co
!
Las aberraciones de las lentes afectan la calidad de las im#genes" especialmente en la falta de definición %bordes carentes de nitidez&" en la disminución del contraste" en la distorsión de la forma $ la aparición de bordes coloreados Las aberraciones de las lentes se producen por dos causas a& La descomposición o dispersión de la luz en el espectro radiante visible $ b& por las superficies curvas de las lentes
+igura luz*<G O/2eto "'tu&do en !.
!
naturaleza de la luz" el comportamiento de los ra$os luminosos al desplazarse a través de las lentes $ las características químicas del material con que se fabrican las lentes" se producen una serie de modificaciones o cambios en la tra$ectoria de los ra$os luminosos" dando como resultado que la imagen proporcionada por la lente no sea equivalente a la imagen construida geométricamente $ teóricamente esperada A estas diferencias que se producen se denominan aberraciones de las lentes
Las principales aberraciones que afectan a una lente son A/e%%&c'*n c%o$8t'c& !i se analiza geométricamente una lente biconve-a" podemos deducir que est# formada por dos prismas unidos por sus bases $ cu$as superficies se pulieron asta transformarlas en superficies curvas En el caso de una lente bicóncava" ésta resulta de la unión de dos prismas por sus vértices ligeramente truncos" $ pulimentados asta que las superficies se icieran curvas %+ig luz *H&
! %a&
%a′&
%a′′&
%b&
6
+igura luz*H E"-ue$& -ue %ep%e"ent& te*%'c&$ente l& con"t%ucc'*n de un& lente /'con3e9& )&+ 0 un& /'c*nc&3& )/+ & p&%t'% de l& un'*n de p&%e" de p%'"$&".
@or lo tanto" el az de luz blanca que incida sobre la superficie curva de una lente5 al atravesarla" refractar# $ luego dispersar# los ra$os luminosos de diferentes longitudes de onda que la constitu$en Los ra$os que se refractan m#s son los de menor longitud de onda %violetas $ azules& $ los ro)os $ amarillos se refractar#n menos En la figura luz* se observa que los ra$os azules se refractan $ desvían m#s que los ra$os de color verde $ estos m#s que los ro)os ,ada uno de estos ra$os interceptar# en distintos focos" al e)e principal5 e-istiendo para cada ra$o de color refractado distintos puntos focales" uno a continuación del otro ,omo consecuencia de lo anterior se formar#n im#genes del ob)eto" en diferentes planos focales Los ra$os azules mostrar#n una distancia focal menor que los ro)os" por lo tanto la imagen del ob)eto" formada por los ra$os azules ser# ligeramente menor $ se formara un poco m#s cerca de la lente que las im#genes formadas por los ra$os verdes $ ro)os %fig luz*& !i la imagen se observa de frente o se recoge en una pantalla mostrar# los bordes levemente coloreados de azul" verde $ ro)o
f
f
co
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divergentes para acer coincidir en un solo plano las im#genes de los tres colores b#sicos azul" verde $ ro)o A/e%%&c'*n e"!,%'c& !i se dirige sobre una lente convergente un az de luz constituido por ra$os paralelos al e)e principal" los ra$os para-iales o m#s cercanos al e)e principal convergen casi en un mismo punto focal" en cambio" los ra$os m#s periféricos sufrir#n una ma$or refracción $ tendr#n puntos de convergencia % puntos focales& a diferentes distancias del foco principal5 esto significa que se formar#n focos secundarios %fig luz 20a& m#s cercanos a la lente La imagen de un punto aparecer# rodeada de un alo de difusión creciente Este tipo de aberración produce im#genes con bordes poco contrastados %fig luz 20b& !e corrige esta aberración empleando diafragmas situados antes de las lentes para eliminar la tra$ectoria de los ra$os luminosos m#s periféricos
f
+iguraluz20 D'&(%&$& -ue $ue"t%&> a& el %eco%%'do de lo" %&0o"
lu$'no"o" en un& lente -ue $ue"t%& &/e%%&c'*n e"!,%'c&; b& '$&(en de un punto lu$'no"o; !o%$&do po% l& &/e%%&c'*n e"!,%'c&.
+igura luz * D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& !o%$&c'*n de '$8(ene" colo%e&d&" del o/2eto; po% l& d'!e%enc'& de (%&do" de de"3'&c'*n -ue e9pe%'$ent&n lo" %&0o" lu$'no"o" &zul; 3e%de 0 %o2o.
La aberración crom#tica se ace evidente en lentes simples En la actualidad se ace la corrección para esta aberración utilizando lentes construidos con diferentes tipos de vidrios %croNn $ flint& que poseen distintos índices de refracción $ utilizando dobletes o tripletes de lentes positivas $ negativas" de tal manera que acen coincidir los ra$os luminosos de dos colores A este tipo de lentes se les denomina &c%o$8t'co". De este tipo de lentes est#n confeccionados los ob)etivos de los microscopios de estudiante !i se desea corregir a4n m#s la aberración crom#tica" las lentes se confeccionan con un mineral denominado fluorita %ir *::& poseedor de propiedades ópticas que permiten alcanzar un alto grado de corrección Las lentes fabricadas con este material se denominan "e$'&poc%o$8t'co". Actualmente e-isten lentes llamados &poc%o$8t'co". Est#n fabricados de tal manera que se a eliminado" en ellos" la aberración crom#tica ,on ellos se confeccionan ob)etivos de microscopios de investigación $ c#maras fotogr#ficas semiprofesionales $ profesionales El costo de ellos es mu$ alto pues se requiere utilizar varios lentes convergentes $
Otra forma de corrección es a1adir a la lente" otra con una curvatura adecuada $ con un índice de refracción diferente que permita que los ra$os periféricos disminu$an su capacidad de refracción Al corregir la aberración de esfericidad se trata de corregir" al mismo tiempo" la aberración crom#tica" obteniéndose lentes o sistemas de lentes aplanticos semiapocromticos o lentes aplanticos apocromticos.
A/e%%&c'*n de cu%3&tu%& de c&$po. Los ra$os luminosos que son emitidos por un ob)eto $ atraviesan la lente convergente forman una imagen curvada naturalmente" es decir que no se constru$e sobre un plano perpendicular al e)e principal u óptico" sino en una superficie curva Esto se debe a los diferentes #ngulos de refracción que e-perimentan los ra$os luminosos para-iales $ periféricos %fig luz 2*& Esta aberración es f#cil de comprobar" observando alg4n ob)eto a través de una lupa o una preparación istológica con un microscopio de estudiante En ambos casos se observar# que la imagen e-ibe una gran nitidez en el centro pero mostrar# bordes ligeramente borrosos P en el microscopio cuando se enfoque la parte periférica" el centro de la imagen aparecer# borroso
C
La aberración de curvatura de campo se corrige utilizando los mismos procedimientos para corregir la aberración de esfericidad Al corregir esta aberración la imagen aparece nítida en toda su e-tensión
,f
f
co
f
E-isten dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de energía para formar im#genes aumentadas $ detalladas de ob)etos que a simple vista no es posible observar a& ;icroscopio fotónico simple o lupa b& ;icroscopio fotónico compuesto
,f
+ig luz 2* D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& t%&0ecto%'& de lo" %&0o" lu$'no"o" p&%& !o%$&% l& '$&(en -ue p%e"ent& &/e%%&c'*n de cu%3&tu%& de c&$po.
A/e%%&c'*n de d'"to%"'*n. En este tipo de aberración la imagen del ob)eto aparece alterada en sus dimensiones referidas al centro de la imagen o en sus porciones periféricas Esto se debe que los diversos componentes del ob)eto adoptan en la imagen diferentes aumentos seg4n la distancia del componente de la imagen con relación al e)e principal ,omo consecuencia de ello las líneas verticales $ las orizontales que se encuentran pró-imas a los m#rgenes de la imagen no resultan rectas En las lentes se distinguen dos tipos de distorsión /istorsión en almoadilla. ,uando en la imagen del ob)eto %22a& se observa que las líneas rectas se curvan de forma cóncava en relación con el e)e óptico" como en la figura luz 22b /istorsión en barrilete. ,uando en la imagen del ob)eto se observa que las líneas rectas se curvan en forma conve-a en referencia e)e óptico como se observa en la figura luz 22b Esta distorsión no afecta la nitidez de la imagen
%a&
%b&
%c&
+igura luz 22 I$&(en de un cu&d%o con"t'tu'do po% l1ne&" :o%'zont&le" 0 3e%t'c&le"> &+ d'"to%"'*n en &l$o:&d'll&; /+ d'"to%"'*n en /&%%'lete.
Agosto del 2006
mir&s, que significa peque1o $ sop/oo, que significa observar Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar ob)etos o estructuras peque1as
MICROSCOPÍA.
C,"&% Edu&%do Mont&l3o A%en&". El estudio detallado de los componentes de células $ te)idos animales o vegetales" por el tama1o que poseen" requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar mucas veces m#s la imagen de las estructuras que los constitu$en El instrumento que fue empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula $ los te)idos" fue el $'c%o"cop'o El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas
El $'c%o"cop'o "'$ple o lup& es un instrumento de amplificación de im#genes que consiste en la utilización de una o m#s lentes convergentes en un solo sistema óptico Dependiendo de la curvatura de la superficie de la%s& lente%s& las lupas pueden ampliar las im#genes de los ob)etos desde <" H"*0" *2" 20 $ asta <0 veces +orman una imagen de ma&or tama'o* dereca & virtual lente ocular
tubo e-tensible
lente ob)etivo
diafragma +igura microsc * D'&(%&$& -ue $ue"t%& lo" co$ponente" del $'c%o"cop'o co$pue"to !&/%'c&do po% lo" G&n"en.
