NITROSAMINES IN MEAT PRODUCTS: FORMATION AND IMPACT / NITROSAMINAS EN PRODUCTOS CÁRNICOS: FORMACIÓN E IMPACTO

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NITROSAMINAS EN PRODUCTOS CÁRNICOS: FORMACIÓN E IMPACTO Liliana María Vargas del Río1 Gonzalo Taborda Ocampo2

RESUMEN El estudio de los compuestos N-nitrosados, como son las nitrosaminas, se ha incrementado en los últimos años debido a los resultados obtenidos en investigaciones realizadas en alimentos, plantas, animales, polímeros y en la salud humana. En ensayos realizados con animales de laboratorio se encontró que la mayoría de nitrosaminas presentan propiedades carcinogénicas, teratogénicas y mutagénicas. Con el propósito de profundizar en el estudio de las nitrosaminas en productos cárnicos, se pretende hacer una revisión de las diferentes causas y condiciones que favorecen la formación de estos compuestos y su impacto en la salud humana. Palabras clave: Cáncer, nitratos, nitritos, nitrosaminas y productos cárnicos.

NITROSAMINES IN MEAT PRODUCTS: FORMATION AND IMPACT ABSTRACT The study of nitrosamines has increased in recent years due to the results obtained in researches carried out in food, plants, animals, polymers and in human health. In trials carried out with laboratory animals it was found that the majority of nitrosamines present carcinogenic, teratogenic and mutagenic properties. With the purpose of broadening the study of nitrosamines in meat products, this research intends revise the different causes and conditions that aid the formation of these compounds and its impact on human health. Key words: Cancer, nitrates, nitrites, nitrosamines, meat products.

Ingeniera de Alimentos. Joven Investigadora-COLCIENCIAS - Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] 2 Profesor Asociado. Departamento de Química - Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] 1

Recibido: Octubre 2 de 2006 - Aceptado: Octubre 5 de 2006 Biosalud, Volumen 5, Enero - Diciembre, 2006. págs 101 - 131

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Liliana María Vargas del Río y Gonzalo Taborda Ocampo

INTRODUCCIÓN El uso indiscriminado de aditivos y conservantes en la industria de alimentos en la carrera de incrementar su vida útil, ha favorecido la proliferación de sustancias peligrosas para la salud, es por ello que cada día crece la necesidad de estudiar y evaluar el impacto de sustancias potencialmente cancerígenas en alimentos como los nitratos, nitritos, nitrosaminas, aminas heterocíclicas e hidrocarburos aromáticos policíclicos. Las nitrosaminas se han señalado en diversas investigaciones como potentes agentes carcinógenos, mutagénicos y teratogénicos en animales de laboratorio. Este potencial carcinogénico varía en un amplio rango y depende de los compuestos, las vías de administración, los niveles de dosis, la frecuencia de dosis y la duración de la exposición. Las nitrosaminas son relacionadas principalmente con cáncer de estómago, aunque también tumores pulmonares, de hígado, riñones, páncreas, esófago, cerebrales y de vejiga. Los N-nitrosocompuestos pueden tener dos orígenes diferentes: formación endógena, que es una formación natural de Nnitrosocompuestos en el estómago, y Nnitrosocompuestos formados previamente, presentes en los alimentos y en los fármacos, debido a las técnicas de fabricación o de tratamiento. Dentro de las nitrosaminas que se encuentran comúnmente en productos curados donde se adiciona nitrito y/o nitrato se destacan la nitrosodietilamina (NDEA), la nitrosodimetilamina (NDMA), la nitrosopirrolidina (NPIR), la nitrosopiperidina (NPIP), la nitrosomorfolina (NMOR), la nitrosotiazolidina (NTHZ) y la nitrosoprolina (NPRO). Es entonces el propósito de esta revisión, profundizar en las investigaciones que se han

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Biosalud, Volumen 5, Enero - Diciembre, 2006. págs 101 - 131

desarrollado sobre las condiciones necesarias para la formación de nitrosaminas en productos cárnicos, hasta los estudios realizados en su impacto sobre la salud humana.

NITRATOS Y NITRITOS Los nitratos y nitritos son utilizados como aditivos en forma de sus sales de sodio o potasio en productos cárnicos y en quesos. En alimentos industrializados, las sales de nitrato y nitrito son adicionadas en el proceso de cura de carnes conjuntamente con otros ingredientes, buscando la preservación del producto –inhibiendo el crecimiento de microorganismos–, la fijación de color, aroma, sabor y mejorando el rendimiento (37). Originalmente, el curado se practicaba como un medio de conservar la carne; eso fue antes de que existiera la refrigeración, ya que el curado data de aproximadamente el año 1500 a.C. En algunas áreas menos desarrolladas en que no existen modernas instalaciones de conservación, éste sigue siendo el principal objetivo del curado. Pero en donde ya hay métodos más efectivos de conservación, los principales objetivos del curado son la elaboración de productos cárnicos con sabores únicos, fijación del color rojo y aromas, inhibición del crecimiento de microorganismos (11, 37).

Principales reacciones químicas del nitrito Tanto los nitratos sódico como potásico son compuestos muy estables, capaces de almacenarse indefinidamente sin sufrir ninguna modificación. Tan sólo el NaNO3 es ligeramente higroscópico, por lo que tiende a humedecerse.

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Nitrosaminas en productos cárnicos: formación e impacto

El nitrito es un compuesto relativamente inestable que se altera con facilidad, como sustancia ambivalente, lo mismo se oxida que se reduce (68), siendo la reacción más frecuente la formación de ácido nítrico la cual va acompañada de otros ácidos relativamente débiles. El ácido nítrico es muy inestable, descomponiéndose en la atmósfera en óxido de nitrógeno que se presenta como vapores nitrosos. Cuando el nitrito es almacenado en ambiente húmedo se observa su transformación paulatina en nitrato (54).

Las propiedades químicas del nitrito sódico y/ o potásico en medio mineral se derivan directamente de su carácter óxido-reductor y de su poder nitrosante (26),

A partir de la Ecuación 1, se puede calcular la cantidad de ácido nitroso no disociado para los diferentes pH. Utilizando esta ecuación, se puede representar qué parte de la curva de disociación del ácido nitroso tiene importancia

en el curado de la carne (Figura 1). Teóricamente, solo una pequeña cantidad de nitrito añadido existe como ácido nitroso para los valores normales de pH de la carne.

Oxidante: oxida el ácido ascórbico, por ejemplo. Reductor: es oxidado por el permanganato. Sal de ácido débil y base fuerte: en medio ácido, se establece un equilibrio entre la sal ionizada y el ácido nitroso no disociado, dependiendo del pH de la solución, según la Ecuación 1 de Henderson-Hasselbach:

Figura 1. Porción calculada de la curva de disociación del ácido nitroso.

En los sistemas biológicos el ion nitrito, el ácido nitroso, puede participar en muchas reacciones químicas. La reacción de Van Slyke es un claro

ejemplo de cómo un -aminoácido puede liberar nitrógeno gaseoso dando lugar al correspondiente -hidroxiácido (Reacción I) (68).

