Metodă HPLC de determinare a unor coloranţi alimentari sintetici din preparate de carne Cromatografia
de
lichide
de
înaltă
performanţă
înlocuieşte
vechile
metode
cromatografice de analiză a coloranţilor alimentari (cromatografia în strat subţire, cromatografia pe hârtie) furnizând rezultate precise, reproductibile şi rapide [113]. 6.1. Stabilirea naturii colorantului şi extracţia sa din proba de analizat S-a aplicat o metodǎ de testare calitativă a produselor alimentare pentru a putea determina natura colorantului introdus în procesul de fabricaţie. Metoda permite stabilirea naturii colorantului folosit şi anume: natural sau sintetic. Dacă colorantul este sintetic, acesta este extras rapid din probă într-un amestec apă-metanol 7/3. Se observă vizual o colorare intensă a amestecului de extracţie, situaţie care nu apare în cazul în care colorantul este natural. Dacă în urma acestei testări calitative, se constată prezenţa în probă a unui colorant sintetic, se trece la extracţia acestuia în vederea dozării lui cantitative. Determinarea coloranţilor alimentari sintetici A fost adaptată o metodă HPLC preluată din literatură la determinarea unor coloranţi alimentari sintetici, şi anume: tartrazină, ponceau 4 R, allura red şi galben de chinolină [189]. S-a încercat mai întâi separarea coloranţilor sintetici menţionaţi utilizând o coloană cromatografică Pecosphere C18, 5 μm, 150 x 4,6 mm (BrownLee), o fază mobilă constituitǎ dintr-un amestec acetat de amoniu:metanol (7:3, v/v) şi un debit al fazei mobile de 0,7 mL/min. Detecţia coloranţilor alimentari sintetici separaţi a fost efectuată spectrofotometric, cu ajutorul detectorului diode array al sistemului HPLC. Coloranţii ponceau 4 R şi galbenul de chinolină au timpii de retenţie foarte apropiaţi şi nu se separǎ. Cu toate că cei doi coloranţi nu s-au separat cromatografic, ei pot fi totuşi determinaţi prin efectuarea de mǎsurǎtori de absorbanţǎ la lungimea de undă de 507 nm pentru determinarea ponceau 4 R (galbenul de chinolină nu absoarbe la această lungime de undă) şi la 413 nm pentru galben de chinolină. De asemenea, în cazul analizei unor probe reale, în vederea identificării compusului separat, este recomandată compararea spectrelor de absorbţie ale compuşilor separaţi
(cu timpii de retenţie în jurul valorii de 3 min) cu spectrul fiecăruia din cei doi coloranţi (ponceau 4 R şi galben de chinolină). Folosindu-se o coloană cromatografică cu aceleaşi caracteristici generale, dar produsă de altă firmă (Supelco), s-a reuşit obţinerea unor picuri cromatografice bine separate pentru coloranţii alimentari sintetici ponceau 4 R şi galben de chinolină. Parametrii metodei cromatografice utilizate sunt prezentaţi în tabelul 1. Tabel 1. Parametrii metodei cromatografice cu fază inversă folosită la analiza coloranţilor sintetici. Coloană: Coloană cu fază inversă Supelcosil C 18 5 μm, 150 x 4,6 mm. Faza mobilă : Acetat de amoniu 0,1 M : metanol : 7 : 3 (v/v). Debit : 0,7 mL/min. Temperatura coloanei: 30 ºC. Detector: UV – Vis tip Diode Array. Volum de injecţie: 10 μL. În figurile 47 şi 48 sunt prezentate cromatogramele obţinute pentru tartrazină şi galbenul de chinolină folosind cea de a doua coloană cromatografică (Supelcosil), precum şi spectrele de absorbţie corespunzǎtoare acestora, spectre trasate cu detectorul diode array al aparatului HPLC. Spre deosebire de cromatogramele obţinute pentru ponceau 4R, allura red şi tartrazină, în care s-a obţinut căte un pic cromatografic bine definit corespunzător fiecăruia din coloranţii menţionaţi, pentru colorantul galben de chinolină cromatograma este constituită din cinci picuri cromatografice. Colorantul sintetic galben de chinolină se prezintă sub forma unui amestec de săruri de sodiu ale unor acizi di şi trisulfonici, aşa cum indică producătorul (Fluka). Numărul şi poziţia grupărilor sulfonice pe nucleul benzenic, explică comportamentul cromatografic diferit al componentelor prezentaţi în tabelul 39.
