TAXONOMÍA - CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS La clasificación definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada suelen ser recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9ª edición de Bergey's Manual of Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados en 4 categorías mayores: 1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; grupos ; en esta categoría se incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patología humana. Espiroquetas:: Espiroquetas - Familia Leptospirac Leptospiraceae eae (genero - Leptospira) - Familia Spirochaet Spirochaetaceae aceae (genero - Borrelia, Treponema) Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerófilas móviles (crecen móviles (crecen mejor a bajas presiones de oxígeno): - Familia Campylobacteriaceae (genero - Campylobacter, Helicobacter) Bacilos y cocos aerobios - microaerófilos microaerófilos (crecen (crecen mejor a bajas presiones de oxígeno): - Familia Pseudomon Pseudomonadaceae adaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas) - Familia Alcaligenace Alcaligenaceae ae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos - Familia Legionellace Legionellaceae ae (genero - Legionella) - Familia Neisseriac Neisseriaceae eae (genero - Neisseria) => diplococos - Familia Moraxellace Moraxellaceae ae / Familia Branhamace Branhamaceae ae (genero - Moraxella, Branhamella) => diplococos - Otros generos => Brucella Brucella (cocobacilos) (cocobacilos) Bacilos anaerobios y facultativos: facultativos: - Familia Enterob Enterobacteriaceae acteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Shigella, Yersinia/peste) - Familia Vibrionaceae (genero - Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas) - Familia Pasteurella Pasteurellaceae ceae (genero - Haemophilus) - Otros generos => Gardnerella Cocos Gram- anaerobios => anaerobios => genero - Veillonella - Veillonella - Familia Rickettsia Rickettsiaceae ceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parásitos intercelulares obligados, altamente pleomórficas cocos/bacilos/hilos - Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parásitos intercelulares obligados de forma f orma esférica. 2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); (17-29) ; en este grupo hay los que provocan patologia humana (la mayoria). Cocos => Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus Bacilos esporulados => esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio) Bacilos regulares no esporulados => esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria Bacilos irregulares no esporulados: esporulados : - Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium) Micobacterias:: Micobacterias - Familia Mycobacte Mycobacteriaceae riaceae (genero - Mycobacterium) 3. Micoplasmas (Mollicutes (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); (30) ; dentro de este grupo, los que provocan patología humana => = > genero Mycoplasma/ Mycoplasma pneumoniae y Ureaplasma Ureaplasma.. 4. Arqueobacterias con 4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ t ermogenas) Taxonomía => la ciencia de la clasificación que Taxonomía => clasificación que agrupa y separa los organismos de acuerdo con su características fenotípicas, estructurales o genéticas para genéticas para facilitar su estudio; la misión => construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los organismos; el sistema jerárquico de la taxonomía se ha formado gradualmente a partir del de l sistema binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y especie establecida por Linneo en 1758 (un botánico); botánico); la taxonomía no es una ciencia estático, goza de gran dinamismo y esta en la relacion con los avances de los procedimientos empleada para su estudio; el termino de sistemática se utiliza como sinónimo de taxonomía; los grupos de taxonomía van
de dominio - imperio - reino - tribu - división - clase - orden - familia - genero y especie. especie . Para la asignación de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el código cód igo internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por el Int´l Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus números; una especie bacteriana, viene definida por un nombre genérico de un nombre especifico latinizado o helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra mayúsculas y el de especie con minúsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o en su defecto, subrayado; en la denominación de un especie, la palabra que define genero puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej. Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, también puede dar referencia a un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico es único; para referirse a un especie o varios especies no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categorías taxonomia superiores, se forman añadiendo las palabras que las asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categorías taxonomía se expresa en cursiva o itálica. FLORAS BACTERIANAS Flora Normal de la especie humana => humana => la población de microorganismos comensales que normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la piel y las mucosas colonizadas por microorganismos dinámicos => cambios cualitativos y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones: 1. La flora residente (FR) => (FR) => un numero relativamente fijo de especies de microorganismos (comensales y oportunistas) oportunistas) en una zona definida (si se producen alteraciones, suelen ser temporales); tempo rales); permanecen intactas; encuentran condiciones fisiológicas y nutritivas a decuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente beneficiosa beneficiosa (produce (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorción de nutrientes y impide la colonización de microorganismos potencialmente potencialmente patógenos. 2. La flora transitoria (FT) => (FT) => microorganismos no patógenos o potencialmente patógenos, patógenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiempo; tiene poca importancia, pero si la flora residente se altera, la flora f lora transitoria puede multiplicarse y producir infecciones. La supresión de FR => vació ecológico => ocupación de microorganismos ambientales ambientales o de otras zonas de cuerpo => infecciones. FR oportunistas => oportunistas => los que tienen acceso a lugares estériles; algunos ejemplos: - Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, boca, si alcanza el torrente sanguíneo => si válvula cardíaca dañada => posible endocarditis; - Bacteroides son comensales del intestino grueso => grueso => si apendicitis perforada => posible peritonitis o bacteriémia. - Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cáncer, leucemias, linfomas, SIDA) - E.coli es es comensal del colon => lugar estéril (o estéril (o no habitual) a traves de uretra => infección urinaria Las causas de las interpretaciones erróneas => erróneas => no se toma en cuenta al microorganismo como patógeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisión o inclusión de una especie en una de las categorías no implica que no pueda ser aislada en otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales, pueda producir enfermedad. Flora normal de la piel, boca y vías respiratorias superiores superiores - Las principales (en principales (en faringe y traquea) => Staphylococcus epidermiditis (coagulasa), Staphylococcus Staphylococcus aureus (coagulasa+) en pequeñas cantidades, Micrococcus spp, Neisseria de especies no patógenas, Estreptococos A-hemolíticos y A-hemolíticos y no hemolíticos, las anaerobias facultativas, Candidas. - FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los ácidos grasos de las secreciones sebáceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes; se disminuye de forma temporal => la repoblación es muy rápida. - Al nacer => nacer => la boca y faringe son estériles estériles;; tras 12 horas => Streptococcus viridas (las mas abundantes en la boca), posteriormente posteriormente => => estafilococos ( S.epidermiditis), diplococos Gram-, difteroides (Corynebacterium); salida de dientes => dientes => espiroquetas de Bacteroides, Fusobacterium e levaduras; Adulto normal=> normal=> las principales (mira Actynomicetes, vibrios anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto
arriba!!) - Los bronquios, bronquiolos y alvéolos suelen ser estériles. Flora normal del tracto intestinal - Al nacer => nacer => estéril estéril,, posteriormente posteriormente => => colonizado por microorganismos de los alimentos dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y Lactobacilos y Lactobacilos y el biberón => flora mixta con mixta con menos Lactobacilos) . - Adulto normal => normal => el el esófago contiene esófago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el estomago hay estomago hay poco (pH acido protegen la cólera y salmonelosis - excepto Helicobacter pilorique pilorique puede causar ulcera péptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez: degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene superior contiene Lactobacilos y enterococos; enterococos;intestino delgado inferior (íleon inferior (íleon y ciego) contiene la flora fecal; el colon contiene colon contiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides spp, Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp , cocos Gram+ anaerobios (Peptostreptococcus spp). - La utilidad/beneficio => utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformación de los pigmentos biliares en ácidos biliares, absorción y metabolismo primario de nutrientes. - La administración de anti-microbianos orales => orales => la posible proliferación de cepas resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada. - La administración de ATB por vía parenteral en una cirugía intestinal => necesario para reducir al mínimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto quirúrgico y infección peritoneal e diseminada. Flora normal de la uretra - Los mas frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no Neisserias no patógenas, enterobacterias (la mayoría son pobladores de la piel que recubre esta zona). - En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar una muestra. Flora normal de la vagina - Al nacer, nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce aerobios (produce pH acido), posteriormente el pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y bacilos, hasta la pubertad. - En la pubertad esta pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que anaerobios que produce ácidos por su metabolismo de hidratos de carbono => = > cambio a pH acido (protección a los otros microorganismos potencialmente patógenos. - En la mujer adulta esta adulta esta colonizada ademas de los anteriores ( Lactobacillus acidophillus - aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no hemoliticos) y otros; el m oco cervical contiene lisozima con actividad bactericida. - En la menopausia la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos y bacilos. - La administración de antibióticos de amplio espectro, e spectro, puede eliminar las especies protectoras, produciéndose una multiplicación excesiva en la vagina de levaduras (candidas) u otras causantes de vaginitis. Flora normal de la conjuntiva del ojo Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y estreptococos no hemolíticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la flora lo ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.
Tema 13 - Pruebas bioquímicas para la detección del metabolismo hidrocarbonado de las bacterias. Metabolismo - conjunto de reacciones químicas que tiene lugar en las celulas vivas; necesitan energía Metabolismo que se obtiene por oxidación (perdida de electrones) de sustancias introducidas en forma de alimentos; la gran mayoría de las bacterias (heterótrofas) se nutren de sustancias orgánicas que proceden de otros seres vivos y otras (autótrofas - cianobacterias) se nutren de sustancias orgánicas que sintetizan ellas mismas a partir de sustancias inorgánicas; 3 etapas en metabolismo metabolismo => 1ª-catabolismo/hidrólisis 1ªcatabolismo/hidrólisis/degradación /degradación de sustancias nutritivas => nutritivas => compuestos mas sencillos + energía en forma de ATP (adenosin trifosfato) 2ª-anfibolismo/metabolis 2ªanfibolismo/metabolismo mo intermedio del producto del catabolismo => catabolismo => compuestos de bajo peso
molecular 3ª-anabolismo/metabolismo biosintético de sustancias simples => biosíntesis de macromoléculas /moleculas complejas + gasto de energía. Enzima - catalizadores biológicos (proteínas); cada enzima afecta solo a un sustrato especifico. Reducción => captan electro nes. Catabolismo de hidratos de carbono - oxidación de azucares para obtener la energía es muy importante, aunque también se catabolizan lípidos y proteínas; la 1ª etapa de la degradación de la glucosa => oxidación de esta para formar acido pirúvico (glucólisis); 2 procesos => la respiración (necesita O2) o la fermentación (no necesita O2); la glucólisis (no precisa O2) se produce en 3 vías, en función de la dotación enzimática. 1º vía glucolítico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto porPasteur => se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilación por cada molécula de glucosa que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la formación de acido pirúvico, las bacterias que usan esta vía, normalmente utilizan la vía fermentativa para acabar transformando este acido pirúvico en ácidos mixtos; degradación/ hidrólisis de glucosa (6C) => acido pirúvico + 2 ATP (fosforilación) => ácidos mixtos (fermentacion); son 9-10 reacciones químicas con un enzima diferente en cada una; utilizados por las bacterias fermentadoras que poseen deshidrogenasas (Clostridium, Enterobacter, Salmonella) 2º vía de las pentosas fosfato /vía fosfoglucónica (vía HMP) - es una ruta mixta y vía alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas y también glucosa,mediante sucesivas reacciones y produce => pentosas intermedias (precursores de síntesis de ácidos nucleicos y ciertos aminoácidos) de gran utilidad para las celulas; ademas de la glucólisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP como una vía alternativa para la oxidación de la glucosa => produce acido láctico o acido mixto + 1ATP (p.ej. Enterobacterias/ E.coli ); esta vía es un híbrido de la vía ED y la EMP, ya que en las primeras etapas, la oxidación de la glucosa es similar a la via ED y en las e tapas posteriores es similar a la vía EMP, es decir: proporcionan a las bacterias no oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirúvico puro, porque no tienen las enzimas necesarios para comenzar la vía EMP, apareciendo en los sistemas analíticos como fermentadoras. 3º vía de Entner-Doudoroff (vía ED/ vía aerobia => requiere O2) - es otra vía por la cual la glucosa se oxida a acido pirúvico; por cada molécula de glucosa se producen 1 molécula de ATP para ser utilizada por la célula en reacciones bio-sintéticas; esta vía requiere enzimas específicos y solo los microorganismos que las poseen pueden utilizarla sin seguir la vía de las pentosas fosfato ni la glucólisis; los microorganismos que la utilizan son Pseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las deshidrogenasas necesariaspara oxidar el acido pirúvico al acido láctico u otros ácidos; los hidrogeniones se transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidación de glucosa => acido pirúvico + 1ATP (no producen acido láctico ni acido mixto) Respiración - es un proceso fosforilación oxidativa de generación de ATP y se caracteriza por el aceptor final de electrones generalmente es una molécula inorgánica (O2); la glucosa se degrada => acido pirúvico se sigue oxidando por la vía de la respiración o la fermentación (en función del sistema enzimático que tienen) => ATP + CO2 + H2O; durante la respiración, cualquier molécula orgánica puede ser degradada /oxidada con un mayor rendimiento que en la fermentación. Respiración aeróbica - cuando el aceptor final de Hidrógenos (electrones) es el O2; en la respiración, el acido pirúvico producido por la glucólisis se escinde en 2 partes: una parte se unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde se liberan electrones y protones (H+); la otra parte para biosíntesis??? Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmática de las celulas procarióticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las celulas eucarióticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una molécula inorgánica como O2 en la respiración aeróbica o hasta una molécula inorgánica diferente del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las moleculas transportadoras de electrones son 3 tipos => [1] flavoproteínas - realizan reacciones de oxidación reducción, [2] citocromos - proteínas con un grupo
prostéticos (Fe) en forma oxidada, [3] ubiquinonas o coenzima Q Q - transportadores no proteicos de bajo peso molecular. Respiración anaeróbica anaeróbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una sustancia inorgánica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4, carbonatos CO2-3. CO2-3 . ( Pseudomonas y Bacillus) Fermentación Fermentación - proceso que se inicia a partir de acido pirúvico formado en la glucólisis de EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto orgánico y no requiere O2;; característ O2 (1) no no precisa O2, pero se puede ocurrir en su características icas principales => (1) presencia, (2) (2) no no necesita el ciclo de Krebs ni cadena transportadora de electrones, (3) (3) utiliza1 utiliza1 molécula orgánica como aceptor final de electrones, (4) (4) libera libera energía a partir de azucares y otras moleculas orgánicas (aminoácidos, ácidos orgánicos, purinas, pirimidinas), (5) (5) libera libera solamente 2 moleculas de ATP por cada molécula del sustrato inicial, (6) (6) los los productos finales pueden ser acido láctico, etanol y CO2, acido propiónico, acido acético, CO2 y agua, acido butírico, etc. (compuesto orgánico); cuando el aceptor final de electrones es el lactato, se producirá acido láctico y láctico y en general cuando el aceptor final sean otras sales orgánicas, se formaran ácidos mixtos p.ej. acido succínico,, que son responsables de la caída de pH en las pruebas empleadas, para la identificación succínico bacteriana; ademas, las bacterias que tienen la dotación enzimática apropiada, apropiada, pueden seguir degradando estos ácidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgánicos; es útil el análisis de los productos finales para identificar así los microorganismos; la mayor parte de la energía producida en la fermentación queda almacenada en los productos finales; las fermentadoras => fermentadoras => Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella, Enterobacter. Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa Permeasa (esta Permeasa (esta en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a traves de ella) y B-D-Galactosidasa B-D-Galactosidasa (esta (esta en el interior de la célula y es capaz de desdobla la lactosa l actosa en glucosa y galactosa). Clasificación de los microorganismos segun su capacidad de fermentar o no la lactosa: lactosa : - fermentadores activos de lactosa en 24 horas (poseen ambos enzimas) - no fermentadores de lactosa (carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la célula) - fermentadores tardíos de lactosa (poseen el enzima B-D-Galactosidasa, permeabilizar la lactosa ligeramente cuando la concentración es alta en 2-15 días).
La aplicación fundamental es la diferenciación dife renciación de Enterobacteriaceae => Enterobacteriaceae =>Escherichia Escherichia (+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no fermentadora y Klebsiella (+) es una fermentadora tardía de lactosa, es decir lactosa (-) y ONPG (+); (+); para detectar la enzima B-D-Galactosidasa => se utiliza un compuesto similar a la lactosa (orto-nitrofenol (orto-nitrofenol): ): al liberarse al medio alcalino por la acción de BDG produce un color amarillo. Material => Material => 1 tubo de ensayos estériles, baño maría o estufa a 37ºC, asa de siembra, solución fisiológica esteril, discos de ONPG, microorganismo problema Técnica => Técnica => una suspensión densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml de suero fisiologico estéril se añade un disco de ONPG y mezclar durante unos segundos, incubar a 37ºC durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30 minutos) Resultados => Resultados => en ONPG+ se ONPG+ se produce una coloración amarillo y en ONPGONPG- no no se produce color (incoloro).
Tema 14 - Pruebas bioquímicas para la detección del metabolismo proteico de las bacterias Principal productor de energía => energía => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de proteinas y lípidos (estan relacionados entre si); la hidrólisis de proteínas/ proteína+agua (mediante enzimas proteolíticos extracelulares, secretadas por ciertas bacterias que sirve para su tipificación/tipación) => polipéptidos y aminoácidos; las pruebas bioquímicas investigan fundamentalmente la capacidad de un microorganismo de producir la hidrólisis de la gelatina; catabolismo de proteínas/ proteólisis se realiza mediante proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminación) peptidasas (desaminación) para obtener => ion amonio NH4+ (+) acido orgánico; orgánico; acido orgánico entrar al ciclo de Krebs y ion amonio NH4+ es secretado de la célula. célula . Producción de acido sulfhídrico sulfhídrico - técnica con indicador incorporado al tubo/a la placa => algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhídrico SH2; SH2; el gas es detectado a traves del medio que contiene fuente de hidrógeno (azucar) hidrógeno (azucar) fuente de azufre(tiosulfato azufre(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales pH (sales de hierro /citrato férrico fé rrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberación del gas SH2 por algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada desulfurasas (activada por la fermentación de la glucosa => acidifica/produce ácidos/baja el pH) que actúan sobre los aminoácidos azufrados; la temperatura de incubación (estufa) tiene que oscilar entre 35-36ºC (superior a 37º se inhibiría la producción de SH2). SH2).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger Material => (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), iron ), agujas y asas de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen ( Hektoen y SS); SS); Técnica => Técnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la técnica se realiza con Brucella(microaerofila), se debe incubar con una atmósfera de CO2. CO2. Resultados => Resultados => SH2 positivo ( positivo ( Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de inoculación ennegrecimiento del medio; SH2 negativo ( negativo ( Brucella y Shigella) no se ennegrece el medio. Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentación fe rmentación de azucar) + indicador de pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro insoluble/ puntos negros (FeS) Prueba de las descarboxilasas descarboxilasas - enzimas que actúan sobre el grupo carbóxilo de los aminoácidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y (alcalinas) y se desprende CO2 ( CO2 (el el proceso se realiza en anaerobiosis) anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba (API - buscar el código en el libro); estas pruebas se aplican para la identificación de Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinización del medio inicialmente de color purpura, se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado supondrá la alcalinización del medio (sigue el mismo color como el inicio); inicio ); cada pocillo contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada descarboxilasa actúa sobre un aminoácido especifico; en cada reacción se desprende CO2 y se alcaliniza el medio: medio: - L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2 - L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2 - L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilación) => Putrescina +CO2
Material => pruebas de API, pipeta Pasteur. Material => Reactivos => Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequeña cantidad en su composicion una pequeña cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y purpura de bromo cresol, pH6); aminoácidos ensayados en forma L, muestra de problema y papel parafina. Técnica => Técnica => se añade una gota del inoculo (suspensión microbiana) en cada pocillo de la prueba de API; se incuba a 35ºC durante 18-24 horas. horas. Resultados => Resultados => durante las primeras horas de incubación, el caldo vira a amarillo, por la fermentación de glucosa que glucosa que lleva el medio; pero si el aminoácido es descarboxilado, el pH vuelve a subir, subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+); si se queda amarillo sera descarboxilasa-; gérmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no es 100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y Ornitina): Ornitina): - Lisina Lisina => => Klebsiella, Serratia, Salmonella - Ornitina Ornitina => => Serratia, Proteus, Salmonella - Arginina Arginina => => Salmonella, Pseudomonas
Tema 15 - Pruebas bioquímicas para la detección de la actividad enzimática de las bacterias Pruebas oxidasa oxidasa - esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo oxidasa que oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxigeno; oxidasa oxidasa => => enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxigeno; oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie microbiana; microbiana ; los citocromos son hemo-proteínas que contiene Fe y actúan como ultimo eslabón de la cadena respiratoria aerobio, transferiéndo H+ al O2 con formación de H2O; H2O; este sistema se encuentra en los organismos aerobios y anaerobios facultativos, facultativos , carenciandolo de ello los anaerobios estrictos; se observara el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando esta reducido (pfenilendiamina=> formar indofenol de color violeta oscuro) y coloreado cuando se oxida; Aplicación => Aplicación => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa; diferenciar entre Enterobacteriaceas (oxi-) de Pseudomonadacea (oxid+); diferencia entre géneros Moraxella (oxi+), Neisseria (oxi+) de Acinetobacter (oxi-). (oxi-) .
Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plástico, papel de filtro, porta, Material => reactivo oxidasa de Kovacs. Técnica => Técnica => mezclar una pequeña muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se sitúa por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de color; otra manera: se añade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y
también en otro medio; si son oxidasa positivo toman un color marrón y en seguida pasan a negro parduzco. Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, después de 60" es negativo; oxidasa- no se produce color. Pruebas de catalasa La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que actúa sobre el peróxido de hidrógeno /H2O2 (es un producto final de la degradación aerobica oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos gérmenes morirían; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O + O2; aplicación => diferenciación de Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+) ;
Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plástico (las de platino catalizará la reacción) Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema Técnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto, simultáneamente, con una asa se añade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-24 horas, homogeneizar y observar. Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen burbujas; se podrán observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangre o otros que lleven hematíes (los hematíes contiene catalasa). Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API) La nitratasa (nitrato reductasa) es el enzima que cataliza el proceso en cual el nitratos son reducidos a nitritos (presentes en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos que utilizan nitrógeno como ultimo aceptor de electrones en el proceso metabólico/ respiración anaeróbica); depende de la especie bacteriana se trate, se pueden producir diversos productos finales; reacción: nitrato/NO-3 + nitratasa => nitrito/NO-2 =>N2 (nitrógeno molecular/ gas nitrógeno) o otros => amoniaco / oxido nítrico / oxido nitroso / hidroxil amina; la prueba detecta los productos finales liberados al medio mediante un reactivo colorimétrico API; aplicación => diferenciación de especies de Haemophilus y Neisserias; cuando no se forma color (rojo) al añadir los reactivos, puede significar => [1] no se ha reducido el nitrato, se comprueba añadiendo polvo de zinc que actúa como reductor y si hay un cambio al rojo, es nitratasa (-) y si no hay cambio de color, sera nitratasa (+); [2] la reducción de nitratos ha sido llevada hasta la formación de N2, se observa con la aparición de grietas o burbujas; [3] la reducción de nitratos ha formado otros productos nitrogenados (oxido nítrico, amoniaco, hidroxil-amina, etc.);
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo, microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es productor de H2S (acido sulfhídrico) este impide la formación de color; técnica => hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el medio; incubar a 37ºC durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B, observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rápido, ya que el color puede desaparecer); si no se forma color, se añade al tubo un poco de polvo de Zinc; resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ ( Haemophilus y Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al añadir el reactivo A y B que indica la reducción de nitratos a nitritos; [2] al añadir polvo de zink no se desarrolla color indica formación de otros productos nitrogenados;Nitratasa- => cuando se forma color rojo o rosado al añadir polvo de zinc en menos de 30 segundos. Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinización de un medio liquido; la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea => carbonato amónico, que sube el pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicación => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o baño maría. Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color ámbar) y microorganismo de problema Técnica => con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas; inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37ºC; la reacción se produce entre 1-4 horas Resultados => en ureasa (+) el caldo de color ámbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de reacción (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Brucella, requieren 6 días de incubación. Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) - observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitación al ponerse en contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en plasma; aplicación => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico +; técnica => (usando el kit comercial /prueba de látex) seguir la instrucción de la casa comercial que hacen el reactivo; resultados => coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un plasma como reactivo => se observara la formación de un hilo de fibrina en la reacción) y en coagulasa- no se forma grumos.
Prueba de Triptófano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de desaminar el triptófano por la acción de TDA, produciendo => acido indol pirúvico que reacciona
con citrato férrico amoniacal y el cloruro férrico que lleva el medio produciendo un color marrón (determina la presencia de la enzima TDA); técnica => en un medio liquido de TDA (color ámbar); se puede utilizar el reactivo urea-indol; añadimos 1 sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo TDA del API, incubar a 37ºC entre 18-24 horas, y leer; resultado => el color marrón/café indica la presencia de TDA+ y sera negativo si no hay cambio de color; los géneros que tienen TDA+ => Proteus, Providencia y Morganella.
Tema 17 - Pruebas de sensibilidad a los anti-microbianos Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patológico a los antimicrobianos; se debe hacer antes de establecer el tto de una infección microbiana; diferentes metodos de antibiograma => (1) por difusión que daran resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por dilución nos dará resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentración Mínima Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por detección enzimática, consiste en detectar la enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. detección de betalactamasa, adenilasa, acetilasa, etc. Clasificación de las sustancias anti-microbianas: (a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmáticos => a CMI en el lugar de la infección; CMI => la mínima cantidad de ATB capaz de inhibir el crecimiento de un germen; CMB => la mínima cantidad de ATB que mataría al germen; normalmente CMI es suficiente para combatir una infección y los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el termino mas utilizado. (b) un microorganismo es resistente => cuando la concentración máxima de ATB que se puede localizar en el lugar de la infección no es suficiente para eliminar el germen, es decir, la concentración de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas por efectos tóxicos secundarios. (c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infección sin llegar a dosis que produzcan efectos tóxicos, puede eliminar el germen.
Casos clínicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a casi todos los ATB, se dará una dosis toxico o una combinación de ATB por vía endovenosa. Normas básicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patológico, ni tampoco utilizar mezclas de gérmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento en placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infección mono-microbiana); para elegir un ATB se deberá ensayar aquellos que son útiles clínicamente y se encuentran disponibles en el mercado farmacéutico. Factores a tener en cuenta => (1) características tintoriales del germen (Gram+o-) (2)lugar de la infección (especialmente las vías urinarias y meningitis); es importante porque es necesario que la CMI sea alcanzable en los líquidos corporales para que sea efectivo (3) bacteria investigada. La selección de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de
sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus pyogenes.