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Esta reacción se emplea en la estimación cuantitativa de los grupos libres -amino en los sistemas biológicos. En el curado de la carne, parte del nitrito puede desaparecer como resultado de esta reacción. Cuando las carnes curadas se sumergen en vinagre u otros ácidos, el nitrito desaparece rápidamente, y la Reacción I, parece ser la mayor responsable de tal merma (68). Formación de compuestos nitrosados por la acción sobre los ácidos aminados. A largo plazo el riesgo procede de la posible formación de nitrosaminas, potentes cancerígenos, por reacción con otros constituyentes del propio alimento (72). Inducción a la hemoglobinemia: este problema surge como resultado de la transformación de hemoglobina (transportador del oxígeno en sangre) en metahemoglobina (incapaz de oxigenar). Al producirse esta transformación, incitada por los nitritos, se reduce el transporte de oxígeno a los pulmones y esto puede dar lugar a una muerte por anoxia (falta de oxígeno). Un exceso de nitratos y nitritos en los alimentos puede acarrear graves trastornos cardíacos y respiratorios, e incluso producir la muerte por cianosis (coloración azul por falta de oxígeno), en el caso de los bebés se dan síntomas de asfixia y azulamiento de labios. Esto sucede cuando estos compuestos producen metahemoglobinemia (26). Se necesita una dosis de nitratos/nitritos alta para producir intoxicaciones agudas a animales o seres humanos adultos, ya que su

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sistema enzimático está bien desarrollado, lo que hace que la metahemoglobina sea reducida a oxihemoglobina; no obstante, la población infantil, en particular los lactantes con edades inferiores a tres meses son los más susceptibles a la metahemoglobinemia por varios factores: 1) poseen baja acidez gástrica, que favorece el crecimiento de microorganismos capaces de reducir el nitrato a nitrito; 2) la cantidad de agua ingerida por los lactantes es diez veces superior a la de los adultos y 3) la hemoglobina fetal es del 60 al 80% de la hemoglobina total de la sangre de los recién nacidos. Cabe destacar que la hemoglobina fetal es reducida más fácilmente que la hemoglobina de un adulto a la existencia de un cierto déficit del sistema enzimático que reduzca la metahemoglobina, que sin embargo es muy eficaz en adultos (35, 44, 90). El ion nitrato (NO3-) es una base conjugada de ácido nítrico (HNO3), ácido fuerte (pka = - 1,37) que se disocia en agua formando iones nitrato solubles en agua, excepto las sales básicas de mercurio o bismuto (60). El ion nitrito (NO2-), que a su vez es una base conjugada de ácido nitroso (HNO2), ácido débil de pka = 3,37. Las sales de nitrito son más estables que el ácido nitroso y son extremadamente hidrosolubles, excepto el nitrito de plata (60). Los iones nitrito y nitrato son formados a través de un proceso de oxidación biológica (nitrificación), a partir del ion amonio de acuerdo con las reacciones II y III (69).

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El nitrito se encuentra bajo dos formas, estable e inestable: 1. Nitrito estable. El nitrito bajo su forma estable (pH = 6,2) conlleva la gelificación de las proteínas cárnicas y hace aparecer, por peroxidación, un pigmento marrón que es la metamioglobina, y por hidroxiperoxidación produce el enranciamiento de las grasas y aumenta el crecimiento de bacterias. La velocidad a que desaparece el nitrito de los productos cárnicos tratados por el calor depende del pH y de la temperatura; a medida que desciende el pH y sube la temperatura se acelera la velocidad a que desaparece. 2. Nitrito inestable. Con un valor de pH comprendido entre 5,6 – 6,0, el nitrito no es tóxico ya que se elimina en forma de NO; desnaturaliza las proteínas de la carne y da lugar a la aparición de los grupos SH, de estas proteínas. El nitrito bajo esta forma tiene un efecto antioxidante sobre las carnes y las protege contra el enranciamiento, así como asegura la bacteriostasis. Las distintas cantidades de nitrito sódico adicionadas a las conservas de carne de bovino originan durante el proceso de tratamiento térmico las siguientes transformaciones: 1. El 3 – 60% del nitrito agregado se oxida y pasa a nitrato. 2. El 0,1 – 8% se une a la mioglobina y el 0,2 – 1,2% a las miofibrillas.

3. Otra fracción es reducida por grupos SH hasta NH3. 4. Una parte se oxida para formar gases. 5. El 2 – 15% del nitrito agregado se encuentra sin ligar, en forma libre. Las reacciones cuantitativas de la reacción nitrito-carne muscular explicadas por Möhler (54) en experiencias realizadas con carne bovina a la que se le adicionó nitrito, según tiene lugar en la práctica, 1 mol de mioglobina (= 1 mol de hierro) reacciona con 1 mol de nitrito, obteniéndose metamioglobina y una cantidad equivalente de nitrato. La tasa de hierro en el músculo sólo tiene la mitad del hierro ligado a la mioglobina ya que la otra mitad del hierro está ligada a otros compuestos férricos (citocromo, por ejemplo); el nitrito reacciona, al menos en frío, siempre únicamente con la mitad del hierro total presente. En cuanto al aspecto cuantitativo, a partir de 3 moles de nitrito se forman, pasando por ácido nitroso, 2 moles de monóxido y 1 mol de nitrato, Reacción IV.

Desarrollo del color de curado En el caso de la generación del color, la secuencia de las reacciones (V, VI, VII, VII, VIII, IX) en las que intervienen el nitrato y el nitrito se resume de la siguiente manera (7):

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Es decir, los microorganismos propios de la carne transforman los nitratos en nitritos y, junto con los nitritos añadidos, son éstos los que realmente cumplen con las funciones descritas anteriormente. Debido al pH que prevalece en la carne, el nitrito se convierte en ácido nitroso y finalmente en óxido nítrico que al reaccionar con la mioglobina produce la nitrosilmioglobina de color rojo; cuando la carne se somete a un cocimiento por encima de 60 ºC, este pigmento se desnaturaliza y se convierte en el nitrosilhemocromo que da como resultado el color rosado típico de las salchichas, los jamones, etc. (7, 9). La estabilidad del pigmento depende de: a) las condiciones de cocción: es necesario mínimo + 65 ºC en el corazón de la pasta, b) la presencia de oxígeno, c) la luz, d) las condiciones de empaque, e) el crecimiento bacteriano y f) el secado superficial (56). La intensidad del color de curado de los embutidos escaldados depende de diversos factores, tales como (70): a) Proporción de carne magra/grasa: para un

grado de enrojecimiento como mínimo del 70%, la tonalidad de color solo se ve influida por una abundante adición de grasa, ya que esta siempre induce al color rosado (rosa claro). b) Cantidad de nitrito: el color del embutido escaldado resulta de la proporción existente entre la mioglobina-óxido de nitrógeno y la metamioglobina. La intensidad del color de acuerdo con la tasa de metamioglobina resulta así: < 30% 30 – 50% 50 – 60% 60 – 70% > 70%

rojo intenso rojo rojo castaño castaño rojizo castaño

Por consiguiente, el color es rojo intenso cuando el contenido de metamioglobina es del 30% o bien con una tasa de mioglobina-oxido de nitrógeno del 70%. c) Influencia del tratamiento térmico sobre el color de curado: la influencia del calentamiento sobre el enrojecimiento se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1. Color de curado al corte de embutidos escaldados: dependencia de temperatura y tiempo.