Los $'c%o"cop'o" !ot*n'co" co$pue"to" que se emplean actualmente tienen sus antecesores en los instrumentos ópticos desarrollados" en el periodo comprendido entre *<0 $ *6*0" por Qans %padre& $ acarías %i)o& Ransen5 quienes mediante el tallado cuidadoso de lentes biconve-as constru$eron los primeros microscopios compuestos %fig microsc *& A partir de esa época" el microscopio es el instrumento m#s utilizado en el estudio de células $ te)idos !e fue perfeccionando" tanto en su parte óptica como en su parte mec#nica" gracias a los adelantos tecnológicos aplicados a los componentes antes mencionados !e denominan compuestos porque la imagen se forma mediante la utilización de tres sistemas de lentes" cada uno de ellos constituidos por lentes convergentes $ divergentes Los sistemas de lentes son el condensador " los objetivos $ los ocul&%e" En la actualidad" el microscopio fotónico es un instrumento de uso cotidiano en los laboratorios de investigación $ de diagnóstico así como en las aulas de ense1anza de Siología" Embriología" Qistología" ;icrobiología $ @atología
Co$ponente" del $'c%o"cop'o !ot*n'co.
El microscopio fotónico compuesto esta integrado por tres tipos de componentes
H
&+ Co$ponente" $ec8n'co" !on aquellos que sirven de
sostén" movimiento $ su)eción de los sistemas ópticos $ de iluminación así como de los ob)etos que se van a observar Mstos se muestran en la imagen del microscopio de la figura microsc 2 H&"e o p', Es un soporte met#lico" amplio $ sólido en donde se apo$an $ sostienen los otros componentes del microscopio H%&zo; e"t&t'3o o colu$n& @ermite la su)eción $ traslado del microscopio !oporta al tubo óptico" a la platina $ el revolver Pl&t'n& !uperficie plana de posición orizontal que posee una perforación circular central En ella se apo$a la preparación %l#mina portaob)etos que contiene a la muestra que se va a e-aminar& que se su)eta a la platina mediante pin!as o con un carrito o carriot que" mediante mandos especiales facilitan el movimiento de la preparación de dereca a izquierda $ de adelante acia atr#s Tu/o *pt'co ,onsiste en un cilindro met#lico que suele medir *60mm o *C0 mm de longitud %dependiendo del fabricante del microscopio& el cual en un e-tremo" est# conectado al revolver o portaob)etivos $ en el otro se relaciona con el %los& ocular%es& Re3ol3e% o po%t&o/2et'3o" Es un componente que gira alrededor de un e)e con la finalidad que los ob)etivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina En su superficie inferior posee varios agu)eros donde se atornillan los ob)etivos To%n'llo" $&c%o$,t%'co 0 $'c%o$,t%'co 3eneralmente est#n situados en la parte inferior del brazo o columna @ueden estar separados %en los microscopios antiguos& o el tornillo micrométrico est# incorporado en la circunferencia del tornillo macrométrico %microscopios actuales& Ambos tornillos permiten el desplazamiento de la platina acia arriba $ acia aba)o con la finalidad de acercar o ale)ar la preparación acia los ob)etivos $ así conseguir un enfoque óptimo de la imagen
+igura microsc 2 P%'nc'p&le" co$ponente" de un $'c%o"cop'o !ot*n'co co$pue"to
El macrométrico produce desplazamientos evidentes $ r#pidos de la platina" en cambio el tornillo micrométrico produce movimientos imperceptibles de la platina $ sirve para efectuar el enfoque fino $ definitivo de la imagen En la actualidad los microscopios tienen incorporados a los mecanismos de desplazamiento de los tornillos macro $ micrométricos" topes de seguridad que impiden que éstos contin4en descendiendo indefinidamente $ así se evita roturas $ da1os a la laminilla $ a las lentes de los ob)etivos En(%&n&2e" 0 c%e$&lle%& ,onstitu$en mecanismos de desplazamientos de las diferentes partes del microscopio C&/ez&l Es un componente situado en relación con el tubo del microscopio que alberga principalmente prismas o espe)os que sirven para acondicionar en él dos o m#s oculares" o sistemas mec#nicos que soportan c#maras fotogr#ficas" de vídeo o sistemas de pro$ección de la imagen
/+ Co$ponente" *pt'co" !on los ob)etivos" los oculares"
el condensador $ los prismas Los tres primeros est#n constituidos por sistemas de lentes positivos $ negativos Conden"&do% Es el componente óptico que tiene como función principal concentrar $ regular los ra$os luminosos que provienen de la fuente luminosa %fig micros & o/2eto
pl&t'n&
condensador
d'&!%&($& 9a$os luminosos
+igura microsc D'&(%&$& de lo" p%'nc'p&le" co$ponente" de un conden"&do% 0 %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".
Est# formado por una o dos lentes convergentes que re4nen los ra$os luminosos $ los orientan acia la abertura central de la platina ;ediante un mecanismo de
cremallera se acerca o ale)a de la platina /ambién tiene incorporado un diafragma iris que regula la entrada de luz /odo ello con la finalidad de concentrar la ma$or cantidad de ra$os luminosos en el plano donde est# situado el ob)eto a observar La ma$oría de los condensadores de los microscopios actuales también poseen una apertura numérica que indica la cantidad de luz que puede captar $ luego enviar acia la preparación
O/2et'3o" Los ob)etivos est#n considerados los elementos m#s importantes en la formación de la imagen microscópica" $a que estos sistemas de lentes establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez $ la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma %pode% de %e"oluc'*n& Est#n constituidos también por un )uego de lentes" en este caso" convergentes $ divergentes" para eliminar" en la medida de lo posible" una serie de aberraciones que afectarían la calidad de las im#genes formadas Las lentes se disponen dentro de un soporte o camiseta de metal" en cu$o e-terior est#n inscritas una serie de anotaciones numéricas que indican" como se observa en la figura microsc: el aumento propio del ob)etivo" la apertura numérica" el tipo de material con que est#n tallados las lentes %de fluorita o semiapocrom#ticos& o la calidad que tendr#n las im#genes" al anularse en la construcción de los ob)etivos" algunas aberraciones de las lentes %acrom#ticos" apocrom#ticos" aplan#ticos etc& o si se debe usar alguna sustancia de inmersión
*0>022
+l4or :0>06<
@lan *00>*2< oíl
+igura micros : P%'nc'p&le" c&%&cte%1"t'c&" e9te%n&" de lo" o/2et'3o".
Los ob)etivos se fabrican para ampliar las im#genes de los ob)etos observados en diversos aumentos5 así se tienen ob)etivos con aumentos propios de < -" :-" *0-" 2<-" :0-" 6<- $ *00- Algunos ob)etivos tienen alrededor de ellos una línea coloreada que indica a simple vista el aumento propio Los ob)etivos también se clasifican de acuerdo al medio que e-iste entre el ob)eto e-aminado $ la lente frontal del ob)etivo De acuerdo a esta característica son "eco" o de 'n$e%"'*n !on ob)etivos secos aquellos que entre el ob)eto observado $ el ob)etivo solamente e-iste el aire5 en cambio se denominan ob)etivos de inmersión aquellos que requieren que entre la preparación $ la lente frontal del ob)etivo se coloque una sustancia líquida" ésta puede ser agua" glicerina o un 7aceite de inmersión8" natural como el 7aceite de cedro8 o aceites artificiales
Otra clasificación de los ob)etivos se refiere al tipo de corrección al que deben someterse las lentes con la finalidad de disminuir o anular algunas aberraciones que se producen en las lentes" como las aberraciones crom#tica" de curvatura de campo" astigmatismo $ de esfericidad Dependiendo de las aberraciones corregidas los ob)etivos pueden ser cromticos. Estos ob)etivos corrigen los ra$os luminosos azules $ ro)os aciéndolos coincidir en un solo plano focal En tanto que los otros ra$os coloreados se forman en otro plano focal generando una imagen cu$os bordes se observan levemente difusos %espectro luminoso secundario& Los ob)etivos de los microscopios 7de estudiante8 son acrom#ticos emiapocromticos . !e les conoce también como ob)etivos de !luo%'t&8" corrigen el espectro secundario dando como resultado im#genes de bordes m#s nítidos @or la alta capacidad que tienen para transmitir las radiaciones luminosas de onda corta" se les considera como los ob)etivos ideales para microscopía de fluorescencia pocromticos. En estos ob)etivos se acen coincidir en un solo plano los ra$os luminosos azules" ro)os $ verdes" obteniendo así una imagen de bordes sumamente nítidos" pero la corrección de esta aberración trae consigo la acentuación de otra" que es la de curvatura de campo" pues la superficie focal de la imagen es ligeramente curva" dando como resultado que" al observar la imagen $ tratar de enfocarla en la zona central del campo microscópico se desenfoca la zona periférica $ viceversa 1lanapocromticos !on los ob)etivos en los cuales se an corregido la ma$or cantidad de aberraciones como la crom#tica" curvatura de campo" de esfericidad $ de astigmatismo5 por lo tanto se obtienen im#genes sumamente nítidas $ el campo microscópico aparece totalmente plano" enfocado en toda su e-tensión !on los ob)etivos que generan im#genes con me)or resolución" es preferible usarlos cuando se desea obtener im#genes fotogr#ficas% fotomicrografía& La comple)idad en la construcción de los ob)etivos $ el n4mero de lentes que se utilizan aumenta conforme se van corrigiendo m#s aberraciones @or e)emplo un ob)etivo planapocrom#tico suele incorporar en su construcción entre *0 a *2 lentes Esto" en consecuencia" encarece el costo de ellos La imagen que forman los ob)etivos es &u$ent&d& de t&$&o; 'n3e%t'd& 0 %e&l !e mencionó al inicio del ac#pite que los ob)etivos est#n considerados como los integrantes m#s importantes del microscopio" pues de la calidad de sus componentes depende que" en la imagen generada a través de ellos" se puedan observar una ma$or cantidad de detalles En otros términos" los ob)etivos son los responsables de ofrecer im#genes me)or resueltas La capacidad que tienen los ob)etivos de formar im#genes en donde se distingan m#s detalles del ob)eto e-aminado depende de una serie de factores como los que se mencionan a continuación *0
Índ'ce de %e!%&cc'*n !e denomina así a la relación
e-istente entre la velocidad de la luz en el aire $ su velocidad en el medio transparente utilizado De la misma manera" se pueden obtener los índices de refracción de una serie de sustancias que se utilizan en la construcción $ tallado de las lentes de los ob)etivos La velocidad de la luz es de 00"000 =m>sg en el aire Al atravesar un medio transparente como el vidrio del cual est#n fabricados las lentes de los microscopios" su velocidad se reduce a 200" 000 ?m>sg @or lo tanto el vidrio tendr# un índice de refracción de *<5 pues el índice de refracción de un ob)eto o una sustancia transparente se e-presa mediante la fórmula
B9
que e-ista entre el ob)eto $ la lente frontal del ob)etivo" el #ngulo de apertura ser# ma$or o menor
C&pt&c'*n de %&0o" lu$'no"o" & t%&3," de o/2et'3o" "eco" 0 o/2et'3o" de 'n$e%"'*n. La figuras microsc 6 $ C muestran la diferencia en la captación de ra$os luminosos de un ob)etivo )&+ en el cual la interfase es aire $ en el ob)etivo )/+ donde se a colocado como interfase una sustancia de inmersión que posee un índice de refracción similar al del vidrio Los ra$os luminosos que atraviesan el aire se refractan m#s $ por lo tanto su desviación es ma$or porque el índice de refracción del aire es igual a *0
Veloc'd&d de l& luz en el &'%e Veloc'd&d de l& luz en el $ed'o
A continuación se muestran los índices de refracción de una serie de sustancias transparentes que se emplean en microscopía para construir lentes o como sustancias de inmersión Agua *00 Aceite de inmersión *<*<0 +luorita *::0 (idrio %croNn& *<200 +lint *6600
ra$o refle)ado
An(ulo de &pe%tu%& Es la capacidad de un ob)etivo de
captar los ra$os luminosos refractados cuando éstos atraviesan un medio transparente ,uanto ma$or sea este #ngulo" la lente frontal del ob)etivo aceptar# una ma$or cantidad de ellos %fig micros <&
o/2et'3o
)&+
)/+
+igura microsc < R&0o" lu$'no"o" -ue !o%$&n el 8n(ulo de &pe%tu%&.
