Universitatea de Medicina si Farmacie Gr.T.Popa Iasi 2012
Microscopul Electronic: tipuri in relatie cu principiul fizic, evolutie, aplicatii medicale
1
Schaas Bogdan Andreas, Anul I , Seria A , Grupa 2
Cuprins : 1) Scurt Istoric.……………………………………...pag. 3 2) Premiul Nobel.………...…………...…………….pag. 4 3)Generalitati...……………………………………...pag. 5 4) Principiul Fizic …………………………………..pag. 6 5) Semnalele rezultate în urma interacţiei dintre fasciculul de electroni şi corpul solid...........................................pag. 8 6) Tipuri:1.Microscopul Eletronic cu transmisie...... pag.10 2.Microscopul Electronic cu scanare sau cu baleiaj………………………………………………..pag.13
2
1) Scurt Istoric Primul microscop electronic a fost construit în 1931 de către inginerii germani Ernst Ruska și Max Knoll. Acesta era bazat pe ideile și descoperirile fizicianului francez Louis de Broglie. Desi primitiv si nepotrivit utilizărilor practice, instrumentul era capabil să mărească obiectele de patru sute de ori. Reinhold Rudenberg, directorul de cercetări al companiei Siemens, a patentat microscopul electronic în 1931, desi Siemens nu făcea cercetări în domeniul microscoapelor electronice la acea vreme. În 1937 Siemens a început să-i finanteze pe Ruska si pe Bodo von Borries pentru dezvoltarea unui microscop electronic. Siemens l-a angajat si pe fratele lui Ruska, Helmut să lucreze la aplicații, în particular cu specimene biologice.(1)
2) Premiul Nobel
Fig 1. Microscopul electronic construit de Ernst Ruska in 1933
3
Ecuatia lui Louis de Broglie pentru identificarea lungimii de unde a electronilor in miscare : λ=h/mv
unde: λ = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa particulei considerate v = viteza de propagare a oscilatiei particulei
Fig 2. Cei 3 laureati ai Premiului Nobel pentru Fizica din anul 1986. Premiul Nobel in Fizica din anul 1986 a fost impartit astfel: jumatate pentru Ernst Ruska atat pentru cercetarile sale in optica electronica, cat si pentru proiectarea designului primului microscop electronic iar cealalta jumatate a fost acordata echipei formate din Gerd Binnig si Heinrich Rohrer pentru realizarea designului microscopului electronic prin efect tunel.(2)
Fig
3. Schita primului microscop, proiectat de Ernst Ruska
3)Generalitati
4
Un microscop electronic este un tip de microscop care utilizeaza un fascicul de electroni pentru a ilumina specimenul si produce o imagine marita.Microscoapele electronice au o putere mai mare decat un microscop optic, deoarece electronii au o lungime de unda in jur de 100.000 de ori mai mica decat lumina vizibila ( fotoni ) si pot realiza mai mult de 50 pm rezolutie si o marire de pana la aproximatic 10.000.000x, pe cand un microscop optic este limitat la o rezolutie de aproximativ 200nm si o putere de 2000x. Microscopul electronic foloseste lentile electrostatice si electromagnetice pentru a controla fasciculul de electroni pe care il concentreaza pentru a forma o imagine.Aceste lentile sunt analoage, dar diferite de lentilele de sticla a unui microscop optic care formeaza o imagine marita, concentrandu-se pe lumina sau prin specimen.Microscoapele electronice sunt folosite pentru a observa o gama larga de probe biologice si anorganice, inclusive microorganisme, celule, molecule mari, probe de biopsie, metale si cristale.Industrial, microscopul electronic este adesea folosit pentru controlul calitatii si analizarea defectelor de fabricatie de marimi foarte mici/microscopice. (3)
Fig 4. Stanga ( schema de principiu a microscopului optic). Dreapta schema de principiu a microscopului electronic.
4) Principiul Fizic
5
Fig 5. Stanga in dreptul sagetilor orificiu de observare. Dreapta : de sus in jos : sursa emitatoare de fascicul de electroni (tunul de electroni), magneti cu rol echivalent lentilei condensor din microscopul optic, traiectul fasciculului de electroni, proba, lentila obiectiv, lentila ocular, ecran. O secţiune transversală printr-un microscop electronic modern relevă următoarele elemente constructive: coloana electrono-optică, sistemul de vidare, sistemele de detecţie (prelucrarea procesarea şi redarea informaţiei) şi blocul de alimentare cu energie a tuturor componentelor.
