INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Laboratorio de Bioquímica
Práctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GR UPO ALA AMINO LIBRE! METODO DE SANGER! Secci"#: $ Grupo: %&$ A)icia * Pi#eda B)a#co A)a# Da+id * Guerrero )ore( ra#ci(co A#dr,(! Alumnos: A'uirre La#dero( B)a#ca A)icia*
INTODUCCIÓN! Las proteínas proteínas son macromoléc macromoléculas ulas formadas por cadenas cadenas lineales de aminoácidos. Las proteínas proteínas desempeñan desempeñan un papel fundamental fundamental en los seres seres vivos vivos y son las biomol biomolécu écula la más versátil versátiles es y más divers diversas. as. Reali Realizan zan una enorm enorme e cantid cantidad ad de funcio funciones nes diferentes, entre las que destacan la enzimática, hormonal, transporta transportadora dora (hemolobin (hemolobina!, a!, defensiva defensiva (anticuerpo (anticuerpos!, s!, estructural (coláeno!, etc. "n polipé polipépti ptido, do, en otras otras palabr palabras, as, es una secuen secuencia cia de aminoá aminoácid cidos os que están están vincul vinculado ados s a través través de enlace enlaces s peptídicos. #rederic$ %aner, fue uno de los cientí&cos más reconocidos de su época' época' este este método método le dio ran ran recon reconoci ocimie miento nto mundial, recibiendo el premio nobel de química en )*+. on el método método de %aner se determina determina el rupo -amino -amino libre de las cadenas polipeptídicas, este reacciona, con el /uoro0,1dinitrobenceno 234#56 en un medio lieramente alca alcali lino no,, form forman ando do los los 347 347 deri deriva vado dos. s. "na "na hidr hidr8l 8lis isis is poster posterior ior con 9l :4 aplica aplicando ndo temper temperatu atura ra y presi presi8n 8n provee los aminoácidos libres y dinitrofenil derivados, estos deriva derivados dos pueden pueden e;tra e;traers erse e del hidro hidroliz lizado ado con éter éter e identi&carse con una cromatorafía en papel.
OB"ETI#O! •
"tilizar el método de %aner para identi&car los aminoácidos que contienen el rupo alfaamino terminal de las cadenas de la molécula de hemolobina.
ESULTADOS! Rf < distancia recorrida por el soluto = distancia recorrida recorrida por el solvente Muestras
DNP- Glu
Distancia recorr rec orrida ida por el soluto. 20.8
Rf
20.8 / 27.5 = 0.75
DNP- Ala
!.5
!.5 / 27.5 = 0.!
DNP-"al
8.7
8.7 / 27.5 = 0.!8
DN#$
.8
.8 / 27.5 = 0.%2
Pro&le'a
0.!
0.! / 27.5 = 0.(8
Pro&le'a
8.(
8.( / 27.5 = 0.!!
3istancia recorrida recorrida por el solvente < 0>.*
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Práctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GR UPO ALA AMINO LIBRE! METODO DE SANGER! Secci"#: $ Grupo: %&$ Alumnos: A'uirre La#dero( B)a#ca A)icia* Pi#eda B)a#co A)a# Da+id * Guerrero )ore( ra#ci(co A#dr,(!
ANALISIS DE ESULTADOS uando se le adiciona bicarbonato de sodio al 1? a la hemolobina, realizamos un medio alcalino el cual favorece la reacci8n, posteriormente al arear el reactivo de %aner /uoro0,1dinitrobenceno (34#5! aitamos el tubo para favorecer la reacci8n y así obtener 347 derivados de la hemolobina. %e acidi&co el medio con 9l @4 para detener la reacci8n del (34#5! con la hemolobina en medio alcalino que realizamos anteriormente, se e;traAo con éter para separar en dos fases, la oránica que es nuestra sustancia problema que contiene aminoácidos dinitrofelinados, y la etérea la cual hace que se eliminen los residuos del (34#5! que no reaccionaron en la etapa anterior de nuestra reacci8n, posteriormente se are8 9l :4 para realizar una hidrolisis acida, que al aplicar temperatura y presi8n en el autoclave esta provee que los aminoácidos libres y dinitrofenil derivados puedan e;traerse del hidrolizado. 7ara identi&car y separar el rupo amino terminal de la hemolobina, se utilizo el e;tracto obtenido en la hidrolisis y con éter se e;traAo nuestra sustancia problema calentamos los e;tractos etéreos en una parrilla con el &n de evaporar el éter que hay en nuestra sustancia para que nuestro problema estuviera concentrado y sin residuo aluno de las sustancias anteriores que utilizamos, disolvimos en alcohol absoluto para la aplicaci8n en cromatorafía nuestro 347
7ara la aplicaci8n de nuestro problema en la cromatorafía, se realiz8 con papel Bhatman' aplicamos las muestras de 347Clu, 347Dla , 347EDL, 34#5 y nuestra sustancia problema para identi&car y hacer una comparaci8n de cuál de estas sustancias que colocamos es nuestro aminoácido con rupo -amino terminal. Fn donde se colocaron estos estándares 2347derivados6. Dl revelar el cromatorama se encontraron dos manchas en la corrida del problema, uno correspondiente al 347Ealina y el otro corresponde al 34#5 sin reaccionar. 9ubo unas lieras diferencias entre la corrida del problema y de los 347 derivados. Fstas diferencias se pueden deber a la temperatura ambiente la cual hace que acelere o sea más lento cuando el cromatorama corre en el disolvente. Ddemás el problema presento 34#5, lo cual se debe a los restos de 34#5 que se quedaron en la muestra debido a que no se e;traAo en su totalidad antes de la hidr8lisis que se hizo con el &n de eliminar todo este e;ceso.
CONCLUSIONES! •
%e determin8 con el método de %aner y la cromatorafía el alfaamino terminal de la hemolobina que es valina con un Rf < G.::
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Práctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GR UPO ALA AMINO LIBRE! METODO DE SANGER! Secci"#: $ Grupo: %&$ Alumnos: A'uirre La#dero( B)a#ca A)icia* Pi#eda B)a#co A)a# Da+id * Guerrero )ore( ra#ci(co A#dr,(!
BIBLIOGA$%A
4'ea)spaa
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