En el esquema anterior" el #ngulo de apertura de la lente frontal del ob)etivo capta o acepta una serie de ra$os luminosos teniendo como límite de captación los ra$os laterales del cono luminoso %líneas continuas&" en cambio los ra$os periféricos %líneas punteadas& no son aceptados Esta capacidad de captación est# dada fundamentalmente por la distancia que e-iste entre el ob)eto $ el ob)etivo Así" se puede constatar que en la figura
)&+ +igura microsc 6 T%&0ecto%'& de lo" :&ce" lu$'no"o" en un o/2et'3o "eco.
En la figura 6 los ra$os que emergen del ob)eto" al llegar a esta interfase constituida por aíre se refractan o su #ngulo de inclinación es tal que sobrepasan el ngulo critico de refracción" por lo que al llegar a la lente frontal del ob)etivo se refle)an en la superficie $ no son captados por la lente En la figura %b& el índice de refracción del aceite de inmersión %*<2& es similar al del vidrio %portaob)etos" cubreob)etos $ la lente frontal del ob)etivo& por lo tanto los ra$os luminosos periféricos que emergen del ob)eto no se desvían $ pueden ser aceptados por el ob)etivo" increment#ndose de esa manera la cantidad de ra$os luminosos que penetran al microscopio
)/+ +igura microsc 6 . T%&0ecto%'& de lo" :&ce" lu$'no"o" en un o/2et'3o de 'n$e%"'*n.
**
A la mitad del #ngulo de apertura se le denomina alfa % &" por e)emplo si el #ngulo de apertura de un ob)etivo es de <0T" su valor alfa ser# de 2
Ape%tu%& nu$,%'c& )NA+ Es una medida que indica la capacidad del ob)etivo de poder captar los ra$os refractados por las estructuras finas de las cuales est# constituido el ob)eto que se observa Esta capacidad se traduce en el poder del microscopio de formar im#genes que muestren al observador una serie de detalles del ob)eto que se est# e-aminando ,uanto ma$or sea la apertura numérica de un ob)etivo" éste tendr# una ma$or capacidad de mostrar detalles finos en la imagen que forma
e2istir entre dos puntos del objeto para +ue se puedan visuali!ar como dos puntos separados . La calidad de una
imagen" en la que se observe la claridad" nitidez $ la riqueza de detalles" depende del poder de resolución del ob)etivo -l poder de resolución de un objetivo depende de la longitud de onda ( ) del ra&o luminoso utili!ado & la apertura numrica del sistema óptico del objetivo.
El poder de resolución %d& se e-presa mediante la fórmula de Abbe 6. 9
dJ
)/ +
.F6 9
dJ Donde n representa el índice de refracción de la interfase que separa el cubreob)eto de la muestra e-aminada $ la lente frontal del ob)etivo $ es la mitad del #ngulo de apertura La apertura numérica de un ob)etivo guarda una relación directamente proporcional con el aumento propio del ob)etivo & tambin con la capacidad +ue tiene de mostrar ma&ores detalles.
@or e)emplo en la relación de ob)etivos que se muestran se puede comprobar lo afirmado referente al aumento del microscopio
6-
)NA o/2et'3o K NA conden"&do%+
)&+
UA n - "en
dJ ) NA+
La apertura numérica de un ob)etivo se calcula empleando la formula matem#tica siguiente
Au$ento del ob)etivo 29 69 *02<9
6. 9
Ape%tu%& numérica 00C .6 . 02< 0:< .F
0H0
69 6.o'l La ma$oría de los denominados microscopios de estudiantes que se fabrican en la actualidad vienen implementados %AU $ aumentos propios& con los ob)etivos que est#n se1alados en negritas
Au$ento de un o/2et'3o Es la capacidad que posee un
ob)etivo de ampliar la imagen del ob)eto observado !e define como la relaci&n entre el tama0o de la imaen y el objeto, en valores lineales (laro y anco). En la relación anterior" un ob)etivo que tiene grabado en la camiseta la cifra *0- aumentar# *0 veces el tama1o de la imagen del ob)eto e-aminado Pode% de %e"oluc'*n. !e define así la capacidad de un ob)etivo de poder distinguir la distancia mínima +ue debe
NA
.F6 9
dJ
NA o/2et'3o K NA conden"&do%
La cifra *22>2 ó 06* es la constante de Abbe
Esto significa que si empleamos un ob)etivo de AU *2< con una longitud de onda de <60nm" el poder de resolución ser# de 2Cnm" la cifra obtenida nos indica que el ob)etivo ser# capaz de distinguir o resolver la imagen de dos puntos que en el ob)eto est#n separados entre sí por 2Cnm !i la separación de ellos es menor a esta cifra el ob)etivo no podr# distinguirlos como dos puntos separados La cifra resultante de aplicar la fórmula se denomina límite de resolución 'n c#lculo m#s e-acto del poder de resolución se obtiene cuando en la fórmula se a1ade la apertura numérica del condensador" tal como se observa en la fórmula %b& ,uando se efect4a correctamente la iluminación del ob)eto utilizando %adecuar la distancia apropiada del condensador $ la regulación de captación de la luz abriendo o cerrando el diafragma iris del mismo& la apertura numérica del condensador" la imagen que forma el ob)etivo logra mostrar el m#-imo poder de resolución @or e)emplo si se emplea el mismo ob)etivo del caso anterior %de AU *2<&" el mismo tipo de luz % λ <60nm& $ se ilumina la muestra con un condensador de AU H0 es posible comprobar lo mencionado anteriormente Al realizar los c#lculos correspondientes resulta que el poder de resolución del ob)etivo" sin tomar en cuenta la AU del condensador" es de 2Cnm En cambio cuando se inclu$e la apertura numérica del condensador el resultado es de *66nm Estas cifras nos demuestran que cuando se realiza la iluminación del ob)eto mediante el uso adecuado del condensador" la capacidad del ob)etivo de resolver detalles me)ora casi en un 60V m#s -l m2imo poder de resolución +ue se puede obtener es de 0., m apro2imadamente* para lo
*2
cual se re+uiere +ue el microscopio proporcione una imagen de un aumento total de 30002 a 34002.