Se compune din : tunul de electroni, lentilele condensoare şi lentila obiectiv.
6
Fig 6. Principial, construcţia unui microscop electronic este într-o oarecare măsură analogă construcţiei microscopului optic obişnuit. Părţile principale, comune celor două instrumente, sunt următoarele: sursa (de iluminare la microscopul optic, de electroni la microscopul electronic), lentila condensoare (sau condensorul), obiectul de studiat, lentila proiectoare şi sistemul de vizualizare şi înregistrare a informaţiei.
Mod de functionare : 1. Condensorul are rolul de a focaliza fasciculul de electroni pe probă, asigurând un paralelism cât mai bun al radiaţiilor cu axa optică. Obiectivul formează imaginea primară, mărită, a obiectului; aceasta este preluată de lentila proiector care o măreşte mai mult, pentru observarea pe ecranul instrumentului. 2. Tunul de electroni are rolul de a genera fasciculul de electroni. În interiorul tunului de electroni un câmp electrostatic dirijează electronii emişi de o porţiune foarte mică a suprafeţei unui filament, printr-o apertură foarte îngustă. După aceea, tunul accelerează electronii prin coloană spre probă, cu energii cuprinse între căteva zeci şi zeci de mii de electronvolţi. 3. Fasciculul de electroni, emis de tunul electronic, care bombardează suprafaţa probei, este compus din electroni monocinetici şi poartă numele de fascicul incident sau primar. El poate fi supus unei tensiuni de accelerare de la 100V până la 40.000V, în funcţie de tipul de microscop folosit. *** În momentul de faţă sunt utilizate căteva tipuri de tunuri de electroni: cu wolfram (W), cu hexaborură de lantan (LaB6) şi cu emisie de câmp. Constructiv, sunt utilizate materiale şi principii fizice diferite pentru obţinerea tunurilor de electroni, dar au ca scop comun generarea unui fascicul de electroni direcţionat, având curent stabil şi diametru cât mai mic posibil. *** 7
4. Electronii parcurg tunul ca un fascicul divergent. O serie de lentile electromagnetice şi de diafragme din coloană reconverg şi focalizează fasciculul într-o imagine micşorată. Aproape de zona de jos a coloanei există câteva bobine de scanare în rastere, care deflectează fasciculul de electroni într-o grilă de baleiere pe suprafaţa probei. Lentila finală focalizează fasciculul într-o arie cu o dimensiune cât mai mică pe suprafaţa probei. 5. După parcurgerea coloanei de electroni, fasciculul ajunge în camera probei. Aceasta încorporează dispozitivul de manevrare a probei, o uşă pentru introducerea sau extragerea eşantionului analizat şi câteva dispozitive pentru montarea detectorilor de semnale sau a altor accesorii. În momentul interacţiei fasciculului de electroni cu suprafaţa probei rezultă o serie de semnale, care după ce sunt detectate, amplificate şi procesate permit obţinerea unor informaţii privind morfologia, structura şi compoziţia probelor. (4)
5) Semnalele rezultate în urma interacţiei dintre fasciculul de electroni şi corpul solid Electroni retroimparstiati (reflectati elastic)
Fascicul electronic incident
Electroni secundari (emisi)
Radiatii X Radiatii infrarosii Radiatii luminoase (fotoni optici)
Microscopie electronica cu baleiaj sau de tip analitic
PROBA
Electroni absorbiti
Curent indus
Imprastiere elastica necoerenta Imprastiere neelastica
Imprastiere elastica coerenta Fascicul nedeviat de electroni transmisi
Microscopie electronica prin transmisie, microsopie electronica cu baleiaj prin transmisie, analiza dispersiva in energie
Fig 7. Interactiunile la nivelul probei, semnalele corespunzatoare si tipuri de microscopie electronica in functie de semnalul utilizat in crearea de imagini.