Tabel 39. Parametrii metodei cromatografice cu fază inversă folosită la analiza coloranţilor sintetici [191]. Coloană: Coloană cu fază inversă Supelcosil C 18 5 μm, 150 x 4,6 mm. Faza mobilă : Acetat de amoniu 0,1 M : metanol : 7 : 3 (v/v). Debit : 0,7 mL/min. Temperatura coloanei: 30 ºC. Detector: UV – Vis tip Diode Array. Volum de injecţie: 10 μL. În figurile 47 şi 48 sunt prezentate cromatogramele obţinute pentru tartrazină şi galbenul de chinolină folosind cea de a doua coloană cromatografică (Supelcosil), precum şi spectrele de absorbţie corespunzǎtoare acestora, spectre trasate cu detectorul diode array al aparatului HPLC. Spre deosebire de cromatogramele obţinute pentru ponceau 4R, allura red şi tartrazină, în care s-a obţinut căte un pic cromatografic bine definit corespunzător fiecăruia din coloranţii menţionaţi, pentru colorantul galben de chinolină cromatograma este constituită din cinci picuri cromatografice. Colorantul sintetic galben de chinolină se prezintă sub forma unui amestec de săruri de sodiu ale unor acizi di şi trisulfonici, aşa cum indică producătorul (Fluka). Numărul şi poziţia grupărilor sulfonice pe nucleul benzenic, explică comportamentul cromatografic diferit al componentelor galbenului de chinolină. Colorantul galben de chinolină livrat de firma Fluka, este de fapt un amestec de mai multi compusi.
Fig 1. Cromatograma pentru colorantul tartrazină şi spectrul de absorbţie corespunzător acestuia
Dacă se compară alura spectrelor de absorbţie corespunzătoare picurilor cromatografice obţinute la separarea componentelor galbenului de chinolină (figura 2), se observă că forma acestora este asemănătoare. Acest lucru se poate explica prin faptul cǎ este prezentǎ aceeaşi grupare cromoforǎ în toate componentele amestecului, dar numărul şi poziţia grupărilor sulfonice din molecula acestora determină un comportament cromatografic diferit pentru fiecare component. În figura 3 este prezentată cromatograma obţinută pentru amestecul format din cei patru coloranţi alimentari sintetici analizaţi: ponceau 4R, allura red, tartrazină, galben de chinolină. Studiind cromatograma prezentată în figura 3 se observă cǎ se obţin picuri cromatografice bine definite pentru tartrazină, ponceau 4R şi allura red.
Fig 2 . Cromatograma pentru colorantul galben de chinolină şi spectrele de absorbţie corespunzătoare diferitelor componente ale acestuia.
În cazul colorantului sintetic galben de chinolină, se obţine un singur pic cromatografic mai mic, care corespunde picului cel mai proeminent din cromatograma obţinută pentru proba etalon a acestuia. Acest lucru se poate explica prin faptul că determinările s-au efectuat la 450 nm, unde absorbanţa corespunzătoare acestui colorant este mică. Picurile corespunzătoare celorlalte forme sub care se găseşte colorantul, fie nu sunt puse în evidenţǎ, fiind foarte mici, fie se suprapun peste picul tartrazinei (picul cu timpul de retenţie 2,08 min, figura 2 ), sau al ponceau 4R (picul cu timpul de retenţie 3,19 min, figura 2). Din acest motiv considerăm că metoda studiată deşi permite identificarea celor patru coloranţi în amestec nu este adecvată pentru determinarea lor cantitativă (atunci când sunt prezenţi toţi patru într-un amestec). Pot fi însă efectuate determinări cantitative pentru următoarele amestecuri de coloranţi: tartrazină, ponceau 4R şi allura red sau galben de chinolină şi allura red. De cele mai multe ori, acest lucru este suficient deoarece într-un produs alimentar se introduc un număr redus de coloranţi, de cele mai multe ori unul singur.
Figura 3. Cromatograma amestecului format din cei patru coloranţi sintetici analizaţi.
Analiza unor probe reale În figura 4, se prezintă un exemplu de analiză calitativă a unui colorant sintetic dintr-o probă de cabanos. Se prezintă cromatogramele (figura 4 a şi 4 b) şi spectrele de absorbţie (figura 53 c) ale unui standard de colorant sintetic şi ale colorantului din proba de cabanos [188, 190]. S-a identificat prin metoda HPLC într-un preparat de carne (cabanos) prezenţa colorantului sintetic ponceau 4R comparând valorile timpilor de retenţie pentru un standard care conţine ponceau 4R şi pentru colorantul extras din proba de analizat. S-a confirmat prezenţa colorantului ponceau 4R în proba analizatǎ prin compararea spectrelor înregistrate pentru compuşii corespunzători cele două picuri şi anume: al colorantului ponceau 4R şi al colorantului din proba analizată. Spectrele înregistrate sunt foarte asemǎnatoare, ceea ce confirmă prezenţa colorantului Ponceau 4R în preparatul de carne analizat Este importantǎ determinarea coloranţilor sintetici din preparate de carne, chiar la concentraţii foarte mici, deoarece în ţara noastră este interzisă folosirea acestei clase de compuşi în carne şi preparate din carne.
Fig 4.Cromatogramele şi spectrele de absorbţie pentru colorantul dintr-o probă de cabanos şi pentru un standard de colorant sintetic (Ponceau 4R).
a) cromatograma obţinută pentru standardul de Ponceau 4R; b) cromatograma obţinută pentru colorantul din proba decabanos; c) spectrul de absorbţie al standardului de Ponceau 4R, precum şi al colorantului din proba de cabanos