Ocul&%. Es otro componente óptico del microscopio" debe su
nombre porque la imagen final se observa a través de él acercando el o)o a la lente 7ocular8 del componente Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el ob)etivo La imagen del ocular es de ma$or tama1o" virtual $ dereca Esta imagen 4nicamente amplía un n4mero determinado de veces %<-" H-" *0-" *2-& a la imagen formada por el ob)etivo Uo a1ade" por m#s aumentos propios que posea" ning4n detalle a los generados por el ob)etivo En la generalidad de los casos" los oculares est#n construidos por dos lentes convergentes %planos conve-os& La primera lente se denomina 7de campo o frontal8" est# situada en la parte anterior del ocular %fig microsH& $" es la encargada de recoger $ ampliar la imagen generada por el sistema de lentes del ob)etivo La lente posterior" en contacto estreco con el o)o del observador" se denomina lente 7ocular8 $ es la responsable de aumentar nuevamente la imagen $ orientarla acia el o)o del observador Los oculares se clasifican" dependiendo de la disposición de las lentes $ del diafragma" dentro de la camiseta met#lica que los contienen" en
Ocul&%e" ne(&t'3o" de 50(en" Est#n constituidos por dos lentes plano conve-os" con la superficie conve-a dirigida acia aba)o Entre ambos se sit4a un diafragma anular" localizado en el plano focal de las lentes En este diafragma se puede aderir un puntero o se1alador que suele ser elaborado por una peque1a porción de una pesta1a o pelo
%a&
%b&
+igura microsc H D'&(%&$& de l& d'"po"'c'*n de l&" lente" en> )&+ un ocul&% ne(&t'3o )/+ en un ocul&% po"'t'3o.
Ocul&%e" po"'t'3o" o de R&$"den Las lentes plano conve-as est#n dispuestas con las superficies curvas dirigidas acia adentro El diafragma est# situado por deba)o de la lente de campo o frontal5 en el plano donde se forma la imagen formada por el ob)etivo Adem#s de estos oculares" e-isten otros tipos como los de campo de visión amplia5 aquellos acondicionados para poder observar con los anteojos puestos $ otros oculares que generalmente que se usan en los microscopios binoculares" denominados oculares de compensación . Mstos consisten en que uno de ellos posee un sistema de lentes móviles que permite enfocar correctamente la imagen del ob)eto" después que el enfoque total del microscopio se a realizado $ se nota a4n una imagen levemente desenfocada en uno de ellos" generalmente el izquierdo" porque al observar la imagen a través de cada ocular dereco e izquierdo se nota que una de ellas no est# enfocada correctamente
P%'"$&". En los microscopios modernos monoculares o binoculares" se requiere el empleo de prismas" estructuras transparentes que" en el caso de los microscopios monoculares" sirven para desviar los ra$os luminosos de la tra$ectoria rectilínea del e)e óptico del ob)etivo $ dirigirlos acia el tubo óptico ligeramente inclinado $ luego acia el ocular !uperficie reflectante
ra$os de luz dirigidos acia el tubo óptico $ el ocular 9a$os luminosos provenientes del ob)etivo
+igura microsc P%'"$& con "upe%!'c'e %e!lect&nte -ue "'%3e p&%& de"3'&% lo" %&0o" lu$'no"o".
En los microscopios binoculares" los prismas separan los ra$os luminosos provenientes del ob)etivo" en dos aces de luz $ los dirigen a cada ocular En ambos casos e-iste siempre una superficie reflectante para evitar la descomposición de la luz
C+ Co$ponente" de 'lu$'n&c'*n !e consideran
dentro de este grupo a los instrumentos que proporcionan energía luminosa al microscopio Las fuentes de energía luminosa son de dos tipos natural $ artificial La luz n&tu%&l" emitida por el sol" se obtiene de manera indirecta mediante un e"pe2o que posee una superficie plana $ otra cóncava El espe)o est# situado en la superficie superior de la base o pie 'n mecanismo especial permite orientarlo acia un lugar iluminado indirectamente por el sol %una ventana" por e)emplo& $ luego dirigir el az luminoso acia la lente del condensador La luz &%t'!'c'&l se genera a través de una l8$p&%& de /&2o 3olt&2e %generalmente de 6 voltios& que" mediante un %eo"t&to regula la emisión $ la intensidad de luz Al igual que el espe)o" este sistema de iluminación se inserta en la base o pie del microscopio En los microscopios que poseen un espe)o" por carecer de una fuente de luz incorporada" también se puede emplear la luz artificial emitida por una l#mpara que pro$ecta el az luminoso de la misma manera como se orienta la superficie reflectante del espe)o cuando se ilumina el microscopio con luz natural B'lt%o" En diversas partes del recorrido de az luminoso" aunque en la ma$oría de los casos se sit4an entre la fuente luminosa $ el condensador /ienen por finalidad modificar la longitud de onda de la luz que ilumina el ob)eto a observar @or e)emplo" cuando se utiliza !on estructuras transparentes %de vidrio" pl#stico o gelatina& coloreadas que se localizan luz artificial es necesario emplear filtros azules pues modifican el color ligeramente amarillento que poseen los ra$os luminosos que emite las l#mparas eléctricas" *
transform#ndolos en ra$os de luz 7blanca8 Este color de luz es m#s aceptada por la retina $ en las preparaciones istológicas coloreadas me)ora facilita la rendición de color de las estructuras celulares o tisulares e-aminadas @ara ciertos casos de microscopía fotónica especial se requiere el au-ilio de filtros especiales como en el caso de los microscopios de fluorescencia" contraste de fases $ de polarización Dependiendo del fabricante $ de los modelos de microscopios" los filtros se colocan en anillos o dispositivos especiales denominados 7portafiltros8 que" en el caso de los microscopios fotónicos de campo claro %de uso m#s frecuente&" est#n situados inmediatamente encima de la fuente luminosa o deba)o de la lente frontal del condensador
&
/
c
d
e
+igura microsc *0 I$8(ene" -ue $ue"t%&n el pode% de %e"oluc'*n de lo" "'"te$&" o/2et'3o K ocul&% &decu&do" )&u$ento 4t'l+. &+ o/2eto /+ o/2et'3o 9 c+ o/2et'3o 69; d+ o/2et'3o 9 0 e+ o/2et'3o 69. Se :& ut'l'z&do un ocul&% de 69.
!e denomina &u$ento 3&c1o de la imagen de un ob)eto" aquel que por m#s ampliación que se aga de la imagen" utilizando oculares de ma$ores aumentos" se llega a un punto en que $a no se logran distinguir m#s detalles %fig microsc**&
Au$ento tot&l del $'c%o"cop'o !ot*n'co co$pue"to El aumento total de la imagen del microscopio compuesto se obtiene multiplicando el aumento propio del ob)etivo por el aumento propio del ocular
)&+
)/+
)c+
)d+
+igura microsc ** I$8(ene" -ue $ue"t%&n un e2e$plo de &u$ento
ATJ &u$ento del o/2et'3o 9 &u$ento del ocul&%
Au$ento 4t'l 0 &u$ento 3&c1o del $'c%o"cop'o. La imagen que forma el microscopio fotónico compuesto posee características que permiten ver menor o ma$or cantidad de detalles de la misma !e observar#n m#s detalles cuanto me)or sea el poder de resolución del ob)etivo empleado Pa se a mencionado que la resolución de la imagen del ob)eto depende esencialmente de la apertura numérica del ob)etivo $ del tipo de luz que se utilice El ocular solamente aumenta la imagen proporcionada por el ob)etivo sin a1adirle a ésta alguna capacidad de resolver me)or los detalles !e define como aumento 4til de un microscopio cuando al ampliar la imagen del ob)eto %a través de un )uego de ob)etivo W ocular& se distinguen una serie de detalles" es decir se resuelven me)or las estructuras que lo integran %fig micros *0&
3&c1o. Gue(o de do" o/2et'3o" 9 0 69 0 de do" ocul&%e"> de 6;9 0 9. &+ o/2eto /+ '$&(en con o/2et'3o de 9 K ocul&% de 69 c+ '$&(en con o/2et'3o de 69 K ocul&% de 69 0 d+ '$&(en de o/2et'3o de 69 K ocul&% de 9.
@ara obtener el &u$ento 4t'l de una imagen e-iste un procedimiento que nos indica el )uego de ob)etivos con los correspondientes oculares que se debe utilizar en la ampliación de la imagen 'na manera sencilla de calcular el aumento 4til de un )uego de o/2et'3o K ocul&% es multiplicando la AU del ob)etivo por *000 La cifra obtenida es el aumento total que debe tener la imagen cuando se multiplica el aumento del ob)etivo por el aumento del ocular" por e)emplo si se tiene un ob)etivo de *00- que posee una AU*2< el aumento m#-imo que debe presentar la imagen para ofrecernos la ma$or cantidad de detalles es aquel que resultaría de multiplicar *2< - *000 *2<0 aumentos" por lo tanto si el ob)etivo es de *00 ampliaciones debemos usar un ocular de por lo menos *2-" si usamos un ocular de *<- la ampliación de la imagen nos estaría dando un aumento vacío Al contrario" si empleamos un ocular de <- <00-" estaríamos frente a un caso de subutilización del poder de resolución del ob)etivo pues no se lograría el aumento necesario para lograr observar los detalles de la imagen que el ob)etivo empleado a logrado resolver Los límites que e-isten para que un ob)etivo pueda ofrecer al observador un adecuado poder de resolución oscilarían entre las cifras que se1alan un m#-imo poder de resolución equivalente a multiplicar la AU del ob)etivo utilizado por *000" $ un mínimo poder de resolución 4til equivalente a multiplicar la AU del ob)etivo por <00
Pode% de penet%&c'*n o de p%o!und'd&d de c&$po La imagen que se forma a través del microscopio proviene de un ob)eto sumamente delgado %< µm a *0 µm de grosor&" que genera varios planos de im#genes profundos" intermedios $ superficiales ,uando se e-amina un te)ido con ob)etivos de ba)os aumentos :- ó *0- la imagen que se observa puede enfocarse *:
con facilidad con el tornillo macrométrico" sin que se diferencien los planos de enfoque antes mencionados" pero cuando la imagen se forma al emplear ob)etivos de :0- $ *00-" es necesario utilizar el enfoque fino a través del tornillo micrométrico" pues es muco m#s evidente que si enfocamos el plano superficial" es probable que al ascender levemente la platina por acción del micrométrico logremos enfocar $ visualizar con nitidez el plano focal medio o el profundo
La imagen generada por el ob)etivo es captada posteriormente por la lente de campo del ocular $ la amplía el numero de veces del aumento que aquel posee La imagen formada por el ocular ser# de $&0o% t&$&o" de%ec:& con %el&c'*n & l& '$&(en !o%$&d& po% el o/2et'3o $ 3'%tu&l %fig microsc *&
@or lo tanto" el poder de penetración o de profundidad de los ob)etivos es inversamente proporcional al aumento propio de los mismos
"
"
Bo%$&c'*n de l& '$&(en & t%&3," del $'c%o"cop'o !ot*n'co La imagen total del microscopio fotónico se forma
La imagen total formada por ambas lentes ser# &u$ent&d& de t&$&o; 'n3e%t'd& 0 3'%tu&l con relación al ob)eto /al como se esquematiza en la figura ;icrosc *:
f
c
f
2f
+igura microsc * . C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en !o%$&d& po% el ocul&%.