6) Tipuri de semnale 1) Electronii secundari
8
Electronii secundari (SE) sunt electronii atomilor din probă care sunt ejectaţi în mediu datorită interacţiei cu electronii primari din fascicul. În general, ei au energii foarte mici (prin convenţie mai mici de 50 eV). Datorită faptului că au energii foarte mici, acest tip de electroni poate scăpa din suprafaţa probei doar dintr-o regiune de foarte mică adâncime. Prin urmare, electronii secundari oferă imagini de cea mai bună rezoluţie. Imaginile date de electronii secundari sunt oferite în principal de toporafia suprafeţei probei. Cu cât volumul de interacţie este mai aproape de suprafaţa probei, cu atât mai mulţi electroni secundari pot fi emişi din probă, acest fenomen producându-se atât în zonele cu vârfuri, cât şi în cele mai joase. Astfel se obţin imagini în care vărfurile vor fi mai luminoase, iar văile mai întunecate. Datorită acestui fapt, interpretarea imaginilor de electroni secundari devine foarte intuitivă. 2) Electronii retrodifuzaţi Electronii retrodifuzaţi (BSE – backscattered electrons), sunt electronii primari care au fost împrăştiaţi în afara suprafeţei probei, datorită ciocnirilor elastice cu nucleele din atomii probei. Aceşti electroni posedă energii mari, cuprinse (prin convenţie între 50eV şi tensiunea de accelerare a fasciculului). Acest tip de electroni provin dintr-un volum mai mare de interacţie cu substanţa, ceea ce contribuie la pierderea rezoluţiei în imaginile de electroni retrodifuzaţi. În aceste imagini, contrastul este determinat de diferenţa numerelor atomice din fiecare punct bombardat cu fasciculul de electroni, de media numerelor atomice ale elementelor din compoziţia probei. Din zonele ce conţin elementele cu numere atomice mai mari vor fi reflectaţi mai mulţi electroni, ceea ce conduce la obţinerea unei arii mai luminoase în imagine. Imaginile de electroni retrodifuzaţi nu sunt atât de uşor de interpretat dar, evaluate corect, pot oferi informaţii importante privind compoziţia probei. În general, intensitatea curentului de electroni retroîmprăştiaţi creşte cu creşterea unghiului de împrăştiere, nu variază sensibil cu energia fasciculului primar şi creşte cu numărul atomic al probei. Semnalul oferit de electronii retrodifuzaţi este detectat de doi detectori cu corp solid, care, lucrând în regim de substituţie-adiţie permit obţinerea unor imagini privind topografia sau compoziţia suprafeţelor analizate. 3) Recombinarea şi catodoluminiscenţa Prin interacţiunea unui fascicul incident cu o probă, mulţi electroni secundari produşi nu pot părăsi proba şi sunt anihilaţi, în urma împrăştierilor, prin procese de recombinare electron-gol. Dacă procesul de recombinare este însoţit de emisia de fotoni optici, apare fenomenul de catodoluminiscenţă. Mecanismul acestei fotoemisii este similar cu luminiscenţa în sensul că este stimulată de o serie de elemente active, aflate în cantităţi foarte mici în aria probei bombardate cu fasciculul de electroni. Exact la fel ca în cazul luminiscenţei normale, catodoluminiscenţa poate indica distribuţia în probă a acestor elemente cu concentraţii mici, completând astfel informaţia privind compoziţia chimică a ariei bombardate, obţinute prin emisie de radiaţii X sau electroni Auger. 9
Catodoluminiscenţa în probele semiconductoare este dependentă de tensiunea electrică aplicată şi, în consecinţă, stările de suprafaţă în unele materiale semiconductoare pot fi studiate prin acest efect care furnizează date privind timpul de viaţă al purtătorilor de sarcină majoritari, lungimi de difuzie, etc. Fenomenul de catodoluminiscenţă este afectat de asemenea de topografia superficială şi de prezenţa unor defecte interne (dislocaţii, precipitate, limite intercristaline). Acest fenomen de excitare a luminiscenţei prin bombardament electronic a fost observat şi în unele materiale plastice, organice şi în unele probe minerale. 