FUENTE: REICHTER. 1988.

d) Influencia del ácido ascórbico sobre el enrojecimiento: El grado de enrojecimiento se ve acentuado notablemente con adiciones de ácido ascórbico del 0,04% dado un mismo

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efecto de calentamiento; los resultados son mejores si se agrega un 0,08% de ácido ascórbico. Se ha demostrado que la tasa de nitrito puede disminuirse en un 50% cuando

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se agrega a la pasta un 0,1% de ácido ascórbico. Para lograr un color de curado estable hace falta un 0,05% de ascorbato sódico (500 ppm) referido al producto inyectado o alrededor de 0,5% a la salmuera de inyección.

El nitrito y los componentes de la carne

Reacciones con las proteínas Las proteínas ofrecen un cierto número de puntos de reacción potenciales para el nitrito (64). El hecho de que a un pH entre 2 – 3 tenga lugar una reacción cuantitativa entre el nitrito y la cisteína, con formación de S-nitrosocisteína ha hecho emitir la hipótesis de la formación de nitrosothioles en la carne. Citando a Mirna y Hofman se ha señalado la existencia de una reacción entre los grupos SH de las proteínas y el nitrito, estableciendo que una parte importante de la “pérdida del nitrito” se sitúa a nivel de una fracción sarcoplásmica.

Reacciones con el tejido adiposo Sobre las relaciones entre el tejido adiposo y el nitrito se ha observado que la mayor parte del nitrito agregado (80 – 90%) permanecía libre, pero un 2 – 5% estaba asociado a la fracción conjuntiva y una porción más pequeña a los lípidos. Demostrándose la posibilidad para el NO de reaccionar con los ácidos grasos insaturados y la producción de Nnitrosopirrolidina a partir del colágeno.

Aspectos microbiológicos El modo de acción del nitrito sobre los microorganismos no es muy conocido, sin embargo, tiene un efecto bacteriostático sobre los gérmenes banales, las enterobacteriaceas, el Clostridium perfringes y el Staphylococcus aureus, aunque tiene poca acción sobre los gérmenes lácticos, los cuales pueden multiplicarse y acidificar el medio en su

presencia. Es especialmente activo sobre el bacilo botulínico, en medio ácido y en presencia de sal (56). El efecto antimicrobiano del nitrito se ve favorecido si, además se toma en cuenta que: a) por su naturaleza de ácido débil, los nitritos son más efectivos a pH ligeramente ácidos de 5,0 a 5,5: en caso de que el pH sea superior, la concentración que normalmente se emplea en los cárnicos será insuficiente; b) su acción se ve muy favorecida por el efecto sinérgico que se presenta cuando se mezcla con el cloruro de sodio, y c) al igual que sucede con cualquier otro alimento, las bajas temperaturas de almacenamiento contribuyen al control microbiológico, y consecuentemente, a la eficiencia de los nitritos (7). Su mecanismo de acción como conservador no se conoce totalmente, pero existen diversas teorías al respecto. Se sabe que los nitritos forman sustancias tóxicas para los microorganismos cuando reaccionan con los grupos sulfhidrilo de las proteínas o con algunos monofenoles como la tirosina, de donde se derivan compuestos nitrados monoaminodisustituidos. También se pensó que sus interacciones con el sistema de citocromos (similares a las reacciones con el hemo de la mioglobina) podrían ser la causa de esta acción; sin embargo se ha visto que los nitritos inhiben el crecimiento de aquellos organismos que no cuentan con un sistema respiratorio basado en estos grupos.

Clostridium boltulinum Los nitritos son potenciales inhibidores del crecimiento de una bacteria denominada Clostridium botulinum, que, aunque no es patógena, produce durante su desarrollo una toxina, la toxina botulínica, que es extremadamente tóxica (una dosis de entre 0,1 y 1 millonésima de gramo puede causar la muerte de una persona). Aunque no se conoce

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la forma exacta de actuación del nitrito sobre el clostridium, se cree que no afecta a las esporas bacterianas pero influye sobre las mismas antes de que las toxinas sean producidas. Se ha señalado en estudios realizados que las sales de nitrito inhiben el crecimiento del botulimun de varias maneras, entre las cuales están: a) reaccionando con el hierro disponible en la carne, reduciendo así la disponibilidad de éste, el cual es fundamental para el crecimiento del botulinum; b) inactivando las enzimas del botulinum que requieren hierro como cofactor (79). En otros estudios se encontró que la inhibición del hierro por otros compuestos diferentes al nitrito no inhibían el crecimiento del botulinum, concluyendo que la presencia del nitrito es necesaria para la inhibición de este microorganismo (82). La idea más difundida es que las reacciones del nitrito con los productos que se forman durante el calentamiento del alimento, pueden dar lugar a compuestos con un mayor poder antimicrobiano que el propio nitrito. Al producto antimicrobiano formado al calentar el nitrito con la carne se le denomina factor de Perigo (PTF). El PTF, sobre todo, ejerce un importante papel al prevenir el crecimiento de esporas del Clostridium botulinum que han sobrevivido al tratamiento térmico. La intoxicación botulínica o botulismo se debe al consumo de productos cárnicos, pescado salado (sobre todo en Japón) o conservas caseras mal esterilizadas en las que se ha desarrollado la citada bacteria, pudiendo resultar mortal. El riesgo de los productos cárnicos es conocido desde antiguo (botulismo viene del latín botulus, que significa embutido) ya que, aunque la toxina se destruye por calentamiento a unos 80 ºC, muchos productos de este tipo se consumen crudos. Los clostridios están presentes de forma natural en el medio ambiente, pudiendo detectar sus esporas en el suelo, aguas, polvo, restos orgánicos o materia fecal, entre otros muchos

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lugares. Por este motivo, la presencia de estos microorganismos en la carne no es anecdótica, sino más bien frecuente. De las diferentes cepas de Clostridium botulinum hay que diferenciar entre las proteolíticas y las no proteolíticas. Las proteolíticas son mucho más resistentes a condiciones de conservación, como bajo pH o la disminución de la concentración de agua disponible. El nitrito tiene poco o ningún efecto sobre la velocidad de muerte del Clostridium botulinum, la célula germinal es altamente susceptible a las sales de curado; sin embargo a las bajas concentraciones aplicadas en carnes curadas no se afecta significativamente la germinación de las esporas, en cambio inhibe notablemente el crecimiento de las células germinadas (64). Según estudios que se han venido desarrollando, después de analizar centenares de muestras de productos cárnicos envasados al vacío, se ha apreciado que el 2,7% de las mismas estaban contaminadas por Clostridium botulinum. Aunque la acción inhibidora de los nitritos depende de diferentes factores, diversos estudios han puesto de manifiesto la mínima concentración que es capaz de impedir la germinación de las esporas de este patógeno. La acción estimulante del pH ácido es tal, que ha sido recientemente demostrado que en el estómago, los nitritos poseen una potente acción antibacteriana que se pone de manifiesto contra una gran variedad de microorganismos gastrointestinales. En presencia de 100, 200 ó 300 mg de nitrito por kg de producto, la probabilidad de producción de toxina disminuye conforme aumenta la concentración del conservante del 96% al 35%, para productos poco tratados térmicamente o incluso sin tratamiento térmico. Sin embargo, para productos adecuadamente calentados (cocidos o incluso conservas) la producción disminuye desde 86% hasta 23%. Sin embargo, en presencia de ascorbatos, la probabilidad de producción de