lente o/2et'3o
@ara que se forme una imagen del ob)eto observado es indispensable que por lo menos dos ra$os luminosos que inciden en el ob)eto iluminen una porción del mismo
2f
f
"
2f
/al como se observó en los casos de formación de im#genes" un punto iluminado del ob)eto trasmite dos ra$os luminosos uno" orientado paralelamente al e)e principal" se refracta al atravesar la lente del ob)etivo" en tanto que el otro se traslada en dirección oblicua acia el centro óptico de la lente $ la atraviesa sin refractarse
c
"
D'"t&nc'& l'/%e de t%&/&2o !e denomina así a la distancia que e-iste entre la superficie de la laminilla cubreob)etos $ la lente frontal del ob)etivo Esta distancia ser# ma$or cuanto menor sea el aumento propio del ob)etivo $ viceversa
mediante las im#genes que generan sucesivamente el ob)etivo $ el ocular
f
"
"
"
"
lente ocul&%
"
f
"
f
2f +igura microsc *: C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en tot&l !o%$&d& po% el "'"te$& *pt'co del $'c%o"cop'o.
+igura microsc *2 C&%&cte%1"t'c&" de l& '$&(en !o%$&d& po% el o/2et'3o
En el lugar donde los dos ra$os luminosos se interceptan se formar# la imagen del punto iluminado !i del ob)eto se trasmiten dos ra$os luminosos por cada punto que lo constitu$en igual numero de puntos luminosos formar#n la imagen ,on la diferencia que la imagen ser# ampliada U n4mero de veces correspondiente al aumento propio que posea el ob)etivo Esta imagen es de ma&or tama'o* real e invertida %ver figura microsc *2& Los otros ra$os luminosos que llegan a la lente frontal del ob)etivo $ que no iluminan ning4n punto del ob)eto" al atravesar la lente" le confieren al campo microscópico una iluminación uniforme A este tipo de iluminación se denomina de c&$po cl&%o
TIPOS DE MICROSCOPIOS BOTÓNICOS. C,"&% Edu&%do Mont&l3o A%en&"
Las características descritas" de los componentes del microscopio fotónico" así como la formación de las im#genes de los ob)etos observados corresponden al microscopio fotónico" instrumento de ma$or uso en los #mbitos académicos docentes $ de investigación el denominado
M'c%o"cop'o de t%&n"p&%enc'& o de c&$po cl&%o. Este microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial como energía luminosa para formar las im#genes del ob)eto que se observa La imagen muestra puntos o #reas iluminadas %generalmente coloreados& sobre un fondo claro o transparente
*<
Lente del conden"&do%
+igura microsc *< L&" !oto$'c%o(%&!1&" $ue"t%&n '$8(ene" de c,lul&" de"c&$&d&" del ep'tel'o /uc&l. &+ '$&(en o/ten'd& de c,lul&" "'n te'%; /+ '$&(en o/ten'd& con c,lul&" te'd&" con &zul de tolu'd'n&; 9.
@ara que la imagen sea visible con nitidez es necesario que el ob)eto e-aminado este coloreado o te1ido" es decir que los componentes celulares $ tisulares de la estructura se contrasten mediante colorantes específicos que absorban $ transmitan determinadas longitudes de onda del espectro visible Las longitudes de onda que no se absorban son transmitidas al o)o umano o a un material fotogr#fico sensible dando como resultado que la estructura te1ida aparece de un determinado color El campo microscópico aparece claro o transparente porque los ra$os luminosos directos que provienen del condensador no encuentran en su camino ninguna estructura coloreada $ entran como ra$os de luz blanca acia el ob)etivo !i se e-aminan ob)etos sin colorear la imagen ofrecer# detalles poco contrastados" casi transparentes Las secciones de te)idos deben ser delgadas con un grosor de < µm a *0 µm !e puede emplear secciones de ma$or espesor pero la imagen no mostrar# un buen poder de resolución $ tampoco e-ibir# contornos nítidos" pues en el campo microscópico se observar#n varios planos superpuestos de las im#genes
M'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o . !e denomina así por que
d'&!%&($&
+igura microsc *6 . D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o"; en el "'"te$& *pt'co del conden"&do% 0 l& de"3'&c'*n de lo" %&0o" lu$'no"o" o/l'cuo"; en el $'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o.
,uando estos ra$os oblicuos encuentran en su recorrido" alguna partícula" son desviados acia la lente frontal del ob)etivo $ la imagen de la partícula se observa brillante en medio de un fondo oscuro
+igura microsc *C I$&(en c,lul&" ep'tel'&le" de"c&$&d&" de l& $uco"& /uc&l; !oto(%&!'&d&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o de c&$po o"cu%o.
E-isten diversos tipos de condensadores dise1ados $ fabricados especialmente para la microscopía de campo oscuro 'na manera sencilla de fabricar un diafragma que produzca campo oscuro en un microscopio de estudiante es elaborar con una cartulina negra un diafragma que se coloca deba)o del condensador del microscopio %ver fig microsc*H&
La imagen que se forma est# constituida por una serie de estructuras brillantes sobre un fondo oscuro
El principio óptico de este microscopio es el de aprovecar un con)unto de ra$os luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del ob)etivo" observ#ndose el campo microscopio totalmente oscuro @ara que esto ocurra se requiere en primer lugar que la apertura numrica del condensador sea ma&or +ue la apertura numrica del objetivo Esta condición facilita que los ra$os luminosos
directos provenientes de la fuente luminosa sean impedidos de entrar a la porción central de la lente del condensador $ solo penetren $ emer)an de él" los ra$os periféricos que al refractarse se acen oblicuos o/2et'3o
po%t&o/2eto"
platina
+igura microsc *H . E"-ue$& -ue $ue"t%& l& $&ne%& de !&/%'c&% un d'&!%&($& p&%& p%oduc'% c&$po o"cu%o en un $'c%o"cop'o !ot*n'co.
El microscopio de campo oscuro se emplea para ver células vivas %protozoarios" bacterias" células descamadas" etc& en las cuales no se an aplicado sustancias fi)adoras ni colorantes /ambién se pueden observar partículas que tengan un tama1o inferior a los 02 de micrómetro5 esto se debe a que los ra$os de luz oblicuos que inciden en ellas forman un alo luminoso brillante alrededor de las mismas ;ediante el empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la forma $ el movimiento elicoidal que muestra la *6
espiroqueta #reponema pallidum" una bacteria causante de la sífilis
M'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e" Es el microscopio fotónico m#s utilizado para observar ob)etos o estructuras transparentes sin te1ir Al igual que el microscopio de campo oscuro facilita la observación de células vivas para distinguir $ analizar sus componentes morfológicos $ ciertas funciones que ellas puedan desarrollar %fagocitosis" mitosis" movimientos ameboideos" ciliares o flagelares" etc&
+igura microsc20 Reco%%'do de do" ond&" lu$'no"&" p&%& $o"t%&% el
e!ecto de 'nte%!e%enc'& en> &+ cu&ndo l&" ond&" de luz "e encuent%&n en !&"e /+ cu&ndo l&" ond&" e"t8n de"!&"&d&" en = lon('tud de ond& 0 c+ en un < de lon('tud de ond&.
De acuerdo a la construcción especial de ciertos aditamentos %anillo de fases $ placa de fases& que posee el microscopio de contraste de fases" es factible que el sistema separe los dos ra$os luminosos que inciden $ emergen del ob)eto %el directo $ el refractado& para que" de manera artificial" el ra$o refractado retrase su recorrido mas o menos a la mitad de longitud de onda $ cuando estos ra$os de luz se interfieran puedan anularse ofreciendo una porción oscura de la imagen es decir disminución de la intensidad luminosa en un fondo iluminado formado por los ra$os luminosos directos %fig microsc *" 2*& El microscopio de contraste de fases requiere de un condensador especial que contiene en su interior el diafragma con el anillo de fases adecuado para cada tipo de ob)etivos $ éstos que alberguen placas de fases localizadas en el plano focal de los mismos
+igura microsc * I$&(en c,lul&" ep'tel'&le" de"c&$&d&" de l& $uco"& /uc&l; !oto(%&!'&d&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e".