1. Betalactámicos => todo el grupo tiene en común que presenta un anilla betalactámico y el mecanismo de acción consiste en inhibir la formación de peptidoglicano de la pared celular; son bactericidas. a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro. * Penicilina G sodica - la forma oral es P V * Amoxicilina - infección del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crónica, neumonías bacterianas y bronconeumonía, producidas por estreptococo, estafilococo sensible,neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria, gonorrea, aborto séptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infección de herida quirúrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli . * Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactámasas producida por algunas bacterias) b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4ª generación (semisintéticos; bacteriostáticas frente a cocos Gram+ y bacilos Gram-) * Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirúrgica; epiglotitis y meningitis por Haemophilus) * Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras de penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y estreptococo beta-hemolítico; son susceptibles Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis) 2. Derivados de betalactámicos: * Aztreonam - se utiliza comúnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli ), como p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus. 3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de acción es la inhibición de la síntesis de proteína en diferentes fases según el ATB; en general derivan de los hongos y son potentes bactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad renal y audio vestíbular en alta dosis o a las personas susceptible. * Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por gérmenes sensibles, como: Mycobacterium tuberculosis, Salmonellas, enterococos, estreptococos, neumococos y algunos Gram- como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones del tracto respiratorio) * Gentamicina (Actúa sobre bacterias Gram- aerobias, incluyendo enterobacteriáceas, Pseudomonas y Haemophilus. Actúa también sobre estafilococos (S.aureus y S.epidermidis) * Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumonía, bronconeumonía y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., E.coli y S.aureus)
* Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora anaeróbica intestinal) 4. Lincosamidas => inhibe la síntesis proteica * Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana es similar a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos; además es efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis. 5. ATB polipeptídicos y glucopeptídicos => su mecanismo de acción es inhibir la formación de peptido glicano de la pared celular ( bactericidas) a. Activos frente a Gram+ * Bacitracina - es utilizado para la identificación del estreptococo del grupo A a cual es sensible; es bactericida; se utiliza tópicamente para infecciones cutáneas (por su efecto de nefrotoxicidad) actúa sobre cocos y bacilos Gram+ ( Neisseria y Treponema pallidum) * Vancomicina - por su alta toxicidad renal y óptica, se reservan para infecciones de Gram+ resistentes; es bactericida; tiene acción ante cocos Gram+ y bacilos Gram+ b. Activos frente a Gram- => ambas (polimixinas) se usan tópicamente sobre Gram-, también se
usa como ATB de identificación; tienen acción ante entero-bacterias (exceptoProteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio, Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda elección (para bacilos Gram- resistentes a otros ATB) * Polimixina B * Polimixina E (Colistina) c. Activos frente a Mycobacterium tuberculosis
6. Otros * Fosfomicina - es un ATB de origen español de un amplio espectro que actúa sobre la pared celular (se usa en infección urinaria) * Acido fucsidico - actúa sobre la síntesis proteica y destaca su acción sobre Staphylococcus aureus. 7. Tetraciclinas - son bacteriostáticas y su mecanismo de acción es inhibir la síntesis de las proteínas; no se deben administrar a menores de 8 años por tener efecto secundarios sobre la dentición y los huesos; también pueden producir toxicidad sobre el tracto gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biológico o semi-sintético; activas frente a cocos y bacilos Gram+ y Gram- aerobios; son fármacos de elección en brucelosis, cólera, granuloma inguinal (ETS). * Tetraciclina * Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones pustulosas por Ricketsias y fiebre de las montañas rocosas por Ricketsias, infecciones del tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de infecciones causadas por Gram-: chancroidecausado por Haemophilus ducreyi , plaga debida a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), cólera causada por Vibrio cholerae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos causadas por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada por especies de Brucella (junto con estreptomicina), bartonelosiscausada por Bartonella bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium granulomatis. 8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la síntesis proteica y es toxica a nivel medular ; es de origen sintético, bacteriostático, actúa frente a Gram+ y - (especialmente Haemophilus influenzae y Salmonella) 9. Macrolidos y similares - inhiben la síntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando es alérgica a penicilina; son bacteriostáticos y bactericidas en alta dosis . a. Eritromicina (un buen ATB frente neumónia atípica, legionelosis, difteria, tos ferina) b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la bronquitis; neumonía; enfermedades de transmisión sexual (ETS); y las infecciones en los oídos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningún efecto sobre los resfriados, la gripe y otras infecciones virales. c. Claritomicina - interfiere la síntesis de proteínas en las bacterias sensibles; faringitis, amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudización de bronquitis crónica, neumonía bacteriana (adquirida en la
comunidad), infección de piel y tejidos blandos leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infección localizada o diseminada por Mycobacterium avium o M.intracellulare, infección localizada por M.chelonae, M. fortuitum y M.kansaii . Prevención de infección diseminada por M.avium complex en pacientes con VIH de alto riesgo 10. Quimioterápicos de síntesis a. Sulfamidas (es bacteriostático, de origen sintetico; inhibe la síntesis de acido fólico; activo frente Gram+ y -, Clamidias, Nocardia) b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la síntesis de acido fólico; elimina las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan las vías urinarias, los pulmones (neumonía), oídos e intestinos c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacioón del ADN bacteriano son buenos ATB de amplio espectro, pero se ha abusado mucho. d. Norfloxacina - infecciones de las vías urinarias y la próstata; inhibe la replicación del ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de antibióticos llamados fluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis. e. Ciprofloxacina - inhibe la replicación del ADN bacteriano; para tratar o prevenir determinadas infecciones bacterianas, también se usa para tratar o prevenir el ántrax (una infección grave que se puede propagar en forma intencional como parte de un ataque bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los gérmenes del ántrax suspendidos en el aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis. 11. Quimioterapia antituberculosa - actualmente se emplea: * Rifampicina - ATB sistémico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la síntesis de ARN bacteriano. Tuberculosis en todas sus formas (asociado a otros tuberculostáticos). Brucelosis.Erradicación de meningococos en portadores asintomáticos, no enfermos. Alérgicos o con contraindicaciones a otros antibióticos o quimioterápicos. Infecciones causadas porestafilococos ( S.aureus, S.epidermidis, cepas polirresistentes) y por enterococos ( S.faecalis, S.faecium). * Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina sólo las bacterias activas (en crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un período de incubación (sin crecimiento) durante largos períodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos para evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6 y 12 meses). * Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjunción con otros fármacos antituberculosos. 12. Quimioterapia antimicótica: * Nistatina * Miconazol * Amfotericina B. * Fluconazol 13. Quimioterapia anti-viral * Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicación de ADN viral, interfiriendo con el ADN polimerasa viral. * Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interferón, para tratar la hepatitis C en personas que no han sido tratadas con interferón antes. La ribavirina pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados análogos de nucleósidos. Esta actúa impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del cuerpo.
Términos utilizados en las pruebas anti-microbianas: - Microorganismo sensible o sensibilidad => es inhibido por un ATB a dosis habituales - Microorganismo de sensibilidad intermedia => el germen "in vitro" no es claramente sensible al ATB, pero si lo seria "in vivo" incrementando la dosis habitual sin llegar a dosis toxicas - Microorganismo resistente o resistencia => no es sensible al ATB a dosis habituales y es necesario administrar dosis toxicas - CMI (cantidad mínima inhibitoria) => es la menor concentración de un ATB capaz de inhibir el crecimiento bacteriano de una cepa dada - CMB (cantidad mínima bactericida) => es la menor concentración de un ATB con la que no quedan bacterias vivas de una cepa dada Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram- => Cefuroxima, Cefotaxima, Colistina, Tobramicina, ; frente a Gram+ => Eritromicina, Tetraciclina, Vancomicina, Meticilina, Clindamicina, Doxicilina; frente a ambos Gram+ y - => Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Cotrimoxazol, Cloranfenicol, Imipenem, Amoxicilina+acido clavulonico.
Clasificación de los antibióticos según su efecto bacteriano Bactericidas => Penicilinas, Cefalosporinas, Aminoglucósidos, Rifampicina, Quinolonas, Monobactá micos, Polimixinas. Bacteriostáticos => Tetraciclinas, Eritromicina, Sulfonamida, Novobiocina, Cloranfenicol Clasificación de los antibióticos según su mecanismo de acción sobre la estructura bacteriana I. Inhibición de la síntesis de la pared celular
Penicilinas Cefalosporinas Vancomicina Fosfomicina Tercoplanina Bacitracina
II. Lesión en la permeabilidad de la membrana celular
Poliomixinas Colistinas
Nistatina Anfotericín B
III. Inhibición de la síntesis proteica
Cloranfenicol Tetraciclina Aminoglucósidos Lincomicinas Eritromicina
IV. Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
Quinolonas Sulfonamidas Rifampicina Trimetropín
Nota: (*) Penicilina semisintética resistente penicilinasa
Estudio de la orina Función del riñón: - La eliminación de nuestro organismo de una importante cantidad de residuos metabólicos, muchos de ellos inútiles, y de otros que incluso pueden comportarse como tóxicos. - La regulación de la composición de los fluidos de nuestro organismo facilitando así, tanto la supervivencia de las células como el optimo desarrollo de todos los procesos metabólicos. - El control hormonal de la presión arterial (adrenalina, noradrenalina) - El control de los niveles orgánicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25 dihidroxicolecalciferol) - El control de la eritropoyesis (eritropoyetina)
Nefronas - son unidades funcionales básicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular. El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia); se filtra agua, urea, creatinina, aminoácidos, ácido úrico, glucosa, proteínas de bajo pm. La red tubular - el filtrado por el glomerulo es recogido en la capsula de Bowman y se dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorción selectiva => reabsorber agua, ciertos elementos útiles para el organismo y que deben ser recuperadas (glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio, bicarbonato, urea, aminoácidos, proteina) y permite la secreción de otras que, por su toxicidad, deben ser posteriormente eliminadas mediante la micción (amonio, urea, hidrogeniones/H+); se elimina 1 ml de orina por minuto (1500 ml diarios); la red tubular esta formada por => túbulo contorneado proximal, asa de Henle, túbulo contorneado distal y túbulo colector. Mecanismo de la función renal: - Filtración glomerular => filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la capsula d e Bowman. - Reabsorción tubular => el producto de la filtración glomerular se modifica su composicion al atravesar la red tubular. - Secreción tubular => transporte de sustancias, desde la red capilar hacia los túbulos renales; destaca la secreción activa de iones H+, que permite la regulación del equilibrio acido-base en el organismo. Procedimiento de la recogida de muestra (el personal facultativo determina el tipo de muestra necesaria para el análisis) => informar a la persona del objeto del análisis; indicar el tipo de muestra deseada; orientar acerca de la técnica de obtención de la misma; indicar las pautas de almacenaje y transporte adecuado (si se toma fuera del laboratorio); insistir en la importancia de la limpieza en general y de la higiene antes de la recogida (evitar la contaminación involuntaria); describir el tipo y características mas adecuadas delrecipiente a utilizar; tener en cuenta la capacidad del paciente para evacuar la vejiga de forma voluntaria y la necesidad de utilizar técnicas invasivas para obtener la orina en condiciones adecuadas. Recogida de muestras de orina - Micción espontanea => paciente responsable de la misma para obtener muestra sin contaminación; prevención: eliminar la primera porción de la micción y asegurar el lavado minucioso previo de los genitales; indicaciones: análisis fisico-químico, estudio del sedimento, concentración de creatina y microbiologia (en ocasiones). - Cateterismo vesical/ sondaje (realizada por personal enfermería) => pacientes que presentan dificultades de la micción, mujeres para evitar la contaminación vaginal. - Punción supra-púbica (realizada por personal facultativo) => diagnostico de infección por microorganismos extraños en niños. Tipos de muestras para un análisis de orina (sin supervisión - micción espontanea): - Primera orina de la mañana => se recomienda porque la concentración de solutos es variable a lo largo del día y esta en relación con la ingesta de liquidos. - Orina tomada al azar => muestra valida para cultivos microbiologicos - Orina minutada (fraccionada, de 2 horas, de 24 horas) => gran utilidad para el paciente diabeticos
Análisis de orina - procedimiento técnico encaminado a examinar los componentes que la integran, su cantidad y la proporción en que se encuentran; su estudio proporciona gran información acerca de múltiples alteraciones orgánicas y de muy diversa etiología (riñon, procesos metabólicos) => permite detectar alteraciones patológicas, estados fisiológicos particulares no patológicos (embarazo) y un buen funcionamiento renal. Objetivos: - obtener información del estado general del riñon y las lesiones que pudieran afectarlo - detectar la existencia de una alteración a nivel de las vías urinarias - teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan vía urinaria, detectar alteraciones funcionales de otros órganos - detectar las alteraciones metabólicas de diversa etiologia - se intenta encontrar sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la orina - detectar alguna alteración en la concentración (por defecto o por exceso) de componentes que habitualmente se encuentran en la orina Tipos de análisis de orina => análisis elemental, completo, rutinario, anormales y sedimento. Parámetro bioquímico => Densidad - Bilirrubina - Cuerpos cetónicos - Proteínas - Urobilinogeno Glucosa - Hemoglobina - Nitritos - pH - Hematíes - Leucocitos (actualmente se utiliza determinación por química seca / tiras reactivas). Análisis general de una muestra de orina: - Físico/macroscópico => cantidad, aspecto/turbidez, color, olor, densidad, pH - Químico/anormales => proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, sangre/hemoglobina, bilirrubina/ pigmentos biliares, urobilinógeno/ urobilina, nitritos - Microscópico => estudio de estructuras cristalinas/cristales y de formas amorfas en suspensión, estudio citológico, estudio bacteriológico. - Microbiológico => urinocultivo, identificación del germen (pruebas bioquímicas), ATB (antibiograma). - Parasitológico => técnicas especificas de visualización macroscópica de parásitos; estudio microscópico de parásitos en la muestra de orina: parásitos enteros o parte de ellos, huevos, formas de resistencia (quistes). El orden cronológico de un análisis general=> características físicas macroscópica sedimentación (a 1500 rpm durante 10-15 minutos) - pruebas bioquímicas (tiras reactivas); la muestra sobrante se debe guardar hasta que la analítica haya concluido; hay que revisar los resultados del sedimento concuerdan con las pruebas químicas y comprobar las anomalías detectadas han sido confirmadas. Examen físico - macroscópico Es orientativo => para diagnosticar una patología, hay que confirmar con otros análisis complementarios; hay que tener en cuenta situaciones fisiológicas (menstruación, grado de hidratación, etc.) que pueden alterar las características de la muestra; 1)- Cantidad / diuresis normal 1200-2000 ml/24H; alteración => oliguria/inferior, poliuria/superior, anuria/falta de eliminación (<300 ml/24H)
2)- Aspecto / turbidez; recién emitida: clara y transparente; almacenada: sedimento blanco/fosfatos y carbonatos, sedimento rojizo (uratos desaparecer al calentar la orina a 60ºC); 3)- Color amarillo / ámbar (en función de la concentración) 4)- Olor aromático, ligeramente amoniacal 5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante tiras reactivas); 6)- pH normal 5,5-6 (ligeramente ácida); pH alcalino => posible contenido de gérmenes con ureasa. Pruebas bioquímicas cuantitativas Proteínas - en condiciones normales las proteínas se encuentran 130-150 mg/día en función del volumen de orina eliminado; en recién nacidos 2-8 mg/100 ml;cantidad de proteína (con peso molecular menor)=> (a) albumina 1/3 del total (fisiológica); (b) globulinas; (c) proteína de TammHorsfall (T-H) es muco-proteína viscosa que no se encuentra en el plasma - se forma en el tubulo contorneado distal, constituye la matriz de los cilindros; (d) transferrina; (e) IgA. Proteinuria => eliminación de proteina en orina superando los VN - intensa (>4 g/día) indica un daño renal grave; se dan en síndrome nefrótico, glomerulonefritis (aguda y crónica), congestión venosa renal; - moderada (de 0,5 - 4g/día) indica un daño renal menos graves; se dan en pielonefritis con hipertensión, nefropatía diabética, mieloma multiple. - leve (<0,5 g/día) se dan en riñones poliquísticos, lesiones renales incipientes. - de patrón glomerular => pierde su selectividad en la filtración. - de patrón tubular => cuando hay lesión tubular - de forma intermitente o transitoria => puede ser fisiológica (hay que comprobarlo) - de forma persistente => suele cursar con hematuria y su pronostico es peor. Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido); normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de la concentración de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la glucemia por encima de umbral renal (2) alteración renal (tubulopatía) Cuerpos cetónicos (compuesto por acido acetilacetico/diacetico, acido beta-hidroxibutirico, acetona) - en personas sanas, los CC se sintetizan en el hígado y se metabolizan por completo, de forma que en la orina aparecen en concentraciones mínimas (indetectables); cetonuria=> aparición de cuerpos cetónicos detectables en orina; la presencia de cetonuria y el aumento de cetonemia implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativo de los ácidos grasos; las causas de cetonuria: - sobrecarga de lipidos en la dieta - diabetes mellitus (coma diabetico) - vómitos (en niños y embarazadas) - bajo consumo de hidratos de carbono o alteración en su metabolismo - ayuno prolongado Hemoglobina - no aparece en orinas normales; hemoglobinuria => presencia de Hb en orina (si la cantidad es alta, se puede ver a simple vista); causas => enfermedad renal de vías altas, anemias hemolíticas, reacciones transfusionales, infecciones (malaria, paludismo) Pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) - se forman en bazo, higado y MO por degradación fisiológica de Hb; 2 tipos => BB-Albumina / indirecta y BB-Glucurónico
/directa; aparece BB en orina, siempre que aumente la BB directa en sangre por causas => enfe rmedad obstructiva (ictericia obstructiva/ acumulación en sangre), lesiones hepáticas(hepatitis, hepatotoxicidad). Urobilinógeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por acción de la flora bacteriana se transforma en urobilinógeno o estercobilinógeno (se elimina en mayoría con las heces y la orina en menor concentración); la cantidad de urobilinógeno aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolíticas; la determinación de urobilinógeno debe realizarse rápidamente en orina, ya que se transforma en urobilina + O2(falso negativo). Nitritos - su aparición en la orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria), de germenes capaces de reducir los nitratos ingeridos con la dieta, hasta nitritos (entero-bacterias); un resultado negativo de la prueba de los nitritos, no indica ausencia de microorganismos, ya que puede haber bacterias que no son productores de nitritos o ausencia de nitratos ingeridos en la dieta. Examen microscópico de orina - sedimento urinario - estudio de elementos o estructuras de origen y composicion variados que aparecen suspendidos en la orina que proporciona ayuda para el diagnostico y evolución de las enfermedades renales; la muestra debe examinarse antes de transcurridas 3-4 horas desde su recogida (algunas estructuras como celulas y cilindros se lisan fácilmente; obtención del sedimento: homogeneizar bien la muestra, verter 10 ml en un tubo de centrifuga (fondo cónico), centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos; decantar el sobrenadante (quedando solo 1 ml), re-suspender el sedimento residual, montar un fresco (una gota entre porta y cubreobjetos, evitando la formación de burbujas), observar al microscopio a 40x, intensidad lumínica media y condensador a media altura; también se puede observar a 10x en el perímetro de cubre si hay los cilindros hialinos. Estructuras organizadas - Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran numeroindica infección, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-2/campo o como una contaminación menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de oxalato cálcico monohidratado; con tinción Gram se diferenciar => los hematíes son teñidos de rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir entre macro-hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y micro-hematuria (únicamente se detecta al microscopio), también si el color rojo observado macroscópicamente procede de hematíes o Hb (al centrifugar el sedimento, el color rojizo de Hb permanece).
- Leucocitos (neutrófilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de ellos se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de 1-2/campo (varón) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria (>5 leucocitos/campo indica => infección renal en cualquier nivel);
- Espermatozoides: formados por 2 partes cabeza y cola; frecuente en un sedimento del varón (eyaculaciones recientes, poluciones nocturnas, etc.), y en mujer después de haber mantenido relaciones sexuales. - Bacterias: la composicion de orina es un excelente medio de cultivo para los microorganismos; la mayoría de ocasiones son fruto de una contaminación de la flora saprofita alojada en zonas próximas al meato urinario => anal, perineal, vaginal (sobre todo en mujeres); su presencia en el sedimento, no debe ser tenida en cuenta salvo que vaya acompañada de piuria (aumento de leucocitos). - Levaduras: su presencia en la gran mayoría debido por una contaminación, salvo acompañada de una piuria; en personas diabéticas, debido a la glucosuria, parecen facilitar el crecimiento micótico; su identificación es sencilla, por su forma ovoidea, frecuentemente con presencia de celulas en gemación; su tamaño es ligeramente mayor que los hematíes (pueden confundirse); su aumento en la orina se trata de vaginitis causada por Candida albicans. - Parásitos: (1) Protozoos: normalmente se trata de Trichomonas vaginalis (frecuente en sedimentos de mujeres con vaginitis que puede ser asintomático y mas raro en los de hombres); aspecto piriforme de mayor tamaño que los leucocitos y una gran motilidad (por sus flagelos); su identificación es mas complicada cuando la motilidad esta mermada (al ser de un tamaño semejante al de los leucocitos); la piuria que le acompaña puede hacer pensar (erróneamente) en una infección bacteriana y se descarta esta posibilidad al obtener urocultivos negativos; (2) otros parásitos: su aparición es siempre el resultado de una contaminación de la muestra de orina con materia fecal;
Celulas epiteliales: el árbol urinario esta revestido por 3 tipos de epitelio => (1)columnar /tubular /renales /cuboideo (capsula de Bowman, túbulos distal, proximal y colector) (2) transicional o urotelio (pelvis renal, uréteres, vejiga y uretra) y (3) escamoso (uretra y vejiga); una escasa descamación es normal, pero se puede aumentar por causas => microorganismos, productos químicos, cuerpos extraños, procesos degenerativos, procesos invasivos-destructivos. - Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamaño 1/3 mayores que los leucocitos; su forma normal es redonda con núcleo grande y céntrico; un sedimento normal 0-1/campo; aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.
- Celulas de transición (segunda capa de vejiga): el epitelio transicional espluriestratificado (3 capas => basal, intermedia y superficial); las celulas son de tamaño 2-4 veces mayor que leucocitos; su forma es redondeada, piriforme o raqueta con un núcleo pequeño; un sedimento normal 0-2/campo; su aumento exige un estudio citológico mas completo (p.ej. tinción de Papanicolau), por posibilidad de un carcinoma en cualquier punto entre la pelvis renal y la vejiga.
- Celulas del epitelio escamoso: son planas y tienen abundante citoplasma con nucleo centrico y pequeño; a veces sus bordes aparecen doblados, replegados; un sedimento normal 0-1/campo.
Cilindros: se forma en túbulos colectores y distales; es un resultado de la consolidación de las proteínas en los túbulos de las nefronas; es normal encontrarse algunos (sobre todo hialinos) en el sedimento; se desintegra en la orina a pH alcalino y en presencia de bacterias (con ureasa); la matriz de todos ellos es una muco-proteína (Tamm-Horsfall) segregada en la orina; causantes de su formación => (1) disminución del pH de la orina, (2) aumento de la densidad o concentración de solutos, (3) un grado de estancamiento de la orina (disminución del filtrado glomerular); el lugar de la nefrona en que se forman, determina su tamaño y forma => cilindros estrechos (contorneados) proceden de los túbulos distales y cilindros anchos se originan en los túbulos colectores. - Cilindros hialinos: se pueden encontrar en grandes cantidades en orinas normales (deshidratación y estrés físico) y también en nefropatías; su aparición en el sedimento no tiene significación clínica (1-2/campo); para visualizar su escasa refringencia, hay que evitar un exceso de iluminación; normalmente sus contornos se aprecian con suficiente nitidez y uno de sus extremos es romo (un dedo de guante); existe también cilindros granulo-hialinos, muy semejante a los hialinos, pero con algunas incrustaciones en su estructura (sin significación clínica);
- Cilindros granulosos: predomina la estructura granular y desaparece el aspecto hialino; 2 tipos => cilindros granulosos finos (semejante a los hialinos en tamaño y forma; tienen mayor refringencia debido a la masiva pequeños gránulos de inclusión) y cilindros granulososgruesos (estructura totalmente diferente a los hialinos; son de mayor tamaño, aspecto rígido y mayor refringencia; sus borden son contrastados y angulados; en orinanormal 01/campo; el aumento de su presencia indica una nefropatía.
- Cilindros celulares: la presencia de ellos en la orina nunca es normal; tipos: (1) Epiteliales - la matriz del cilindro engloba celulas epiteliales que se han desprendido de la luz tubular; gran variedad de nefropatías, lesiones del epitelio tubular (debidas adiversos tóxicos industriales, medicamentos y virus) puede causar la formación de este cilindros. (2) Hemáticos (eritrocitarios) - aparecen en sedimentos con hematuria; es un signo de lesión a nivel del parénquima renal (vasculares o pielonefritis); la cantidad de estos cilindros suele ser escasa y dificulta su localización. (3) Leucocitarios - fácil de reconocer porque los leucocitos presentes en su matriz se conservan estables durante el trayecto por los túbulos; su presencia normalmente acompañada por piuria intensa e indica infección localizada en el parénquima renal(pielonefritis) o lesiones de tipo inflamatorio (glomerulonefritis aguda). (4) Bacterianos - se parecen a los granulosos toscos; generalmente unidos a piuria y muy probablemente se trate de una pielonefritis.
- Cilindros grasos: cilindros granulosos o celulares con pequeñas inclusiones lipídico (gotitas de grasa); muy refringentes y tonalidad amarillenta donde se localizan dichas inclusiones; indica una nefropatía todavía no manifestada.
- Cilindros céreos: son muy refringentes, rígidos, de apariencia dura, superficie rugosa y brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran tamaño; su presencia es un síntoma claro de una alteración renal importante; suelen estar inmersos en una cilindruria (presencia de la mayoría de los diversos tipos de cilindros).
Estructuras no organizadas Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas cristalinas según la condiciones físico-químicas de la orina (la pH sobretodo, densidad, temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos: (1) Cristales endogénos normales - no corresponden a alteraciones metabólicas ni funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recién emitidas. (2) Cristales endogénos patológicos - reflejan trastornos metabólicos o afectación grave de algún órgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina. (3) Cristales exógenos - aparecen en la orina tras la introducción en el organismo (vía enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiológicos/ contraste radiopaco vía endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)
- Cristales de acido úrico: en orinas ácidas; son birrefringentes; de formas variadas (p.ej. agujas); color entre marrón rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica una situación patológica o concentraciones elevadas de acido úrico; un sedimento normal 0-2/campo.
- Cristales de oxalato cálcico mono-hidrato y di hidratado: en orinas ácidas y ligeramente neutras; menos frecuente; de forma prismas incoloros -casi nunca aislados-unidos por un punto intermedio (pesas de gimnasia), la mas frecuente es de forma sobre; también los hay de forma redondeados, finamente estriados, incoloros y con una depresión central (radios de bicicleta); un sedimento normal 0-2/campo.