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toxina en productos sin tratamiento oscila entre el 26% y el 1% y entre el 8% y el 0% en los productos adecuadamente tratados térmicamente. Las condiciones que favorecen el crecimiento y la producción de toxina por el microorganismo son una relativamente alta cantidad de proteínas, baja concentración de sal, pH ligeramente ácido o alcalino (superior a 4,6), el envasado sin oxígeno (al vacío o en atmósfera modificada) y a una temperatura superior al mínimo de crecimiento, cifrada en 3 ºC para microorganismos no proteolíticos y en 10 ºC para los proteolíticos. Infortunadamente la carne es un excelente medio para el crecimiento de estos microorganismos y para la producción de toxinas. Para prevenirlo, multitud de publicaciones indican que el nitrito de sodio es un aditivo inmejorable para garantizar la seguridad de los alimentos cárnicos, especialmente en productos perecederos poco fermentados, como salchichas, bacon o jamón cocido, entre otros muchos. No obstante, y a pesar del riesgo potencial, la acumulación de toxina en los alimentos puede depender de otros factores. El primero de ellos es el número de esporas. Normalmente en la mayor parte de los productos, el nivel de contaminación es bajo, por lo que si el producto se mantiene en refrigeración, incluso a temperaturas compatibles con la producción de toxina, los niveles que se pueden llegar a acumular son bajos, ante el tiempo necesario para su multiplicación y para la posterior acumulación de toxina. Si consideramos además que en los productos cárnicos perecederos la vida comercial es corta, cifrada en pocas semanas, no le da tiempo a que el producto sea peligroso. Otra cosa ocurrirá si se rompe la cadena del frío (71).

Ingesta Diaria Aceptable (IDA) La Ingesta Diaria Aceptable es la cantidad máxima de una sustancia que se recomienda ingerir al día. Se asigna sobre la base de un Nivel de No Observación de Efectos Adversos (NNOEA) derivado de ensayos toxicológicos para aditivos, u otras sustancias, que puedan representar un riesgo para la salud. Se han realizado diferentes estudios para estimar la ingesta diaria de nitratos y nitritos por las diversas fuentes, y los resultados están por encima de los límites de Ingesta Diaria Aceptable (62). La concentración residual de nitritos controla la formación de Nnitrosaminas en alimentos, en vista de que la velocidad de formación de nitrosaminas es directamente proporcional al cuadrado de la concentración de nitrito (32). Se ha verificado que a medida que aumenta la proporción de nitrito en tocino, ocurre un incremento en la velocidad de formación de Nnitrosopirrolidina (NPIR) (29). El Comité Conjunto de Expertos de FAO/OMS ha recomendado una IDA de 0 - 3,7 mg por kg de peso corporal, expresada en iones nitrato. Sin embargo, al derivar una IDA para los nitratos, el comité adoptó una posición cautelosa. Se sabía que las verduras constituían una importante fuente potencial de ingestión de nitratos. No obstante, a la vista de los reconocidos efectos beneficiosos de las verduras y de la falta de datos sobre los posibles efectos de las sustancias vegetales sobre la biodisponibilidad de los nitratos, el comité consideró inadecuado comparar directamente la IDA con la exposición a los nitratos de las verduras, y en consecuencia, derivar directamente de ello unos límites para el contenido de nitratos de las verduras (12). Puesto que la toxicidad de los nitratos proviene de su conversión en nitritos y de la posible formación endógena de N-nitrosocompuestos, deberá tenerse en cuenta también la IDA de nitritos. Por ello, el Comité Conjunto de

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Expertos de FAO/OMS recomienda para los nitritos una IDA de 0 - 0,06 mg por kg de peso corporal, expresada en términos de iones nitrito. Esta IDA se aplica a todas las fuentes de ingesta, si bien los nitritos no deben utilizarse como aditivos en alimentos para niños menores de tres meses. La IDA no se aplica a estos niños. IDA Nitratos: 0 - 3,7 mg/kg de peso corporal, expresados como ion nitrato. Se establece sobre la base del NNOEA (Nivel de No Observación de Efectos Adversos) de 370 mg de ion nitrato/ kg de peso corporal/día obtenido en el estudio a largo plazo en ratas y un factor de seguridad de 100. IDA Nitritos: 0 - 0,06 mg/kg de peso corporal, expresados como ion nitrito. Se establece sobre la base del NNOEA (Nivel de No Observación de Efectos Adversos) de 5,4 mg de ion nitrito/ kg de peso corporal/día obtenido en estudios de toxicidad de 90 días en ratas en las que se observó hipertrofia de la zona glomerulosa adrenal, y 6,7 mg de ion nitrito/kg de peso corporal en un estudio de toxicidad de dos años en ratas, en las que se observaron efectos tóxicos en el corazón y en los pulmones y un

factor de seguridad de 100. Esta IDA no se aplica a niños menores de tres meses (12). Los nitratos son constituyentes naturales de alimentos de origen vegetal, pudiendo encontrarse en ellos en concentraciones muy elevadas. Las espinacas o el apio, por ejemplo, pueden contener de forma natural más de 2 g/kg de nitrato (10 veces más que la concentración máxima autorizada como aditivo). Los nitratos también pueden estar presentes en otras verduras, como la remolacha o acelga, o en el agua de bebida. Los nitritos están en concentraciones muchísimo menores. (Tabla 3).

Cantidades máximas de uso permitidas en Colombia Actualmente en Colombia se permite el empleo de las siguientes cantidades máximas de nitritos y nitratos en los productos alimenticios, según la Resolución número 4125 de 1991 del Ministerio de Salud (45) (tabla 2): Nitratos de potasio y sodio hasta 500 mg/kg. Nitritos de potasio y sodio hasta 200 mg/kg.

Tabla 2. Valores mínimos y máximos de nitritos y nitratos encontrados en algunos productos cárnicos.

FUENTE: ANDRADE, 2004.

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Tabla 3. Concentraciones de nitratos y nitritos en algunos alimentos.

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FUENTE: WHO FOOD ADDITIVES SERIES: 50. 2006.

NITROSAMINAS Compuestos nitrosos, como por ejemplo Nnitrosaminas, N-nitrosoúreas, Nnitrosoguanidinas y N-nitrosoaminoácidos pueden ser producidos durante el procesamiento de alimentos. Dentro de los N-

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nitrosocompuestos las nitrosaminas constituyen el grupo más numeroso y más estudiado de sustancias, siendo grande el número de revisiones al respecto de los niveles de nitrosaminas volátiles presentes en carnes

