Bienvenidos.
Generalidades
y
Los
antígenos (Ag) reaccionan tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos (Ac)
específicos y
El sitio activo para el antígeno denominado epítrope reacciona con el sitio activo del anticuerpo llamado paratopos (Ag-Ac).
y
El número de epitópos presentes en los antígenos determina la valencia del ag. en el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tiene sólo dos paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs tienen 10 y 4 paratópos respectivamente, debido a la multivalencia multivalencia del Ag con las respectivas respectivas valencias del Ac, cuando se da la reacción Ag ± Ac se forman agregados moleculares.
Clasificación de interacciones Ag-Ac. y
El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos son débiles, no covalentes y entre ellas están: puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles, de Van der Waals e hidrofobicas, por lo tanto son reversibles y fácilmente se disocian el complejo ya formado y de acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenómenos que se pueden presentar como consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en :
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.
REACCIONES DE FLOCUL ACIÓN.
REACCIONES DE NEUTRA LIZACIÓN.
REACCIONES DE OPSONIZACIÓN.
REACCIONES DE CITÓLIISIS. REACCIONES DE FIJACION DE COMPLEMENTO. REACCIONES CON REACTIVOS MARCADOS.
HISTORI A SOBRE LOS MÉTODOS DE ANALISIS INMUNOLOGICOS.
Creite (1869) y Landois (1875), Krauss en 1887 estableciendo el fenómeno de Precipitación (anticuerpos y antígenos solubles Dos años después Charrin y Roger al mezclar bacterias bacterias con suero previamente sensibilizados observa grumos o aglutinados (anticuerpo soluble y antígeno fijo en membrana),
el de aglutinación de eritrocitos con anticuerpos por Ehrlich y Morgenroth (1900),
Landstainer
descubre el sistema ABO empleando técnicas de hemaglutinación 1908 Ottenberg realiza al primer primer prueba Transfusional
Stillmark experimenta Stillmark aglutinaciones entre eritrocitos y extractos de Ricinos communis
antigenicidad de los eritrocitos por Bordet (1898) por
1930`s Marrack Marrack propone una explicación de la reacción antígeno--anticuerpos, antígeno considerando que el anticuerpo se une en forma de unión bivalente y el antígeno en multivalente la formación de un retículo o enrejado
RE ACCION DE PRECIPIT ACIÓN Se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, etc.., al estar
en presencia de sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac posteriormente se insolubilizan , dando como resultado una reacción de PRECIPIT ACIÓN. MECANISMO:
Primera fase o de sensibilización: identificación y fijación del anticuerpo , esta primera etapa casi no se ve influenciada por factores tales como, temperatura, pH, fuerza iónica y la concentración de los reactantes.
Segunda fase o de estabilización de la reacción: formación de una estructura molecular en forma progresiva da un enrejado. Esta 2ª etapa es mas tardada y es dependiente de lo siguientes factores.
F ACTORES QUE y
Temperatura
y
Relación Ag / Ac
y
Exposición del antígeno
y
pH (6.5 ± 7.5)
y
Tiempo
y
Fuerza iónica del medio
INFLUY EN
Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas, la fase 2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes. TEMPERATURA :
Acelera la reacción debido aun incremento de la difusión y el
movimiento de las moléculas. Esto es válido hasta los 56 °C, la mayoría de las reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, algunas técnicas se usan a 37 °C , otras a 45 °C y otras a temperaturas frías (4-6 °C).
COMO A FECT AN ESTOS F ACTORES LA RE ACCIÓN
pH: de este factor depende el estado iónico de grupos importantes que participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH ) y carboxilo (-COO), aun así el pH
óptimo esta entre 6.8 a 8.6.
FUERZA IÓNICA (): Corresponde a la concentración de iones presentes en el medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir las cargas de repulsión que impiden que se formen los agregados, el intervalo óptimo es 0.01- 0.1 para el enlace del Ag y Ac, a altas los grupos iónicos son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.
CONCENGTRACIÓN DE Ag Y Ac. La concentración de Ag y Ac deben ser equivalentes para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, si hay exceso de Ag o de Ac solo se forman complejos primarios, no hay precipitación.
CURV A DE PRECIPIT ACIÓN CUANTIT A TIV A.
y
Ag
PREZONA
POSTZONA
Ac
TÉCNICA S DE PRECIPIT ACIÓN. Las
reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas y cuantitativas y se
pueden realizar en medio liquido y semisólido. Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:
La
simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar.