- Uratos amorfos: en orinas ácidas; se presentan como un precipitado amorfo, coloreado debido a la presencia de pigmentos urinarios de color amarillo-naranja (color ladrillo); no tiene mucha importancia clínica.
- Cistina: en orinas ácidas; tiene significación clínica por si solos => aparecen comoconsecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de placas hexagonales, regulares finas y transparentes; es imprescindible una vez observados en el sedimento, confirmar la concentración de cistina en la orina.
- Leucina y tirosina: en orinas ácidas; raramente se observan; son productos finales del metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en situaciones clínicas graves=> destrucción o necrosis tisular importante, fundamentalmente de tejido hepático (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina forman manojos de agujas finas y los de leucina son como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas, de aspecto oleoso o graso y muy refringentes; ambas son de color amarillo o marrón.
- Cristales de bilirrubina: en orinas ácidas; de pacientes con bilirrubinemia (bilirrubina alta en sangre); de forma agujas con color marrón-rojizo (flecha verde).
- Uratos amoniacos: en orinas muy alcalinas; de color amarillo/marrón muy intensa; predomina la forma esférica de distinto tamaño; no tienen mucha importancia clínica, peropueden estar asociados a infecciones del tracto urinario, por bacterias con ureasa+.
- Carbonato cálcico: en orinas alcalinas o neutras; no es frecuente y no tiene mucha importancia clínica (procedencia de ingesta vegetales); de forma amorfo o granular, en ocasiones como pequeños lazos y raramente como pequeñas esferas incoloras;
- Fosfato cálcico (hipurato cálcico): en orina alcalina o neutra; no es frecuente; de forma prismas largos y afilados (agujas), en ocasiones se agrupan formando rosetas o estrellas, también como placas granulares, amorfas e incoloras (similares a acido úrico); no tiene mucha importancia clínica, pero puede ser ligada a hipertrofia de próstata o algunas infecciones urinarias crónicas; cálculos urinarios contienen fosfato cálcico.
- Fosfato triple (amónico-magnesico-cálcico): frecuente en orinas alcalinas o neutras; de forma tapa de ataúd, aunque también puede verse como octaedros (muy variable); no tiene mucha importancia clínica.
- Cristales de creatina: raramente encontrados en orinas de adultas, pero es frecuente en orinas de niños y niñas antes de la pubertad; es un metabolito de la degradación endógena del tejido muscular (su aumento => distrofias musculares, poliomielitis, etc.); de forma pseudohexagonal característica. - Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color blanquecino.
Informe del sedimento urinario 1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad y características patológicas) 2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos. 3. debe proporcionar una visión del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido en todos los campos observados. 4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante) 5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citológico, segundo el de químico y por ultimo el de microbiológico. Examen citológico: - celulas hematológicas => se redactan con números y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C = no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acúmulos. - celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las de transición; las celulas escamosas (de las vías bajas), se informan cuando son abundantes. - cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el informe el tipo de cilindro. Examen químico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el informe): - cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis". - compuestos amorfos => se redactan con adjetivos Examen microbiológico: - bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su movilidad - levaduras => se informa con adjetivos. Examen microbiológico de una muestra de orina - en condiciones normales carecen totalmente de flora bacteriana; la infección del tracto urinario es frecuente y la mayoría de m.o. patógenos proceden de la flora intestina => Bacilos Gram- (E.coli, Proteus spp, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae); Cocos Gram+ (Streptococcus grupo D y Staphylococcus); Levaduras (Candida spp.); la toma de muestra debe ser obtenida en condiciones asépticas en un recipiente estéril, evitando en todo momento la contaminación; el paciente debe ser instruido de la forma mas adecuada. Análisis de microbiológico (urinocultivo) 1. Preparación de un "inoculo" 2. Sembrar en medio Cled (la ausencia de electrolitos, impide la invasión por proteus); McConkey (un medio selectivo y diferencia para m.o. Gram-); agar Cetrimide (eficaz para la búsqueda de pseudomonas) 3. Incubar a la temperatura optima de crecimiento de los m.o. buscados (generalmente a 37ºC) 4. Realizar el recuento tras la incubación (presumible-mente han crecido los causantes de la infección) => menos de 10.000 mo/ml de orina es negativo; mas de 100.000 mo/ml hay infección urinaria; entre 10.000 y 100.000 mo/ml el diagnostico es incierto; puede haberse infección no detectada por causas => un tratamiento ATB instaurado, una obstrucción a nivel de las vías renales o la muestra recogida por una punción supra-púbica (sin pasar por la uretra, donde esta la infección). 5. Una vez determinada la infección, hay que resembrar en medios selectivos, para proceder la identificación (tipación) del germen causal de la misma.
Tema 18 - Cocos aerobios y anaerobios facultativos (patología e identificación) Gram+ => Micrococaceae ( Staphylococcus - Micrococcus - Stomatococcus Planococus); Streptocococeae ( Streptococcus - Pediococcus - Gemella Aerococcus); Peptococaceae Gram- => Neisseriaceae ( Neisseria - Branhamella - Moraxella) Staphylococcus => cocos Gram+ inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamaño +/- 1 um; en forma de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas azucares ( via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios con alto contenido de NaCl (halófilo); resistentes a agentes externos, distribuidas ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la intoxicaciones alimentarias, heridas, etc. Especies importantes (existe >25 especies y varios sub-especies/ cepas) (1) S. aureus (saprofito de >40% de fosas nasales y 10% de vaginas) => estafilococo dorado (pigmento amarillo); coagulasa+; fermenta el manitol; sensible a la novobiacina. - 30 Ags (propiedades antifagocitarias y producen estructuras piógenas/ características en las lesiones: polisacárido A es el mas importantes - inducen la formacion de Acs; proteína A - un potente agente antigénico) => se subdividen en tipos según sus caracteres antigénicos; - Produce toxinas (hemolisinas - lisan eritrocitos y leucocitos; t.exfoliativa/ exotoxina - causa eritemas en la piel; leucopidinas - destruyen pmn y macrófagos; enterotoxina - anula la acción del jugo gástrico y actúa en el centro del vomito, nauseas y diarreas); - Fermentos/enzimas (coagulasas - activa la protrombina; fibrinolisinas o estafiloquinasasactivador del plasminógeno; penicilinasas o beta-lactamasa - romper el anillo b-lactamico de las penicilinas creando resistencia); - Hemolisinas alfa - provoca hemólisis beta en AS; hemolisina beta - provoca hemólisis alfa en
AS; - Enterotoxinas tipo A, B (causan intoxicaciones alimentaria) y D causa enterocolitis; La acción patogena directa => procesos inflamatorios, forunculos, supurativos y de necrosación (en heridas y quemaduras); indirecta => afecta al tubo digestivo por la entero-toxina
(gastroenteritis con nauseas, vómitos y diarreas, duración 1-2 días, se trata con sueros orales o antidiarreicos); la bacteria no llega al intestino (solo su toxina), por eso no se encuentra en las heces; crece muy bien con la temperatura veraniega y en las cremas; infección generalizada (septicemia) => formación de coágulos o trombos intravenosos, artritis, pleuritis, endocarditis, osteomielitis o meningitis en los debilitados (periodo de incubación 1-6 horas).
(2) S.epidermidis y (3) S.saprophyticus son estafilococos oportunistas; distribuidas en el medio
ambiente, la piel y mucosas; son patógenas en debilidad; S.saprophyticus puede tener pigmento dorado y puede fermentar Manitol; S.epidermidis sensible a la novobiocina (lo que le diferencia a S.saprophyticus).
Aislamiento de los estafilococos: - Muestra procede de las heces => medios selectivos Chapman, ricos en NaCl(carácter halófilo), contiene manitol (diferencia S. aureus del resto de Staphylococcus); Otros tipos de muestras => medio AS (observar características de las colonias - color, hemólisis, etc). Pruebas bioquímicas: - Los estafilococos degradan muchas azucares (glucosa, sacarosa, fructosa, manosa, etc.); produce gelatinasa+, catalasa+, nitratasa+, crecen muy bien a 37ºC, hemolisina alfa y beta, coagulasa+ (S.aureus). Diagnóstico bacteriológico: - Toma muestra con torunda estéril o por punción según los casos en total asepsia; tinción Gram; aislamiento en medio Chapman/manitol salado y AS, tras la incubación observar las colonias; pruebas bioquímicas - coagulasa (S.aureus), fermentación de glucosa, catalasa, gelatinasa, hemolisinas alfa y beta (cepas patógenas), fibrinolisinas, fermentación del manitol (S.aureus); estudio de la sensibilidad a la novobiocina(diferenciar S.epidermidis de S.saprophyticus) - Diferenciacion del genero Staphylococcus y Micrococcus (en principio no es patogeno) => Staphylococcus sensible a bacitracina y eritromicina; Micrococcus a veces pueden daroxidasa+. - Estafilococos coagulasa- es un grupo heterogéneo (+ importante son S.epidermidis y S.saprophyticus) 80% en el pasado no causan infecciones importantes, pero cada vez esta tomando mas importancia; ademas muestra resistencia a varios ATB alternativa de penicilina (meticilina y cloxacilina); pueden producir infecciones urinarias, bacteriemias (por la implantación de cateteres i.v.) y endocarditis.
Streptococcus => cocos Gram+, tamaño pequeño, capsulados, anaerobios facultativos, se agrupan en cadenas, fermentador de glucosa, son saprofitos, oportunistas y algunos patógenos; poseen Ags ( polisacárido C - según sus características, se clasifican engrupos A-V de Lancefield; proteína M antifagocitarias, la posee el grupo A ) Clasificacion A. según el tipo de hemolisis (capacidad de romper hematíes - produce hemólisis alrededor de sus colonias en AS) => gamma hemolítico, alfa hemolíticos/ hemólisis parcial (decoloración parda verdosa - S.viridans); beta hemolíticos/ hemólisis total (halos de transparencia grandes entorno a su colonia) grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolíticos - grupo D, S.viridansy S.pneumoniae (alfa y gamma) B. según sus caracteres bioquímicos (sensibilidad a bacitracina, optoquina, tolerancia a NaCl, degradación de bilis esculina y factor CAMP): - Sensible a bacitracina (grupo A ) - Crecimiento en NaCl 6,5% (grupo D enterococos) - Factor CAMP => potenciar la acción hemolítica de S.aureus (lo produce grupo B) - Pruebas de bilis esculina - hidrolisan este compuesto (grupo D enterococos) - Sensible a optoquina (S.pneumoniae /neumococo) - Hidrólisis de hipurato sódico (grupo B) C. según los caracteres antigénicos (a traves de reacciones serologícas especificas => aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia, etc.) => los Ags en la pared celular (péptido glicano - toxica y facilita la unión de ellos a las células epiteliales invadidas; polisacárido C distintas características que confiere la agrupación de los estreptococos (grupos de Lancefield); - Grupo A (la + importantes) => la mayoría son Beta-hemolíticos y patogenos al hombre; proteína M se presenta como pelos en el perímetro de la pared celular (anti-fagocitarías). - En las capsulas del grupos A y C se encuentra enzima hialuronidasa(características antifagocitarías) Acción patógena e Interés clínico: (1) Streptococcus del grupo A ( S.pyogenes ) => causan 90% de las infecciones estreptocócicas; muy sensibles a los agentes externos; son floras de la mucosa nasal y faríngea; poseen polisacárido C (proporciona la especificidad de grupo) y proteína M (facilita la adherencia a las células invadidas y protección a la fagocitosis); son Beta-hemolíticas, sensibles a la bacitracina y variable a optoquina - Poseen hemolisinas estreptocócicas/ estreptolisinas (O y S); estreptolisina S(poco antigénico) => holoproteína toxica responsable de hemólisis en medio AS;estreptolisina O (muy antigénico) => hetero-proteína exotóxica muy activa de efecto hemolítico frente a glóbulos rojos y leucocitos (pmn y macrófagos => alterando la estructura celular); induce a la formación de Acs ASLO. - Produce toxina eritrogénica responsable del exantema de la fiebre escarlatina; - Enzimas estreptoquinasas (activador de plasminógeno => plasmina en fibrinolisis); induce a la formación Acs; se utiliza en el hospital en procesos trombo-génicos. - Enzima desoxirribonucleasa estreptocócica (despolimeriza ADN); son antigénicas y se distingue en 4 grupos (A-B-C-D). - Enzima Hialuronidasa (hidroliza el acido hialurónico del tejido conjuntivo); facilita su invasión.
- Proteinasa estreptocócica (origina procesos inflamatorios y necrosación) Patogenicidad de S.pyogenes (grupo A) => Infecciones en la piel o mucosas (+frecuentes anginas/faringitis sobre todo a niños/contacto directo, otitis y sinusitis) 95% de infecciones nasofaringeas son producidas por estreptococos del grupo A; infecciones NO supuradas/ inmunológica => fiebres reumáticas (complicaciones de tto no adecuados), glomerulonefritis, endocarditis, meningitis, sepsis.
(2) Streptococcus del grupo B ( S.agalactiae ) => saprofito del hombre en rino-faringe, urogenital, vaginal e intestinal; produce infecciones oportunistas; hipurato+(degrada el hipurato sódico) es lo que le diferencia del grupo A; posee factor CAMP (potenciar la acción hemolítica de S.aureus); puede origina meningitis e infecciones pulmonares en el neonato, infecciones del tracto respiratorio, mucosas, piel, etc; son Beta-hemoliticos, resistente a la bacitracina;
(3) Streptococcus del grupo C => es el mas proximo al grupo A; sonBeta hemolíticos (también alfa y gamma) y muy sensible a los agentes externos; resistente a la bacitracina; crecen en medios salinos (NaCl 6,5%); posee enzima hialuronidasa; saprofito del hombre en la rinofaringe; puede producir mastitis en vacas, muermo en caballos y sepsis ??? en el hombre. (4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolíticos; resistentes a agentes externos y ATB; - los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina; son alfa-betagamma hemolíticos; resistente a la bacitracina; puede producir infección urinaria e herida. - los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y caballos);hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina; (5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e intestino en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a la bacitracina; son alfa y beta-hemolíticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%) (6) Streptococcus Alfa hemoliticos ( S.viridans ) => no son capsulados; producen alfa y gamma hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries); resistente a la optoquina;
(7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos, Gram+ y son capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y gamma hemolíticos;sensibles a optoquina; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%); saprofito en aparato respiratorio; puede producir neumonias, inflamaciones sinusitis, otitis y meningitis (mas frecuente en adultos);
Aislamiento: - toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estéril, una muestra del pus (si hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos); - un frotis para la tinción de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza una tinción negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula); se produce una reacción de Quellung cuando un Acs tipo específico se une al polisacárido capsular del neumococo y causa un cambio en el índice refractivo de la cápsula haciéndola aparecer “hinchada” y más vi sible. - la siembra en AS-CNA (posibles hemólisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que inhibe el crecimiento de otros gérmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis o sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeños; medios selectivo y diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D. Pruebas bioquímicas: - pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina; hidrolisis de hipurato (positivo en el grupo B), utilización de bilis esculina. - identificar los grupos antigénicos según el tipo de sustancia polisacárido C (clasificación de Lancefield) por metodo serológicos => prueba de látex (romper la capsula para sacar la sustancia; reacción inmuno-complejo Ag-Ac). - los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+, catalasa- que no son estreptococos ( Pediococcus es resistente a la vancomicina). Pruebas serologícas / inmunologicas: - la búsqueda en el suero (dilución seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas de estreptococos (sobre todo grupo A ) => títulos de Acs antiestreptolisinas O ( ASLO); para saber si la infección es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumáticas con títulos de ASLO negativos, se determinan los títulos de Acs antiestreptoquinasas ( ASK ), antihialuronidasas( ASH); pruebas de hinchamiento capsular con suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para determinar S.pneumonia => se añaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinación es signo de que esta estreptococo. Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de café), aerobios; son saprofitos de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los animales;citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a medios externos. Especies mas importantes - 4 géneros => Neisseria, Branhamella (B.catharralis), Acinetobacter y Moraxella. (1) Neisseria meningitidis (meningococo) => es una especie patógena para el hombre; son parásitos obligados del hombre (no se encuentran libre en la naturaleza); es difícil de cultivar si hay competición (acompañadas por otros gérmenes); son capsulados; utiliza glucosa y maltosa; posee fimbrias (facilita su adherencia) y capsulas (contiene polisacáridos con comportamientos serológicos diferentes A,B,C, etc.); crecen a 35-37ºC; son muy sensibles a medios
externos; producen meningitis epidémico (contagio por gotas de flugge en contacto íntimos); otros causantes de meningitis => Haemophyllus influenzae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Pseudomona aeroginosa, Micobacteria, Neisseria meningitidis, Cryptococcus neoformans y otros. (2) Neisseria gonorrhoeae (gonococo) => idénticas características que meningococo; utiliza glucosa como fuente de carbono; requieren medios enriquecidos con CO2 5-10% para potenciar su crecimiento a 35-37ºC; son muy sensibles a medios externos y son parásitos estrictos del hombre y produce gonorrea (no se encuentra libre en la naturaleza); (3) Neisseria saprofitas => saprofitos de la rino-faringe y genitales; son poco exigentes y crecen a 22-35ºC en medios generales; resistentes a medios externos y no son patógenos para el hombre. Acción patógena e interés clínico Neisseria meningitidis (meningococo) => diplococos /granos de café; coloniza las mucosas y vías respiratorias (sobre todo superiores); 5-30% son portadores sanos en rino-faríngeo; afectan a niños de 6 meses hasta 5 años (causas mas importantes de mortalidad infantil); también afectan niños mayores y adultos jóvenes de 6 hasta 25 años;estructura antigénica => componentes de su capsula (polisacárido), las fimbrias (facilitar la adherencia y la invasión) y proteínas de la membrana (toxica sobre las celulas invadidas); Cuadro clínico - comienza con una rino-faringitis de sintomatología leve (sobre todo en niños - en adultos se forman Acs anti meningococo) evoluciona a forma severa, se complica con bronquitis; si el meningococo pasa a la sangre, originara micro-focos en la piel conerupciones petequiales (1-2mm) en el tronco e extremidades inferiores, cefaleas, fiebres altas, artralgias; puede pasar a LCR con fiebres muy altas, cefaleas fuertes, rigidez de nuca, vómitos, diarreas, etc.; se agravan hasta la muerte sin tto efectivo y rápido; el examenLCR es turbio, purulento con abundantes meningococos (debido a acumulación de pmn con meningococo dentro (celulas CLUE); tto con penicilina (G) - el tto del portador es rifampicina.
Neisseria gonorrhoea (gonococo) => idénticas características que el meningococo; su afinidad
particular es sobre las mucosas uro-genitales, con fimbrias (adherencia a las celulas epiteliales dificultando la fagocitosis); posee endo-toxina que inactiva Acs próximos; produce gonorrea en hombres y mujeres (ETS); Cuadro clínico - tras un contacto sexual, los gonococos se adhieren a la superficie de la mucosa gracias a las fimbrias y proteínas de la membrana; posteriormente se penetran a tejidos subepiteliales y empiezan a multiplicarse, liberando endo-toxina con efecto toxico a la uretra, cuello del útero, ano (donde colonicen), produce la destrucción de celulas del epitelio y supuración (secreción purulenta) y dolor a la micción; en las mujeres puede ir acompañada por uretritis, vaginitis y 20% salpingitis de las trompas (produce esterilidad en mujeres); 50% de los casos son asintomáticos con lo que la ausencia de tratamiento conduce a la cronificación; puede provocar bacteriémia dando artritis supurativos; tto => penicilina o sus derivados; en neonatos provoca gonococia ocular que conduce a la ceguera - se previene instilando gotas de nitrato de plata método de "Crede" y (contra Chlamydia es mas efectivo) eritromicina???
Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico N.meningitidis - toma de muestra de LCR (punción lumbar), sangre y/o exudado faringeo; se deben examinar de lo antes posible (sensibilidad al medio externo); se transporta en un medio de ThayerMartin modificado a 37ºC (en caliente); si la muestra de LCR es turbio o purulento, se divide en 2-3 tubos; 1er tubo se centrifuga y sobre el sedimento se realizan frotis Gram; 2nd tubo se utiliza para la siembra en AS, agar chocolate, Mueller Hinton y Thayer-Martin; 3er tubo se realiza un hemocultivo y recuento celular; meningococo crecen dando colonias transparentes diminutas y no hemolíticas; las placas se incuban a 37ºC enambiente de CO2 5-10%. - Pruebas bioquímicas => catalasa+, oxidasa+, prueba de la utilización de glucosa y maltosa por oxidación (aerobio), lactosa-, nitratasa-. - Estudios serológicos => inmunofluorescencia directa del LCR o el suero, contrainmunoelectroforesis y técnica ELISA. - Existe sistema de multi-prueba para Neisseria y Haemophylus. N.gonorrhoeae - toma de muestra a partir de la uretra (hombre), recto en homosexuales y uretra,
cuello de útero y recto (mujer), se realizan en el laboratorio (sensibilidad a medio externo), por la mañana antes de la primera micción (al ser posible); se procede de inmediato al estudio directo y la siembra en medios específicos o se transporta en medio TM modificado. - se realiza la tinción (Gram- en forma de granos de café); en el frotis se ven los pmn con diplococos dentro; la siembra se hará en AS, agar chocolate, Thayer-Martin (con factores de crecimiento y ATB vancomicina, anfotericina, colistina y trimetropin que inhibe el crecimiento de otros gérmenes); en TM los gonococo son colonias pequeñas de color gris y los meningococo son blanquecinas se incuba a 3537ºC y atmósfera enriquecida de CO2 5-10%; - Pruebas bioquímicas => utilización de azucares por vía oxidación (glucosa+, lactosa, maltosa+ para meningococo, y sacarosa); oxidasa y catalasa son positivos, nitratasa-. - Pruebas serologícas => hemo-aglutinación, inmunofluorescencia indirecta, ELISA (mas utilizadas) - Sistema de identificación multiprueba para Neisseria y Haemophylus.
Neisseria saprofitos (Neisseriaceas) - normalmente son flora de oro-faringe/ naso-faringe; son especies de bajo patogenicidad, aunque a veces implicadas en meningitis y otros; no requieren medios especiales para su crecimiento. - Branhamella catharralis / Moraxella catharralis => hoy en día la clasificación es confusa (la tendencia - dentro de la familia moraxellacea), otros autores tienden a diferenciarla y la clasifican como familia Branhamellaceae; es Gram-, oxidasa+, catalasa+, nitratasa+ (reducen nitratos a nitritos), no fermentan azucares, crecen bien en medios generales (AS, agar chocolate y Thayer Martin), son aerobias o 5% de CO2; flora normal de naso-faringe, pero a veces se aísla como agente causal en septicemias e infecciones otorrinolaringológicas (sinusitis, otitis). - Acinetobacter => anteriormente clasificada dentro de la familia Gram- no fermentadoras (pero
oxidasa- => bacteria inerte) junto con Pseudomonas; actualmente esta incluido dentro de la familia Moraxellaceae; son microorganismos que pueblan fundamentalmente suelos y aguas y presentes en medios hospitalarios (infección nosocomial); la especie mas importante => A.calcoaceticus (causan neumonías, infecciones urinarias y sepsis); crecen en Mac, AS y otros; en AS producen colonias grises con halos de hemólisis, oxidasa-, catalasa+, son cocobacilos Gram- (se pueden confundir con Neisserias por su tamaño). - Moraxella => coco-bacilo, Gram-, no fermentador, inmóvil, oxidasa+, catalasa+, difícil de distinguir con Neisseria; en general los no fermentadores son muy difíciles de distinguir y requiere numerosas pruebas bioquímicas para etiquetarlos.
Tema 19 - Entero-bacterias y vibrios (patología e identificación) Entero-bacterias - bacilos o coco-bacilos Gram-, aerobios y anaerobios facultativos, móviles (flagelación perítrica) o inmóviles, fermentadoras de glucosa (con o sin producción de CO2), oxidasa-, catalasa+; algunos usan metabolismo fermentativo y otros usan metabolismo oxidativo; la mayoría son nitratasa+; algunos son sulfuhidratasa+ (Proteus y Salmonella), indol+ (E.coli); son saprofitas/ flora del tracto gastrointestinal del hombre y de los animales; también se encuentra en el agua y en el suelo; resistentes a medios externos; son potencialmente patógenos en individuos debilitados y produce infecciones oportunistas; algunos son patógenos siempre donde sea se encuentra, otras depende de la muestra donde se aísla y el resto se cuestiona su papel. Características antigénicas: - Ag somático / Ag O => es lipo-polisacárido, termo-estables, se encuentra en la pared bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacárido es muy antigénico y la parte lipídica es inactiva bioquímicamente). - Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacárido, es antifagocitarías (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella thyphi ). - Ag flagelar /Ag H => es característico de las cepas móviles, es proteico y responsable de la acción patógena de la bacteria. Clasificación según su capacidad para fermentar la lactosa: - Fermentadoras rápidas de lactosa (coliformes) => Escherichia, Enterobacter y Klebsiella(tardía a veces) - Fermentadoras lentas de lactosa / ONPG+ (coliformes) => Citrobacter, Serratia, Hafnia, Yersinia (patógeno) y Shigella sonnei. - NO fermentadoras de lactosa (no coliformes) => Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Providencia y Edwardsiella. Salmonella - entero-bacterias no coliformes, móviles con flagelación perítrica; bacilos Gram-; en general provocan infecciones entérico febriles (gastroenteritis, entero-colitis o fiebres tifoideas o paratifoideas). Especies importantes - S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis, S.paratyphi A,B y C, S.arizonae. Acción patógena e interés clínico - Ag somático O, Ag flagelar H y Ag capsular VI (en S.typhi - Ag termolábil con poderprotector frente a los ácidos /ácida gástrica, resistencia y anti-fagocitarías) - endo-toxina y enterotoxina (efecto irritante y citotóxico sobre el tracto intestinal) Cuadros clínicos 1. Infecciones entéricas ( S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-tifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre vía oral (alimentos crudos, poco hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la acidez gástrica,pasa al intestino delgado (íleon), penetra por endocitosis destruyendo parte de las celulas de la mucosa intestinal; una vez
dentro las salmonellas son fagocitadas fagocitadas por por macrófagos y transportadas por transportadas por diferentes vías y provoca bacteriémia => bacteriémia => todo sucede en el periodo de incubación (8-15 días); días); comienzo brusco de signos y sintomas sintomas => los macrófagos les transportan hacia el bazo, higado y MO, MO, produciendo multiplicación de nuevas salmonellas, salmonellas, volver al intestino generando placas ulceradas,, necrosación ulceradas necrosación de de placas de Peyer y en casos mas graves originar perforación y hemorragias. hemorragias. Las fiebres para-tifoideas son para-tifoideas son mucho mas leve con leve con un periodo de incubación de entre 7-10 dias con dias con bacteriémia y estado febril que dura varias semanas; no hay perforación intestinal perforación intestinal ni hemorragias ni hemorragias ni invasión de salmonellas a otros órganos; cuadros clínicos => dolores de cabeza, fiebres altas, anorexia, astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 días. días . 2. Infecciones gastrointestinales y enterocolitis ( enterocolitis ( S.enteritidis - la mas frecuente, S.choleraesuis, horas ; se S.choleraesuis, S.typhimurium S.typhimurium y otras); periodo de incubación 12-36 horas; transmite por alimentos contaminados con una concentración de salmonellas de 10 millones a mil millones/ml,, depende de tipo de la cepa; el alimento les facilita su llegada a pasar el estomago y llegar millones/ml al intestino delgado colonizando el íleon y el ciego, se penetran por fagocitosis al epitelio y se multiplican originando multiplican originando una inflamación inflamación que que genera cuadros diarreicos con dolor abdominal (perdidas abdominal (perdidas de electrolitos y agua), fiebres altas, nauseas, vómitos; vómitos ; re quiere untratamiento untratamiento de re-hidratación que dura 6 días días - las floras se encargan de eliminarlas.