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curadas, pescados, quesos, cerveza, plantas medicinales y alimentos destinados a la población infantil (6, 27, 61, 74). Las nitrosaminas son compuestos N-nitrosos, de fórmula estructural R1R2N=O, donde R1 y R2 pueden ser grupos alquilo o arilo, dependiendo del radical R1 y R2 estos compuestos se pueden encontrar en forma sólida, líquida o gaseosa. De forma general las nitrosaminas son estables, descomponiéndose lentamente en soluciones ácidas o por radiación ultravioleta (43). Los compuestos N-nitrosos son producidos a través de una reacción química entre compuestos orgánicos nitrogenados y un agente nitrosante. En el laboratorio las nitrosaminas son, en general, sintetizadas a partir de un ácido nitroso y aminas secundarias (39, 42, 95). Numerosos estudios señalan a las nitrosaminas como cancerígenos (19, 28, 65), que especialmente producirían cáncer de estómago, aunque también tumores pulmonares, de hígado, riñones, páncreas, esófago, cerebrales y de vejiga. De hecho en Japón, gran consumidor de nitratos, los niveles de este cáncer de estómago son superiores a los de otros países. Existen algunos trabajos que relacionan la incidencia del cáncer de colon y de esófago en Japón y en ciertos países africanos con el elevado consumo de nitrosaminas. Se considera que la capacidad mutagénica de esas sustancias se debe a su facilidad para metilar la posición 3 de la citosina de los ácidos nucleicos (7). Las nitrosaminas se metabolizan por citocromo P-450 enzimas (CYP2E1, CYP2A3). Tanto las nitrosaminas alquilo como cíclicas son carcinógenas y el organotropismo es una característica principal de esa clase de compuestos. Un paso clave en la activación metabólica de este tipo de carcinógenos químicos parece ser la alfa hidroxilación. En el

tabaco y en los productos de su combustión se encuentran nitrosaminas derivadas de la nicotina. Las especies reactivas finales nitrosaminas son agentes alquilantes. Por tanto, es probable que el consumo de tabaco presente la mayor exposición humana a agentes alquilantes. Existe evidencia de inducción de las enzimas metabolizantes de nitrosamina por exposición previa a nitrosaminas específicas a tabaco Nnitrosonornicotina y 4-(metilnitrosamino)-1-(3piridil)-1-butanona. En los países con porcentajes altos de cáncer gástrico, las nitrosaminas que se encuentran en la dieta (por ejemplo, alimentos ahumados o preservados) pueden ser las causantes de este aumento. Se tiene evidencia adicional de que un componente (o componentes) dietético es el causante del aumento en la incidencia de cáncer gástrico. Estudios epidemiológicos indican que el porcentaje de cáncer gástrico en los inmigrantes disminuye cuando se establecen en un país con una incidencia más baja de ese mal, y sus hábitos dietéticos se adaptan a los del nuevo ambiente. La formación in vivo de nitrosaminas y la incidencia subsecuente de tumor puede reducirse después de la administración de ácido ascórbico. No obstante, este no reduce de manera significativa la incidencia de un tumor en animales cuando se administra concurrentemente con nitrosaminas (58). Los N-nitrosocompuestos pueden tener dos orígenes diferentes: formación endógena, que es una formación natural de Nnitrosocompuestos en el estómago, y Nnitrosocompuestos formados previamente, presentes en los alimentos y en los fármacos, debido a las técnicas de fabricación o de tratamiento (87). La formación endógena de N-nitrosocompuestos comienza cuando los nitratos son reducidos a nitritos por los microorganismos de la cavidad oral y estos nitritos se transforman después en

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óxido nítrico en el estómago debido a las condiciones ácidas allí existentes (14, 52). Bajo circunstancias específicas, como la gastritis crónica, los nitritos pueden oxidarse en el estómago a agentes nitrosantes y reaccionar para formar N-nitrosocompuestos. Esta reacción se produce con precursores nitrosables, que incluyen una gran variedad de componentes de la dieta tales como aminas secundarias, amidas, proteínas y derivados de urea. SEN et al., 2000 (77), estudiaron la formación de nitrosodimetilúrea (NMU) por nitrosación de creatinina en carnes curadas a pH gástrico y encontraron niveles de (NMU) por encima del límite permitido. En el caso de formación previa de Nnitrosocompuestos, sólo puede producirse en la boca, ya que en el intestino, salvo casos patológicos, se absorbe rápidamente sin que haya tiempo para esta transformación (14, 52). En la boca, los nitratos pueden proceder del alimento o aparecer en la saliva, recirculados después de su absorción. Los nitratos no recirculados (la mayoría) se eliminan rápidamente por la orina. Investigaciones realizadas revelan que la mayor cantidad de nitrosaminas encontradas en el organismo, se sintetizan en el mismo, como causa del consumo de sus precursores, entre ellos los nitritos (31, 88). La otra forma de presencia de Nnitrosocompuestos son los formados previamente, que aparecen en los estudios de investigación clínica como causantes seguros de tumores. Las fuentes principales de los Nnitrosocompuestos (por ejemplo, las nitrosaminas) previamente formados, son el humo del tabaco, los cosméticos y los productos alimenticios. El Comité Conjunto de Expertos en Aditivos Alimentarios de FAO/OMS señaló algunos estudios que mostraban que las técnicas de preparación de alimentos para productos cárnicos y productos de pescado, así como también verduras deterioradas o mal

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almacenadas, pueden promover, en determinadas condiciones, la formación de Nnitrosocompuestos. En su último informe, el comité destacó la necesidad de emplear buenas prácticas de fabricación en la preparación de productos cárnicos y productos de pescado, así como la de reducir la exposición a estos compuestos. Estas técnicas de preparación incluyen el malteado, el ahumado, el secado y el cocido de productos de pescado y productos cárnicos, así como la freidura de carnes curadas, incluido el bacon. Un ejemplo de ello viene dado por un reciente estudio de las nitrosaminas en los alimentos, referente al jamón cocido. El estudio muestra que los jamones deshuesados que se procesan envueltos en mallas de goma elástica contienen un alto nivel de nitrosaminas en su capa exterior, originado probablemente por la malla. De todos los alimentos, las carnes y los pescados son los productos donde se encuentra la mayor cantidad de nitrosaminas, aunque la concentración no es tan elevada como la que se emplea en las pruebas experimentales de laboratorio para demostrar su toxicidad. El pH óptimo para su síntesis es de 3,4 y se producen aún en condiciones de congelación, ya que en la fracción líquida no congelada se concentran los nitritos y las aminas y esto les da mayor facilidad de interacción (7). El pescado no debe conservarse con nitrito sódico, ya que en su carne se forma con facilidad por ligera descomposición bacteriana, dietilamina y trietilamina, que, aunque en menor proporción, también aparecen en la carne y en los quesos. La reacción de esas aminas con los nitritos origina Nnitrosodietilamina y N-nitrosotrietilamina. Ya a temperaturas inferiores a 0 ºC la dietilamina reacciona con los nitritos, originando Nnitrosodietilamina. El nitrato sódico, que se encuentra en pequeñas cantidades en el agua de mar, puede formar con estas aminas

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dimetilnitrosamina en la carne de los peces. Por este motivo, la carne de los peces marinos contiene cantidades de dimetilnitrosamina superiores a la de los peces de agua dulce. En la elaboración de harina de pescado es importante evitar la descomposición de la materia grasa que contiene, lo que se realiza adicionando el antioxidante etoxiquina. Estudios realizados han demostrado que este compuesto puede actuar como inhibidor de la reacción de nitrosación (4). En los embutidos, existen compuestos como piperidina y pirrolidina. La reacción de estas aminas con el nitrato contenido en la sal de curado se produce después de un largo contacto entre ambos, no en mezclas de preparación reciente. Cuando estos embutidos se almacenan durante mucho tiempo o se cocinan, es posible que se produzcan reacciones de formación de esos cancerígenos. También en la carne adobada se pueden formar nitrosopiperidina y nitrosopirrolidina por reacción de los aminoácidos prolina y lisina con el nitrito cuando se calienta fuertemente. El proceso de malteado de la cerveza es otra vía de formación de estos compuestos. Esto se debe al desecado de la malta con óxido nitroso, que al ponerse en contacto con la dimetilamina que la cerveza contiene puede formar dimetilnitrosamina. Cambiando el sistema de desecación de la malta se elimina la aparición de este cancerígeno; por ello se ha venido efectuando este proceso por un método de calentamiento indirecto, usado ahora en todas las fábricas de cerveza. (80). También en la leche desecada aparecen dimetilnitrosaminas a causa, al parecer del procedimiento de desecación. El tratamiento de alimentos con corrientes de humo puede igualmente dar lugar a la aparición de compuestos nitrosos.