4) Emisia de radiaţii X şi electroni Auger Emisia de radiaţii X se produce dacă un electron de pe un nivel energetic inferior este excitat de fasciculul primar de electroni şi trece pe un nivel energetic superior, sau părăseşte complet atomul (fotoelectron). Locul vacant este ulterior ocupat de un alt electron care cade de pe un nivel energetic superior şi emite un foton de radiaţie X, de energie hυ egală cu diferenţa ∆ Ε dintre energiile corespunzătoare celor două niveluri energetice între care a avut loc tranziţia. Este posibil ca anumiţi electroni să fie reflectaţi din probă, după ce în prealabil au interacţionat neelastic cu atomii din probă. Ceilalţi electroni, care sunt împrăştiaţi la unghiuri mai mici spre interiorul probei, îşi pierd din ce în ce mai mult din energie, după fiecare coliziune, până când nu mai pot participa la un proces de ionizare prin impact (de obicei energia de ionizare este cuprinsă între 3 şi 8 eV). Energia rezultată în urma frânării acestor electroni este emisă sub forma unor fotoni de radiaţii X ce alcătuiesc spectrul continuu de emisie a probei. Intensitatea maximă a spectrului continuu creşte cu tensiunea de accelerare, cu intensitatea fasciculului şi cu numărul atomic al probei.(4)
6.1 ) Microscopul Electronic cu Transmisie (MET) si utilizarile sale Forma originală a microscopiei electronice, microscopia electronică cu transmisie implica o rază de electroni la tensiune înaltă emisă de un catod, de regulă filament de tungsten, şi focalizată de lentile electrostatice şi electromagnetice. Raza de electroni care a fost transmisă printr-un specimen parț ial transparent pentru electroni transportă informație despre structura internă a specimenului în raza care ajunge la sistemul de formare a imaginii. Variația spaț ială a acestei informaț ii ("imaginea") este apoi mărită de o serie de lentile electromagnetice până când este înregistrată la coliziunea cu un ecran fluorescent, placă fotografică, sau senzor de lumină cum ar fi un senzor CCD. Imaginea detectată de CCD poate fi afişată în timp real pe un monitor sau transmisă pe loc unui calculator.
10
Fig 8. De sus in jos in sagetile indica: sursa de inalta tensiune, tun de electroni, prima lentila condensor, dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 1, a doua lentila condensor, dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 2, suport pentru specimen si orificiu etans pentru aer, lentila obiectiv si dispozitiv de reglare a acesteia, fasciculul de electroni transmisi, ecran fluorescent si camera. Rezoluţia unui microscop electronic cu transmisie este limitată în principal de aberaţia de sfericitate, dar o nouă generaţie de sisteme de corecţie a aberaţiilor a avut ca efect depăşirea parţială a aberaţiilor sferice şi creşterea rezoluţiilor. Corecţiile din software ale aberaţiei de sfericitate pentru microscoapele electronice cu transmisie de înaltă rezoluţie a permis producerea unor imagini cu rezoluţie suficient de bună pentru a evidenţia atomii de carbon în diamante, aflaţi la distanţe de doar 0.89 ångströmi (89 picometri) unii de alţii şi atomi din silicon la distanţe de 0.78 ångströmi (78 picometri).(5),(6) Proteinele recombinate care contin etichete tetracisteine pot fi cu usurinta distribuite in celule vii cu diferite culori a “biarsenical fluorescent chromophore”* astfel incat , atat proteinele tinere , cat si cele batrane sa fie observate diferit de microscopul electronic. Astfel, noua proteina sintetizata connexin43** a fost transportata predominant intre 100 si 150 de nanometri prin plasma membranei si incorporata la periferia
11
membranei unde exista “gap junctions”***.Aceasta metoda are rolul de a clarifica procesele de transport de proteine in situ****.(7) *Fluorescent chromophore ( fluorophore ) reprezinta un flourcrom covalent la o macromolecula care ajuta la patarea tesuturilor, celulelor sau materialelor pentru imagine fluorescenta sau spectroscopie.(8)
Fig 9. ** connexin ( sau gap junction proteins ) reprezinta o serie de proteine care formeaza aceste jonctiuni.(9) *** gap junctions ( sau nexus ) reprezinta o conexiune specializata intercelular intre o multitudine de celule animale. Acesta se conecteaza direct la citoplasma si permite moleculelor si ionilor sau treca intre celule.(10) **** in situ = in habitatul natural (11)
Fig 10. Imaginea unui virus cu o dimensiune de 30 nm prin microscopul electronic cu transmisie.