El principio óptico de este microscopio consiste en la capacidad que tiene para transformar" en los ob)etos transparentes" los peque1os índices de refracción que cada uno de sus componentes posee en diferencias de intensidad luminosa" ofreciendo im#genes donde las estructuras del ob)eto aparecen contrastadas en tonos oscuros o tonos brillantes $ tonos intermedios ,uando se trató en el tema de óptica" los índices de refracción" se afirmó que un ra$o luminoso retrasaba su velocidad cuando atravesaba una sustancia transparente que poseía un índice de refracción ma$or que el aíre %B9 *00& Los componentes celulares $ tisulares de muestras sin te1ir no son f#cilmente observables por el o)o umano porque sus índices de refracción que cada uno de ellos posee" son de escasa diferencia entre sí Los ra$os luminosos que los atraviesan suelen retardar su recorrido en un I ó J longitud de onda %de acuerdo a sus índices de refracción& respecto a los ra$os luminosos directos que en su recorrido no encuentran estructura alguna5 por lo tanto" el $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e" utiliza la propiedad que tienen dos ondas luminosas desfasadas de interferir entre ellas para generar im#genes contrastadas por la ma$or o menor intensidad luminosa que e-iban sus componentes
@laca
9a$o directo
ra$o refractado
Ob)etivo
@latina
ob)eto
,ondensador Anillo
&+
/+ +igura microsc 2* D'&(%&$& -ue $ue"t%& l& t%&0ecto%'& de lo" %&0o"
c+
lu$'no"o" & t%&3," de lo" co$ponente" *pt'co" del $'c%o"cop'o de cont%&"te de !&"e".
*C
M'c%o"cop'o de cont%&"te 'nte%!e%enc'&l d'!e%enc'&l )CID+ o de No$&%"'.
B'(u%& $'c%o"c. . D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" co$ponente" *pt'co" del $'c%o"cop'o CID 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".
Este tipo de microscopio fue dise1ado $ construido bas#ndose en los principios ópticos seme)antes al microscopio de contraste de fases" porque la imagen se genera utilizando las diferencias de fase de los ra$os luminosos que atraviesan el ob)eto observado
,onsiderando que el retraso est# en relación directa con el grosor del ob)eto $ con su índice refracción" el valor del retraso se puede emplear para determinar la masa por unidad de superficie del material observado" células por e)emplo $" por lo tanto la masa de sus componentes
La diferencia con el microscopio de contraste de fases radica en que el sistema óptico" mediante un filtro especial %de luz polarizada& ace vibrar las ondas de luz en un solo plano" m#s o menos en un #ngulo de :< °5 estas ondas de luz polarizada se dirigen a un prisma especial %de Xollaston # *& donde en la primera parte del prisma" se dividen en dos ondas luminosas que vibran aora en dos planos diferentes de 0° entre ellas" pero ligeramente desfasadas" emergen" después de atravesar la segunda parte del prisma" como dos ondas luminosas separadas pero aora en fase $ se dirigen al ob)eto para que iluminen puntos mu$ cercanos $ los atraviesen %Las zonas iluminadas pueden tener índices de refracción omogéneas" una zona omogénea $ otra con un B9 diferente o bordes de estructuras con diferentes B9" etc& En cualquiera de los casos" la onda luminosa que atraviesa el ob)eto se retrasar# con relación a la otra onda que no lo atraviesa" la cual servir# como referencia
Las ondas luminosas que emergen del ob)eto entran al prisma de Xollaston # 2 %cu$a estructura cristalogr#fica tiene una posición invertida con respecto al prisma # *& $ colocado ligeramente descentrado del e)e óptico del microscopio Las dos ondas que estaban desfasadas empiezan a ponerse en fase en la primera mitad del prisma" pero luego en la segunda parte vuelven a desfasarse un I de longitud de onda $ así salen del prisma" pero no pueden interferirse porque vibran en planos distintos !e dirigen al analizador" otro filtro de polarización con su estructura cristalogr#fica perpendicular al primer filtro de polarización" encargado de acer rotar el plano de las dos ondas luminosas" los ace coincidir $ se produce la interferencia De esta manera se observa una ligera diferencia de intensidad entre la zona que fue atravesada del ob)eto $ la porción omogénea o de menor índice de refracción que se muestra con una ma$or intensidad luminosa !i la primera zona es un borde" por e)emplo" de una célula o de una estructura intracelular $ la segunda zona es omogénea o de menor índice de refracción se observar# un borde mu$ brillante o luminoso rodeado de una zona menos iluminada" dando el aspecto de una imagen tridimensional
+iltro analizador @risma de Xollaston Y 2
ob)etivo
ob)eto condensador
+igura microsc 2 I$8(ene" o/ten'd&" $ed'&nte el $'c%o"cop'o e
cont%&"te 'nte%!e%enc'&l d'!e%enc'&l o de No$&%"0. &+ e%'t%oc'to" no%$&le" 0 c%en&do". H+ c,lul&" de"c&$&d&" del ep'tel'o /uc&l. @risma de Xollaston Y *
El borde brillante se forma en un lado del ob)eto" en tanto que el otro lado ocurre un proceso inverso" el borde se oscurece $ el #mbito que lo rodea muestra cierta brillantez La imagen que se forma da la sensación visual de ba)orrelieve o de un 7aspecto tridimensional8 % fig microsc 2&
+iltro polarizador
M'c%o"cop'o de luz pol&%'z&d&. Onda luminosa
'na serie de componentes biológicos" vegetales $ animales" celulares o tisulares est#n constituidos por moléculas que por *H
su organización cristalina" paracristalina o fibrilar en su estructuración bioquímica" adoptan determinada orientación en el espacio Estas estructuras orientadas en el espacio con un arreglo molecular especial" interactuan con las ondas luminosas que incidan en ellas de formas mu$ variadas" dependiendo de cómo ese ob)eto esta orientado Así" los índices de refracción del ob)eto ser#n diferentes dependiendo de los e)es de rotación del ob)eto 'n ob)eto con e)es que poseen varios índices de refracción se denomina birrefringente @or la disposición espacial de los #tomos $ moléculas también se denominan anisotrópicas La birrefringencia resulta de la alineación de #tomos o moléculas en un determinado plano del ob)eto Estos #tomos $ moléculas interaccionan intensamente con ondas luminosas que incidan en ellos desde una determinada dirección" aciendo que el plano de vibración de las ondas luminosas pueda ser modificado o rotado asta en un #ngulo de :<° Las estructuras birrefringentes cuando son iluminadas con luz polarizada brillar#n intensamente sobre un fondo oscuro5 en cambio su respuesta a la iluminación ser# mu$ débil o nula cuando las ondas luminosas incidan desde una dirección diferente $ éstas no puedan ser modificadas en su plano de vibración Bmagen
brillante
!e
denominan estructuras o monorrefringentes anisotrópicas aquellas cu$o arreglo molecular les confiere un mismo índice de refracción Esta disposición espacial impide que las ondas luminosas polarizadas puedan ser giradas @ara analizar la anisotropía o birrefringencia de una estructura celular o tisular se utiliza el microscopio de luz polarizada Este microscopio se caracteriza porque posee entre el recorrido de los ra$os luminosos dos filtros o prismas polarizadores 'no de ellos % filtro polari!ador & est# localizado después de la fuente luminosa $ antes del ob)eto" es el filtro encargado de polarizar la luz5 el otro se localiza posterior al ob)eto %filtro anali!ador
oscura
+iltro analizador
onda de luz no girada
ob)etivo
ob)eto
La birrefringencia de una estructura depende de la disposición asimétrica regular de sus moléculas o iones" por e)emplo cristales de fosfatos $ carbonatos de calcio %cristales de idro-iapatita& del te)ido óseo o ciertas inclusiones celulares como los granos de almidón % birrefringencia cristalina o intrínseca& o una disposición regular de unidades submicroscópicas asimétricas como los miofilamentos de miosina de las fibras musculares estriadas" los microt4bulos del uso acrom#tico % birrefringencia de forma&
onda de luz girada
Las re)illas moleculares de cada filtro se disponen" en el microscopio de polarización" perpendiculares entre sí Esto significa que si iluminamos el microscopio $ observamos el campo microscópico" éste aparecer# totalmente oscuro" en cambio si en la platina colocamos un ob)eto birrefringente %fibras musculares estriadas" células vegetales conteniendo cloroplastos" células animales en mitosis" fibras col#genas" granos de almidón" etc& la estructura cristalina o paracristalina de sus moléculas ar#n rotar el plano de luz polarizada que se trasmitió entre ellas $ lo ar#n coincidir con el arreglo molecular de la re)illa del filtro analizador" por lo tanto el ob)eto birrefringente aparecer# brillante sobre un fondo oscuro !e emplea también para observar células $ organismos microscópicos vivos
condensador ondas polarizadas +iltro polarizador
Ondas luminosas
+igura microsc 2< Boto$'c%o(%&!1& de un& !'/%& $u"cul&% e"t%'&d& +igura microsc 2: D'&(%&$& -ue $ue"t%& el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o" en el $'c%o"cop'o de pol&%'z&c'*n 0 l& /'%%e!%'n(enc'& -ue e9:'/e l& e"t%uctu%& $olecul&% del o/2eto.
e"-uel,t'c& $o"t%&ndo /&nd&" e"t%'&d&" /'%%e!%'n(ente" )&n'"ot%*p'c&"+ 0 $ono%%e!%'n(ente" )'"ot%*p'c&"+. L& /'%%e!%'n(enc'& "e de/e & l& d'"po"'c'*n e"p&c'&l -ue po"en lo" !'l&$ento" de $'o"'n&.