Finalmente, se debe indicar que el principal aporte de nitrosaminas al organismo humano es el humo del tabaco en el caso de las personas fumadoras.

Inhibición de la formación de nitrosaminas Se conocen afortunadamente una serie de técnicas para disminuir el riesgo de formación de nitrosaminas. En primer lugar, obviamente, reducir la concentración de nitritos y nitratos siempre que esto sea posible. Debe tenerse en cuenta que la cantidad de nitritos que llega al consumidor es siempre mucho menor que la añadida al producto, ya que estos son muy inestables y reactivos. En segundo lugar, se conocen sustancias que bloquen el mecanismo químico de formación de nitrosaminas o aceleran la reacción. Dentro de las sustancias que se destacan como catalizadores están: tiocianato, formaldehído, ácidos, y como inhibidores: ascorbatos (ácido ascórbico E-330, especialmente eficaces en medios acuosos), -tocoferol (E306 y siguientes, especialmente eficaces en medios grasos) y SO2/bisulfito (18). Si no hay estudios que concreten la cantidad de nitrosaminas que en el organismo humano produce cáncer ni se conoce su mecanismo de actuación, sí se sabe, que la vitamina C –ácido ascórbico– o el ácido isoascórbico son muy eficaces para evitar sus efectos (20). El ácido ascórbico, o el isoascórbico, se añade a las carnes junto al nitrito con el fin de prevenir la formación del no deseable anhídrido nitroso (N 2 O 3 , el agente nitrosante primario). La reacción que se ha propuesto es (20, 40) (reacción X):

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La formación del NO es deseable porque es el ligando que se requiere para unirse a la mioglobina y formar el color típico de la carne curada. El radical semideshidroascorbato residual retiene parcialmente la actividad vitamina C. En los alimentos pueden existir sustancias inhibidoras de reacción de formación de nitrosaminas, tales como: taninos, compuestos fenólicos y vitaminas C, E y A. Particularmente, el ácido ascórbico y el -tocoferol, son los inhibidores más importantes, una vez que se encuentran presentes en algunos alimentos (67,

75). En algunos países (USA, por ejemplo) el empleo de nitritos con ácido ascórbico es obligatorio. Se potencia la acción de la vitamina C con un bioflavonoide llamado hesperidina. Según estudios realizados in vitro, el mecanismo de inhibición de las reacciones de nitrosación comienza con una reducción del anhídrido nitroso a óxido nítrico tanto con el ácido ascórbico (AA) como con el -tocoferol (TF). Los inhibidores son oxidados a ácido dehidroascórbico (DHA) y -tocoquinona (TQ) (Figura 2) (78).

Figura 2. Inhibición de la reacción de nitrosación por ácido ascórbico.

La acción inhibidora del ácido ascórbico sobre una reacción de nitrosación de una amina fue descubierta accidentalmente durante la formulación del analgésico aminopirina, cuando fue inhibida la formación de nitrosodimetilamina. Posteriormente fue observado que esta vitamina inhibía fuertemente la formación de compuestos nnitrosos a partir de la mayoría de las aminas y amidas (52). La administración conjunta de ácido ascórbico con carotenoides y aminas o amidas en animales inhibe los efectos hepatotóxicos, carcinogénicos y teratogénicos provenientes de la síntesis endógena de nitrosaminas o nitrosamidas (5, 89). RYWOTYCKI en el 2002 (73), estudió la influencia de algunos aditivos funcionales en la formación de nitrosaminas en carnes y productos cárnicos y llegó a la conclusión de que la adición de polifosfatos al mismo tiempo que de nitrito de sodio aumenta los niveles de

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nitrosaminas (NDMA y NDEA) y que este nivel puede ser minimizado con la incorporación de ascorbato a las salmueras. Estudios realizados para evaluar el efecto del ascorbato y el isoascorbato en la formación de nitrosodimetilamina (NDMA) en salchichas, al emplear niveles de nitritos legalmente permitidos en EUA (156 mg kg-1), evidenciaron que no hay formación de cantidades significativas de NDMA. Sin embargo con el empleo de una cantidad de nitrito 10 veces superior, las salchichas presentaron niveles de 10 a 20 mg kg -1 de NDMA. Los resultados demuestran que el ascorbato y el isoascorbato en un intervalo de 550 mg kg-1, en ambos los niveles reducen pero no se evita la formación de nitrosodimetilamina en salchichas . Otra manera de inhibir la formación de nitrosaminas en carnes curadas fue evaluada por AHN et al., 2003 (2), al utilizar radiación

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gama. Los autores relatan resultados satisfactorios en cuanto a la reducción de nitrosodimetilamina (NDMA) y nitrosopirrolidina (NPIR), con una radiación de 5 KGy en anchoas saladas y fermentadas. El número de trabajos publicados con respecto

a la proporción de N-nitrosaminas en productos cárnicos ha sido creciente, relacionándose la mayoría con la proporción de nitrosopirrolidina (NPIR) y nitrosohidroxipirrolidina (NHPIR) en tocino (27, 73) (tabla 4).

Tabla 4. Valores mínimos y máximos de nitrosaminas en alimentos ( g kg-1).

NDMA: nitrosodimetilamina, NDEA: nitrosodietilamina, NMOR: nitrosomorfolina, NPIR: nitrosopirrolidina, NPIP: nitrosopiperidina, NTHZ: nitrosotiazolidina. FUENTE: ANDRADE, 2004.

Reacciones de formación de nitrosaminas Las especies nitrosantes más importantes son N 2O 3, NO 2/N 2O 4, H 2ONO+ y NO. El ácido nitroso (HONO) y el ion nitrito (NO2), a pesar

de ser inactivos, pueden formar especies nitrosantes activas a través de diversos equilibrios químicos (Figura 3) (15).

Figura 3. Equilibrios químicos desarrollados en la formación de especies nitrosantes.

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El agente nitrosante más importante que participa en la formación de N-nitrosaminas en sistemas alimenticios es el anhídrido nitroso (N2O3) producido

a partir de 2 moles de HNO2 y NO2- en solución acuosa ácida, reacciones XI y XII (22).

Como el ácido nitroso es inestable, se genera in situ, mezclando nitrito sódico (NaNO 2) con ácido clorhídrico diluido y frío (figura 4).

Figura 4. Reacción nitrito sódico y ácido clorhídrico.

En una disolución ácida, el ácido nitroso se protona y a continuación pierde agua para formar el catión nitrosonio +N=O (figura 5).

Figura 5. Reacción ácido nitroso en disolución ácida.