Aislamiento - pruebas bioquímicas bioquímicas - diagnostico diagnostico de Salmonella Salmonelosis => Salmonelosis => toma muestra de las heces (coprocultivo (coprocultivo), ), análisis del alimento sospechoso; medios de cultivo SS, McConkey, caldo selenito; pruebas bioquímicas: bioquímicas: ONPG-, TDA-, Citrato+ (S.cholera(S.cholerasuis y suis y S.enteritidis S.enteritidis,, tambien son CO2+ y Ornitina descarboxilasa+), SH2+, fermentacion de azucares: azucares: Glucosa+, Trehalosa+ ( S.typhi y y S.enteritidis), etc. Fiebres tifoideas y para-tifoideas => para-tifoideas => toma muestra de diferentes localización según la fase de fase de enfermedad; en la fase de incubación se busca en heces (coprocultivos), heces (coprocultivos), en orina(urocultivo), orina (urocultivo), sangre sangre (hemocultivo); (hemocultivo); en la fase inicial de inicial de la enfermedad / periodo febril, febril, se realiza hemocultivo hemocultivo;; en el periodo posteriores o finales se finales se busca en heces (coprocultivo); heces (coprocultivo); medios adecuados; se realiza las pruebas bioquímicas, reacciones de aglutinación cuantitativa (títulos) de Ags O, H y VI a traves de sueros específicos e specíficos monovalentes y polivalentes, especialmente especialmente para Ag VI (pruebas inmunológicas). => prueba inmunológica utilizando suero polivalente (Acs anti O y anti H), un resultado Mucaptest => positivo dara unas colonias fluorescentes (posible Salmonella).
Shigella - bacilo Gram- inmóvil Shigella inmóvil,, no fermentador de lactosa (excepto S.sonnei ) ; son patógenas para el hombre, provoca afecciones graves y contagiosas sobre el tracto gastrointestinal (disentería ( disentería bacilar) bacilar) especialmente en ambientes de salubridad baja. baja. Acción patógena e interés clínico clínico - se debe a la producción de sustancias toxicas, Ags O y K, plásmidos (facilita la invasión), adhesinas adhesinas (adherencia (adherencia a las celulas que qu e invaden),exotoxina invaden),exotoxina con propiedades cito-toxicas ( cito-toxicas (tipo tipo A - origina necrosis celular, ulceras, hemorragias y perforación), p erforación), neurotoxicas y entero-invasivas (tipo (tipo B B - adherencia a las celulas del epitelio gastrointestinal); al llegar al intestino del hombre vía hombre vía oral (puede oral (puede resistir el acido gástrico, por la alta cantidad ingerido y también protegido por los alimentos), alimentos), ejerce su acción toxica, pasar al colon originando necrosis con necrosis con signos y sintomas características (las toxinas de S.disente S.disenteriae riae no suelen pasar a la sangre); cuadros diarreicos van diarreicos van acompañados dedolor dedolor cólico, nausea, vómitos, malestar general y fiebres muy altas con deposiciones sanguinolentas con moco y pus. pus . Aislamiento - pruebas bioquímicas, bioquímicas, diagnostico diagnostico de Shigella Toma muestras de heces recién emitidas en emitidas en los primeros días de la enfermedad (hay mayor numero de shigellas), eligiendo restos de moco y sangre si sangre si los hubiera; el estudio riguroso(teniendo riguroso(teniendo en cuenta que Shigella Shigella se se destruye en medios ácidos y a temperaturas tem peraturas <4ºC; <4ºC; medios de cultivos SS, McConkey, Hektoen, Yersinia CIN, Campylosel, TCBS;pruebas TCBS;pruebas bioquímicas TDA, bioquímicas TDA, KIA (K/A para Shigella Shigella y y A/A para S.sonnei S.sonnei), ), ONPG (positivo para S.sonnei S.sonnei), ), fresco, ureasa-, VP-, nitratasa+ nitratasa+,, manitol (positivo para (positivo para Shigella Shigella y y negativo negativopara para S.disenteriae S.disenteriae); ); pruebas de aglutinación cuantitativa (titulo) para demostrar Acs en el suero del paciente a traves de sueros específicos e specíficos mono y polivalentes.
Escherichia - entero-bacterias bacilar o coco-bacilar Gram- móviles Escherichia móviles,, fermentadoras de glucosa y lactosa,, produce CO2, aguantan temperaturas altas (la lactosa altas (la diferencia de otros coliformes), resistente a medios externos, externos, fácil de encontrar en el agua, alimentos (indicativo alimentos (indicativo de contaminación fecal reciente); saprofito de flora aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo; puede provocar trastornos gastrointestinales de diarrea, infecciones urinarias, meningitis en neonatos y excepcionalmente bacteriémia; la especie mas importante para el hombre es E.coli (según la cepa puede tener Ag somático O, capsular K y flagelar H, fermentos y endo-toxinas). Acción patógena e interés clínico clínico - los cuadros clínicos son variables según según el el tipo de toxina que originen; algunas cepas cepas de de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitarías y resistencia a bactericidas y ATB (alto ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo de acción análogo al de Shigella con menor gravedad; a veces la entero-toxina que producen es parecida parecida a a la de Vibrio cholerae que cholerae que causa perdida masiva de agua y electrolitos. - si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotóxica parecida citotóxica parecida a Shigella Shigella => => cuadros diarreicos en brotes epidémicos que afectan a niños y lactantes lactantes ( E.coli entero-patógena)) E.coli entero-patógena - si forma una entero-toxina entero-toxina semejante semejante a Vibrio a Vibrio cholerae => cholerae => procesos diarreicos en niños, adultos, originándose esporádica-mente brotes epidémicos (diarrea (diarrea del viajero viajero - E.colienterotoxígena)) toxígena - si forma una entero-toxina citotóxica similar citotóxica similar a S.disenteriae S.disenteriae => => procesos diarreicos graves, hemorragico esporádicamente en brotes ( E.coli entero-hemorragica entero-hemorragica)) - si presenta ciertos plásmidos plásmidos que que incrementan su capacidad de invasión => cuadros diarreicos graves que afectan a niños, adultos con brotes epidémicos en casos aislados ( E.colientero-invasiva entero-invasiva)) Las cepas de E.coli se distingue con sueros antigénicos; antigénicos ; E.coli también puede provocar infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges ( meningitis en neonatos). neonatos). Aislamiento, pruebas bioquímicas - diagnostico diagnostico Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram; medios de cultivo Mc, Levine; pruebas bioquímicas => bioquímicas => lactosa+, indol+, citratocitrato-,, sensible a la Colistina. Colistina.
Yersinia - entero-bacterias muy patógenas para el hombre (Y.pestis - causante la peste bubónica); son Yersinia coco-bacilos Gram-, móviles a 25ºCcon 25ºCcon flagelación perítrica e inmóviles a 37ºC, 37ºC, fermentadores de glucosa (ONPG variable),capsuladas variable),capsuladas (Y.pestis) (Y.pestis) y oxidasaoxidasa-..
Especies mas importantes - Y.pestis (agente etiológico de la peste bubónica en el hombre) trasmitida a traves de ratas y pulgas, originando enfermedad grave febril, epidémico de alta mortalidad; Y.pseudotuberculosis afecta animales y excepcionalmente al hombre; Y.enterocolitica (sacarosa+ en medio TSI); los 2 últimos afectan mas a animales que al hombre (niños) => originando estados febriles y diarreicos. Acción patógena e interés clínico de Y.pestis => cuadros agudos y febriles con alta inflamación de los ganglios linfáticos, hemorragias internas, petequias difusas en la piel, en ocasiones septicemia y neumónia; es muy contagiosa, se origina en lugares de salubridad baja; la muerte se produce por shock séptico (fracaso multi sistémico) o por neumónia; factores de virulencia: - La toxina murina (liberada al medio cuando muera la bacteria) => proteína que bloquea la utilización de O2 por parte de las celulas. - Endo-toxinas (liberadas en el transcurso de la enfermedad) => origina el proceso febril - Ag V con propiedades anti-fagocitarías - Coagulasas y fibrinolisinas Y.pestis llega al hombre a traves de la picadura de pulga (infectada por ratas con peste),atraviesa los vasos linfáticos, pasa a los ganglios donde se multiplica originando bubones,pasa a la sangre y se disemina por el bazo, higado, pulmones, piel, mucosas, se multiplica provocando lesiones piógenas (toxina murina), hemorrágicas, necrótica y edematosa; en casos graves aparece coagulacion intravascular diseminada (CID) (por la acción de lascoagulasas) o diátesis hemorragica (por la acción de las fibrinolisinas), colapso circulatorio, toxemía generalizada y muerte; formas clínicas: 1. Peste bubónica (la mas frecuente); tras el periodo de incubación de 3-7 días después de la picadura, aparecen signos y sintomas con escalofríos, vómitos, formación de bubones en las ingles axilas y/o zonas submaxilares (los tejidos circundantes aparecen inflamados); sin tratamiento se agrava hasta la muerte. 2. Peste pulmonar (es la complicación de peste bubónica); se produce afección pulmonar grave con insuficiencia respiratoria, cianosis; es altamente mortal. 3. Peste septicémica es estadios últimos de la peste en cual quiera de sus formas y es generalmente mortal. Aislamiento - pruebas bioquímicas - diagnostico Toma de muestra de exudados purulentos del bubón (por aspiración), de sangre, LCR, tejido pulmonar, nódulos linfáticos o esputo, heces, según los casos; la tinción Gram-, nigrosina (visualización de capsulas); medios de cultivo => Mc, Yersinia CIN (colonias muy pequeñas); pruebas bioquímicas => móvil a 22ºC y inmóvil a 37ºC, Lactosa-, ONPG+,ureasa+, indol y TDA-, oxidasa-, nitratasa+; a veces Y.pestis y Y.pseudotuberculosis son ONPG variable; Y.enterocolitica es sacarosa+.
Entero-bacterias oportunistas - bacilos Gram- aerobios y anaerobios facultativos, poco exigentes nutricional-mente, ampliamente distribuidos en el medio ambiente; son saprofitos de la flora gastrointestinal, resistente a medios externos y ATB; no son patógenos al no ser si el huésped es debilitados, pueden provocar infecciones hospitalario; en la mayoría son lactosa+, bacilos Gramcoliformes;
Principales especies de coliformes/ lactosa+ (Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Klebsiella y Hafnia) y no coliformes /lactosa- (Proteus, Morganella y Providencia). 1. Escherichia => Gram- aerobias y anaerobias facultativas, fermentadoras rápidas de lactosa y glucosa, produce CO2, indol+, citrato-, sensible a Colistina, móviles. 2. Enterobacter => fermentadora rápida de lactosa, produce CO2, produce acetoína de la glucosa ( VP+), citrato+, móvil, ornitina-descarboxilasa+, son comensales de flora intestinal; puede provocar a individuos debilitados diarreas, infecciones del tracto respiratorio, heridas, etc; especies importantes: E.aerogenes y E.cloacae. 3. Serratia => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+) y la glucosa,produce acetoína (VP+), móviles, citrato+, ADNasa+, ornitina-descarboxilasa+, saprofitas del hombre y también en el medio ambiente (agua y otros líquidos), resistentes a ATB y desinfectantes; provoca infecciones urinarias y sepsis a personas debilitadas. 4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), móvil, fermenta la glucosa y VP- RM+, citrato+; son comensales del tubo digestivo del hombre y puede provocar infecciones urinaria, respiratoria, sepsis, bacteriémias, meningitis a los individuos debilitados; especies importante => C.freundii . 5. Klebsiella => inmóviles, fermentadoras tardía de lactosa, utiliza glucosa y produce acetoína (VP+), citrato+, ureasa+; son comensales del tracto gastrointestinal y vías respiratorias superiores; puede provocar neumonías, rinitis, infecciones urinarias; especies importante => K.pneumoniae (sub especies VP+ y VP-) y K.oxytoca (indol+). 6. Hafnia => móviles a 22ºC y inmóviles a 37ºC, fermentadora lenta de lactosa (ONPG+),citrato+, utiliza glucosa y produce acetoína (VP+); provoca infecciones hospitalarias. 7. Proteus, Morganella y Providencia => NO fermentan la lactosa, pero si glucosa y produce CO2, RM+; móviles, TDA+ (diferenciar del resto entero-bacterias), pueblan aguas residuales, el suelo, materia orgánica y son comensales en la flora intestinal del hombre; pueden provocar infecciones hospitalarias; especies importantes: - Proteus mirabilis (indol-, ureasa+, TDA+, SH2+), P.vulgaris (indol+, ureasa+, TDA+) - M.morganii (ureasa+, indol+, TDA+) - Providencia rettgeri (ureasa-, indol+, TDA+) P.mirabilis puede provocar infección urinaria, descompone la urea de la orina quegenera precipitación de sales cálcicas => formación de cálculos renales; también puede provocar infecciones gastrointestinales, toxinfecciones alimentarias, heridas, etc.
Acción patógena e interés clínico - si el huésped se encuentra debilitado (postoperatorio, tratamiento inmunosupresores) los saprofitos podrían ser patógenos; las infecciones mas frecuentes => - tipo urinario (40% de las infecciones hospitalarias - pacientes sondados, encamados, intervencionados quirúrgica-mente) provocado por E.coli, P.mirabilis, P.vulgaris, Klebsiella y Enterobacter, provocando cistitis (de las vías bajas) y pielonefritis (de las vías altas); son infecciones agudas con fiebre, dolor lumbar, polaquiuria o anuria y disuria; es frecuente en los análisis de orina piuria, bacteriuria y proteinuria; - tipo abdominal son poco frecuente => abscesos y peritonitis debido a perforación intestinal. - tipo respiratorio (20% de las infecciones hospitalarias) afectando vías respiratorias altas, neumonías y bronco-neumonías (pacientes con afecciones crónicas) Aislamiento - pruebas bioquímicas - diagnostico - Toma de muestra según las afecciones o procesos patológicos en condiciones de total asepsia - Examen directo (fresco y tinción Gram) - Aislamiento en medios específicos/ selectivos (Hektoen, Mac) que inhiben los Gram+ - Pruebas bioquímicas e inmunológicas
Familia Vibrionaceae - Genero Vibrio, Aeromonas y Pleisomonas (los patogenos)
Especie mas importante y patógeno del genero Vibrio - V.cholerae => bacilos Gram- anaerobios facultativos de morfología curva (pleomórficos), móviles (flagelación lofótrica), crecen bien en medios generales y pH alcalino (sensibles al medios ácidos), oxidasa+ (la diferencia de la enterobacteriaceae), halófilo, catalasa+, afectan al tracto gastrointestinal del hombre; es el agente causal del cólera => provoca diarreas graves hasta llegar a la deshidratación (diarreas masivas), shock hipovolémico, coma y muertepor deshidratación (puede perder hasta 10-15 lt/día de agua y electrolitos); se diferencia dePseudomonas por la diferencia en el patrón de fermentacion de azucares. Acción patógena e interés clínico: - Ag somático O (polisacáridos) se utiliza para su tipación - Ag flagelar H (no tiene valor para su tipación - común a todas las cepas) - Exotoxina / entero-toxina proteica (el principal efecto patógeno del cólera - provoca diarrea masiva) - Adhesina (proteína que tiene afinidad por los azucares) que permite adherirse a la pared intestinal Para formar cuadros graves es necesario su penetración por vía oral (agua o alimentos contaminados con el bacilo, p.ej. productos marinos crudos), eludir el medio acido del estomago (sucede cuando se ingieren >100 millones de gérmenes - en el caso de epidemias donde se encuentra 1 millón/ ml de agua). Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Toma de muestra a partir de las heces diarreicas, vómitos, procediéndose de inmediato a su identificación (sensible a medios externos); medio de transporte Cary-Blair. - Aislamiento en medios de cultivo específicos TCBS que impide el crecimiento de gran parte de microorganismos => produce colonias amarillas por la fermentacion de la sacarosa sobre el medio verde y también se siembre en el Mc. - Pruebas bioquímicas => oxidasa+, catalasa+, sacarosa+ (produce un tipo de acido débiles que no bajara mucho el pH) - Pruebas serologícas para determinar el titulo de Acs. Aeromonas - bacilo Gram- no fermentadoras de la misma familia; el especie mas importante Aeromonas hydrophila; catalasa+ y oxidasa+, VP+, lactosa-, ureasa-, indol+, SH2, móviles; no son halófilo (a diferencia de Vibrio) implicadas en procesos diarreicos. Plesiomonas - tiene las mismas características bioquímicas que Aeromonas (excepto en pruebas de VP y ornitina descarboxilasa); el especie mas importante Plesiomonas shigelloides(se propone a incluirla a la familia enterobacterias); hay que hacer API para distinguirla de Aeromonas (Plesiomonas - ornitina descarboxilasa+)
Tema 20 - Bacilos y cocobacilos aerobios y anaerobios facultativos (patología e identificación) Pseudomonas - bacilos pequeño (coco-bacilo) Gram-, móviles (flagelación), en generalaerobios estrictos, catalasa y citocromo oxidasa positivos, en generalmetabolismo glucídico oxidativo;
ampliamente distribuidos en el agua y suelo, pasando de aquí a los animales y al hombre; son oportunistas en el ambiente hospitalario (pacientes inmunodeprimidos), en ocasiones resultan muy graves (resistente a muchos ATB - hay que combinar varios). Los especies mas importantes: - P. aeroginosa => presenta pigmentos fluorescentes, saprofita en la piel, tubo digestivo??, puede provocar cuadros graves en individuos debilitados y es mortal si se produjese septicemia; - P. maltophilia (ahora se llama Stenotrophomonas maltophilia) se llama así, porqueoxida maltosa (no oxida la glucosa); cogen cada vez mas importancia; oxidasa variable. Acción patógena e interés clínico - Pseudomonas aeroginosa - Ag somático O (polisacáridos), Ag flagelar H (proteico), Ag mucoide M (produce exotoxinas => enterotoxina responsables de cuadros diarreicos y toxina eritrodérmica). - Sustancia => (1) piocina (pigmento azulado de acción bactericida), (2) fluoresceina(pigmento verde amarillo) y (3) pigmento melánico (tiñe de color marrón los cultivos). - Cuadros graves o muy graves (de carácter oportunista) => sinusitis crónicas, infecciones del aparato respiratorio (neumonías, faringitis, bronco-neumonías); puede producir endocarditis en drogadictos y paciente con SIDA ; enterocolitis, pielonefritis y meningitis en neonatos; en grandes quemaduras, agravando la lesión o provoca infección de heridas quirúrgicas; en casos mas graves puede originar bacteriémia (quemaduras graves). Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnóstico bacteriológico - Toma de muestra de cualquier producto patológico, especialmente de carácter purulento en total asepsia. - Examen directo (tinción Gram); si el pus es azulado se sospechara de P.aeroginosa. - Aislamiento en medios generales (el bacilo piociánico es fácil de cultivar) a temperatura 37ºC; es importante estudiar la presencia de pigmentos que se difunden en el medio; lapiocianina es un pigmento responsable de la coloración azul verdosa que puede adquirir el medio y el olor a jabón de las colonias son las características de P.aeroginosa. - Pruebas bioquímicas de citocromo oxidasa+, catalasa+, gelatinasa+, utilización de la glucosa vía oxidativa (aerobio). - Pruebas serologícas para buscar Acs anti Pseudomonas.
Brucella - bacilos pequeños (coco-bacilos) Gram- inmóviles, aerobios estrictos, algunas crecen mejor en atmósferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+, oxidasa+, nitratasa+, ureasa+, sensibles a medios ácidos y se destruyen fácilmente a temperatura de pasteurización.
Especies mas importantes (en función del huésped en el que anidan): - Brucella melitensis afecta a cabras y ovejas; afecta al hombre a traves de sus leches no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha. - Brucella abortus afecta a bóvidos (la mayoría de los casos de brucelosis en España - en menor proporción B.melitensis) Acción patógena e interés clínico - depende de su estructura antigénica; Brucella es capaz de mantenerse latente en el interior de la celulas que la han fagocitado y posteriormente, empezar a multiplicarse con la consiguiente producción de endo-toxina;penetran en el hombre a traves de heridas y vía digestiva (alimentos procedentes de animales infectados (leche no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha); posteriormente,pasaran a los ganglios linfáticos, donde serán fagocitadas por neutrófilos (en la sangre) y macrófagos (en los tejidos) y se distribuyen por todo el organismo, volver a pasar al torrente circulatorio originando bacteriémia ( brucelosis aguda o fiebres de Malta); se caracteriza por artralgias difusas (dolores de articulaciones), sudoración abundante, esplenomegalia y otras distintas formas clínicas dependientes de la localización de Brucella (orquitis, neumónia brucelar, etc); las fiebres son ondulantes con tendencia a las recidivas(frecuente entre los 3 y 6 meses subsiguientes a la infección por Brucella);
Bordetella - bacilos o coco-bacilos Gram- aerobios estrictos, inmóviles (algunas son móviles), capsulados; son parásitos estrictos (no se encuentran libres en la naturaleza); se transmite por las gotitas de flugge o contacto directo. Especies mas importantes: - Bordetella pertussis (bacilo Bordet y Gengou) => la mas patógena y es elagente etiológico de la tosferina - B.parapertussis => aislada en casos benignos de tosferina y no es estrictamente patógena - B.bronchiseptica => afecta mas a animales que al hombre; aislada en el hombre excepcionalmente en casos benignos de tosferina. Acción patógena e interés clínico ( Bordetella pertussis) - se infectan a traves de gotitas (flugge) que se producen al hablar; tras periodo de incubación de 1-2 semanas, empiezan a multiplicarse en la superficie de las celulas epiteliales ciliadas de la traquea, bronquios y bronquiolos, originando inflamación en estas zonas, paralización de sus cilios y consiguiente necrosación; presenta una fuerte acción tusígena (tos seca) que puede llegar a agotar debido a la acción de la toxina proteica y incremento de las mucosidades queobstruyen los bronquios (bronco-constricción) lo que facilita un déficit en la ventilación pulmonar; puede originar cianosis, taquicardia y vómitos alimenticios; es altamente contagiosa, pero ya existe vacunas de la tosferina.
Haemophilus - bacilos muy pequeños Gram- aerobios y anaerobios facultativos, inmóviles y patógenos para el hombre y muchos animales; sensibles a medios externos, desecación, el calor y muchos antisépticos; necesita medio de cultivo especifico con sangre como AS o agar chocolate (contiene factores X/hemina o ferroprotoporfirina y factor V /NAD o nicotinamida-adenina-dinucleotido necesarios para el proceso de respiración). Especies mas importantes (clasificadas en función de los factores que necesitan): - Haemophilus influenzae (bacilo de Pfeiffer) es el agente etiológico de 10-15% de lasmeningitis en niños de corte edad en España y de neumonías en ancianos; requiere ambosfactores V y X. - H.parainfluenzae es agente causales en ciertas meningitis, afecciones respiratorias y septicemias; también son saprofitos en fosas nasales y boca; requiere solo factor V . - H.ducreyi es agente etiológico del chancro blando (enfermedad venérea /ETS); requiere solo factor X. Acción patógena e interés clínico ( Haemophilus influenzae): - Es capsulada (su capsula esta formada por polisacáridos distintos de A-F) en España es mas frecuente la del tipo B. - Posee endo-toxina que es responsable de lesiones en la traquea y bronquios en procesos neumónicos - Suelen afectar a las vías respiratorias originando neumonías, bronquitis aguda en ancianos y adultos debilitados. - Puede producir meningitis en niños de corta edad; se transmite por vía aérea y mas frecuente en invierno y primavera; comienza como infección de las vías respiratorias altas y posteriormente se extiende via sangre hasta el sistema nervioso produciendo meningitis purulenta con mortalidad alta sin tratamiento a tiempo. - Existe vacuna para H.influenzae tipo B. Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico de Haemophilus: - Toma de muestra a partir del exudado faríngeo, esputo o líquidos purulentos (en caso de infección de vías respiratorias), LCR por punción lumbar (en caso de sospecharmeningitis). - Examen directo (tinción Gram, tinción negativa) - Se cultiva en agar chocolate o AS de conejo/caballo, se añaden discos que contengan factores V y X, ATB como la bacitracina que inhibe a otros gérmenes; se formaran satelitismo según sus necesidades de los factores; incubar en la atmósfera rica en CO2. - Pruebas bioquímicas => indol+, ureasa+, nitratasa+, oxidasa variable (según la cepa),fermentacion de glucosa positiva, ONPG-. - Técnicas inmunológicas => determinar el Ags capsular (se realizan por la urgencia del diagnostico)
Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella pneumophila(el agente etiológico de la legionelosis / neumónia atípica por Legionella); un coco-bacilo o bacilo Gram, aerobio estricto, requiere medios muy específicos para crecer (agar legionella),catalasa+, oxidasa+, en ocasiones puede presentarse de forma filamentosa; en general son móviles, pero algunas cepas son inmóviles. Acción patógena e interés clínico - se transmite vía aérea a partir de aerosoles procedentes de aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores contaminados con Legionella; tras el periodo de incubación (+/- 1 semana) se produce fiebres altas, astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un cuadro típico de una neumónia atípica); se conoce como la enfermedad de los legionarios; el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el tratamiento preciso suele remitir sin problema.