*
M'c%o"cop'o de !luo%e"cenc'& o de %&d'&c'*n ult%&3'olet&. ,iertas sustancias naturales o artificiales poseen la propiedad que cuando son estimuladas por energía de cierta longitud de onda % por e)emplo energía radiante invisible como la radiación ultravioleta o radiación luminosa violeta o azul& absorben esta energía $ emiten fotones que integran ondas visibles de luz" de longitudes de onda siempre ma$ores que las ondas con las que fueron e-citadas Este fenómeno se denomina fluorescencia La luz emitida se observa en forma de destellos coloreados sobre un fondo oscuro %fig microsc26& La condición esencial para que se produzca fluorescencia es que la longitud de onda de la energía radiante e-citatoria sea menor que la longitud de onda emitida La propiedad de generar fluorescencia es propia de ciertas estructuras celulares animales o vegetales @or e)emplo la clorofila cuando es e-citada por radiación ultravioleta emite radiación visible de color ro)o La vitamina 7D8 contenida en células animales como los epatocitos resplandece de un color blanco brillante E-isten una serie de sustancias colorantes artificiales que también emiten fluorescencia cuando son e-citadas Estas sustancias se denominan “fluorocromos”. Los fluorocromos se emplean para demostrar una serie de componentes celulares o tisulares pues al unirse de manera específica a algunos de ellos $ ser e-citados por radiación ultravioleta o longitudes de onda menores %azul" violeta& resplandecen ofreciendo im#genes de colores diferentes" generalmente de longitudes de ondas azules" verdes" amarillas" naran)as o ro)as 'no de los fluorocromos m#s conocidos es el naran)a de acridina @or e)emplo cuando se 7colorean8 células o te)idos con este fluorocromo es posible demostrar de manera específica #cidos nucleicos El DNA emite radiación verdeGamarillenta $ el RNA fluoresce de color ro)o E-isten dos tipos de fluorescencia a& natural o autofluorescencia se produce cuando determinadas estructuras o sustancias animales o vegetales" al ser e-citadas con radiación ultravioleta irradian fluorescencia Los e)emplos citados en p#rrafos anteriores %clorofila" (itamina 7D8" etc&" el pigmento flavina" componente del semen también es autofluorescente" corroboran lo mencionado b& fluorescencia artificial Es aquella que irradian" de manera específica" determinadas estructuras celulares o tisulares cuando son 7coloreadas8 por fluorocromos8 $ observadas a través del microscopio de fluorescencia La fluorescencia artificial se aplica mediante dos procedimientos 1rocedimiento directo que consiste en unir directamente el fluorocromo" a ciertos componentes de las células o te)idos5 por e)emplo" el naranja de acridina con los #cidos nucleicos La auramina con los bacilos de la tuberculosis %en este caso
el 1ycobacterium tuberculosis fluoresce de color amarillo dorado& En otros casos es posible in$ectar soluciones de fluorocromos vitales al interior de las células para observar el transporte de sustancias de una célula a otra 1rocedimiento indirecto. @ara que se produzca fluorescencia es indispensable que el fluorocromo se ligue a una determinada sustancia proteínica" mediante enlaces covalentes %con)ugados&" la cual mediante la reacción inmunológica antígeno %componente que se desea identificar& G anticuerpo %sustancia ligada con el fluorocromo&" se unir#n de manera específica @or e)emplo se ligan fluorocromos con anticuerpos antiGtubulina $ el con)ugado se vierte en un cultivo de te)idos 3racias a este procedimiento se puede observar el uso acrom#tico %constituido por microt4bulos& de las células en proceso de mitosis Así mismo se con)ugan fluorocromos a anticuerpos antiG actina o antiGmiosina para demostrar el citoesqueleto de células como macrófagos o fibroblastos u observar la disposición de los miofilamentos de actina $ miosina en las fibras musculares Bmagen fluorescente
@lano de la imagen
ocular
filtro protector
ob)etivo ra$os verdes espécimen
,ondensador
9a$os filtrados %azules&
ra$o filtrado ultravioleta
+iltro selector
+igura microsc 2C D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o de !luo%e"cenc'& po% t%&n"p&%enc'& 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".
La microscopía de fluorescencia a permitido avanzar de manera sorprendente en la investigación de procesos fisiológicos celulares que mediante otros procedimientos no ubiera sido posible realizar La fluorescencia permite demostrar" por la radiación luminosa que emiten" partículas sumamente peque1as que con otros tipos de microscopios 20
fotónicos no son f#ciles de visualizar En este tipo de procedimiento es indispensable obtener el registro fotogr#fico de las im#genes obtenidas El microscopio de fluorescencia consta de los mismos componentes de un microscopio fotónico al que se le a1aden varios aditamentos %fuente luminosa $ filtros especiales& con la finalidad de que emita" de manera selectiva" radiaciones de determinadas longitudes de onda radiación ultravioleta u ondas luminosas de color violeta" azul" ó verde E-isten dos tipos de microscopio de fluorescencia aquel en el cual las radiaciones e-citatorias atraviesan la muestra a observar" se le denomina microscopio de fluorescencia de transmisión o de transparencia Este tipo de microscopio casi est# en desuso P el denominado microscopio de epifluorescencia donde la radiación e-citatoria es aplicada sobre la muestra a través de un sistema incorporado al ob)etivo La radiación no atraviesa el espécimen Los aditamentos son Buente lu$'no"& de gran potencia que preferentemente emita radiaciones '(" violeta" azul $ verde B'lt%o" "electo%e" o e9c't&do%e" encargados de filtrar $ seleccionar las ondas radiantes de aquellas que no se desean emplear B'lt%o p%otecto% o de /&%%e%&. Es un filtro de color amarillo5 est# localizado entre el ob)etivo $ el tubo óptico Es indispensable utilizarlo para bloquear alg4n tipo de radiación ultravioleta que pueda aberse trasmitido o refle)ado $ que no e)erció en la muestra actividad e-citatoria %la radiación '( posee una alta energía que puede irritar e inflamar los te)idos del globo ocular&
O/2et'3o" de !luo%'t&. Los ob)etivos cu$as lentes est#n construidos por silicatos %vidrios de flint o de croN& poseen autofluorescencia" por lo que es necesario reemplazarlos por ob)etivos de fluorita En el caso del microscopio de epifluorescencia" los ob)etivos est#n dise1ados $ construidos para que ellos también funcionen como lentes condensadores pro$ectando la energía radiante uniformemente sobre la muestra E"pe2o d'3'"o% de :&ce". Es un aditamento propio de este tipo de microscopio Est# situado en posición oblicua por encima del ob)etivo !us características físicas solamente le permiten refle)ar" acia el espécimen la longitud de onda filtrada $ seleccionada 9adiaciones que no fueron bloqueadas por el filtro e-citador atraviesan el espe)o divisor $ contin4an su tra$ectoria sin ser refle)ados
+igura microsc 26 Boto$'c%o(%&!1& de e"t%uctu%&" celul&%e" -ue $ue"t%&n !luo%e"cenc'&. Bmagen fluorescente
plano de la imagen
ocular
filtro protector
filtro selector
espe)o divisor de aces
ob)etivo condensador
espécimen
+igura microsc 2H D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o de ep'!luo%e"cenc'& 0 el %eco%%'do de lo" %&0o" lu$'no"o".
M'c%o"cop'o t%'d'$en"'on&l de %&"t%eo con!oc&l.
Las im#genes obtenidas con los microscopios de fluorescencia" de transmisión $ de epifluorescencia" tienen el inconveniente que no siempre muestran una resolución $ una nitidez deseada" $a sea porque los especímenes e-aminados son demasiado gruesos %los componentes que fluorescen muestran varios planos focales" los que al superponerse e-iben una imagen desenfocada& o porque durante proceso de preparación de la muestra $ su observación posterior el fluorocromo tiende a ser fotoo-idado por la energía radiante que lo e-cita $ su capacidad de generar luminiscencia se pierde con rapidez5 en otros casos suele difundirse lentamente $ el contorno del espécimen aparece levemente difuso !i la muestra e-ibe zonas sumamente peque1as que 2*
reaccionan al fluorocromo" el resplandor o el brillo de la imagen suele ser mu$ débil sobre un fondo del campo microscópico totalmente oscuro Esto obliga a que para obtener las im#genes fotogr#ficas se requiere tiempos de e-posición bastante prolongados %a pesar de e-istir material fotogr#fico con velocidades de e-posición sumamente r#pidas& lo que ocasiona que se presenten los inconvenientes mencionados anteriormente Ante estos inconvenientes se a logrado dise1ar $ construir un microscopio denominado microscopio fotónico tridimensional de rastreo confocal" a través del cual se obtienen im#genes" preferentemente fluorescentes" sumamente nítidas" con una gran capacidad de resolución $ sin que se produzca la fotoo-idación del fluorocromo El mecanismo de acción de este microscopio se basa en la iluminación de la muestra con un delgado ra&o laser concentrado en un foco que recorre con rapidez" punto por punto" todos los componentes del espécimen" a una profundidad microscópica constante" de tal manera que se ilumina un plano mu$ delgado %plano óptico&" apro-imadamente calculado entre 0< a 0H de micrómetro La imagen así obtenida se recoge en un monitor $ se guarda en la memoria de un procesador" el cual )unta las im#genes de otros planos" inferiores o superiores asta integrarla en una sola imagen de contornos sumamente nítidos $ con una gran e-ibición de detalles que" en otras condiciones" no serían posibles de observar ;ediante el sistema computarizado la imagen compuesta se puede observar en tres dimensiones e inclusive puede rotarse para ser visualizada desde diferentes #ngulos
)unto con otros científicos desarrollaron un microscopio electrónico" en el que mediante la aplicación de energía eléctrica de alto volta)e a un electrodo met#lico" se emitían aces de electrones con longitudes de onda que en un principio no lograron sobrepasar el poder de resolución del microscopio fotónico pero que" en el a1o de *H" después de una serie de innovaciones como el fabricar $ adicionarle un condensador que orientaba" concentraba $ aceleraba la marca del az de electrones emitidos" les permitió alcanzar im#genes con un poder de resolución cercano a los *0 nanómetros %*00Z& La longitud de onda de los electrones emitidos por el electrodo met#lico %c#todo&" depende del volta)e aplicado" es decir" a ma$or volta)e utilizado menor ser# la longitud de onda del az de electrones La relación de λ con el poder de resolución del microscopio electrónico es ,on *0 ?ilovoltios %?(& de aceleración" se produce una longitud de onda % λ& de 000*nm que genera" a su vez" una resolución de *0 nm ,on *00 ?(" la λ es igual a 0000: nm $ el poder de resolución es de : nm ,on *000 ?(" la λ es igual a 0000* nm $ el poder de resolución es de * nm Los aces de electrones emitidos por el c#todo se desplazan en todas las direcciones del espacio" por lo tanto es necesario reorientarlos $ acelerar su desplazamiento Esto se consigue con un #nodo colocado en las cercanías de la emisión que genera un alto potencial eléctrico positivo E-isten dos tipos de microscopios electrónicos el ME de t%&n"$'"'*n $ el ME de /&%%'do %scanning&
B'(u%& $'c%o"c. Bmagen de una fase de la mitosis obtenida mediante microscopio tridimensional confocal
M'c%o"cop'o elect%*n'co.