Cada una de las tres clases de aminas reacciona de forma diferente con el ion nitrosonio. Una vez que la amina ha sido protonada y participa en la formación de las nitrosaminas , tanto el pH como el pka influencian la reacción de nitrosación. En general el pH óptimo para la reacción se sitúa entre 2,5 y 3,5, lo que se debe al efecto inverso entre la formación de anhídrido nitroso, favorecido en pH ácido y, de amina libre, favorecido en pH básico. Por otro lado la velocidad de formación de nitrosaminas inversamente proporcional a la basicidad de la amina. Ejemplo de esto es que, a un mismo valor de pH, la piperazina (pka 6, 74) forma un

Figura 6. Reacción amina primaria con ácido nitroso.

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compuesto N-nitroso a una velocidad 5x104 veces mayor que la dimetilamina de pka 10,72 (15, 18).

Reacción de las aminas primarias con el ácido nitroso Las aminas primarias reaccionan con el ácido nitroso para formar sales de diazonio (figura 6). A este procedimiento se le llama diazoación (o diazotación) de la amina. El mecanismo de la reacción se inicia con el ataque nucleofílico de la amina sobre el catión nitrosonio, lo que genera una N-nitrosoamina.

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A continuación, la transferencia de un protón de un átomo de nitrógeno al oxígeno forma un grupo hidroxilo y un segundo enlace N-N (figura 7).

Figura 7. Reacción de formación de un grupo hidroxilo y segundo enlace N-N.

La protonación del grupo hidroxilo, seguida de pérdida de agua, produce el catión diazonio (figura 8).

Figura 8. Reacción de diazotación.

Las sales de alcanodiazonio son inestables y se descomponen rápidamente en nitrógeno y carbocationes (figura 9).

Figura 9. Reacción de formación de carbocatión.

La fuerza impulsora del proceso es la formación de N 2, que es una molécula muy estable. Los carbocationes que se generan en estos procesos tienden a disminuir su energía reaccionando con nucleófilos y con bases dando lugar a olefinas, o experimentando

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reacciones de transposición. Debido a la competencia que se establece entre las vías de reacción del carbocatión, por lo general, las sales de alquildazonio se descomponen para dar mezclas de productos y en consecuencia esta reacción no tiene una gran utilidad sintética.

Reacción de las aminas secundarias con el ácido nitroso Las aminas secundarias reaccionan con el ácido nitroso para formar N-nitrosoaminas (figura 10).

Figura 10. Reacción de amina secundaria con ácido nitroso.

Reacción de las aminas terciarias con el ácido nitroso Las N-nitrosoaminas secundarias son estables bajo las condiciones de reacción, porque no tienen el protón N-H necesario para participar en la segunda etapa de formación de cationes de diazonio. La N-nitrosoamina secundaria se separa de la mezcla de reacción como un líquido aceitoso.

Las aminas terciarias reaccionan con el ácido nitroso para formar sales de N-nitrosoamonio (figura 11). Como no hay un protón N-H ácido en la sal de N-nitrosoamonio terciario, es imposible la pérdida de protón para dar la Nnitrosoamina y se produce un equilibrio entre la amina y la sal de N-nitrosoamonio.

Figura 11. Reacción de amina terciaria con ácido nitroso.

ÓXIDO NÍTRICO El óxido nítrico puede ser obtenido de la reducción de nitrito que puede ocurrir de tres formas distintas: acción de agentes reductores, acción reductora de los tejidos y descomposición de ácido nítrico (21, 76). Agentes reductores, como sales de ácido

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ascórbico, donan electrones al nitrito, incrementando la formación de óxido nítrico (8, 34, 37). Esta se convierte en la principal vía de obtención de óxido nítrico en los procesos de curas comerciales (13). Las especies reactivas derivadas del NO (RNOS) potencialmente pueden dañar el ADN de forma directa mediante procesos de

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oxidación, desaminación y metilación de bases; e indirecta inhibiendo la actividad de las enzimas reparadoras. La oxidación de bases conduce fundamentalmente a transversiones y la desaminación a transiciones. La especie reactiva N 2O 3 puede reaccionar con aminas biógenas generando N-nitrosaminas, reconocidos agentes alquilantes. La inhibición de las enzimas se manifiesta por la reacción de las RNOS con grupos nucleofílicos de aminoácidos críticos para la actividad enzimática. Todos estos mecanismos pudieran favorecer de una u otra forma a la ocurrencia de mutaciones en el ADN, implicadas en la activación de oncogenes o inhibición de genes supresores de tumores, o ambas, favoreciendo así el surgimiento y desarrollo tumoral.

El óxido nítrico (NO) es una molécula que desempeña importantes funciones en procesos fisiológicos y patológicos en humanos. Su implicación en el funcionamiento de los sistemas inmune, cardiovascular y nervioso ha sido ampliamente detallada (93, 94). Este gas es producido en cantidades abundantes bajo condiciones asociadas a procesos inflamatorios, reconocido factor de riesgo para el surgimiento y desarrollo del cáncer.

Destinos fisiológicos del NO

3. Reacción con superóxido (O 2-) para formar peroxinitrito (ONOO-). Esta reacción presenta una cinética de tipo difusiónlimitante, por lo que se plantea que es la que rige el destino del NO en presencia del anión superóxido (O2-) (16). El producto es altamente oxidante, comparado en algunas ocasiones con el radical OH.

Una vez sintetizado el NO, su destino en los sistemas biológicos es regido por los procesos siguientes: 1. Difusión a células vecinas. La presencia de un electrón no pareado en su molécula le permite interactuar con metales de transición de algunas enzimas y así modular su actividad (33). El coeficiente difusional de este gas depende de los lípidos y proteínas que se encuentre a su paso (67). 2. Autoxidación del NO. Generalmente se produce cuando se incrementan mucho sus concentraciones intracelulares, el cual en presencia del O2 se convierte en trióxido de dinitrógeno (N2O3). Esta reacción se acelera cuando ocurre en sitios hidrofóbicos como en el interior de las membranas lipídicas o de núcleos proteicos (1). El N2O3 es un agente nitrosante poderoso, con gran afinidad por sitios nucleofílicos (33).

Su síntesis es llevada a cabo por un grupo de enzimas denominadas óxido nítrico sintasas (NOS), cuyo único sustrato fisiológico parece ser el amino ácido L-arginina (Reacción XIII) (68). La presencia y elevada actividad de estas enzimas se ha reportado en algunos tipos de tumores (16, 25) y además correlacionada positivamente con daños al ADN (25).