Bacillus - de la familia Bacillaceae; el genero Bacillus son bacilos esporulados aerobios o anaerobios facultativos con tamaño entre 1-7 micras Gram+ y en su mayoría móviles; otro genero de la misma familia es Clostridium son bacilos esporulados y anaerobios estrictos, que origina en su mayoría potentes exotoxinas responsables de cuadros clínicos graves. Especies mas importantes de Bacillus: - Bacillus anthracis (agente etiológico del ántrax o carbunco) - Bacillus cereus (responsable en muchas ocasiones de trastornos gastrointestinales) - otros bacilos son comensales para el hombre o saprofitos del suelo, agua, etc., y que depende del estado inmunitario, puede producir diferentes cuadros clínicos (p.ej. Bacillus subtillis). Acción patógena e interés clínico de Bacillus anthracis: - Es un bacilo grande, habitualmente se presenta en forma de cadenas cortas o en parejas, formando fácilmente esporas sobre todo en los cultivos viejos; es inmóvil, presenta capsulas(los patógenos) y exotoxina proteica que proporcionan propiedades anti-fagocitarías. - En general, el cuadro clínico que produce es el carbunco animal o humano; en el humano tiene lugar tras un primer contacto a partir de animales infectados que tras periodo de incubación de 23 días surge una pústula maligna (color negro en la mano) en el punto de contagio (las manos y cabeza); comienza con una pápula eritematosa que se complica a vesícula pruriginosa que se convierte en ulcera o escara, que sin tratamiento puede necrosarse y extenderse en superficie y profundidad; los casos no tratados, podrían ser graves, ya que existe el riesgo de septicemia intensa que en pocas horas podría originar la muerte; lo mas habitual son las formas benignas que curan con facilitad tras
un tratamiento. - En casos excepcionales pueden aparecer formas internas como el carbunco pulmonar ante la inhalación de polvo contaminado con esporas de Bacillus anthracis que da lugar a neumonías graves; también puede producirse carbunco intestinal por la ingestión de alimentos contaminados con las mismas esporas y originara diarreas, vómitos, dolor tipo cólico, fiebre, etc.
Acinetobacter - (también esta descrito en genero de Moraxella/ Neisseriaceas) este genero engloba especies que pueblan la flora de suelos y agua, al igual que Pseudomonas, son bacilos Gram- no fermentadoras, capsuladas y presentes en ambiente hospitalarios donde afectan a pacientes inmunodeprimidos; la especie mas frecuente es Acinetobacter calcoaceticus que produce infección urinaria, neumonías y sepsis; crecen bien en Mc y AS que da colonias grises y Bhemolíticas; se diferencian de Pseudomonas en que Acinetobacter es oxidasa-; son fácilmente confundible con Neisserias porque es bacilo muy pequeño (coco bacilo); también es muy resistente a los ATB.
Tema 21 - Corinebacterium (patología e identificación) Genero Corinebacterium - pequeños bacilos inmóviles a temperatura corporal, se comportan como Gram+, suelen agruparse en formas geométricas parecidas a letras chinas o abecedario (empalizadas); presenta granulaciones metacromáticas, catalasa+, anaerobios facultativos y pueden dar lugar a un velo superficial en medios líquidos; presentan ciertos rasgos comunes con Mycobacterium en su pared bacteriana que es muy rica en ácidos micólicos, arabinosa y galactosa, aunque la tinción de BAAR (Zhiel-Nielssen) paraCorinebacterium resulta negativa; la especie mas importante es Corinebacterium diphteriae.
Acción patógena e interés clínico de Corinebacterium diphteriae - el bacilo diftérico llega al hombre por vía respiratoria a traves de gotitas de saliva (pflugge) u objetos recientemente contaminados invadiendo la oro-faringe y las amígdalas; desde aquí se extiende, liberando toxinas y enzimas inhibiendo la síntesis proteica celular, originando necrosis en las celulas epiteliales que invade; este epitelio necrosado junto con leucocitos y fibrina formara una pseudomembrana que cubre las amígdalas, que puede llegar a provocar una obstrucción respiratoria si se extiende por la nasofaringe y laringe; tal pseudomembrana se encuentra fuertemente adherida a las mucosas, de forma que si se intenta arrancar, originaria al paciente una fuerte hemorragia; en general los signos y sintomas de la difteria suelen ser de tipo respiratorio; en casos excepcionales, por vía linfática podría pasar a la sangre difundiéndose al resto del organismo.
Tema 22 - Mycobacterium y Nocardia (patología e identificación) La familia Mycobacteriaceae engloba un solo genero Mycobacterium; son pequeños bacilos finos rectos y a veces incurvados, excepcionalmente pueden encontrarse algo filamentosos; son inmóviles con una pared típica y característica no encontrada en ninguna otra familia excepto Nocardia (altamente enriquecida con ácidos micólicos y componentes céreos que se tiñe muy difícilmente - responde a Gram+), se necesitan colorantes con alta capacidad tintorial para su penetración; una vez teñidos son altamenteresistentes a la decoloración ácida (AAR+ o acido alcohol resistencia positivo) lo que les diferencia del resto de microorganismos; son muy distribuidos en la naturaleza, pueden sersaprofitos del agua y suelo y puede provocar infecciones graves al hombre y en ocasiones crónicas como la lepra; necesita gran cantidad de oxigeno para sobrevivir (aerobias estrictas). Las especies mas importantes del genero Mycobacterium (3 importantes grupos): (1) Bacilos de Mycobacterium cultivables en medios artificiales, de crecimiento lento(>1semana hasta 3 semanas); en función de los cuadros clínicos se subdividen en 2 grupos: a. especies que producen tuberculosis al hombre y a los animales ( Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis). b. especies de micobacterias atípicas de crecimiento lento, podrían presentar un poder patógeno para el hombre distinto al de la tuberculosis y la lepra (Mycobacterium avium y Mycobacterium marinum). (2) Micobacterias de crecimiento rápido (<1semana); no tiene interés clínico (no son patógenos) para el hombre. (3) Bacilos de Mycobacterium no cultivables sobre medios artificiales y patógenos para el hombre ( Mycobacterium leprae) y ciertos roedores (Mycobacterium lepraemurium) Los micobacterias también se pueden clasificar en función de la producción de pigmentos, de las morfologías de las colonias y de la velocidad del crecimiento.
Acción patógena e interés clínico Mycobacterium tuberculosis - responsables de tuberculosis en el hombre Muy rica en componentes lipídicos en su pared celular dotándole un carácter tintorial especifico AAR+ que servirá para su identificación y clasificación; contiene proteínas que provocan la formacion de Acs (reacción de la tuberculina /test de Mantoux); es capaz decrecer en el interior de las celulas que constituyen el sistema retículo endotelial, se multiplican dentro de ellas sin ser destruida; en el frotis de baciloscopia se puede observar forma cordones microscópicos. Llega al hombre por inhalación (excepcionalmente por ingestión de alimentos contaminados con Mycobacterium o a traves de las heridas de la piel); produce una lesión primaria en el pulmón y mas concretamente a nivel de los alvéolos pulmonares, provocando unaintensa reacción inflamatoria que da lugar a exudación; estos bacilos pueden llegar hasta los vasos linfáticos y de aquí a los ganglios, retornando a la circulación venosa y originandofocos metástasis en distintos órganos; sin tratamiento se va desarrollando evolucionando hacia una necrosis "caseosa" (parecida a queso de caverna); después de 6 semanas o mas va evolucionando hacia una destrucción y desintegración de las celulas pulmonares con la formación de una masa solida, homogénea, parecida al queso (caverna tuberculosa); provocara fiebres mas o menos variables, sudoración por la tarde, adelgazamiento progresivo, tos débil o intensa (a veces con esputos muco-purulentos) y en fases mas avanzada,hemoptisis; en general cualquier parte del organismo podría verse afectada a causa de diseminación (gastrointestinales, genito-urinarias, pericárdicas, etc.) Mycobacterium leprae - productoras de la lepra en el hombre
Se multiplica con extraordinaria lentitud y su clínica es bastante insidiosa y no ha podido ser cultivado en ningún medio in vitro, por lo que se conocen poco sus características microbiológicas; su único reservorio es el hombre con autentica predilección por las terminaciones nerviosas; es un bacilo inmóvil, rectilíneo, se tiñe con Zhiel-Nielssen ( AAR+); suelen encontrarse en la mucosa nasal, en la dermis y en biopsias de lesiones en individuos con lepra; La vía de entrada es a traves de lesiones en la piel, se propagan a los nervios superficiales próximos, concretamente a las celulas de Schwam; de aquí propagarse via linfática al sistema venoso y disemina a otros órganos (lepra lepromatosa); se multiplica mejor en las partes mas frías del organismo (la cara, extremidades) invadiendo los nervios mas superficiales; el bacilo se multiplica en el interior de los macrófagos de la piel y las celulas de Schwam, originando inflamación y perdida de sensibilidad; en estado grave también aparece en órganos mas profundos y su pronostico es mas complicado; su periodo de incubación es muy difícil de determinar, puede durar muchos años; su periodo de invasión es muy insidioso, sintomas raros y no asociables a lepra (picor, hormigueo y perdida de sensibilidad en las manos/pies; a partir de aquí, de forma lenta y progresiva aparecen lesiones cutáneas (maculas prominentes en extremidades y cara); su periodo durara toda la vida y su evolución mas o menos grave dependerá del grado de inmunidad del huésped; tto => ATB sistemico.
Micobacterias atípicas - producido por Mycobacterium avium y Mycobacterium marinum Las micobacterias atípicas son m.o. patógeno para el hombre, frecuentemente de carácter pulmonar, a veces confundido con Mycobacterium tuberculosis ya que la sintomatología es similar => tras una invasión, se producen formación de tubérculos y consiguiente necrosis caseosa con formación de cavernas, diseminación y cuadros de fibrosis pulmonar con rara aparición de focos extra-pulmonares; la gravedad de lesiones depende del estado inmunológico del paciente; los gérmenes invadirá especialmente individuos inmunodeprimidos; la vía de entrada es muy variable (respiratoria o mucosas).
Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico a)- Aislamiento de Mycobacterium tuberculosis
- Muestras puede proceder de esputo, aspirado bronquial, aspirado gástrica; LCR e orina; la muestra de esputo han de someterse a una descontaminación, homogenización y concentración (mediante centrifuga) previa al cultivo; LCR, orina, etc. se puede sembrar directamente, pero lo mejor seria centrifugar-lo antes. - Se realizara un examen microscópico del frotis previa tinción de Zhiel-Nielssen (AAR); también se pueden utilizar tinciones fluorescentes (auramina, rojo de tiacina, naranja de acridina), cuando se sospecha que hay pocos bacilos (todo se trabaja bajo la campana de flujo laminar). - Para aislar el bacilo de Koch de muestras estériles (LCR, orina) se utilizaramedios líquidos como Proskauer-Beck ; si pretendemos hacerlos crecer en medios sólidos (esputo), existe medios específicos como Lowenstein-Jensen o Coletsos, que contienen huevo, aminoácidos, sales minerales y verde malaquita (inhibe los gérmenes contaminantes) cuyo crecimiento es lento (2-4 semanas); también existe agar Middlebrook que se suele emplear junto con el anterior para completar su identificación; Micobacterias son muy exigentes en su crecimiento => incubar a 37ºC, en la oscuridad, en el ambiente con CO2 de 5-10% (en 1ª semana) y en atmósfera normal a partir de la 2ª semana; los tubos desenroscados hasta que se evaporen el agua (sin secar el medio); la mayoría tardan entre 3-6 semanas en crecer (algunos aun mas); si hay crecimiento, se hará la identificación de su morfología mediante tinción de Zhiel-Nielssen y pigmentos. - Pruebas bioquímicas => la mas importante es la prueba de la niacina+ (todas las micobacterias producen ácido nicotínico durante su crecimiento; M.tuberculosis no metabolizan el ácido nicotínico y por ello lo acumulan y es excretada al medio, sobre todo en medios con base de huevo, del cual puede ser extraída y detectada); es nitratasa+ y catalasa+(solo algunas cepas de Mycobacterium tuberculosis no tienen la catalasa; en general tienencatalasa termolábil (a temperatura alta no tienen catalasa). - Pruebas serologícas => la mas utilizada es la técnica ELISA ; actualmente la identificación se hace con el PCR , posteriormente se realiza la hibridación con las sondas genéticas (ADN) de M.tuberculosis marcadas. - Pruebas de alergia /la prueba de la tuberculina (Mantoux); tuberculina es un extracto proteico de bacilo tuberculoso; es solo toxico para individuos que han estado en contacto con dicho germen, originando una reacción intradérmica en la cara anterior del brazo intensa; este eritema endurado (pápula de >10mm es positivo) se debe leer hacia 48-72 horas (se mide la pápula no la zona roja); después de las 4-6 semanas posteriores al contacto, la prueba del Mantoux dará de por vida positiva. b)- Aislamiento de Mycobacterium leprae
- Muestras a partir de heridas sospechosas en piel y otras localizaciones. - Se realiza una tinción de Zhiel-Nielssen o AAR , que deberá dar positiva - No podrá ser cultivada en medios de cultivo
- Se realizara un diagnostico serológico (un estudio de la inmunidad celular y humoral del individuo) - Pruebas cutáneas: (depende del resultado, se hace los 3 pruebas o solo algunos). 1. reacción de la lepromina => para conocer el tipo de lepra que posee ese individuo (prueba de intradermorreacción /Ag de bacterias inactivadas); Las personas que no tienen lepra tendrán poca o ninguna reacción de la piel al Ag. Los pacientes con un tipo particular de lepra, llamado lepra lepromatosa, no tendrán ninguna reacción de la piel al Ag; una reacción positiva de la piel se puede observar en pacientes con lepra tuberculoide y lepra dimorfa tuberculoide. 2. test de pilocarpina => para buscar la ausencia de sudoración de la piel lesionada después de una inyección de clorhidrato de pilocarpina. 3. test de la histamina => inyectar histamina de tal forma que en una piel sana aparecerá una reaccion alérgica característica, mientras que en las lesiones lepromatosas esto no sucede debido a que los nervios periféricos están lesionados y no aparecerá ninguna reacción alérgica. c)- Aislamiento de Micobacterias atípicas
- Recogida de muestra de los lugares sospechosos en total asepsia - Tinción de Zhiel-Nielssen (positiva); tinción fluorescencia con auramina, rojo de tiacina, naranja de acridina. - Cultivos en medios Lowenstein-Jensen, Coletsos o caldo Middlebrook, donde se puede observar el aspecto de las colonias, su velocidad de crecimiento y la presencia de pigmentos. - Pruebas bioquímicos: niacina- (la diferencia de Mycobacterium tuberculosis), catalasa+, nitratasa+. - Pruebas serologícas de ELISA Actualmente en grandes laboratorios, se utilizan medios de cultivos radiométrico (Bactec TB)de deteccion mas rapida que contiene liquido de soporte (agar Middlebrook) con ATB para inhibir los demas gérmenes y el sustrato marcado con un isótopo del carbono C14; las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan gas CO2 marcado radioactivamente que es detectada automáticamente por el Bactec y una vez que se ha detectado crecimiento en alguno de los medios, se realiza la tinción de Ziehl-Neelsen para ver si lo que ha crecido son BAAR o no.
Baciloscopias - las extensiones para baciloscopias se deben hacer previamente a la descontaminación (CHNa 2-4%) de las muestras y homogenización (N-acetil cisteina) , posteriormente su concentración por centrifugación; la preparación del frotis del esputo ha de hacerse seleccionando la parte mas purulenta que es donde hay mas micobacterias; cuando se lleva acabo la tinción de los frotis, se debe evitar el contacto físico entre las portas para evitar contaminación cruzada; es importante cuantificar el numero de bacilos encontrados ya que esta directamente relacionado con el grado de contagiosidad del paciente y con la gravedad de la infección.
El genero Nocardia - corresponde a actinomicetos aerobios que forman micelio vegetativoque tiende a fragmentarse originando estructuras bacilares o coco-bacilares; Gram+ inmovil,aerobios estrictos y AAR+ (tiene características análogas al Mycobacterium) poseen gran cantidad de acidos micolicos de cadena larga en su pared bacteriana; poseen ademas glicolípidos y fosfolípidos que sirve para su identificacion y diferenciación; algunas especies son patógenas para el hombre. Acción patógena e interés clínico Gran parte de nocardiosis son infecciones de carácter oportunista; no produce toxinas, pero contiene en su pared bacteriana alta proporción de lípidos que le confiere una resistencia a los sistemas de defensa (macrófagos, linfocitos, etc.); tiene capacidad de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos (macrófagos) como parásito intracelular y solo crece cuando las defensas del individuo se encuentran bajas; las manifestaciones clínicas mas frecuentes son: A. Nocardiosis pulmonar - causada sobretodo por Nocardia asteroides que produce lesiones pulmonares con abscesos, inflamación diseminada semejante a la tuberculosis; pueden surgir áreas de necrosis y diseminarse por sangre a otros órganos provocando septicemia. B. Micetomas (lesiones granulomatosas) de carácter crónico originadas en eltejido subcutáneo donde se producen tumefacción, abscesos y pústulas y/o nódulos que al abrirse presentan exudados serosanguinolentos; generalmente causados por Nocardia brasiliensis y es frecuente en las extremidades inferiores y superiores; presenta periodos de remisión y es característico de climas tropicales;
Tema 23 - Bacterias anaerobias (patología e identificación) Anaerobias - todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con O2 a la presion atmosférica; presentan un metabolismo anoxibiótico => incapaz de utilizar O2 de
la atmósfera como aceptor final de electrones; en su lugar utilizan sustratos orgánicos como aceptores finales de electrones(respiración anaeróbica /fermentacion); la presencia de O2 puede ser (1) bactericida /toxica /letal directa o bacteriostático (crecerán de nuevo cuando las condiciones son favorables); (2) inhibir ciertos sistemas enzimáticos o la función reguladora primordial del metabolismo celular; (3) generan producto tóxicos al interaccionar sus componentes propios con O2; los anaerobios son las bacterias predominantes en la flora normal humana y en algunas partes p.ej. boca o intestino están en proporción de 1000:1 con respecto a la flora aerobia, por tanto, la mayoría de la infección que provoca los anaerobios son endógenas; dentro de los anaerobios se distingue => anaerobios estrictos y anaerobios aero-tolerantes/microaerofílicos (puede crecer a 2-8% de O2). Genero Clostridium - bacterias anaerobias esporuladas; son bacilos Gram+, anaerobios estrictos, forman esporas a nivel terminal o subterminal, presentan flagelación perítrica, móviles, no presentan capsulas excepto Clostridium perfringes; ampliamente distribuidas en el suelo, agua, etc. y altamente resistente a medios externos; responsable de infecciones e intoxicaciones muy graves (tétanos, botulismo, gangrena gaseosa, etc.); las especies mas patógenos actúan mediante la formación de toxina con poder toxico sobre el huésped; algunos podrían formar parte de la flora normal del hombre y animales.
Las especies mas importantes A. Clostridium que originan toxinas cuyo mecanismo de acción es neuro-toxico =>Clostridium tetanii - el agente etiológico de tétanos y Clostridium botulinum - agente etiológico del botulismo. B. Clostridium que originan toxinas que actúan sobre tejidos provocando histotoxicidad =>Clostridium perfringes - agente etiológico de la gangrena gaseosa; para su penetración en el organismo se requieren lesiones previas. C. Clostridium que originan toxinas que actúan sobre el tracto digestivo (clostridios entero-toxicos) => Clostridium difficile - responsable de trastornos gastrointestinales no graves. D. Clostridium responsables de cuadros purulentos (clostridios piógenos) => Clostridium perfringes; es frecuente la presencia ademas, de otras bacterias anaerobias. Acción patógena e interés clínico A. Clostridium que ejercen acción neuro-toxica sobre las personas (C.tetanii y C.botulinum) Clostridium tetanii - es un bacilo Gram+ pequeño, formadora de esporas (aspecto de tambor o cerilla), habitan la tierra y el intestino del hombre y animales; produce 3 toxinas responsables del cuadro típico del tétanos que son transportadas vía sanguínea o humoral hasta SNC bloqueando la liberación de neurotransmisores, originan hiperactividad de las neuronas motoras que da lugar a convulsiones y parálisis espástica o espasmo muscular a nivel periférico; se ve alterado el sistema muscular variando el ciclo de contracción-relajación de forma que este entra en fase de contracción y no se recupera (rigidez tetánica / epistótonos). Para que se produzca el tétanos es necesario una serie de condiciones tales como que el microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida profunda (cortante, punzante, mordeduras, arañazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras por decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que facilita la infección anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas deClostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo de incubación (5-7 días), se origina su acción patógena; es rara que se produzca de forma local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es importante la detección precoz y medidas profilácticas (vacunación se renueva cada 10 años).
Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, móviles por
su flagelación y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes sobre las personas que originan parálisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patógena sobre el organismo seraneuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que solo se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30ºC, pH neutro o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son de carácter proteico y termolábiles (se destruyen a temperatura 100ºC durante 5 minutos o 70ºC de 30-60 minutos). El mecanismo de acción de las toxinas botulínicas => a traves de los alimentos contaminadosllega esta neuro-toxina al tubo digestivo del hombre y producirá toxinfección alimentariainicialmente; de aquí via sanguínea y linfática llega hasta sistema nervioso periférico donde actúa en las terminaciones nerviosas, originando parálisis en el musculo esquelético y otras manifestaciones neurológicas como visión borrosa, fotofobia, sequedad de boca, lengua y faringe, disfagia, disartria (dificultad al hablar), debilidad de los musculos (flacidez) incluyendo los respiratorios que puede llegar mortal por fallo respiratorio y arritmias cardíacas (depende de la cantidad de toxina o del germen); su periodo de incubación en torno 18-36 horas después de la ingestión del alimento contaminado y los cuadros mas graves se originan en un periodo de incubación inferior a 24 horas. B. Clostridium que ejercen acción histo-toxica en múltiples tejidos Clostridium perfringes - ejercen un efecto toxico importante pero no actúan sobre SNC; son Gram+, anaerobia estricta, la única especie capsuladas, ampliamente distribuida en el suelo; de aquí a traves de heridas profundas, puede pasar al hombre produciendo gangrena gaseosa; también puede encontrarse en la flora intestinal; capaz de formar toxinas que actúan sobre los tejidos, entero-toxina, hemolisina, neuroaminidasa. El mecanismo de acción => tras la vía de entrada (heridas) en condición anaerobiosis adecuadas, germinan las esporas y proliferan; es frecuente que se contaminen con otro tipo de bacterias aerobias que consiguen agotar el oxigeno aumentando las condiciones de anaerobiosis, se disminuye el pH aumentando el acido láctico y facilitando la liberación de las enzimas proteolíticas y sustancias toxicas; se producirán los efectos lesivos y graves sobre los tejidos extendiéndose a los vecinos, se romperán las estructuras celulares a nivel de sus membranas, se destruirán las celulas hemáticas, las celulas endoteliales, las membranas de las celulas musculares originando procesos de dermo-necrosis con daño tisular (gangrena). Ademas de provocar la gangrena gaseosa a traves de heridas infectadas, C.perfringes es también el agente etiológico de una toxo-infección alimentaria producida por la ingestión de carne contaminada provocando cuadros diarreicos y dolor abdominal leve; existen otros casos mas excepcionales y graves que da lugar a cuadros diarreicos muy acuosos y sanguinolentos, vómitos y estado de shock producido por C.difficile.
Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Toma de muestra representativa, adecuada y estéril en medios específicos de transporte anaerobiosis con sustancias reductoras (bolsas generadoras de CO2) que crean atmósferas sin O2 o en una jeringa sin aire (tapando la aguja). - Se hará un examen directo (tinción de Gram) donde se pueden apreciar las formas de esporas (palillos de tambor); también se puede realizar tinción de esporas. - Se cultivaran en medios de cultivos específicos como ASA (agar sangre anaerobio); incubación a 37ºC en 48 horas en condición anaerobisis, utilizando unacampana con un sobre generador de gas CO2, da lugar a la liberación de H y CO2; el O2 que existe en el anterior de la campana, se une al H, forman H2O que se depositan en forma de gotitas en las paredes, también hay que introducir un indicador de anaerobiosis (una tira reactiva). - Pruebas bioquímicas => cuando existe crecimiento en el medio anaerobio, se monta directamente el API en un recipiente/ una caja, también anaerobio.
Bacterias anaerobias no formadoras de esporas - crecen en ambientes de bajo potencial oxido reductor o ambientes microaerófilos; son ampliamente distribuidos en la naturaleza y muy pocas capaces de producir cuadros patógenos graves al hombre; gran parte de ellos forman parte de la flora gastrointestinal, vaginal o bucal del hombre, no ejerciendo efecto patógeno alguno. Las especies mas importantes A. Bacilos Gram+ no esporulados: - Lactobacillus => microaerófilos, crecen mejor en anaerobiosis; son flora habitual de la boca, vagina e intestino del hombre; son de gran utilidad a nivel industrial (produce acido láctico para los yogures); no intervienen en ningún proceso patógeno para el hombre. - Propionibacterium => son anaerobios, pueden crecer en ambientes microaerófilos; forman parte de la flora normal intestinal, tracto urinario y piel. - Bifidobacterium => es flora intestinal del hombre y no son patógenos. B. Bacilos Gram- no esporulados: - Bacteroides => son flora intestinal, vaginal y bucal del hombre y se ha asociado en ocasiones a procesos gastrointestinales, especialmente Bacteroides fragilis que actúa comooportunista. - Fusobacterium => solo la especie Fusobacterium nucleatum se asocia a algunosprocesos patógenos en el aparato respiratorio y tracto genital femenino, de carácter oportunista. C. Cocos Gram+ no esporulados: - Ciertos Streptococcus anaerobios que se encuentran frecuentemente en la floragastrointestinal y bucal; no son patógenos. - Peptococcus => no produce efecto patógeno sobre el hombre
D. Cocos Gram- no esporulados: - Veillonella => forma parte de la flora intestinal y bucal y no son patógenos para el hombre. Acción patógena e interés clínico Salvo excepciones, no son relacionados con procesos patógenos y la patogenicidad que pudiera desencadenar alguno de ellos depende sobre todo de las circunstancias del huésped (oportunistas); pueden producir infecciones post-quirúrgicas, complicaciones de escaras o ulceras por decubito, complicaciones de herida en general. Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Toma de muestra en condiciones adecuada (anaerobiosis) - Examen directo (tinción de Gram) - Se aislaran en medios anaerobiosis (ASA/ANA - agar sangre anaerobio) - Pruebas bioquímicas se realiza con API en condición anaerobia
Tema 24 - Espiroquetas (Treponema, Borella y Leptospira); patología e identificación La familia Espiroquetaceas (con interés clínico para el hombre) - Treponema, Borrelia y Leptospira; corresponden a especies bacterianas cuya morfología es filamentosa, helicoidal o espiral con filamentos axiales relacionados con su movilidad; presenta una pared celular fina y flexible de lipopolisacárido y lipo-proteica donde se encuentran la mayoría de Ags específicos de estas; son Gram(difícilmente se tiñe), también se pueden visualizar por el microscopio de contraste de fases; presentan un metabolismo oxidativo y/o fermentativo(aerobias o anaerobias facultativas); difundidas en las aguas, el suelo y como agentescomensales en las mucosas del hombre y animales. La familia Espiroquetaceae se divide en 5 generos: - Genero Espiroqueta => espiroquetas mas grandes y no existen especies patógenas para el hombre. - Genero Cristispira => son de tamaño algo menor que el Espiroqueta y no es patógeno para el hombre. - Genero Treponema => son espiroquetas muy helicoidales, muy finas, pequeñas y móviles; son microaerofílicas y presentan un metabolismo fermentativo; existen especies patógenas para el hombre - Treponema pallidum (el agente etiológico de la sífilis). - Genero Borrelia => son espiroquetas mas grandes que Treponema; son microaerofílicas y presentan pocas espiras que son amplias e irregulares; su metabolismo es fermentativo y son difíciles de cultivar en medios artificiales; pueden provocar fiebres recurrentes al hombre transmitido por artrópodos. - Genero Leptospira => son espiroquetas largas, muy finas y con numerosas espiras, profundas y regulares; es difícil su visualización aunque se suele utilizar microscopia de contraste de fases; son aerobias con un metabolismo oxidativo; se cultivan con facilidad en medios artificiales; ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en las aguas; pueden parasitar al hombre provocando leptospirosis.