La
formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interface o Ascoli)
La
difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)
La
doble difusión unidimensional en agar
La
difusión radial simple de agar (RID)
La
doble difusión radial en gel de agar (DDR)
Las
técnicas de difusión se combinan con procedimientos electroforéticos como:
y
La inmunoelectroforesis
(IEF)
y
La
y
La electroforesis bidimensional
electroinmunodifusión
A GLUTINACIÓN. Técnicas como la aglutinación y la hemólisis son los métodos cualitativos más empleados en el Laboratorio del
Banco de Sangre:
Para determinar:
Grupo sanguíneo ABO y Rh,
Rastreo de anticuerpos
Coombs directo
Pruebas cruzadas Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico y este se encuentra en estado particulado o forme (p.ej. Bacterias, eritrocitos, levaduras, células) reaccionan formando grumos o aglutinados y los principios que regulan esta reacción son los mismos de la reacción de Precipitación.
RE ACCIÓN DE A GLUTINACIÓN.
La
primera fase es conocida como sensibilización: proceso mediante el cual el anticuerpo se une al
antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede haber activación del complemento, donde se observa lisis.
y
La
segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de anticuerpo,
formando grumos o aglutinados que puedes ser vistos a simple vista o en microscopio. Factores que afectan la reacción de aglutinación: Temperatura Relación
Ag / Ac
Exposición pH (6.5 ±
del antígeno
7.5)
Tiempo Fuerza
iónica del medio
R eacciones de aglutinación factores que influyen: Tipo de inmunoglobulina
R eacciones de Aglutinación Factores que influyen: Integridad de la membrana de eritrocito
R eacciones de Aglutinación Factores que influyen: Densidad del antígeno
Potencial zeta
Las La
reacciones de aglutinación pueden ser: IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la
distancia entre partículas, en un medio salino. Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albúmina o la utilización de enzimas proteolíticas como la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de reacción. Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una antigamaglobulina humana denominada suero de coombs, este se une a la IgG unida al Ag formando puentes y formar aglutinados. Estas reacciones se llevan a cabo con gran facilidad y su alta sensibilidad, pero no puede cuantificarse y solo pueden darse resultados en función de realizar diluciones. AGLUTINACIÓN DIRECTA O ACTIVA , donde los antígenos que intervienen son componentes naturales de la partícula. AGLUTINACIÓN INDIRECTA O PASIVA , en donde los antígenos solubles se absorben en forma artificial a partículas que funcionan como soporte ( de tipo natural o artificial ). las reacciones de aglutinación se pueden realizar en, placa, tubo y placa de microtitulación.
REACCIONES DE CITÓLISIS. y
y
y
y
y
y
Los anticuerpos producidos en la respuesta humoral, activan el sistema complemento.
El complemento es un conjunto de glicoproteínas que inactivas se conocen como (zimógenos) y requieren de ser activados. La
activación del complemento se lleva a cabo en forma de cascada y derivado de su activación se generan actividades como: quimiotaxis, opsonización, degranulación de basófilos y células cebadas y la lisis celular. La
activación del complemento se lleva a cabo por dos vías (la clásica y la alterna), y la vía de la lectina Cuando se activa el complemento por cualquier vía se lleva a cabo sobre una superficie celular y en la última etapa forma el complejo de ataque a la membrana (MAC), que causa la lisis de la célula. Para que este sistema no cause daño a las propias células, existen otros factores de regulación.
R eacción de citólisis. En las reacciones de citólisis , en donde se emplea el complemento como reactivo (titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de complemento) se utiliza el suero de algún animal como fuente de complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el complemento en el suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que alguno de los componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su actividad, por lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en refrigeración o en su caso de usar productos comerciales liofilizados.
Hemólisis. y
Las
hemolisinas (amboceptores hemolíticos)son anticuerpos producidos frente a los
antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos. y
los amboceptores en presencia del antígeno que estimuló su formación y del complemento, desencadenan una reacción que causa la lisis de eritrocitos.
y
Para medir la actividad del amboceptor se realizan diluciones y a veces se mide sólo el 50% de la hemólisis.
Técnicas con Anticuerpos o Antígenos marcados y
y
y
Las
reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de estos reactantes. La especificidad de esta reacción le da a estas reacciones in vitro una elevada confiabilidad. Aumenta la sensibilidad de estas pruebas al utilizar marcas en cualquiera de los dos (Ag o en el Ac), permitiendo demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeñas de los reactantes. Las principales sustancias utilizadas como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos. Los
isótopos se empazarón a usar en 1966 por la Dr. Yallow, cuando realizó su primer radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de unensayo competitivo en donde se permitía la competencia entre moléculas de Ag no marcadas y marcadas con radiosótopos por los sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificación y la cuantificación del analito en la fracción libre y unida a la reacción.
ANTIGENOS ERITROCITARIOS y
La cantidad de sitios antigénicos , muestran diferencias substanciales para cada sistema eritrocitario así como su expresión en función de la edad SABO/ ANTIGENOS A1 ADULTO A1 NEONATO
SITIOS ANTIGENICOS x 10 3 800 ± ± 1170 250 ±
A2 ADULTO
240
A2 NEONATO
140
A1B ADULTO
460 ±
A2B ADULTO
140
B ADULTO
750
B NEONATO
200 ±
370
850
320