12
Fig 11. Imaginea virusului subtilis la microscopul electronic de transmisie
6.2 ) Microscopul electronic cu scanare ( sau cu baleiaj MES) si utilizarile sale
13
Fig 11. Schema de principiu a microscopului electronic de scanare. Stanga, de sus in jos sagetile indica: tunul de electroni, magnetii condensori, fasciculul de electroni, bobina, magnetii obiectiv, electroni secundari, proba. Dreapta, de sus in jos sagetile indica: imaginea vazuta pe ecranul format din tub catodic sincronizat la bobina, detectorul de electroni. Spre deosebire de MET, unde semnalele electronilor transmisi formeaza imaginea, microscopul electronic cu scanare produce imagini prin detecţia electronilor secundari, cu energie scăzută, emisi de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza principală de electroni. În MES, raza de electroni parcurge întreg specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziț ia razei. În general, rezoluţia MET este de regulă cu un ordin de mărime mai mare decât cea a MES. Datorită faptului ca imaginea produsă de microscoapele cu scanare se bazează pe procese de suprafaţă şi nu pe transmisie, acesta este capabil să vizualizeze probe mai mari, şi are o adâncime de penetrare mult mai mare, producând astfel imagini care sunt o bună reprezentare tridimensională a probei.(12)
14
Fig 12. Imaginea unor cristale de gheata la microscopul cu scanare
- Analizarea Coloniilor Bacteriene Aceasta tehnica este utilizata pentru observarea cresterii coloniilor bacteriene. Bacillus cereus si Bacillus subtilis au fost cultivate pe fasii de membrane de dializa etichetate cu nutriment agar. Microcoloniile au fost fixate pe fasii in vapor Formalin in situ.Apoi fasiile au fost scoate de la nutriment agar si analizate cu ajutorul microscopului cu scanare fara a fi distruse aranjamentele celulare. Astfel cu ajutorul acestui microscop s-au observat atat morfologia celulelor, cat si orientarea lor in cadrul coloniei.(13)
Fig 13. Imaginea unei colonii bacteriene - Evolutia Micoscopiei cu scanare ( Reconstructia structurilor 3D ) – furnici Fig 14. Observarea si analizarea structurilor lanivel 3DImaginea este de ounei importanta majora in la nivelul microscopului cu domeniul biologic si biofizic.Exista metode de a obtine stuctura unei molecule sau a unui scanare
15
atom la nivelul microscopului optic.Dar nimic nu se compara cu analiza 3D in momentul in care trebui sa se reconstruiasca anumite structuri de ordinul micrometrilor si sa se analizeze cele mai mici procese. De asemenea, sistemul 3D este foarte util in intelegerea retelelor de celule , mai ales cand vine vorba de Sistemul Nervos.(14)
Bibliografie :
1. Ernst Ruska (1986). Autobiografia lui Ernst (versiunea in engleza). Nobel Foundation. Accesat la 2007-02-06. 2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1986/ 3. Erni R, Rossell MD, Kisielowski C, Dahmen U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50-pm Electron Probe. Phys Rev Lett 2009: 102 (9): 096101. 4. http://www.scribd.com/doc/57678478/Microscopie-electronica 5. OÅM: World-Record Resolution at 0.78 Å, (18 mai 2001) Berkeley Lab Currents. 6. Nellist PD, Chisholm MF, Dellby N, Krivanek OL, Murfitt MF, Szilagyi ZS, Lupini AR, Borisevich A, Sides WH Jr., Pennycook SJ .(17). „Direct Sub-Angstrom Imaging of a Crystal Lattice” (în engleză). Science 305 (5691): 1741. doi:10.1126/science.1100965. 7. Gaietta G, Deerinck TJ, Adams SR, Bouwer J, Tour O, Laird DW, Sosinsky GE, Tsien RY, Ellisman MH. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 2002 Apr 19;296(5567):503-7. PubMed PMID: 11964472. 8. Tsien RY, Waggoner A (1995). Fluorophores for confocal microscopy. In Pawley JB. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press 2008: pp. 267–74. ISBN 0-306-44826-2. 9.Lodish, Harvey F.; Arnold Berk, Paul Matsudaira, Chris A. Kaiser, Monty Krieger, Mathew P. Scott, S. Lawrence Zipursky, James Darnell (2004). Molecular Cell 16
Biology (5th
ed.). New York: W.H. Freeman and Company. pp. 230–1. ISBN 0-7167-
4366-3. 10. White, Thomas W.; Paul, David L. (1999). "Genetic diseases and gene knockouts reveal diverse connexin functions". Annu rev physiol 61: 283–310. 11. http://dexonline.ro/definitie/in%20situ 12. Microscopia electronică cu scanare, 1928 - 1965 13. Bulla LA, St Julian G, Rhodes RA, Hesseltine CW. Scanning electron and phasecontrast microscopy of bacterial spores. Appl Microbiol. 1969: 18(3): 490-95 [PMC free article][PubMed] 14. Denk W, Horstmann H. Max Planck Institute for Medical Research, Heidelberg, Germany. PubMed )
17