Genero Treponema - son espiroquetas pequeñas, finas con un numero de espiras entre 520 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tiñe difícilmente con Gram y se tiñe mejor con
Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro y de contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de cultivo in vivo para crecer (testículo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial oxido-reductor (microaerofila), presentando en ocasiones una respiración anaerobia y un metabolismo fermentativo; el especie patógena para el hombre es Treponema pallidum que transmite la sífilis por contacto directo; existen dentro del genero Treponema especies comensales de las mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo digestivo, etc. que no son patógenos para el hombre y se pueden cultivar. Treponema pallidum es la especie mas importante por su difusión cosmopolitana; es el agente causal de sífilis; no son capaces de vivir fuera del organismo humano, ya que mueren por desecación; su transmisión es por contacto directo ( vía sexual) y si no se detecta a tiempopuede durar toda la vida; mecanismo de acción: - Periodo primario de la sífilis => comienza tras un primer contacto con lesiones ricas en treponemas presentes en las mucosas; periodo de incubación 10-90 días (termino medio de 21 días) aparece en la zona genital un chancro primario con abundantes treponemas, se van diseminando vía hemática y linfática a otras localizaciones convirtiendo-se en unaenfermedad sistémica; es frecuente su multiplicación en ganglios próximos a la zona genital originando pequeñas tumoraciones (adenopatias); transcurrido un tiempo corto de 2-6 semanas estos signos desaparecen espontáneamente y entra en una fase silente. - Periodo secundario o sífilis florida => surge después de un tiempo entre 2 meses y 2 años de la fase silente; de forma súbita se produce una espiroquetemia en general muy florida por las manchas en la piel y en las mucosas, muy ricas en treponemas y altamente infecciosas; también puede surgir excepcionalmente una forma eruptiva como lesiones en otros órganos, fiebre en ocasiones, pústulas o pápulas muy ricas en treponemas; este cuadro clínico de carácter sistémico remite a las pocas semanas (2-6 semanas), volviendo a entrar en una nueva fase de latencia. - Periodo terciario o sífilis terciaria => surge tras la fase de latencia entre 3-30 años, una forma muy grave con mal pronostico; el numero de treponemas en sangre es muy escaso y muy abundante en ganglios, bazo, huesos, sistema nervioso (neuro-sífilis) y aparato cardiovascular; es frecuente la formación de granulomas, necrosis, gomas, parálisis general progresiva, aneurisma aórtico, etc. Resumen de la evolución de sífilis => Incubación 10-90 días (termino medio 21 días) - Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 años) - Periodo secundario/ sífilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 años) - Periodo terciario/ Neuro-sífilis forma muy grave con mal pronostico. Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Treponema pallidum - Treponema pallidum se aísla muy difícilmente, no crece en medios in vitro, solo lo hace en medios in vivo (testículos de conejo) y el diagnostico de la infección se establece durante los periodos primario y secundario mediante muestras de exudados, condilomas, etc. - Examen directo al microscopio de campo oscuro o microscopio de contraste de fases o microscopio de fluorescencia de una tinción de Giemsa o tinción Nitrato de plata (sales de plata; es una técnica difícil de efectuar, reservada a los laboratorios especializados, útil en la detección de Pneumocytis carinii, Legionella, Treponema, hongos, Rickettsias). - Pruebas serologícas => se realiza la prueba de la presencia de Acs anti Treponema pallidum en el suero del paciente con Ags específicos de Treponema pallidum que presentan una sensibilidad y fiabilidad del 100%; los resultados dependen del periodo de sífilis en el que se encuentre; también se incluyen las inmunofluorescencia indirecta, así como las de hemo-aglutinación pasiva partiendo de hematíes tratados con Treponema pallidum que es muy sensible y económica.
Diagnostico serológico de las sífilis - existe 2 tipos de pruebas (no treponémicas y treponémicas) a) No treponémicas => son de gran sensibilidad y fácil de hacer; se usa para prueba de screening y si resulta (+), hay que confirmar con pruebas treponémicas; también se utiliza como un seguimiento de la enfermedad; se le llama también prueba de WASSERMANN; consiste en enfrentar el suero del paciente con sustancia lipídica "cardiolipina" que no es Ags treponémicos; si existen Acs anti Tp en el suero, reaccionaran con la cardiolipina (+); pero al no ser la cardiolipina un Ags treponémicos, puede dar lugar falsos positivo con otras enfermedades; 2 tipos de pruebas => VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) y RPR (reagina plasmática rápida) son pruebas de aglutinación con partículas de carbón (darán grumitos grises). b) Treponémicas => se utilizan como prueba confirmativas con varias técnicas: (1) FTA (técnica fluorescencia de Acs anti Tp) enfrentando Ags de Tp con posibles Acs anti Tp en el suero del paciente; (2) FTA abs donde previamente se absorben posibles Acs naturales anti Tp saprofitos; (3) TPHA (Tp Haemagglutination Assay) que tiene como base hemaglutinación y sencillo de realizar (no se necesita microscopio fluorescencia); (4) también se puede utilizar pruebas de ELISA para detectar IgM y IgG; todas son pruebas muy especificas; no se utilizan para el seguimiento, porque sera siempre resulta (+). Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamaño con espiras mas amplias e irregulares con extremos afilados y son móviles; las especies patógenas para el hombre y los animales,originan fiebres recurrentes endémicas y epidémicas; es microaerofílica con un metabolismo fermentativo; se tiñen con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro, pero requiere medios muy específicos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se transmiten por piojos y por garrapatas. Acción patógena e interés clínico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy cosmopolita, en ocasiones endémica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del huésped, ayudadas por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dará lugar a micro-traumas en la piel y facilitan el paso de dichas borrelias; después de unos7 días de incubación se originan fiebres, dolores musculares, cefalea, etc; clínica que dura unos 10 días y luego desaparecer, produciendo posteriormente recurrencias; no es una enfermedad grave y es fácil de tratar, especialmente con tetraciclinas.
Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y móviles; se tiñen débilmente con Gram, también se pueden teñir con Giemsa; su metabolismo es oxidativo (crecimientoaerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parásitas; puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el reservorio son animales, consideradas como zoonosis.
Tema 25 - Rickettsias, Chlamydias y Micoplasmas (patología e identificación) Genero Rickettsia - son parásitos celulares estrictos (porque su dotación enzimática es muy escasa) de los artrópodos (crecen muy bien en el citoplasma); son coco-bacilos Gram-; producen en el hombre enfermedades transmitidas por piojos, garrapatas, pulgas y ácaros.
Especies mas importantes de la familia Rickettsiaceae - hay 3 géneros importantes => Rickettsia, Rochalimaea y Coxiella (Coxiella burnetti es coco-bacilo Gram+ que origina la fiebre Q). Acción patógena e interés clínico: (1) Tifus exantemático epidémico - producido por R.prowazekii; mediante la picadura de piojo; tras el periodo de incubación de 1-2 semanas, aparecen escalofríos, fiebres altas (40ºC), cefaleas, dolores generalizados, nódulos inflamatorio de los capilares, arteriolas, vénulas, la piel y musculos (dificulta la corriente sanguínea y en casos graves puede provocar gangrena en las extremidades); es frecuente la formación de maculas rosadas y posteriormente pápulas y petequiales. (2) Tifus murino o endémico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga, garrapatas y ácaros; tras el periodo de incubación de 4-15 días, se produce fiebres altas, cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clínico leve sin complicaciones ni recidivas como el tifus exantemático. (3) Fiebres manchadas de las montañas rocosas - producida por R.rickettsiitrasmitidas por las garrapatas; tras el periodo de incubación de 3-6 días, aparecen fiebres altas, mialgias generalizadas y una mancha negra en la zona de la picadura; en España la especie mas extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre botonosa o exantemática mediterránea, transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del perro); tras el periodo de incubación de 2-6 días provoca una mancha negra a modo de botón en el lugar de la picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se suelen complicar y responden bien al tratamiento. (4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalación de esta u otras(presencia de artrópodos), la vía de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el periodo de incubación de 3 semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas y cuadro clínico leve. Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Rickettsia Se toma 2 muestras de sangre en estadios febriles (cuando hay mas Rickettsia): - La 1ª se centrifuga para obtener un sedimento sanguíneo (concentración alta de Rickettsia); se usa para realizar varias tinciones p.ej. May-Grunwald-Giemsa (las rickettsias aparecen de color purpura), tinción Gram (resulta negativo para Rickettsia y positiva para Coxiella burnetii), tinción inmunofluorescencia y estudios de microscopia electrónica (para observar); el sedimento también se usa para sembrar en medios de cultivo celular o embriones. - De la 2ª se obtiene sueros para pruebas serologícas (buscando títulos de Acs), con tecnicas inmunofluorescencia, seroaglutinación o ELISA.
Genero Chlamydia - se consideran mas próximos a virus que a bacterias; son parásitos intracelulares estrictos (carecen de mecanismo biosintético auto-suficiente) del hombre y animales; son cocos pequeños de Gram-, inmóviles; poseen ADN y ARN y su multiplicación es por división binaria (a diferencia de virus); es capaz de vivir en medios intracelulares durante mucho tiempo sin presentar una sintomatología clara lo que facilita la cronificación de procesos infecciosos. Especies mas importantes - dentro de la familia Chlamydiaceae: - Chlamydia psittaci => parásito intracelular de animales y excepcionalmente del hombre(tras la inhalación de heces de pájaros infectados), provocando brotes neumónicos de distinta gravedad. - Chlamydia trachomatis => parásito intracelular del hombre, provocandoinfecciones sistémicas o locales de distinta gravedad y afectando especialmente a los genitales y a los ojos. Acción patógena e interés clínico - se multiplican en el citoplasma de la célula que parásita, presentando un ciclo con 2 tipos celulares diferentes: - En 1er periodo formara una célula densa o corpúsculo elemental con gran resistencia a la sequedad, lo que permitirá la dispersión de Chlamydia; es la forma infectiva. - En 2nd periodo formara una célula mas grande de menor densidad o corpúsculo reticulado, que es responsable de la división binaria y por tanto de crecimiento clamidias. El proceso del ciclo => la forma infectiva (corpúsculo elemental) penetra en la célula que va a parasitar ayudado por los Ags específicos, se produce infección celular, se forma una vesícula citoplasmática que bloqueara los mecanismos de defensa de la propia célula; a partir de aquí este corpúsculo elemental aumenta su tamaño, su pared se hace mas fina y permeable permitiendo el paso de complejos enzimáticos, ATP y otras sustancias que van a necesitar de la célula que parasitan; el citoplasma de la clamidia se hace mas denso y esponjoso y aparece la segunda forma, donde comienza a multiplicarse por división binaria. Cuadros clínicos de Chlamydia trachomatis: - Tracoma => tras un contacto directo se produce una infección crónica en el epitelio conjuntival y corneal, siendo frecuentes las recaídas y sobre infecciones con evolución lenta hacia la ceguera; frecuente en edades infantiles. - Conjuntivitis neonatal => aparece entre la primera y la segunda semana después del nacimiento; surge una conjuntivitis purulenta al neonato, asociada a infecciones genitales por clamidias en la madre; puede evolucionar positivamente o hacia lesiones análogas al Tracoma. - Linfogranuloma venéreo => es una infección que se trasmite por contacto venéreo. Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico del genero Chlamydia Debido al elevado riesgo de infección en el laboratorio al manipular clamidias se suelen utilizar metodos indirectos (serológicos) a veces tambien se realiza examenes citologicos en cultivos específicos. - Se toman muestras de secreciones oculares y/o genitales - Se realiza un examen directo que incluyen una tinción de Giemsa y de Gram. - Se realizan técnicas citológicas - Se realizaran exámenes indirectos mediante técnicas serologícas (la m as frecuente ELISA) que son mas seguras y fiables; existe un kit para buscar clamidias.
Genero Micoplasma - es uno de los microorganismos mas pequeños existentes en bacteriología y se caracteriza por no contener pared celular => sensible a la presión omotica del medio (se lisan facilmente), su morfología es pleomorfismo y resistente a ciertos antibióticos cuya mecanismo de acción se establece en la pared bacteriana; se dividen por división binaria y vivir de forma independiente y crece bien in vitro a partir de medios artificiales enriquecidos; se encuentra extendidos en la naturaleza; son comensales de la mucosa del hombre; existe especies patógenas como Micoplasma pneumoniae que afecta al aparato respiratorio. Especies mas importantes - dentro de la familiaMicoplasmataceae están los géneros Micoplasma y Ureaplasma; solo unas 10 especies pueden producir algún efecto patógeno en las membranas celulares de las mucosas orofaríngeas y uro-genitales; la mas importante para el hombre es Micoplasma pneumoniae(produce neumonías); el Ureaplasma urealyticum es otra especie patógeno que se asocia a ETS junto con el Micoplasma hominis. Acción patógena e interés clínico - Su infectividad se relaciona con su adherencia (debido a una glicoproteína especifica) a los epitelios de las mucosas; su pleomorfismo puede adoptar formas filamentosas y alargadas que aumenta la superficie de contacto a las estructuras epiteliales a las que se une; una vez adherida, los cilios de las celulas epiteliales que tapizan la mucosa se paralizan y provoca alteraciones metabólicas en dichas celulas epiteliales. - Cuadros clínicos => cuadro pulmonares y mas raramente cuadros genitales o uro-genitales, siendo Micoplasma pneumonia es mas importante como el agente causal mas frecuente de las neumonías atípicas. - En casos excepcionales se han podido aislar Micoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum en procesos uretrales y genitales como salpingitis, vaginitis, prostatitis, cervicitis, etc. (son casos muy raros) Aislamiento - caracteres bioquímicos - diagnostico - Se toman muestras de la mucosa faríngea, secreciones uretrales, exudados, muestras de esputo, de sangre, etc según la patología. - Se realiza un frotis de la muestra que se puede observar en campo oscuro con nigrosina, al microscopio de contraste de fases o con la tinción de Giemsa (se tiñe débilmente). - Se siembra en medios específicos y con un alto grado de humedad para evitar la desecación. - Se realiza pruebas bioquímicas => fermentacion de glucosa, prueba de arginina, ureasa, etc.; existe un kit de la detección micoplasmas. - Metodos serológicos son mas rápidos, mas fiables y mas utilizados en la actualidad (inmunofluorescencia y ELISA).
Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de gaviota (en cultivos jóvenes); son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar; no fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de muchos animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extra-intestinales (meningitis, endocarditis, artritis séptica), especialmente en pacientes con SIDA. Especies clínicamente importantes para el hombre - C.jejuni, C.coli y C. laridis sonagentes etiológicos de diarrea; C.fetus subsp. fetus produce septicemia en pacientes inmuno-suprimidos. Aislamiento a partir de "heces" - la siembra inmediata en medios selectivos a la toma de muestra; si se tiene que posponer, se utilizaran medios de transporte especiales (Cary-Blair o Campy-Thio) donde se mantiene viables; el cultivo de campylobacter tiene que cumplir 3 requisitos => (1) empleo de medios selectivos p.ej. "Campylosel" contiene sangre de cordero con ATB y antifúngico o "Skirrow" contiene sangre de caballo con ATB (2) uso de atmósfera reducida de O2/ microaerofílica se consigue mediante sistema de evacuaciónreemplazo hasta lograr 5% de O2, 10% de CO2 y 85% de N2 o campanas anaerobios con sobres comerciales que generan la atmósfera deseada. (3) temperatura de 42ºC en aislamiento inicial entre 24-48 horas (para inhibir la flora fecal acompañante), después pasa a 37ºC el 3º día; las placas han de incubar hasta 72 horas antes de descartarse como negativas; a esta temperatura se consigue el máximo aislamiento deC.jejuni y C.coli. Si pretende aislar otras especies de campylobacter distintas a C.coli y C.jejuni => ha de emplear medios selectivos sin cefalosporinas, incubación a 37ºC, atmósfera microaerofílica, incubación de 7 días. Identificación - los campylobacter termofílicos dan lugar a colonias grises, incoloras, mucosa y no hemolíticas; se les hace una tinción Gram ( bacilos Gram- con forma de S en cultivo joven y en cultivo viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para observar la movilidad; son oxidasa y catalasa positivos; para diferenciar entre las especies se puede montar un API o se realizan varias pruebas => (1) crecimiento a distintas temperaturas, (2) sensibilidad al acido nalidixico y a la cefalotina (3) hidrólisis del hipurato (se introduce una tableta dentro de un tubo inoculado, dará + si cambia a color amarillo). Campylobacter jejuni => crecimiento a 42ºC, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina Campylobacter coli => crecimiento a 42ºC, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina Campylobacter fetus => no crecen a 42ºC, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a Cefalotina Campylobacter laridis => crecimiento a 42ºC, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y Cefalotina Patogenia y patologia - C.jejuni es la especie con mayor frecuencia se asocia a infeccion en el hombre (gastroenteritis con eliminación de sangre en heces), se adquiere por via oral (comida y bebidas contaminadas) o por contacto con animales infectados; sensible a pH gástrico (debe ingerirse una concentración elevada de ellos para que se produzca infeccion); se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamación; en ocasiones puede pasar al torrente circulatorio y desarrollarse un cuadro de fiebre entérica; la diarrea acompañada de dolor abdominal agudo, dolor de cabeza y fiebre; la infección es autolimitada resolviendose en una semana sin necesidad de ATB; los casos graves se trata con eritromicina.
Helicobacter Pylori - se aislaron por 1ª vez (1982) del estomago de pacientes con
lesiones gástricas y ulcera péptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran actividad ureasa; se les denomino Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a Campylobacter pylori y cuando demostraron que difería morfologicamente del genero Campylobacter, se propuso la creación de un nuevo genero Helicobacter que se incluyo la especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente descubrimiento, implicada en procesos de infección gástrica.
Metodos de detección de H.pylori - Metodos directos => las muestras mas idóneas para el aislamiento de H.pylori son las biopsias de las zonas pliegues de la mucosa gástrica del antro, cuerpo y fundos; se remitirán directamente al laboratorio para proceder a su cultivo inmediato en medios específicos para H.pylori; una porción de la biopsia se invertirá en la realización de un frotis para la tinción Gram o Giemsa. - Incubación => las placas deben incubarse en condiciones reducidas de O2 (5%), de 10% CO2 y 85% N2. Se consigue mediante sistema de evacuación-reemplazo o usando jarras de anaerobios con sobres comerciales que generan dicha atmósfera; la temperatura optima es de 37ºC (no se desarrolla a 25ºC, 30ºC ni 42ºC); en aislamiento primario, es conveniente incubar las placas hasta 7 días; Las colonias son de 1-2 mm de diámetro, translucidas y poco hemolíticas. - Identificación => son oxidasa+, catalasa+, ureasa+, hipurato- (algunas cepas son capaces de virar la urea de Christensen en minutos); es sensible a la cefalotina y resistente al nalidixico (algunas cepas pueden ser sensibles); no son fermentadora de carbohidrato; crece a 37ºC. Metodos indirectos: - Prueba de la urea rápida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio con alta concentración de urea y un indicador de pH. - Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se detecta con un espectrofotómetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un contador de centelleo (un método diagnostico rápido y no invasivo, pero requiere un equipo especial par al lectura). - Prueba serología => para detectar Acs utilizando la técnica de ELISA. Patología - existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en diversas patologías gástricas, pero se cuestiona como la causa de dichas infección; parece claro que es agente etiológico de gastritis aguda; se piensa que también pueda tener un papel en la gastritis crónica activa; en las ulceras pépticas se aísla 100% de pacientes con ulcera duodenal y 77% de ulcera gástrica; parece ser que su presencia no es suficiente para desarrollar la ulcera; no esta claro el papel que desempeña en la dispepsia no ulcerosa, en el reflujo gastro-esofágico y en el carcinoma gástrico; hasta 50% de la población adulta de >60 años es portadora de este microorganismo; se desconoce su modo de transmisión; se ha propuesto una posible adquisición del mismo por contacto con animales, región periodontal y transmisión persona-persona (ninguno están demostrados) Sensibilidad antibiótica - H.pylori es sensible in vitro a un gran numero de ATB, pero, el tratamiento in vivo es difícil; nunca se emplea mono-terapia porque no es eficaz, suelen administrarse varios fármacos juntos y aun así no se consigue erradicar al m.o. por lo que son frecuentes las recaídas tras la supresión de la terapia.
Tema 26 VIROLOGÍA CLÍNICA (características generales de los virus) Introducción - virus es un parásito intracelular estricto que requiere infestar una célula para sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy pequeños tamaños (filtrables) y se caracteriza por su mecanismo de replicación, organización y composicion; virología clínica se remonta al siglo XX y la composicion de un virus fue determinada por Schlesinger en 1933; en los últimos años se han descubierto otros agentes infecciosos mas simples como los viroides y los priones; - los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que causan enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales; - los priones => son proteínas que parecen estar codificadas por genes celulares y actúan como señales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los procesos físico-químicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o inflamatoria en el huésped; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras (scrapie), encefalopatía espongiforme en las vacas y enfermedades neurodegenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-Jacob /encefalopatía espongiforme progresiva y síndrome de Gerstman-Straussler-Streinker y el kuru); la patogenia (de todas) se caracterizan por desordenes progresivos como ataxia (dificultad motórica), demencia, deterioro cognitivo y motor; tras un periodo de incubación largo (meses o años), aparecerá los sintomas clínicos; el tropismo de la infectividad es SNC, seguido por el bazo y nódulos linfáticos; en el cerebro se detecta acumulación anormal de proteína-prion en el genoma del huésped; los priones son resistentes a las proteasas e induce una degeneración neuronal.
Concepto de virus - es un bloque de material genético (ADN o ARN) rodeado de una cubierta proteína (cápside) que le sirve como vehículo para su transmisión; algunos presenta membrana lipídica (envuelta) que se adquieren de la membrana citoplasmática de la célula infectada durante el proceso de salida; los virus envueltos tienen un matriz proteica que sirve como puente entre la nucleocápside y la envoltura; carecen de organelas citoplasmáticas para crecer y multiplicarse, por lo que necesitan la maquinaria de una célula huésped, pero si poseen algunos enzimas (nucleasas,
transcriptasas, etc.); viriónes la partícula viral completa (genoma + nucleocápside); se clasifican por el tipo de huésped que parasitan (virus animales, vegetales, bacteriófagos)
Estructura y morfología de los virus - son de tamaño entre 20-25 nm hasta 200-300 nm; su observación requiere un microscopio electrónico. - Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayoría de virus ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los virus ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core o núcleo) pueden ser moleculas lineales o circulares únicas o segmentadas en varios fragmentos. - Estructura de la cápside => su función es de proteger el genoma del medio extracelular y facilitar la entrada al interior de la célula; están compuestas de subunidades proteicas repetidas (capsómeros) que a su vez están compuestas de moleculas proteicas (protómeros); según la disposición que adopten los capsómeros /la cápside, se clasifican en virus de simetría helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20 caras triangulares y 12 vértices) y compleja. - Estructura de la envoltura => los lípidos de la envoltura es lipoprotéica y procede de la membrana célula infectada, pero las proteínas suelen ser virales desplazados a las proteínas celulares originales; en algunos casos, las proteínas incluyen una matriz (proteína M) que contacta/ engancha con la nucleocápside; los virus envueltos tienen estructuras glucoprotéicas (espículas) importantes para los procesos de adsorción y penetración al interior de la célula.
Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicación varían dependiendo de la estructura del virus y de su material genómico, pero en general conlleva pasos de => adsorción/ adherirse - penetración decapsidación - replicación - ensamblaje - liberación. - Adsorción => la unión de la partícula viral a la superficie de la célula; no requiere energía y no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la superficie del virión (proteínas de unión) y proteínas de la superficie de la membrana de la célula diana (proteínas receptoras); en los virus envueltos, la proteína de adherencia viral son las espículas de la capa externa de la envoltura. - Penetración => tras ser adherido, se penetra el virión completo o solo el genoma y las polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3 mecanismos: penetración directa, endocitosis o fusión; penetración directa => la membrana solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej. fagos); endocitosis=> los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la membrana citoplasmática de la célula huésped formándose una vesícula endosómica (mecanismo mas utilizados de los virus sin envuelta); fusión => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras de fusión: en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la membrana citoplasmática directamente y la nucleocápside se libera al interior del citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura viral se fusiona con la membrana celular formándose una vesícula endosómica que posteriormente libera la partícula viral hacia el citoplasma. - Decapsidación => se degrada la cápside viral para que el genoma viral pueda liberarse e iniciar la transcripción y la traducción; en la mayoría la penetración y la decapsidación se produce a la vez.