El microscopio fotónico tiene una capacidad m#-ima de mostrar detalles de la imagen de un ob)eto %poder de resolución&" cuando entre ellos e-iste una distancia apro-imada de 02 de micrómetro Este tipo de microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolución ma$or porque e-isten dos factores limitantes la longitud de onda % λ& de la energía luminosa utilizada $ la apertura numérica %AU& de la lente del ob)etivo La 4nica manera de aumentar el poder de resolución de un microscopio era encontrar energía radiante con longitudes de onda menores a las que posee el espectro radiante visible En *0" el físico De Sroglie" bas#ndose en estudios teóricos predi)o que los electrones" emitidos ba)o ciertas circunstancias" como en el vacío" por e)emplo" podían desplazarse $ comportarse como ondas de energía ,omprobada esta teoría" entre *2 $ *:" =noll $ 9us?a"
B'(u%& $'c%o"c. . +otografía de un microscopio electrónico de transmisión
22
M'c%o"cop'o elect%*n'co de t%&n"$'"'*n +ue dise1ado $ construido bas#ndose en los mismos principios de un microscopio fotónico5 con la diferencia que en vez de usar energía luminosa emplea aces de electrones $ reemplaza las lentes ópticas %de vidrio& por 7lentes8 construidas mediante campos electromagnéticos En la figura microsc * se representan los principales componentes del ;E de transmisión" los cuales son
conden"&do% $ue"t%&
lente ob)etivo
imagen ampliada
n ctodo"
constituido por un filamento de alambre de tungsteno que se calienta e irradia un corro de electrones cu$a velocidad $ longitud de onda est#n relacionadas con el volta)e de la energía eléctrica que se le aplica n nodo" encargado de orientar los aces de electrones" reagruparlos $ acelerar su recorrido
Lente )ocul&%+ p%o0ecto%&
“Lente” condensadora (primer campo electromagntico).
Los aces de electrones provenientes del #nodo son concentrados por este primer campo electromagnético $ dirigidos acia el oporte de la muestra* en este lugar" dependiendo de la densidad que posean los componentes del espécimen los aces de electrones los atraviesan" son absorbidos" refle)ados o son desviados en su recorrido Las muestras deben ser secciones sumamente delgadas para permitir el paso de los electrones 3eneralmente se utilizan secciones de te)idos del orden de 20 a *00 nanómetros El escaso grosor del espécimen dificulta la formación de la imagen por lo que es necesario 7te1ir8 o contrastar las secciones con soluciones de sales de metales pesados %plomo" uranio" plata o vanadio&" los cuales tienen cierta afinidad por determinados componentes celulares “Lente” objetivo (segundo campo electromagntico) . Los electrones que atraviesan la muestra o los desviados por los componentes de la misma" llegan a esta zona donde son enfocados para formar una imagen ampliada Esta imagen es recogida por la “ Lente ocular” o de pro&ección (tercer campo electromagntico) que vuelve a enfocar la imagen $ la pro$ecta" ampliada también numerosas veces" acia la pantalla fluorescente. 2sta es una superficie plana constituida por un soporte de colodión donde se distribu$en partículas mu$ finas de sales de zinc o de fósforo verde" las cuales emiten energía luminosa %ondas de ma$or longitud" visibles al o)o umano& cuando son estimuladas por el coque de los electrones @ara obtener un registro permanente de la imagen observada se reemplaza la pantalla fluorescente con una placa fotogrfica" cu$os componentes son estimulados por los electrones de la misma manera que act4an los fotones
imagen final
@antalla fluorescente o placa fotogr#fica
+igura microsc * D'&(%&$& -ue %ep%e"ent& lo" co$ponente" p%'nc'p&le" de un $'c%o"cop'o elect%*n'co 0 el %eco%%'do del :&z de elect%one".
/odos los componentes del microscopio electrónico est#n contenidos dentro de una columna met#lica conectada a un
sistema de acer vacío Es imprescindible que e-ista el
vacío dentro de la columna pues los electrones son desviados f#cilmente si e-isten en el medio partículas o moléculas suspendidas Los electrones que atraviesan o son desviados por estructuras del espécimen que poseen escasa o nula densidad llegan a la pantalla fluorescente $ estimulan sus partículas Aquellos electrones que inciden en estructuras de ma$or densidad" son refle)ados o absorbidos" no las atraviesan $ de)an zonas de la pantalla sin estimular" por lo tanto en esos lugares no se emite luminosidad De esa manera se forma la imagen con zonas iluminadas o claras denominadas electronl5cidas " $ otras oscuras o electrondensas %fig microsc 2& El ;E de transmisión se emplea para obtener im#genes con un gran poder de resolución que alcanza desde 0< a *0 nanómetro
c#todo 8nodo
:&z de elect%one" +igura microsc 2 Boto$'c%o(%&!1& o/ten'd& con el $'c%o"cop'o
Lente
elect%*n'co de t%&n"$'"'*n.
2
M'c%o"cop'o )"c&nn'n(+.
elect%*n'co
de
/&%%'do
Este tipo de microscopio electrónico funciona con los mismos principios electrónicos del ;E de transmisión una fuente generadora de electrones" campos electromagnéticos que act4an como 7lentes8 concentradoras %& de los aces de electrones o como ampliadoras de im#genes La diferencia estriba en que los electrones no atraviesan el espécimen para formar las im#genes Los electrones se aceleran $ concentran asta formar un az sumamente delgado de mas o menos < nm de di#metro que rastrea o 7barre8 la superficie de la muestra Los electrones son refle)ados por los componentes de la misma o al cocar con ellos generan electrones secundarios En ambos casos los electrones se envían e inciden en la superficie de un detector localizado en las cercanías de la muestra Este aditamento est# conectado a un amplificador que envía se1ales en forma de ra$os catódicos a la pantalla de un monitor de televisión %ver fig microsc 2& @ara registrar la imagen formada se utiliza una c#mara fotogr#fica El ;E de barrido" ofrece im#genes con una resolución que alcanzan de *0 a 20 nm El aumento efectivo es de *<"000 a <0"000 di#metros Otra venta)a de este microscopio es que forma im#genes con una gran profundidad de foco5 de apro-imadamente <00 veces que la del microscopio fotónico Esta propiedad le confiere a la imagen su aspecto tridimensional %fig microsc :&
c#todo
8nodo :&z de elect%one" Lente" conden"&do%&
"
@antalla de /( Bmagen del ob)eto
+igura microsc E"-ue$& -ue %ep%e"ent& lo" p%'nc'p&le" co$ponente" del $'c%o"cop'o elect%*n'co de /&%%'do 0 l& t%&0ecto%'& del :&z de elect%one".
Otra diferencia radica en la preparación del espécimen que debe ser e-aminado5 este microscopio sirve para observar su superficie constituida por una serie de diminutos relieves" sinuosidades" depresiones" grietas $ prominencias" tal como se e-iben en estado viviente" pero que debe estar totalmente desidratado pues también en este microscopio se debe traba)ar en el vacío El agua del material biológico no se puede sustituir por una sustancia de inclusión porque no se requiere efectuar secciones delgadas del te)ido En cambio" se le debe proporcionar a la superficie del espécimen la capacidad de acerse reflectante a los electrones que incidan en ella La totalidad del material biológico a observar" posee un alto contenido de agua" si se desea eliminarla sec#ndola al aire se producirían graves da1os en la estructura morfológica de las células por efecto de la tensión superficial en la interfase aireGagua @ara que esto no ocurra las muestras se preparan a través de la técnica del secado asta el punto crítico en el que se sustitu$e el solvente de desidratación por un gas en su estado líquido %,O 2& que" aplic#ndole una determinada presión $ a una temperatura específica" pasa a la fase gaseosa sin pasar por el estado sólido5 esto evita que el material se colapse $ mantenga su superficie intacta5 con todos los relieves que tuvo al estado natural A continuación se cubre la superficie con una capa conductora %60 a *00 nm& de carbón finamente pulverizado $ posteriormente con una película de metal pesado %plata" oro" platino o paladio& del mismo grosor Ambos elementos se depositan mediante un sistema de evaporación al vacío De esta manera la superficie de la muestra est# preparada para recibir los electrones" refle)arlos o emitir electrones secundarios
detector
muestra amplificador
2:
B'(u%& $'c%o"c. . Bmagen que forma el microscopio de
7scanning8 o de barrido
9evisado el * de septiembre del a1o 2002
2<