Mecanismos genotóxicos del NO Actualmente se considera que el NO es capaz de generar lesiones en la secuencia primaria del ADN y otras biomoléculas, y de esta forma mediar el surgimiento y desarrollo tumoral. Los mecanismos por los cuales este gas puede producir esos daños son explicados a partir de los efectos deletéreos de las especies reactivas derivadas de él. 1. Mecanismos de daño directo al ADN por especies reactivas derivadas del NO (RNOS)

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Formación endógena de N-nitrosaminas carcinogénicas. Las N-nitrosaminas son compuestos químicos con potencial carcinogénico reconocido, debido a que pueden ser metabolizadas a fuertes agentes alquilantes (90). Se sintetizan mediante la reacción del agente electrofílico N2O3 con aminas biógenas según la primera reacción representada en las reacciones XIV y XV. La

La presencia de este tipo de aminas en la estructura de las bases nitrogenadas indica que estas pueden ser desaminadas por el NO vía N2O3, generándose alteraciones puntuales con potencial mutagénico (10). Experimentos in vitro han aportado evidencias, las cuales sugieren que la desaminación de bases por este mecanismo parece tener un patrón de mutaciones dirigido fundamentalmente a las bases púricas, aunque también se pueden afectar las pirimidínicas. Las mutaciones más comunes son las transiciones guanina (G) a adenina (A) y viceversa (10). También es frecuente la formación de bases modificadas como la oxanina, derivada de la guanina, que puede producir entrecruzamientos inespecíficos ADN-proteínas. De esta manera se afecta la integridad del ADN por 2 mecanismos diferentes: provocar inestabilidad genómica por el entrecruzamiento entre las proteínasADN y actuar como un sustrato suicida para enzimas reparadoras de este daño (59). Se ha observado in vitro una mayor frecuencia de alteraciones en simples que en dobles cadenas de oligonucleótidos, eso sugiere que este mecanismo mutagénico se produce cuando

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formación endógena de estos compuestos se ha demostrado en líneas celulares de hepatocitos inmortalizados con el virus de los simios SV 40 Tag (41).

Desaminación de bases Las N-nitrosaminas de aminas primarias pueden generar iones diazonium, los que se hidrolizan espontáneamente a alcoholes como se representa en la Reacción XIV.

las bases se encuentran desprotegidas en eventos celulares como la replicación y la transcripción, en los que la doble hélice se abre (10).

Oxidación de bases Experimentos en macrófagos activados en cultivos celulares muestran daño oxidativo y por desaminación del ADN (10). El análisis del destino del NO en estas células mostró que la mayor parte pasaba a la generación de peroxinitrito (ONOO); un fuerte agente oxidante. El tratamiento de plásmidos de ADN con ONOO-sintético y su inserción en sistemas biológicos para su replicación y posterior análisis, mostraron un espectro de mutaciones puntuales; fundamentalmente transversiones de guanina a timina (T) y de guanina a citosina (C). El poder oxidante de esta especie es suficiente también como para dañar directamente al azúcar y provocar sitios sin bases en el ADN, además de oxidar y modificar las bases generando especies difíciles de reparar. La formación de estas lesiones ocurren con más frecuencia en simples que en dobles cadenas, siendo reparada por la formamidopirimidina-DNA glicosilasa (Fpg).

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2. Modificación indirecta de la secuencia del ADN por las RNOS Algunos autores han sugerido que tanto la desaminación, oxidación y ruptura de cadenas del ADN por las RNOS requiere de concentraciones muy elevadas, situación que muy raramente se daría en humanos. Además, in vivo los antioxidantes como el ascorbato y el glutatión (GSH) son abundantes, lo que disminuye las posibilidades de acumularse RNOS a concentraciones suficientes como para producir daño al ADN directamente (30). Es por ello que se han sugerido otras hipótesis. Una hipótesis muy prometedora se basa en la inhibición de los sistemas enzimáticos reparadores de las lesiones en el ADN y de esta manera favorecer el daño indirectamente. Las RNOS poseen una elevada afinidad por el grupo tiol (-SH) de la cisterna (36). Lo anterior sugiere que aquellas enzimas con cisteínas críticas para su actividad, pueden ser inhibidas por estas especies reactivas. Otros grupos nucleofílicos como el hidroxilo (-OH) de la tirosina (22) y el amino (-NH2) de la lisina, también son potencialmente modificables. Jaiswal y otros, observaron que las líneas celulares de colangiocarcinoma y colangiocitos transfectados con el gen de la NOS inducible (iNOS), eran incapaces de reparar la lesión 8oxo-G. Esta lesión es reparada por las enzimas Fpg y 8-oxoguanina glicosilasa (Ogg1), enzimas que resultaron inhibidas por el NO y sus especies reactivas (70). Estas evidencias pudieran explicar los resultados de Jaiswal y otros. Otras enzimas inhibidas por el NO resultaron ser las ADN alquiltransferasas

reparadoras de los residuos metilados de G y T (O6-metil guanina y O4-metil timina), y la enzima ADN ligasa. La inhibición de esta última pudiera explicar el hecho de que cuando las células se exponen al NO, se observe un elevado número de rupturas de cadenas de ADN.

El óxido nítrico en la iniciación y promoción tumoral Todos los mecanismos hasta ahora expuestos explican, desde diferentes puntos de vista, los efectos mutagénicos del NO (Figura 12). Estas mutaciones bien colocadas pudieran provocar la inactivación de genes supresores de tumores y la activación de oncogenes y de esta forma participar en diferentes etapas del proceso carcinogénico. Quizás el ejemplo más evidente de esto lo constituye el gen para la proteína p53, el cual se encuentra mutado en alrededor de 50% de todos los tumores humanos (62). Estudios previos presentaron in vitro mutaciones de importancia biológica en el gen p53 inducidas por el NO y la mutilación (57). Posteriormente se demostró que en estadios iniciales del carcinoma de pulmón existe una correlación significativa entre la actividad de las NOS y las mutaciones presentes en dicho gen.27 Aunque en estos estudios no se analizó la funcionabilidad del producto génico, la hipótesis es suficiente como para plantear que el NO, en situaciones como la inflamación, puede provocar la inactivación del gen p53 y favorecer al menos de este modo el surgimiento y desarrollo tumoral.

Figura 12. Mecanismos mutagénicos del NO, mediados por sus especies reactivas (RNOS).

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CONCLUSIONES El empleo de nitritos y nitratos como aditivos en la industria de alimentos, específicamente en la industria cárnica, ha sido evaluado en muchos aspectos, siendo uno de los más relevantes el factor riesgo/beneficio. Por una parte se sitúa el beneficio de la prevención del botulismo y las propiedades que estos aditivos le confieren a los productos cárnicos, y por otra parte el gran riesgo de la formación de nitrosaminas. La necesidad de realizar estudios sobre sistemas modelo de los diferentes productos cárnicos comercializados en Colombia y en el mundo, se deriva de la importancia del impacto que tienen los nitritos y sus derivados sobre la salud humana, formación de nitrosaminas, inducción a la hemoglobinemia, iniciación y promoción tumoral. Las investigaciones que se han desarrollado sobre los nitritos y las sustancias que se derivan de sus reacciones en las matrices alimentarias,

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o en el ser humano, son amplias, y sus resultados muestran con claridad que estos conservantes deben emplearse adecuadamente con mezclas de sustancias inhibidoras de reacciones de nitrosación, como el ácido ascórbico y los tocoferoles, y además en cantidades mínimas que permitan la conservación del alimento, mas no un efecto nocivo en la salud. Actualmente se están desarrollando diferentes investigaciones sobre las nitrosaminas, dentro de las cuales están: métodos de detección y cuantificación; mezclas de sustancias inhibidoras de reacciones de nitrosación aplicadas a los alimentos, evaluación de mezclas y aditivos que puedan reemplazar a los nitritos total o parcialmente. La realización de estas investigaciones pone de manifiesto el interés de los sectores de la salud, la investigación, el académico y el industrial, en dar respuestas y soluciones a este tema tan renombrado y de tanto impacto en la salud humana.

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NITROSAMINES IN MEAT PRODUCTS: FORMATION AND IMPACT / NITROSAMINAS EN PRODUCTOS CÁRNICOS: FORMACIÓN E IMPACTO

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