- Replicación => es la fase donde se produce la síntesis de todas las macro-moleculas virales; la célula huésped debe proporcionar la energía y los medios suficientes que a veces puede afectar su propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es esencial que los ARNm transcriban la información viral y la replicación de la información genética y que posteriormente mediante los componentes celulares se traducen para fabricar proteínas que se necesitan. a. Replicación de virus ADN bicatenario => tras la adsorción y la penetración, el ADN viral es
liberado y penetra en el núcleo + ARN polimerasas celulares => ARNm transcrito y traducido para la síntesis ADN viral; para el proceso de traducción => ARNm emigra al citoplasma celular y es traducido para formar las proteínas de la cápside => que posteriormente son transportadas al núcleo para ensamblar el virión completo que serán liberados por lisis celular; la excepción dará al virus ADN poxvirus (grande y de simetría compleja) que realiza el proceso de transcripción y traducción en el citoplasma celular utilizando su propia ARN polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden utilizar ARN de la célula huésped que se localiza en el núcleo. b. Replicación de virus ADN mono-catenario ( fagos, parvovirus ) => necesitan un
intermediario replicativo para formar ADN bicatenario que puede transcriben el ARNm (ARN polimerasa celular necesita como plantilla una ADN bicatenario); como resumen: ADN monocatenario + ADN polimerasas de la célula huésped => produce ADN bicatenario + ARN polimerasas celulares => forma ARNm c. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN viralpenetrado en el
citoplasma de la célula huésped es reconocida de inmediato como ARNm por los ribosomas, los cuales la captan e inician su traducción a proteínas virales y también un enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA polimerasa producida + ARN viral (se utiliza como molde) => replicación del ARN viral (todo ocurre en el citoplasma independientes del ADN del huésped). d. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-)
complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas sintetizara el ARNm que después le servirá de molde para la síntesis de nuevo ARN de polaridad (-) y también para la traducción de sus proteínas utilizando la maquinaria celular. e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+) queposeen un
enzima transcriptasa de reversión (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa); su genoma ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma) retrotranscriptasa => origina ADN
bicatenario que se integran al ADN celular y permanece alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN integrado se reactiva y es transcrito a ARNm vírico por la polimerasa del huésped y entonces, se completa el ciclo replicativo.
- Ensamblaje y liberación => se puede producir tanto en el núcleo como en el citoplasma, tras la replicación del genoma viral y la transcripción de las proteínas virales, los viriones se ensambla y se libera de la célula huésped; consiste en la unión ordenada del acido nucleico y de las proteínas para formar la nucleocápside, dando lugar a un virión viable; la liberación de los virus sin envuelta (desnudos) se produce por lisis celular; en caso de virus envueltos, salen al exterior por gemación de una zona de la membrana nuclear o citoplasmática (depende si son virus ADN o ARN); la zona de la membrana por donde se producirá la gemación, adquiere primero las espículas y las proteína de la matriz (codificadas por el virus), que atrae a la nucleocápside, fusionándose a la membrana, formándose la envuelta y liberándose el virión al exterior; en caso de poxvirus(mas grandes y complejos), estos pueden sintetizar sus propias envueltas; en caso deretrovirus, el virus no se libera de la célula sino que se integra en su genoma y permanecer así largo tiempo o de por vida; el proceso de ensamblaje y liberación es a veces ineficaz, formándose partículas no infectivas.
Taxonomía vírica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y según su forma del genoma, tamaño, forma, estructura, sintomatología clínica que producen, tropismo celular, etc; según el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica en virus ARN y virus ADN. Virus ARN 1. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+) que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la célula huésped ya que no se necesita transcribir ARNm) con la excepción de Reoviridae(bicatenarios) que utilizan su propia ARN polimerasa para transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y son resistentes al éter. - Familia Reo-viridae => tamaño intermedio (60-80 nm de diámetro), los únicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca problemas diarreicos), tiene forma redonda.
- Familia Calici-viridae => son pequeños (35-39 nm), tienen poca importancia en microbiología clínica; el mas importante /patógeno para el hombre es el virus de Norwalk(productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusión no es definitiva)
- Familia Picorna-viridae => son pequeños (20-30 nm); los géneros mas importantes son los Enterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).
2. De simetría cubica o icosaedrica con envuelta - mono-catenario de polaridad (+), todos se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y son sensibles al éter. - Familia Retro-viridae => son grandes +/- 100nm, de elevado Pm, contienen trazas de ADN y poseen transcriptasa inversa (retro-transcriptasa) en su dotación; adquieren su envoltura en la membrana citoplasmática de la célula huésped; se engloban todos los virus ARN tumorales; se divide 3 subfamilias: Oncoviridae (causan tumores y canceres), Spumaviride y Lentiviridae (dentro de esta estaría VIH).
- Familia Toga-viridae => son de 40-70 nm y adquieren su envoltura en la membrana citoplasmática; se incluyen la mayoría de los arbovirus (transmitidos por artrópodos - los arbovirus pertenecen a numerosas familias como Togaviridae, Flaviviridae, Arenaviridae, Reoviridae); se incluyen también los no arbovirus: Alphaviruscon virus Sindbis su principal tipo, Pestivirus con el virus de la diarrea mucosa como su principal tipo y Rubivirus con rubeolavirus su principal tipo.
- Familia Flavi-viridae => son de 40-50 nm y adquieren su envoltura en las membranas intracitoplasmáticas (antes se incluyen dentro de la familia Togaviridae y los han separado por su menor tamaño y por el lugar de su ensamblaje que ocurre en el retículo endo-plasmático); incluyen 2 géneros de importancia clínica: (1) Flavivirus (antes llamados arbovirus del grupo B) que destaca el virus de la fiebre amarilla y del dengue; (2) virus de la Hepatitis C ; actualmente se incluye de manera no definitiva al virus de la hepatitis G .
3. De simetría helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza su propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en el citoplasma y son sensibles al éter. - Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastón; el diámetro del cilindro +/- 70nm con longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmática; el genero mas importante es virus de la rabia.
- Familia Paramyxo-viridae => de tamaño 150-300nm, son pleomórficos predominandoformas esféricas rugosas y filamentosas; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmático; se incluyen 3 géneros: Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas, parainfluenza tipos 1,2,3,4A,4B...), los Morbilivirus ( virus del sarampión, entre otros) y los Pneumovirus ( virus sincitial respiratorio - causan bronquiolitis en niños pequeños).
- Familia Orthomyxo-viridae => morfológicamente semejante a la familia Paramyxoviridaepero mas pequeños 80-120nm, parecidos también a la familia Rhabdoviridae (los 3 proceden de un ancestro común); adquieren su envoltura en la membrana citoplasmática; se incluyen2 géneros: los virus de la influenza o de la gripe tipos A, B y C.
- Familia Arena-viridae => de tamaño 50-300nm, adquieren su envoltura de la membrana citoplasmática; algunos producen infecciones virales "lentas"; el mas importante es virus de la fiebre de Lassa (en Africa).
- Familia Bunya-viridae => de tamaño 80-100nm, de forma esférica, adquieren su envoltura en el aparato de Golgi; la mayoría de los géneros son arbovirus.
- Familia Corona-viridae => de tamaño 80-130nm, morfológicamente se parecen a Orthomyxovirus, pero sus proyecciones en la superficie a modo de pétalos o "corona solar"; adquieren su envoltura en las membranas intra-citoplasmáticas; la mayoría de los géneros son virus respiratorios de vías altas.
Virus ADN a. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - su genoma es ADN bicatenario con excepción de Parvo-viridae (mono-catenario); todos se ensamblan en el núcleo y sonresistentes al éter - Familia Adeno-viridae => de tamaño mediano 70-90nm; se conocen 34 tipos que afectan al hombre y mucho de ellos afectan el tracto respiratorio.
- Familia Parvo-viridae => de tamaño muy pequeño 18-26nm con genoma ADN mono-catenario; la mayoría no tienen importancia clínica, excepto parvovirus B19, pertenece al genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.
- Familia Papova-viridae => son de tamaño pequeños 45-55nm con ADN de tira circular; el genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades latentes y crónicas y algunos son oncogénicos.
b. De simetría cubica o icosaedrica con envuelta - son bicatenarios y todos se ensamblan en el núcleo con excepción de Irido-viridae que se ensamblan en el citoplasma. - Familia Herpes-viridae => de tamaño medio +/-100nm, adquieren su envoltura en la membrana nuclear y son sensibles al eter; de los 80 virus que existen, solo 8 tienen interés clínico para el hombre y se divide en 3 subfamilias: (1) Alphaherpesviridaecon géneros importantes el virus Herpes simples tipo 1 y 2 y el virus Varicella-zoster; (2)Betaherpesviridae con géneros Citomegalovirus al citomegalovirus humano (Herpesvirus humano tipo 5) y al Herpesvirus humano tipo6, y al genero Roseolovirus con elherpesvirus humano tipo 7 ; (3) Gammaherpesvirus que incluyen virus de Epstein-Barr(herpesvirus humano tipo 4) que provoca enfermedad de Beso, pertenece al genero Limphocriptovirus.
- Familia Hepadna-viridae => de tamaño 40-50nm, adquieren su envoltura en el citoplasma, son resistentes al éter y poseen un genoma ADN parcialmente bicatenario; el mas importante es el virus de la hepatitis B.
- Familia Irido-viridae => de tamaño grande 130-300nm, sensibles al éter, adquieren su envoltura en
la membrana citoplasmática y también se ensamblan en el citoplasma (a diferencia de otros); no tienen importancia clínica para el hombre, pero si en veterinariacomo el virus de la fiebre porcina africana.
c. De simetría compleja - Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o ovoide; se caracteriza como la única familia de virus ADN que se replica y ensambla en el citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina nuclear), de hecho su replicación es posible en celulas a-nucleadas (sin núcleo); sonresistentes al éter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la otra en la membrana citoplasmática; los mas importante son virus de la viruela , virus de la vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.
Principales familias de virus de interés clínico 1. Virus ARN (mono-catenario) 1.1. Familia Reo-viridae (tamaño mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 géneros, únicamente cabe destacar Rotavirus) Rotavirus (forma de rueda - el único bicatenario) => descubiertos en 1973 en niños con gastroenteritis; el único con importancia clínica (agente causal degastroenteritis esporádica y epidémica en lactantes y niños; la infección suele ser asintomática en neonatos; afecta principalmente a niños entre 6-24 meses; la prevalencia máxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubación 1-3 días, precediendo los vómitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 días; el virus se detecta en heces (dura bastante horas fuera del huésped) 1.2. Familia Calici-viridae (pequeños 35-40 nm - icosaedrica - sin envuelta - de polaridad+) - se ensamblan en el citoplasma) => tiene poca importancia en clínica, posibles agentes causales de gastroenteritis en cualquier día del año y a cualquier edad; es el agente Norwalk (virus que causan
gastroenteritis en EEUU) que ahora esta dentro de Parvovirus - Parvoviridae; se incluye de forma no definitiva el virus de Hepatitis E. 1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeños 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta - de polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus presenta, destacando 2 géneros Enterovirus y Rhinovirus. Enterovirus - se asocian con distintos síndromes clínicos como parálisis, meningitis aséptica,
encefalitis, miocarditis, pericarditis, pleurodinia, herpangina, infecciones agudas del tracto respiratorio y fiebre aftosa; son habitantes transitorios del tracto digestivo humano; existen >70 sero-tipos, siendo el tipo 72 es el virus de la Hepatitis A ; todos se diseminan por vía fecal-oral y la mayoría son asintomáticas; los mas importantes sonPoliovirus, Echovirus y Coxsackievirus; - Los virus de poliomielitis /Poliovirus son tres (tipos 1,2 y 3), mas temidos normalmente por la parálisis flácida (de cintura para-bajo) y deformidades aunque son complicación infrecuente; la vacuna es de Sabin (virus atenuados), también Salk (virus inactivados); la vacuna de poliomielitis se administra a los niños de 2-4-6-18 meses.
- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo). Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clínico, y deben descartarse otras causas; por el contrario si se trata de LCR. Rhinovirus - agentes etiológicos mas frecuentes del resfriado común (rinitis agudas); existen >100
tipos 1.4. Familia Toga-viridae y Familia Flavi-viridae (toga=envuelta - icosaedrica - de polaridad+ se ensamblan en el citoplasma); ambos son de forma icosaedrico, virus de RNA mono-catenario con envuelta; se incluyen la mayoría de los arbovirus; los v.Togaviridae (pequeño 40-70 nm, adquiere su envuelto en la membrana citoplasmática de la célula mientras los v.Flaviviridae (40-50 nm, lo adquieren de retículo endo-plasmático; dentro de Togaviridae están los arbovirus y los géneros no arbovirus como Alphavirus(sindbis), Pestivirus y Rubivirus (rubeola) dentro de Flaviviridae esta el virus Hepatitis C y otros que producen enfermedades como fiebre amarilla, dengue, de genero flavivirus que pertenecen a los arbovirus tipo B (transmitidos por artrópodos). Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 años; consta la
importancia como agente causal de malformaciones congénitas desde la epidemia de 1940 en Australia (un oftalmólogo australiano constato un elevado numero decataratas congénitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infección suele ser benigna y auto-limitada; sintomas => procesos
respiratorios superiores leves, erupción eritematosa y linfadenopatía sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se puede complicar con artritis transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o purpura trombocitopénica; muy importante la infección en gestantes por posibles aparición de sordera neuro-sensitiva, alteraciones cardíacas, cataratas, retraso del crecimiento y sintomas encefalíticos; la incubación dura 14-21 días; diagnosticopor método serológico (técnica de ELISA) para detectar IgG y sobre todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo indica inmunización frente al virus; actualmente es poco frecuente debido a la vacuna obligatoria que se incluye en latriple vírica (paperas, sarampión y rubeola) que se pone a los niños de15 meses (suele dar inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 años (solo las niñas); a los 11 años solo se dan vacuna de varicela. Clínica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampión; dura +/- 3 días y puede haber enantema palatino.
1.5. Familia Retro-viridae (de tamaño grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retrotranscriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIHque se estudia aparte. 1.6. Familia Orthomyxo-viridae (de tamaño 80-120nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) - en1918 tras la Guerra Mundial, mato mas personas que la propia guerra; esta compuesta por los distintos tipos de virus influenza/ Gripe (tipo A, B y C). Virus Influenza /la gripe española (empezó en España) - causan gripe, infección respiratoria aguda
epidémica normalmente durante mes de noviembre-abril; la vía de transmisión es aérea, periodo de incubación 1-4 días, seguido de clínicas tipo respiratorias superior, mas grave en los ancianos; se realizan campañas de vacunación todos los años (sobre todo a los ancianos y pacientes broncopulmonares), ya que presentan gran variabilidad antigénica segun el serotipo que causa la epidemia (tiene gran poder mutagénico); existe 3 tipos => A, B y C ( A y B causan epidemias de importancia); los influenza A se subdividen según la diferente composicion antigénica (en la envoltura) de la hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico es clínico; recientemente se introduce metodos de diagnostico de muestras clínicas de antígenos virales; el de mayor importancia clínica es virus respiratorio sincitial (VRS); para el diagnostico rápido se usa la inmuno-fluerescencia directa en aspirados naso-faringeos, esputos o biopsia de pulmón;existe un kit con Ags virales para detectarlos. 1.7. Familia Paramyxo-viridae (de tamaño grande 150-300nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => morfológicamente parecida al de anterior/
Orthomyxoviridae; todos ellos son causas importantes de enfermedad respiratoria en los niños; se incluyen 3 géneros Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas y parainfluenza), Morbilivirus (virus del sarampión), Pneumovirus (virus sincitial respiratorio) Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen infecciones
del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-traqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumónia en niños (segundo agente después del VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clínico. Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante
de neumónia y bronquiolitis en niños y recién nacidos; produce un amplio espectro de infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado común con abundante rinorrea; VRS esmuy contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la inmunidad no es completapor lo que se dan las reinfecciones (mas suaves); Es importante que la excreción de virus se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los inmunodeprimidos), por lo que al ingresar un niño en el hospital durante 1 o 2 semanas, puede ser contagioso todavía (es el agente mas frecuente de infección nosocomial en pediatría); las infecciones graves se trata con la ribavirina (inhibe la síntesis del ARN viral); el diagnostico rápido es la inmunofluorescencia en secreciones respiratorias. Virus del Sarampión - causa una enfermedad aguda, febril, exantemática, de gravedad variable que afecta a niños de 5-9 años, se contagia por vía respiratoria y conjuntival;sintomas clínico => los
primeros días como un catarro naso-oculo-faringo-laringeo, luego aparece fiebre, cara rubicunda, congestión de mucosa y a los 3-4 días aparece "manchas Koplik " (manchas blanquecinas diminutas delante del 1º y 2º molar) dura un par de días; empieza aparecer exantema, primero retroauricularmente, despues se extiende a todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en zonas distales, sube a la fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 días mejora bruscamente y desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento (dará inmunidad permanente); el diagnostico es por metodos serológicos.
Virus de la parotiditis - es una enfermedad endémica con incidencia todo el año; es rara en niños <
1 año, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a niños de 5-14 años, se transmite por vía aérea y por objetos introducidos a la boca (dará inmunidad permanente); clínica => tras 24horas de clínica inespecifica, aparecerán dolor y tumefacción de retro-parotidia y oído, aumento de fiebre, puede haber afectación de nervio facial leve y bilateral; complicación => meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis; diagnostico es por vía serológico; el diagnostico es por metodos serológicos.
1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamaño grande en forma de bastón, diámetro 70nm y longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => característica típica de su morfología es forma de "bala"; el mas importante es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua). Virus de la rabia - causa enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importancia histórica por
los trabajos de Pasteur; existe la obligación de vacunar todos los años a perros y gatos, ya que es una zoonosis en la que el hombre es un eslabón irrelevante; existen 2 formas epidemiológicas => urbana (lo adquieren perros y gatos no inmunizados) y salvática (los zorros); normalmente el virus esta presente en la saliva de animales rabiosos, transmitiéndose por mordeduras (son fuentes de infección humana); el diagnostico solía realizarse postmortem, mediante la observación de los cuerpos de Negri (cerebro); también se pueden cultivar en laboratorio; clínica de animales => cambian de carácter, se vuelven caprichosos, pierden apetito, ingerir objetos no engullibles autllan con ronca, irritabilidad creciente y muerden a personas y animales; mueren en 2 semanas; clínica de humanos => la incubación 1-3 meses depende del lugar de la mordedura; el virus se propaga por los nervios a una velocidad 1mm/hora; comienza con la alteración del sueño, dolor de la mordedura, también parestesias/ hormigueos de la zona, trastornos respiratorios (en la voz), posteriormente aparece espasmos faríngeos tras la ingestión de líquidos o solo de verlo (hidrofobia), salivación espumosa y espasmos en las extremidades (basta con pequeños estímulos de luz o ruidos, para provocar lo); las personas suelen morir por parálisis en pocas horas tras la afectación de bulbo-raquídeo; el cuadro normal es de 3-6 días, después mueren.
1.9. Familia Corona-viridae (de tamaño 80-130nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con proyecciones a modo de pétalos/ corona solar) en las membranas intra-citoplasmáticas; escasa importanciaen patología, únicamente causan el resfriado común y pueden estar involucrados en cuadros de gastroenteritis. 2. VIRUS ADN (bicatenario) 2.1. Familia Parvo-ridae (de tamaño muy pequeño 18-26nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistentes al eter) => son de tamaño muy pequeño y sonlos únicos que presentan ADN de una sola hebra (mono-catenario); algunos tienen importancia en veterinaria y solo destaca uno como patógeno humano (Parvovirus B19).
Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk ) - fue vinculado al eritema infecciosoen
1983; es benigna y afecta niños en edad escolar; presentan una erupción eritematosa en las mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades y tronco (respeta a las palmas, las plantas y los labios); los adultos son propensos a artropatía asociada, que se resuelve en 2-4 semanas; diagnostico por método serológico y metodos de ELISA .
2.2. Familia Papova-viridae (de tamaño pequeño 45-55nm - ADN de tira circular - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => son unos viruses oncogénicos (efecto cancerígeno), producen enfermedades latentes y crónicas, causantes verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de cérvix) y papilomas(Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de tipo clínico y serológico; prevención => se vacunan a las niñas de < 14 años. 2.3. Familia Adeno-viridae (de tamaño mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => producen principalmente patología al tracto respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en niños <6 años; el diagnostico se realiza mediante clínicas y técnicas serologícas. 2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamaño pequeño 40-50nm - ADN parcialmente bicatenario icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el núcleo - resistentes al éter) => su envuelta se adq uiere en la membrana citoplasmática y se ensamblan en el núcleo; en esta familia se encuentra virus hepatitis B que se estudiara a parte. 2.5. Familia Herpes-viridae (de tamaño medio +/-100nm - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el núcleo - sensibles al éter) => adquiere su envuelta de la membrana nuclear y se ensamblan en el núcleo; destaca 3 subfamilias => Alphaherpesviridae (VHS 1y2, virus Varicella-Zooster), Betaherpesviridae (CMV y Roseolovirus), Gammaherpesvirus (VEB/Limphocriptovirus); todos los virus producen infecciones latentes, capaces de reactivarse. Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin lesiones que
sirven de fuente de infección para individuos susceptibles (los virus de Herpes no se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en los genitales, transmitiéndose por vía venérea); cada individuo tiene un tropismo estable;suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesículas, costra y desaparece en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secreción oral, infección a nivel peri-oral, también otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente daran infección genital y se contrae por vía sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venérea mas frecuente; en mujer gestante se puede transmitir al bebe vía placenta o canal de parto o en los primeros días de vida; en general estos virus tienen capacidad oncogénicos como VEB (virus Epstein-Barr), puede producir cáncer cervical; el
diagnostico se realiza mediante la tinción de Giemsa de celulas raspadas de lesiones herpéticas, para observar las características de las celulas gigantes multi-nucleadas; también se cultivan en SHELLVIAL.
Citomegalovirus (CMV) - producen infección asintomática, pero con gran importancia
en huéspedes inmuno-comprometidos; las infecciones se pueden clasificar en congénitas, perinatales o pos-natales (antes o después del parto); es la causa mas frecuente de infección congénita; el CMV se ha detectado en saliva, orina, leche materna, semen, por lo que su transmisión es variada; también se transmite por transfusiones o trasplantes; en pacientes inmuno-competentes, normalmente son asintomática, si da clínica va a ser semejante a mononucleosis infecciosa ( virus Epstein-Barr ), comofiebre, adenopatias, hepatomegalia; en paciente inmunodeprimidos es diferente, en general dará fiebre, neumonitis, colitis, esofagitis, hepatitis, infección congénita y perinatal, puede dar retraso mental, ictericia y sordera; el diagnostico => por serología buscando Acs anti CMV (metodos ELISA ), cultivo en SHELLVIAL (artificial) ya que no se pueden cultivar en celulas vivas. Virus Varicela-Zóster (VVZ) - la varicela y el herpes zóster representan diferentes
manifestaciones clínicas de un mismo virus; la varicela es mas frecuente en niños y se caracteriza por fiebre y exantema vesicular generalizado; es una infección primaria mientras su reactivación producirá el herpes zóster, aparece normalmente en adultos (cuando hay una disminución de la inmunidad) que consiste en una erupción dolorosa circunscrita de lesiones vesiculares, acompañada de inflamación de las raíces dorsales de los nervios raquídeos o de los ganglios sensitivos craneales; los estadios son => macula - pápula - vesícula - umbilicación costra; característicamente existe estados evolutivos todos mezclado a la vez y prurito sobre todo en el tronco y cara (menos en las extremidades); el diagnostico sera tipo clínico y también por los distintos metodos en laboratorio => examen directo previa tinción Giemsa por microscopio electrónica, por serología (ELISA) y por cultivo celular.
Virus de Epstein-Barr (VEB) - es uno de los virus humanos mas ubicuos, linfotrópico y
oncogénico; la infección primaria suele pasar en la infancia, aumentando su sero-prevalencia 60-70% en jóvenes y 80-90% en adultos; el síndrome clínico mas frecuente es lamononucleosis
infecciosa (enfermedad de beso) que presenta fiebre, adenopatias, faringitis y linfocitosis con
linfocitos atípicos; VEB también se ha asociado a carcinoma naso-faríngeo y al linfoma de Burkitt; diagnostico => la prueba de Paul Bunnell es la detección de Acs heterofilos y también por método de ELISA.
Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) - es un virus de muy reciente aparición, se ha aislado
en síndromes linfo-proliferativos y se ha vinculado al exantema súbito (elevación brusca de la temperatura hasta 40ºC de 2-4 días, seguida de un descenso rápido que coincide con la aparición de un exantema maculo-papular que persiste 1-2 días; el diagnostico sera clínico y serológico. Herpesvirus Humano 7 - se descubrió en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos T, provocando exantema súbito; se investiga si tiene relacion con síndrome de fatiga crónica (que lo
padecen sobre todo mujeres mayores). 2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamaño grande 230400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el citoplasma;el mas importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y virus de la Vaccinia; - Viruela se contagia por inhalación y tras 15 días aparece fiebre, mialgias y erupción pápula vesicular dura y luego evoluciona a pústulas y a la curación; a veces puede provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infección bacteriana.
- Virus de la Vaccinia es muy próximo al virus de la viruela; en individuos inmunodeprimidos puede provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes es auto-limitado; es importante en los principios de la vacunación (Jennen); últimamente se investiga su utilización como vector para actuar como vacuna contra virus de Hepatitis B, Herpes simple y VIH, ya que su genoma es susceptible de poder insertarle secuencias de genes que codifiquen proteínas de otros virus y que se expresarían posteriormente cuando el virus se replique, con lo cual tendríamos Acs contra estos virus.
- Virus de Moluscum Contagiosum - provoca enfermedad cutánea benigna, contagiosa que pueda adquirir por compartir objetos o contacto sexual; aparece en epidermis lesiones nodulares blancas de aspecto nacarado de 2-10 mm que son indoloras; cualquier traumatismo provoca su contagio; desaparece entre 2 meses y 1 año.
Esquema de Virus Respiratorio
HEPATITIS VIRAL - es una enfermedad sistémica que afecta fundamentalmente el Hígado; se conocen 7 virus de la hepatitis, denominados A,B,C,D,E,F y G que pertenecen cada uno a familias y géneros distintos, pero que tienen todos un tropismo hepático (no tienen relación taxonómica); existen además otros virus que producen hepatitis, comoCitomegalo virus y el virus de Epstein-Barr; se pueden clasificar según la principal vía de transmisión y la tendencia a la cronicidad en 2 grandes grupos(1) transmisión fecal-oral y no cronifican: VHA, VHE y VHF (2) transmisión parenteral y pueden cronificar: VHB, VHC, VHD y VHG.
Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospechó mucho antes; virus ARN de la familia Picornaviridae (de pequeño tamaño 20-30nm, icosaédrica, sin envuelta, polaridad+) dentro del género Enterovirus, el tipo 72; la mayoría de infecciones son aguda sin cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de incubación(hasta 2 semanas). Transmisión - se disemina por la ruta fecal-oral (estrecho contacto persona-persona) con la
implicación de agua y alimentos que pueden causar brotes epidémicos; la mayor excreción del virus en heces se da en las semanas previas a la aparición de la ictericia, sobre todo en la fase tardía de la incubación; otras vías de transmisión del virus son posibles pero poco probables; existe casos durante todo el año, con un pico en otoño. Sintomatología clínica – suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infección
es asintomática y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubación 20-45 días, a continuación suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o dolor en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia. Diagnostico – requiere la confirmación del laboratorio; se observó el virus por la primera vez
por Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serología basada en la respuesta inmunitaria; el método más utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su fase aguda; también se pueden detectar Ags virales en heces (detectar Acs total de IgG y IgM no tiene utilidad clínicamente); IgM suele durar 6 meses; IgG confiere inmunidad y la mayor parte de nuestra población de >40 años los tienen; hasta la fecha no se han descrito casos de cronicidad. Prevención – las medidas más importantes son la higiene personal, lavado y desinfección de manos y
objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente mientras se mantiene las medidas de desinfección-esterilización, cloración y nivel higiénico-sanitarias; inmunización pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto paraprofilaxis pre-exposición (se estudia la relación coste-eficacia antes de utilizarla/ solo si viajan a zonas endémicas) como postexposición; inmunización activa => existe una vacuna con buenos resultados ( virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al año (3x).
Virus de la Hepatitis B (VHB) – es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae ( ADN parcialmente bicatenario, icosaédrica con envuelta, resistentes al éter), de gran importancia socio-sanitaria y distribución mundial (250 millones portadores asintomático – 1% desarrollan cirrosis hepática o carcinoma hepato-celular que son complicaciones más importantes); primeros casos se describieron en 1833 en Bremen (Alemania), por la administración de la vacuna de la viruela que contiene suero
humano, pero hasta los años 40-50 no se distinguió de la hepatitis A; en 1965 Blumberg descubrió el Ag Australia y se identificó el virus. Estructura – se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores
serológicos: - Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el gen S) que induce a la formación de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad. - Ag del core o nucleo-cápside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiológico que se mantiene de por vida); IgM-HBcAc se detecta como marcador más fiable de hepatitis B aguda. - Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronóstico de la enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicación del virus; HBeAc es unmarcador de buena evolución). -Además se distinguen su genoma ADN y una polimerasa. - El virión completo se denomina partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en sangre (como p.ej. HBsAg). Infección por VHB – la mayoría son sub-clínicas/ asintomática (50-80%) y solo se detectan en
controles serológicos; la mayoría de las infecciones sintomáticas son auto limitadas y se resuelven en menos de 6 meses (Hep.aguda); la lesión hepática puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (> de 6 meses se pueden cronificar); lasintomatología clínica es similar a la de Hepatitis A ; un periodo de incubación es de 1-6 meses; entre 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por vida (como portador asintomático o sintomático); en la mayoría de ocasiones la función hepática y la histología son normales, pero en otras ocasiones dan lugar a síndromes hepatitis crónica persistentes (HCP) y hepatitis crónica activa (HCA); HCP es menos progresiva que HCA (puede ser más grave y desembocar en cirrosis).
Epidemiologia – existen áreas hiper-endémicas, endemia media y baja (España está en baja); el
único reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto íntimo ( vía sexual, parenteral y vertical-perinatal) y mediante objetos personales o materiales de hospitales (familiares y personal sanitario corre un mayor riesgo); la existencia de HCP presenta un reservorio estable para el virus y asegura su supervivencia indefinida que se detecta en líquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis, lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordón);
Marcadores en la infección aguda auto-limitada (en el orden de aparición):
-HBsAg (aparece antes del 1º mes y desaparece antes de 6º mes) -HBeAg (aparece el 1º mes y desaparece antes del 3º mes) -DNA viral (aparece después del 1º mes y desaparece al 3º mes) -Anti HBc (aparece entre 1º-2º mes; Anti-HBc IgM desaparece antes del 5º mes => Hepatitis aguda) -Anti HBe (aparece al 3º mes) -Anti HBs (aparece antes del 7º mes) Prevención – es la medida más eficaz para combatir la infección; es un virus muy contagioso cuando
hay exposición parenteral; existe inmunización pasiva (gammaglobulina hiper-inmune eficaz en situaciones de pre y post-exposición ) y inmunización activa (vacuna de HBsAg que se administra universalmente a 0-1-6 meses que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).
Virus de la Hepatitis D (VHD) – descubierto en 1977; es un virus ARN incompleto /defectivo que requiere HBsAg para su replicación (adquieren su envuelta del virus B y si no hay infección de por VHB no la hay por VHD). Tipos de infección:
1-Coinfección => infección simultáneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso natural de VHB no se modifica; al resolverse la infección de VHB, re resuelve también la de VHD; clínicamente la hepatitis es más grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor (hasta 20%). 2-Sobreinfección => cuando el VHD sobre infecta a portadores crónicos de VHB; aquí si se modifica el curso natural de VHB y la mayoría de las sobreinfecciones (70%) desembocan en hepatitis crónica y acaban en cirrosis entre 15-20 años. El pronóstico de VHD depende de marcadores de replicación del virus (anti-HBe) => puede acabar en hepatitis crónica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicación => puede evolucionar a la curación.
Virus de la Hepatitis C (VHC) – es de reciente descubierto (1988 - aunque se sospechó desde hace mucho tiempo) del que quedan aún muchos interrogantes por resolver; en actualidad se sabe que VHC es responsable del 80-90% de los casos de hepatitis post-transfusional y del 20-50% de los hepatitis esporádica; es un virus del tamaño medio dentro de la familia Flaviviridae ( virus ARN icosaédrica
pequeño de tamaño 40-50nm con envuelta, de polaridad+ y sensibles al éter); se distingue regiones para la envoltura (E), el core (C) y otras no estructurales (NS). Infección por VHC – se diseminan fundamentalmente por la vía parenteral; es la causa más
frecuente de hepatitis post-transfusional, hepatitis esporádica y ampliamente distribuido entre ADVP (adicto a la droga de vía parenteral), pacientes en diálisis y hemofílicos; se puede transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor importancia que Hep.B);la clínica es similar a la de la hepatitis B; 25% cursan con ictericia y la tasa de mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado; el inicio no es muy brusco, es frecuente las recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 2025% acaban desarrollando cirrosis. Prevención – tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todavía no se
dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece, porque la sensibilidad de las técnicas más utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un accidente en el laboratorio o en la práctica clínica con sangre anti-VHC+, se debe realizar un protocolo de seguimiento serológico de la persona; existen evidencias de que VHC puede estar implicada en cáncer hepático.
Virus de la Hepatitis E (VHE) – se descubrió en 1983 y es responsable de la epidemias por transmisión fecal-oral en India, Paquistán, África del Norte y Méjico (países de baja salubridad); el curso es corto y parece ser que se puede transmitir parenteralmente, pero no transfusional-mente; el virus todavía no está catalogado, se parece más a los calcivirus da lafamilia Calciviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 35-40nm sin envuelta, de polaridad+); clínica => aunque no se cronifica al igual que VHA, tiene un pronóstico peor (la mortalidad 1-2%), más grave en gestantes del 3º trimestre del embarazo (mortalidad de 20%); la habitual vía de transmisión es a través del agua de bebida.
Virus de la Hepatitis G (VHG) – se transmite por vía parenteral; esta relacionado con virus de la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 40-50nm, con envuelta de
polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una coinfección con el VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad. Virus de la Hepatitis F (VHF) – se transmite por vía entérica (fecal-oral) SEROLOGIA DE LAS HEPATITIS VIRICAS (1993) Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis A – la mayoría de infecciones son aguda sin cronificarse (<1% se fulmina); se encuentra en las heces durante el periodo de incubación (hasta 2 semanas); su detección con fines diagnósticos no se emplea rutinariamente. - Ac Anti-VHA IgM => siempre es positivo en el inicio de la sintomatología clínica (hasta 3-6 meses); se usa como marcador de infección aguda; en Ag viral es detectado solamente en el hígado y no se utiliza para el diagnóstico. - Ac Anti-VHA IgG => su presencia demuestra un contacto previo con el virus (se mantiene durante largos periodos de tiempo). Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis B – la evolución clínica es variable (desde asintomática y anictérica hasta una enfermedad aguda que se puede complicar hacia la cronicidad, la cirrosis o forma fulminante fatal); es evidente su relación con el carcinoma hepatocelular; la determinación cualitativa y cuantitativa de ciertas proteínas virales (Ags) y de los Acs nos sirve para evaluar la situación actual y pronosticar el futuro de la infección. - Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito; debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y puede ser detectada durante el periodo de incubación (es el 1º marcador que aparece, incluso 2-6 semanas antes de que aparezca los síntomas, aunque pueda haber de 5-10% de hepatitis aguda sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio crónico; si la evolución es favorable desaparecerá a los 3-6 meses de la enfermedad; por el contrario, si se mantiene más de 6-8 se manas después o si no existe una disminución significativa de su título, es indicio de mal pronóstico y de evolución a la cronicidad. - Ac anti-HBs => es el indicador de recuperación de la enfermedad y el ultimo en aparecer(+/- a los 3 meses de su evolución); persiste durante mucho tiempo neutralizando al virus y confiriendo protección; en los individuos vacunados es el único marcador presente. - Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cápside y no se detecta serológicamente, ya que no se encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1º Ac que aparece en la enfermedad, detectable con los primeros síntomas de la enfermedad en la fase aguda y en la crónica (entre 3-5 semanas después de Ag Australia y es el 4º marcador en hacerse positiva); puede significar una infección pasada o curada dada la larga persistencia de estos Acs en el suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la protección frente a la enfermedad). - Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolíticamente degradado y antigénicamente diferente; es el 2º marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad crónica en las que histológicamente se corresponde con hepatitis crónica activa (HCA); su valor clínico se funda en su excelente correlación con la presencia de replicación viral y viremia; la sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su estudio es obligatorio en todos los sueros de HBsAg (+). - Ac anti-HBe => es el 5º marcador; su aparición indica buena evolución y una baja infectividad del paciente; en la mayoría de los casos es detectable poco antes de que desaparezca HBsAg, pudiendo encontrarlo (+) durante varios años después de la infección.
-DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3º marcador; su detección en el suero mediante la hibridación no es una técnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo en un elevado número de pacientes HBeAg (+).
Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis D 1º- Antígeno delta (HDcAg) => aparece fugazmente en sangre en la primo infección y su utilizad clínica es muy limitada. 2º- Anticuerpos Anti-Delta (Anti-HD IgM) => es el marcador más importante que aparece después de la aparición del Ag y se mantiene positivo a bajos títulos a un tiempo limitado si la evolución es favorable; persistirá su positividad a títulos altos en casos que evolucionan a la cronicidad. 3º- Anticuerpos Anti-Delta IgG (Anti-HD IgG) => aparecen más tardía y se mantiene positivo durante largos periodos de tiempo; su detección indica solamente contacto con el virus. Esquema evolutivo: -Coinfección de VHB y VHD = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (+) y AntiHD IgM (+) -Sobre infección de VHD en paciente con VHB = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (-) y Anti-HD IgM (+) 4º- RNA Viral (HD-RNA) => la positividad por técnicas de hibridación o PCR indica presencia del virus. Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis C - Anticuerpos Anti-VHC => se detecta empleando Ags sintéticos o recombinantes; pruebas confirmatorias de Acs Anti-VHC => se detectan por método Western Blot para ver las bandas. -RNA viral (VHC-ARN) => no se suele hacer porque la epidemia es corta. Marcadores serológicos para el diagnóstico de la hepatitis E – se están comercializando pruebas que detectan Ag y Acs específicos (IgG y IgM) mediante técnica de ELISA. DIAGNOSTICO DE LA INFECCION A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio): VHA => anti-VHA IgM VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM VHC => anti-VHC (totales) VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP) Criterios generales de interpretación:
-La presencia de anti-VHA IgM => es diagnostica de infección aguda por VHA. -La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM => es diagnostica de infección aguda por VHB;
-La presencia simultánea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda => se considera diagnostica de coinfección aguda por ambos VHB y VHD; la presencia de anti-VHD IgM y HBsAg en ausencia de anti-HBc IgM => indica sobre infección por VHD en un portador crónico de VHB. En cualquier caso, dada la situación epidemiológica actual en España, no parece recomendable la búsqueda rutinaria de la infección delta en pacientes ADVP. -La seroconversión de anti-VHC es un criterio fiable para un diagnóstico de infección aguda por VHC (cambio de negativo a positivo); la seroconversión suele retrasarse mas de 3 meses desde el comienzo de los síntomas, por lo que requiere el estudio de muestras de seguimiento al menos hasta el 6º mes; no se ha demostrado que la detección de anti-HVC IgM sea de utilidad en el diagnóstico de la hepatitis C aguda. Criterios de interpretación en pacientes ADVP – las tasas de seropositividad para VHB (anti-
HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los ADVP crónicamente infectados por VHB (positivos para HBsAg), la seropositividad para VHD (anti-VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es frecuente que los ADVP se hallen crónicamente infectados por uno o más de dichos agentes en un episodio de hepatitis aguda, resultando imposible precisar su etiología.
B-Hepatitis Crónica
Marcadores de rutina: VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG) VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg) VHC => anti-VHC Criterios de interpretación:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica => es diagnostica de hepatitis B crónica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infección crónica por ambos VHB y VHD. -La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crónica => es altamente indicativa de hepatitis C crónica, aunque no es un diagnostico seguro; la detección de ARN viral en suero mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de métodos de confirmación de anti-VHC, se considera que una re comprobación del resultado positivo mediante un segundo método de cribado (método screening con técnica de ELISA) que utilice Ags obtenidos por tecnología diferente, es suficiente para establecer la presencia de anti-VHC en pacientes con hepatitis crónica. VIH o SIDA Descubrimiento del virus – se sospechó desde 1981 en 5 casos de neumonía porPneumocystis carinii en varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el número de casos y se fue
asociando esta inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de Kaposi; en junio de 1982 se contabilizaron 439 casos y en EEUU se emite un informe para definir los casos de SIDA; en febrero del mismo año Montagnier expone la hipótesis de un retrovirus linfotropico pudiera ser el agente causante del síndrome; en Mayo de 1983 se aislo por primera vez el virus por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linfático de un paciente con linfadenopatia persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA (HTLV-III).
El virus – es un virus ARN de la familia Retroviridae, subfamilia Lentiviridae (=incubación lenta >10 años) con tipos 1 y 2; esta familia de virus se caracteriza por sintetizar ADN a partir de ARN viral, mediante una retro-transcriptasa; consta de nucleo-cápside y envoltura; es muy sensible a los agentes químicos y calor; sus principales genes son: a) Estructurales: -Gen GAG (Core) => proteínas 24 -ENV (Envoltura) => glicoproteínas 41, 120 y 160 -POL (Polimerasa) => es importante b) Reguladores => genes que regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no está completamente dilucidado
Patogenia – en la infección aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4 gracias a gp41 y gp120; por lo tanto, sus células diana fundamentalmente son los linfocitos T4 (aunque también se unirá a los linfocitos B que tiene CD4, a los macrófagos, a las células cerebral, y a los precursores de hematíes); este episodio se manifiesta como un cuadro pseudogripal; es importante saber que la respuesta inmunitaria en forma de Acs frente al virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3 semanas); a continuación el ARN se copia a ADN por acción de la transcriptasa inversa, se pone en circulación y se integra en el ADN de la célula (periodo de latencia); latencia o crecimiento es clave de la patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga durante periodos largos de tiempo (2-8 años incluso más), pero en un momento dado puede progresar la enfermedad con un progresivo deterioro de la inmunidad hasta desarrollar el SIDA; el ciclo biológico se resumen=> Entrada de virus – transcripción de ARN al ADN – integración en la genoma de T4 – formación de nuevos viriones tras periodo de latencia (al salir, el virión tomara en su salida parte de la membrana
celular para utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye los T4, se paraliza el sistema inmunológica y acaba provocando el SIDA.
Epidemiologia – las vías de transmisión del virus => por sangre, sexual y vertical-perinatal; en España la tasa de transmisión por sangre es importante (el principal grupo afectado sonlos UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los mas afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan 15-50%, cobrando una especial importancia en África; la transmisión al personal sanitario o similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso (o también de líquidos donde se haya cultivado al virus). Sintomatología clínica de SIDA – desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle la enfermedad, suele transcurrir 6-10 años; el estudio de la evolución de SIDA puede realizarse por las manifestaciones clínico que van apareciendo o por marcadores bioquímicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinación de la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha convertido en principal marcador de la evolución de la enfermedad. Fases de la enfermedad (1) fase de la infección aguda => la mayoría de los pacientes experimentan al cabo de unas 3 semanas de haber infectado con el virus una serie de síntomas pseudogripales como fiebre, cefalea, eritema, adenopatías y sensación de mal estar, desaparecen después de 1-2 semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento se produce un descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras normales en respuesta de una activación del sistema inmunológico; los individuos son altamente contagiosos durante esta fase; (2) fase asintomática que puede durar 10 años o incluso mas; durante este periodo, el virus continua replicándose, causando destrucción progresiva del sistema inmune; durante esta fase, el recuento de los linfocitos es normal; (3) fase sintomática precoz, se suele iniciar el desarrollo del síntoma clínico característica de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carácter leve p.ej. de tipo viral =>CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestación de parásitos => Pneumocystis carinii , Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus y Cándida; (4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA (sarcoma de Kaposi) que además, puede complicarse con un cuadro neurológico (demencia del SIDA)con alteraciones motoras y del área cognitiva, debido a la acción directa del virus sobre SNC;la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser 18-125 semanas, dependiendo del tipo de infección que tenga; en ningún caso habrá supervivencia cuando están en esta fase.
Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH – en España fundamentalmente serológico, por la importancia y las implicaciones que conlleva; se realiza mediante técnicas de ELISA en primera instancia (técnica de cribado), aplicando a los positivos, métodos de confirmación => Western Blot (WB), inmunofluorescencia (IFI) o radioinmuno-precipitacion (RIPA). **) El Western Blot es más utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas proteínas del virus; tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados (OMS, CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en: -Positivos => lo más aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y además bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos. -Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del virus (solo algunas proteínas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide). -Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos negativos). La técnica de WB consiste básicamente en la incubación de unas tiras de nitrocelulosa en los que sean transferido las proteínas de los virus, básicamente las estructuras con el suero del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela la presencia de Acs frente a diferente proteínas del virus mediante diferentes técnicas inmuno-enzimáticas dependiendo del fabricante; el resultado será la aparición de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde están situadas las proteínas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera automatizada por densitometría; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500 linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3 de sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de sangre, será indicativo de SIDA.
*) Los métodos de cribado (ELISA) son más sensibles y más específicos, siendo lo más novedoso los de 3ª generación con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo de ventana. *) También existen métodos rápidos, aplicables en situación de urgencia como la aglutinación con partículas de látex o los que utilicen Ags fijados a soportes solidos o membranas (se llamaDot-Blot). *) Las técnicas de centros especializados => cultivo y PCR ; la PCR es una técnica con mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no están al alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicación de estas técnicas es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH. *) Marcadores de monitorización o seguimiento de la enfermedad (detección del Ag p24); en fases tardías, se puede observar el declinar de los Acs anti p24 que se pueden utilizar con el mismo fin. *) De todos modos, el que más se utiliza para un diagnóstico de SIDA es el recuento celular de los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8). MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN VIROLOGÍA CLÍNICA Objetivo de laboratorio - proporcionar el diagnóstico etiológico y orientar correctamente el tratamiento en el menor tiempo posible; de manera simultanea se intenta practicar 2 tipos de diagnostico => - Dº directo (visualizar o aislar el germen mediante el cultivo e identificarlo => en virología clínica no es posible, por las características físicas y biológicas del virus, porque se ha de hacer mediante la detección de sus componentes, p.ej. Ags o ácidos nucleicos). - Dº indirecto (la identificación de los componentes de la respuesta inmune especifica/ Acs generados). Metodos de diagnostico directos: a) Examen directo de la muestra (macroscópica /a simple vista) => aspecto purulenta (en una infección viral nunca hay pus), presencia de sangre, moco, etc. b) Microscópia => con la Microscópia óptica solo se puede identificar los cambios celulares (efecto citopático) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscópia electrónica se puede visualizar el virus (en laboratorios de experimentación). c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por ello debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in vitromediante siguientes técnicas: - cultivo de órganos => las secciones de algunos órganos pueden ser viables varias semanas y nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante secciones de tejido respiratorio. - cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensión (cultivar adenovirus en un tejido adenoideo) - cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociación mecánica y con enzimas proteolíticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un frasco de cristal o de plástico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren con medios nutritivos
para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre las que se podrán replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares: *) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero de cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad de virus (p.ej. celulas del riñon de conejo y mono, embrión de pollo). *) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somáticas) que se pueden cultivar durante un tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de quese mantiene durante mas tiempo que cultivo primario. *) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo heteroploide (numero menor que las celulas somáticas); se originan de tejido maligno o por mutación de una célula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a -70ºC o -90ºC indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero). *) Shell-vial => es una técnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los últimos años y que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto periodo de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml de medio de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la muestra problema; el método se basa en la centrifugación (suave) de la muestra sobre la mono capa, y tras un corto periodo de incubación se pone de manifiesto la expresión de los Ags virales en la mono capa mediante tinción inmunológica; la ventaja => la rapidez de obtención de resultados en 24-48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infección; tiene una sensibilidad superior al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de muestra en un área mas pequeña y mas fácil la observación al microscopio de fluorescencia. Identificación del crecimiento en el cultivo celular - las mas frecuentes y disponibles en el laboratorio: 1). Efecto citopático - los virus al multiplicarse provocan cambios en la célula donde se replican que se manifiesta por una modificación en la morfología celular que se pueden observar (p.ej. inclusiones dentro de las celulas, hinchazón del citoplasma, formación de celulas gigantes multi-nucleadas) en la célula sin teñir o teñidas (se ve mas detalladas); cada virus presenta un tipo de efecto citopático característico que puede ser identificado en menos de 1 semana (p.ej. enterovirus, herpesvirus, adenovirus o poxvirus tienen como efecto citopático la destrucción o lisis celular en 24-48 horas; la fusión celular/ formación de sincition son característico de herpes virus, CMV, virus herpes zóster, etc.) 2). Formación de cuerpos de inclusión - son cambios histológicos que se producen en las celulas por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares; pu eden localizarse en el núcleo, en el citoplasma o en ambos y se clasifican según su tinción en eosinófilos o basófilos; cada virus produce unos cuerpos de inclusiones característicos. 3). Hem-adsorción - es la capacidad que adquieren las celulas infectadas por un virus para adherir a su superficie los hematíes de diversas especies (p.ej.aves, carnero). 4). Hem-aglutinación - la capacidad que adquieren las celulas infectadas por el virus de aglutinar diversos tipos de hematíes, por la formación en su membrana de este tipo de proteínas, las hemaglutininas. 5). Detección mediante metodos inmuno-enzimáticos o por inmunofluorescencia, de los Ags virales mediante Acs específicos para los cuerpos de inclusión celular.
Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no después de los 3-7 primeros días del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4ºC durante 24 horas y si no, se deben congelar a -70ºC porque muchos virus son lábiles a -20ºC; las muestras que se utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis faríngeo, exudado conjuntival, líquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc. d) Detección de los componentes estructurales virales - las técnicas mas usadas que permiten detectar Ags en suero y líquidos orgánicos (cuando existe una alta concentración viral, sera fácil detectarlos) son: - Aglutinación en látex => a las moleculas de látex se les une varias moléculas de Acs conocidos y cuando se pone en contacto con una solución que contiene el Ag (la muestra problema) se origina una aglutinación que puede visualizarse; es una técnica sencilla, sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad dependerá de la pureza del Ac utilizado. - Contra-inmunoelectroforesis => esta basada en el principio de que los Ags virales (o bacterianos en su caso) suelen tener carga (-) y los Acs (+), en medio alcalino; con este fundamento se colocan las soluciones de Acs conocidos y del Ag problema en unas cavidades realizadas en un gel de agarosa de tal manera que puedan difundir libremente; se colocan unas mechas en los extremos de la capa de agarosa, que conectan con unas cubetas que contienen un buffer con una composicion diferente dependiendo del sistema Ag-Ac; cuando se aplica una corriente eléctrica, las moléculas de Ags con carga (-) migran hacia el ánodo que esta en el extremo opuesto de la placa; los Acs son arrastrados por el buffer levemente alcalino y, en el punto en que ambas lineas se encuentran, se forma una banda de precipitación visible; es una técnica de alta sensibilidad pero laboriosa, que precisa una alta concentración de Ag y Ac. - Enzimoinmunoensayo => se basa en la detección de Ags mediante el empleo de un Ac unido a una enzima, que mantiene la capacidad de canalizar la reacción Ag-Ac; el enzima utilizado puede ser peoxidasa de rabano, Beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina; la presencia del inmuno-complejo es detectada por una reacción coloreada que se produce al añadir el sustrato; el empleo de enzimas tiene una serie de ventajas: *) el enzima se une al Ac pero deja libre los lugares de unión al Ag *) el enzima no se modifica con la reacción Ag-Ac y queda unido al inmuno-complejo junto con el sustrato amplificando la reacción y aumentando la posibilidad de detección *) los conjugados con enzimas son muy estables *) la lectura de la reacción se realiza en un espectrofotómetro y la cantidad de sustrato liberado es directamente proporcional a la cantidad de Ag fijado en la reacción *) la lectura también puede hacerse cualitativamente de forma manual, "de visu". La reacción tiene lugar en 2 fases => en la 1ª- en unos pocillos sobre los que se ha fijado un Ac especifico; al agregarle la muestra que puede contener los Ags, se unen formando el complejo Ag-Ac; posteriormente se hace un lavado para eliminar el resto de Ags no unidos a los Acs de la placa y otras partículas que pudieran interferir, en la 2ª- se agrega un Ac marcado con un enzima que se une a los sitios de unión del Ag y al añadirse un sustrato, da lugar a una reacción coloreada, que procederemos a medir en un espectrofotómetro; es una técnica que necesita varias horas para su realización.